JP5312799B2 - 収集精密ろ過における剪断保護剤 - Google Patents

Description

本出願は、細胞培養の収集（ｈａｒｖｅｓｔ）精密ろ過の分野に関する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、全体を参照にして本明細書に一体化させた２００５年１月２５日提出の米国仮出願第６０／６４７，１８４号の優先権を主張する。

透析ろ過は、操作様式に応じて緩衝液交換と産物回収の生物工学的な応用に使用される。透析ろ過では、ろ液がシステムから除去されるのと同時に、緩衝液が再循環もしくは保持タンクに投入される。透析ろ過は、産物である保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を洗浄するか、又はろ過システムを通して産物を洗浄して収集する方法として使用され得る。プロセス流からの産物の回収を最大にすることが透析ろ過を用いる精密ろ過収集プロセスの目的である。

（概要）
本発明は、精密ろ過プロセスの一部（例、タンジェンシャルフローフィルトレーション；ＴＦＦ）として透析ろ過工程で用いられる緩衝液への非イオン界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ポリエチレングリコール、あるいは他の非イオン性ブロック共重合体界面活性剤の添加がプロセス流体の濁度を減少させうるという知見に関する。従って、本発明は透析ろ過の方法を含む。該方法は透析ろ過に保持液を提供し、該保持液に非イオン界面活性剤を添加することを含む。該非イオン界面活性剤は、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）であり得る。いくつかの具体例では、該非イオン界面活性剤は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に存在する。緩衝液中の該非イオン界面活性剤濃度は、０．２ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、０．２ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２．５ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２ｇ／Ｌの間、および０．５ｇ／Ｌと１．５ｇ／Ｌの間であり得る。いくつかの場合において、緩衝液中の該非イオン界面活性剤濃度は、約１ｇ／Ｌ又は約２．５ｇ／Ｌである。ある具体例において、該保持液は細胞および培地を包含する。本発明のある態様において、透析ろ過から生じるろ液の濁度は、非イオン界面活性剤の非存在下で行われる透析ろ過と比較して減少する。別の具体例において、該保持液からの産物の回収は、非イオン界面活性剤の非存在下における産物の回収と比較して非イオン界面活性剤の存在下で増加する。さらに別の具体例において、該保持液は、医薬品、例えば、組み換えタンパク質、組み換えペプチド、又は天然に存在するタンパク質もしくはペプチドを含む。いくつかの場合において、該保持液は、保持液中の細胞に対して等張である緩衝液、例えば、ＰＢＳを含む。別の具体例において、透析ろ過は約２０℃〜２５℃、２℃ないし３７℃、又は２℃〜２５℃の温度で行われる。透析ろ過は、例えば、不連続な透析ろ過又は一定容積の透析ろ過であり得る。ある場合において、非イオン界面活性剤の濃度は透析ろ過中に実質的に変化しない。非イオン界面活性剤は細胞培地中に含まれ得る。

本発明はまた、例えば、本明細書記載のごとき透析ろ過の方法を用いて得られる産物にも関する。

別の態様において、本発明は、約１ｇ／Ｌの非イオン界面活性剤（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８もしくはＰＶＡ）濃度を維持することを含む透析ろ過の方法に関する。

さらに別の態様において、本発明は、約１ｇ／Ｌ（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）もしくは約２．５ｇ／Ｌ（例、ＰＶＡ）の非イオン界面活性剤を含む透析ろ過用の組成物に関する。該組成物はまた、等張性緩衝液、例えば、ＰＢＳを含み得る。

別段に規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語もしくは科学用語は、本発明が属する分野の当業者間で一般的に理解されることと同一の意味を有する。本明細書記載の方法と材料と同様又は等価であるものが、本発明の実施もしくは試験に使用され得るが、適する方法と材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体を参照することで本明細書に一体化される。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図しない。

本発明の他の特徴と利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明白であろう。

（詳細な説明）
タンパク質の処理において、ＴＦＦが回収プロセスの一部として用いられることにより、供給流中の他の組成物から未処理細胞と残屑が分離され得る。例えば、培養細胞を用いる産生プロセスは、濃縮と透析ろ過を包含する収集精密ろ過工程を使用しうる。このプロセスは、例えば、ＴＦＦを用いて、産生細胞系統に由来する組み換えタンパク質のごとき産物を含む細胞培養流動体を分離する。最初の収集精密ろ過（濃縮）後、一般的に、最初のろ過前の密度より高密度の細胞を含む保持液がろ過システムを通して再循環され、精密ろ過されることにより、収集精密ろ過システム（透析ろ過）に滞留されるさらなる産物が回収される。この透析ろ過工程では、一般的に等張性緩衝液（例、ＰＢＳ）が保持液に添加される。この透析ろ過は、緩衝液を添加する不連続な方法もしくは一定容積の方法のどちらかを用いて実施され得る。

一般に、用語「プロセス流」は、供給流、透過流、および保持流、すなわち細胞培養の産物を含むプロセスにおける可動流体を包含する。ろ液は、フィルターを透過するいずれかの物質、すなわち透過流である。「保持液」は、フィルターを透過しないが、ろ過装置に接触し、リザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に戻される物質を意味する。「供給流」は、リザーバーを離れ、ポンプを透過し、フィルターに送り込こまれる物質を意味する。

上に記載のごとき方法の目的は、細胞培養液もしくは保持液から回収された産物、例えば、分泌タンパク質もしくはペプチド産物の量を最大にし、同時に細胞培養液とプロセス流の望ましくない物質の量を最小にすることである。細胞培養液もしくは保持液における濁り負荷（ｌｏａｄ）の上昇は、一般的に透過液濁度の上昇に関連する。望ましくない物質は、例えば、細胞内微粒子と残屑を含みうる。一般的に、濁度はプロセス流における望ましくない物質の負荷の指標として使用される。濁度はフィルターを見えなくし、清澄化トレイン（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｒａｉｎ）の閉塞（例えば、孔の目詰まり）を引き起こし、細胞内酵素放出の介在を含む産物の質に害を及ぼし得る状態を示すので、培地もしくは緩衝液あるいは両混合液のごとき細胞懸濁溶液における過剰な濁度は望ましくない。収集される培養細胞の破壊（例、剪断による）は、プロセス流濁度の上昇を引き起こしうる。本明細書で報告されるように、透析ろ過中の保持液への緩衝液添加が濁度を上昇させうることは、緩衝液が等張性であっても観察された。

本発明は、保持液への非イオン界面活性剤（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８もしくはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のごとき非イオンブロック共重合体界面活性剤）を含む緩衝液（例、ＰＢＳ）の添加が、保持液への緩衝液単独の添加と比較して保持流および透過流における濁度の量を減少させるという知見に関する。一般に、保持液の濁度は、保持液に添加される緩衝液中又は他の溶液中の非イオン界面活性剤の存在下で該界面活性剤の非存在下より低い。加えて、ろ液の濁度は典型的に減少する。典型的には、非イオン界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はＰＶＡである。使用され得る他の非イオン界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、少なくとも約１０００の分子量を有するＰＥＧを包含する。剪断保護剤（ｓｈｅａｒ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として機能できるだけでなく、イオン特性を有する特定の化合物、例えば、デキストランが使用され得る。本明細書記載の方法で用いられるデキストランの典型的な濃度は、少なくとも１０ｇ／Ｌである。他の適する化合物は本明細書記載の方法を用いて同定され得る。本明細書記載の方法で用いられる非イオン界面活性剤又は他の剪断保護剤の濃度は、一般的に０．２ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間、０．２ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２．５ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと１．５ｇ／Ｌの間、又は約１ｇ／Ｌである。いくつかの場合では、非イオン界面活性剤もしくは他の剪断保護剤の濃度は、少なくとも１ｇ／Ｌもしくは少なくとも１．５ｇ／Ｌである。最大量は、いくつかの場合では、２ｇ／Ｌまで、５ｇ／Ｌまで、１０ｇ／Ｌまでであり得る。

いくつかの場合では、ＴＦＦの開始前に、緩衝液、例えば、ＰＢＳのごとき等張性緩衝液が保持液に添加される。一般的に、該緩衝液はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８のごとき非イオン界面活性剤を包含する。

本明細書記載の方法の適用例においては、産生細胞系統に由来する組み換えタンパク質を含む細胞培養流動体を分離する収集精密工程を採用する、市販の組み換えタンパク質の製剤産生プロセスが用いられた。該収集システムは、０．６５μｍの精密ろ過（ＭＦ）膜モジュールを包含するＰｒｏｓｔａｋタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）ｕｎｉｔ（マサチューセッツ州、ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。全細胞培養流動体（細胞を含む）は、ＴＦＦシステムの保持側の一連のＰｒｏｓｔａｋのモジュールを介して再循環され、収集タンクに戻された。細胞遊離培養流動体は、０．６５μｍのＰｒｏｓｔａｋのフィルターモジュール膜の片側を透過し、さらなる処理のために採集される。

全細胞培養流動体は、最初のＴＦＦプロセスにより１０倍に濃縮された。ろ過トレインの保持側に生じる流動体は、本明細書では保持液と称する。細胞濃縮後、緩衝液透析ろ過工程が精密ろ過の最終保持液体積の１．８倍で行われることにより、収集精密ろ過および清澄化システムで滞留している産物の収率が改善された。

収集スキームに用いられる透析ろ過緩衝液はＰＢＳであった。他の等張性溶液、例えば、トリス緩衝食塩水のごとき緩衝液もしくは培地が本明細書記載の方法で使用され得る。非イオン性溶液もまた使用され得る。ＰＢＳは等張性であり、細胞生存率に有害な効果を有することが予想されていなかった。しかし、緩衝液が保持液に添加された後に、望ましくないレベルの濁度が観察された。収集透析ろ過緩衝液への１ｇ／Ｌ濃度でのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８もしくは２．５ｇ／Ｌ濃度でのＰＶＡの添加は、収集プロセス流における濁り負荷の減少を生じた。

特別な理論を有していないが、非イオン界面活性剤が本明細書記載の回収プロセスで用いられる場合に見られる濁り負荷の減少は、該非イオン界面活性剤が少なくとも部分的に剪断保護剤として作用することで、収集時の剪断誘導による細胞分解が減少するためであるかもしれない。

透析ろ過時に緩衝液にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はＰＶＡのごとき非イオン界面活性剤を添加する利点は、１）例えば、収集時に産生細胞系統から放出されるプロテアーゼの低レベル化の結果として、収集保持プールにおける産物安定性が改善されること、２）下流処理前のプロセス流における細胞由来の不純物負荷が減少すること、および３）収集フィルタートレインに必要な表面積が減少することであり得る。

（有用な非イオン界面活性剤の同定方法）
非イオン界面活性剤は、本明細書記載の方法を用いて、例えば、収集流中の望ましくない物質（例、細胞残屑）の量を減少させることによる保持液の質を改善する能力についてテストされ得る。質はまた、例えば、非イオン界面活性剤の使用の存在下または不在下において回収される産物の純度又は産物の量を、ろ液をアッセイすることで調べられ得る。一般的に、非イオン界面活性剤は透析ろ過時に添加される緩衝液に含まれ、該保持液は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％（ｖ／ｖ）もしくはそれ以上の緩衝液を包含する。保持液中の望ましくない物質の量が測定され、非イオン界面活性剤の添加がないこと以外は同一の緩衝液を用いて透析ろ過される保持液中の望ましくない物質の量と比較される。緩衝液に添加される非イオン界面活性剤は、細胞培地中の非イオン界面活性剤と同一もしくは相違たり得る。一般的に、非イオン界面活性剤は細胞培地のものと同一であり、緩衝液中の界面活性剤濃度は細胞培地中の濃度と同一である。非イオン界面活性剤の様々な濃度が測定されることにより、保持液中の望ましくない物質の量を最小にし、産物の回収を最大にする好適な濃度が決定され得る。いくつかの場合において、保持液をアッセイすることに加えて、あるいはその代わりにろ液の濁度が測定される。

いくつかの具体例では、保持液の濁度は、緩衝液もしくは非イオン界面活性剤を含む緩衝液が保持液中で透析ろ過された後にテストされる。濁度は細胞内微粒子と細胞残屑の指標を提供する。一般的に、より低い濁度はより望ましい保持液の質に関連する。濁度は当該技術分野で知られる方法を用いて測定され得る。例えば、比濁分析法（Ｂａｋｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２ Ａｐｒ；２０（４）：１４９−５６）もしくは吸光度法が使用され得る。吸光度法は、一般的に吸光度：５５０ｎｍ−６５０ｎｍを測定することでアッセイされる。非イオン界面活性剤の存在下での濁度の減少は、非イオン界面活性剤がＴＦＦの保持液の質を高めることを示す。いくつかの場合では、様々な濃度の非イオン界面活性剤がテストされることにより、特定のプロセスにおける好ましい濃度が決定される。

保持液の質を測定するか、もしくは細胞残屑の存在を試験するのに使用される当該技術分野で知られる他の方法を用いることにより、緩衝液を含む保持液の質を改善する非イオン界面活性剤の能力を測定することができる。例えば、保持液中および／もしくは透過液中の細胞内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に対するテストが、細胞溶解物を検出する方法として使用され得る。使用され得る他の方法は、緩衝液が添加された保持液中における細胞数の測定を包含する。一般的に、保持液中の細胞数は、非イオン界面活性剤を含む緩衝液の存在下および緩衝液単独の存在下で測定される。有用な緩衝液組成物は、非イオン界面活性剤を含む緩衝液で透析ろ過された時に、細胞の合計数が透析ろ過開始時と比較して透析ろ過終了時の保持液中で一定数にとどまるものである。有用な組成物、すなわち、非イオン界面活性剤を加えた緩衝液はまた、透析ろ過後の保持液中の細胞数が緩衝液単独を用いる透析ろ過後の保持液中の細胞数より多い緩衝液組成物を包含する。

透析ろ過プロセスの温度はまた、保持液からの産物回収の向上、濁りの減少、フィルターブラインディングの減少、又は緩衝液を含む保持液の他の望ましくない質の減少のために調整され得る。一般的に、透析ろ過は、例えば、約２０℃〜２５℃、２℃ないし３７℃、又は２℃〜２５℃の温度で行われる。

本明細書記載の方法を用いて回収され得る非限定的な例は、タンパク質とペプチド、例えば、抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、自然分泌性タンパク質、分泌されるように改良されたタンパク質とペプチド、および細胞で産生される非タンパク質産物を包含する。

（実施例）
本発明はさらに以下の実施例で例示される。実施例は例示のみを目的として提供される。それらは決して本発明の範囲又は内容を限定して解釈されるものではない。

実施例１：収集精密ろ過の開発
上に記載された収集と清澄化プロセスを、組み換えタンパク質を産生する細胞を用いてテストした。精密ろ過工程の細胞濃縮段階にわたって、細胞を細胞培地中のＰＶＡ（Ｃｅｌｖｏｌ、テキサス州、ダラスのＣｅｌａｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）もしくはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（ドイツ、ルートウィヒスハーフェンのＢＡＳＦ）のごとき剪断保護剤の存在下で再循環させた。透過液（ろ液）の濁度はこれらの条件下では低いままであり、保持液の濁度は細胞量の増加に比例して増加した。比濁分析法を用いて測定された濁度を使用して、プロセス流中の細胞内微粒子および残屑の負荷を定量した。保持液へのＰＢＳ透析ろ過緩衝液の添加（添加非イオン界面活性剤なし）は、保持液と透過液の濁度の上昇を生じた。

透過流の過剰な濁りは、孔の目詰まりおよび他のメカニズムを介して清澄化トレインにおけるフィルターのブラインディング／閉塞を引き起こすので好ましくない。ＰＢＳ緩衝液単独の添加は、該緩衝液が添加される時に、希釈による効果的な剪断保護剤濃度の減少を生じうる。それゆえ、細胞系統が剪断保護剤の非存在下の上昇した剪断レベルに曝露される。収集システムにおける剪断メカニズムを介する細胞分解は、プロセス流濁度の増加を引き起こしうる。

剪断保護剤として作用しうる非イオン界面活性剤（例、ＰＶＡもしくはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）を透析ろ過緩衝液に添加する有効性を表１に示す。これらの研究は、透析ろ過終了時の最終保持液濁度が８ないし３３ＮＴＵ／１０^６細胞であり、透過液では２．６ないし４．１ＮＴＵ／１０^６細胞であることを示す。剪断保護剤が透析ろ過緩衝液に添加された収集液は、保持液中で９．７ないし１０．１ＮＴＵ／１０^６細胞および透過液中で０．７ないし２．４ＮＴＵ／１０^６細胞の範囲の濁度であった。それゆえ、透析ろ過中における非イオン界面活性剤の存在と保持液濁度の減少の間には相関関係がある。透過液の濁度もまた減少する。

表１．精密ろ過開始時および終了時における細胞数、保持液遠心（ｓｐｕｎ）濁度（１０００ｒｐｍで５分間（約２０１ｘｇ））、ならびに透過液濁度。遠心濁度は細胞がプロセスサンプルから遠心された後の上澄み液の濁りの指標となる。

実施例２：ベンチスケールモデル
ベンチスケールモデル（ｂｅｎｃｈ−ｓｃａｌｅ ｍｏｄｅｌ）を用いて実験を行い、収集透析ろ過緩衝液に剪断保護剤を包含する有効性について調べた。該モデルは、細胞リザーバー（ｃｅｌｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）から構成されており、該リザーバーから細胞が精密ろ過タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＭＦＴＦＦ）装置を介して投入され、リザーバーに戻される。該リザーバーに透析ろ過緩衝液が添加されると同時に、上澄み液をＭＦＴＦＦ装置から除去し、一定容積の透析ろ過が実施されることを可能にする。緩衝液のみが異なる同一バイオリアクターおよび同一テスト条件に由来する各試験細胞を用いた。該緩衝液は、ＰＢＳ又は２．５ｇ／Ｌ濃度の剪断保護剤ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含むＰＢＳのどちらかであった。比濁分析法を用いて濁度を測定した。

一般的に、透過液の濁度は、透析ろ過緩衝液へのＰＶＡの包含を介して減少した。これは、透析ろ過前に開始細胞濃度に標準化した透過流濁度の測定により示される（表２、テスト１と２）。３番目のテスト（表２、テスト３）は、ＰＢＳとＰＢＳ／ＰＶＡ条件に対して透過液の濁度が大部分等価であり、顕著な有効性が少ないことを示す。

表２．ＰＢＳもしくはＰＶＡを含むＰＢＳを用いた細胞の透析ろ過

透析ろ過緩衝液中のＰＶＡ有無における生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存細胞消失の試験は、ＰＶＡを含む透析ろ過緩衝液の保護的な性質を明白に示す（表３を参照）。テスト３の細胞消失から発生した濁った物質がろ過装置の保持側に残留し、それが透過液濁度の顕著な増加に反映されることはないだろう。これは、透析ろ過開始時の生存細胞密度の増加する可能性が考えられ、例えば、さらなるケーク形成および／もしくは膜分極などを介するフィルターの保持機能を変化させ得るであろう。

全テストケース（テスト１−３）において、ＰＶＡ包含を介する生存細胞消失の最小化は、プロセス流のろ過特性の改善および孔の目詰まりメカニズムを介したフィルターブラインディングのリスクの減少を導く。

表３．表２のテスト１−３の透析ろ過前後における生存細胞密度

他の具体例
本発明はその詳細な説明とともに記載される一方で、以上の記載は例示を意図し、発明の範囲を限定せず、発明の範囲は特許請求の範囲で定められる。他の態様、効果、および変更は特許請求の範囲内である。

Claims (15)

1. 透析ろ過による培養細胞を含む細胞培養物からの生成物の収集方法であって、
   (a) 細胞培養物を収集して提供し、
   (b) 収集した細胞培養物の精密ろ過を実施して、保持液と、細胞を含まない透過液とを得、ここで該保持液は培養細胞と培地を含み、該透過液は細胞により産生された生成物を含むものであり、次に
   (c) 該保持液に非イオン界面活性剤を含む等張性の透析ろ過緩衝液を添加して該保持液の透析ろ過を行うステップを含み、ここで、非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン（160）ポリオキシプロピレン（30）グリコールまたはポリビニルアルコールであり、
   (d) 透析ろ過の保持液を前記細胞培養液に再循環するステップを含み、また、
   (e) 透析ろ過の透過液から更に生成物を精製するステップを含んでも良い、
   培養細胞を含む細胞培養物からの生成物の収集方法。
2. 該非イオン界面活性剤が緩衝液中にあり、緩衝液中の該非イオン界面活性剤の濃度が０．２ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、０．２ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２．５ｇ／Ｌの間、０．５ｇ／Ｌと２ｇ／Ｌの間、又は０．５ｇ／Ｌと１．５ｇ／Ｌの間である請求項１の方法。
3. 緩衝液中の該非イオン界面活性剤の濃度が、１ｇ／Ｌ又は２．５ｇ／Ｌである請求項１の方法。
4. 透析ろ過から生じるろ液の濁度が、非イオン界面活性剤の非存在下で行われる透析ろ過と比較して減少する請求項１の方法。
5. 該保持液からの産物の定性的又は定量的な回収が、非イオン界面活性剤の非存在下の産物の回収と比較して非イオン界面活性剤の存在下で増加する請求項１の方法。
6. 該保持液が医薬品を含む請求項１の方法。
7. 該保持液が組み換えタンパク質を含む請求項１の方法。
8. 該保持液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む請求項１の方法。
9. 透析ろ過の工程が２０℃〜２５℃、２℃〜３７℃、又は２℃〜２５℃の温度で行われる請求項１の方法。
10. 該透析ろ過が不連続な透析ろ過である請求項１の方法。
11. 該透析ろ過が一定容積の透析ろ過である請求項１の方法。
12. 該非イオン界面活性剤の濃度が透析ろ過中に変化しない請求項１の方法。
13. 該非イオン界面活性剤が細胞培養の培地中に存在する請求項１の方法。
14. 非イオン界面活性剤濃度を１ｇ／Ｌに維持する、請求項１２記載の方法。
15. 該非イオン界面活性剤がポリオキシエチレン（160）ポリオキシプロピレン（30）グリコールである請求項１４の方法。