CN109790549A - 生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体 - Google Patents

生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体 Download PDF

Info

Publication number
CN109790549A
CN109790549A CN201780045164.8A CN201780045164A CN109790549A CN 109790549 A CN109790549 A CN 109790549A CN 201780045164 A CN201780045164 A CN 201780045164A CN 109790549 A CN109790549 A CN 109790549A
Authority
CN
China
Prior art keywords
method described
raav
real
carrier granular
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780045164.8A
Other languages
English (en)
Inventor
曲光
约翰·弗雷泽·莱特
吴永勋
王玉环
张海波
劳拉·邓肯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Star Fire Treatment Co Ltd
Original Assignee
Star Fire Treatment Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Star Fire Treatment Co Ltd filed Critical Star Fire Treatment Co Ltd
Publication of CN109790549A publication Critical patent/CN109790549A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/14—Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases (3.4.14)
    • C12Y304/14009—Tripeptidyl-peptidase I (3.4.14.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Abstract

提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×1013)个载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。

Description

生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产 生的重组腺相关病毒(rAAV)载体
相关申请
本申请要求于2016年7月21日提交的美国临时专利申请No.62/365,312的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。
引言
切向流过滤(TFF)是生物技术工业中使用的技术，其通过超滤过程(UF)浓缩产物并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换以配制产物。然而，当TFF用于进行重组腺相关病毒(rAAV)载体的UF/DF时，在该过程中丢失了大量的rAAV载体。当rAAV载体高度浓缩时，甚至会丢失更多的载体。在UF/DF过程中损失的载体量使得几乎不可能制备高浓度的rAAV载体制备物，这在rAAV相关基因治疗产物的开发中是非常需要的。
在rAAV载体的制造中经常观察到的另一种现象是rAAV载体倾向于在UF/DF过程中聚集，特别是当载体制备物高度浓缩时，例如1E+13vg/ml(1×1013载体基因组/ml；vg：载体基因组)或更高。rAAV载体聚集似乎依赖于滴度，滴度越高，则载体聚集越多。载体聚集还导致制造期间的载体损失。此外，当在临床中使用时，聚集的载体是患者安全性的关注点。
在使用上述TFF技术的UF/DF过程中，rAAV载体聚集和载体丢失的问题代表了rAAV载体的制备和/或纯化中的重要过程挑战。本发明解决了这些问题。
发明内容
在许多不同的假设中，在使用TFF技术的UF/DF过程中的rAAV载体聚集和载体丢失可以是过程依赖性的和/或制剂依赖性的。基于这样的假设，设计了新的制剂并为UF/DF过程创建了新的操作参数，以改善载体回收率并减少、最小化或防止rAAV载体聚集。在用于UF/DF过程的发明配方和操作参数中，rAAV载体恢复得到改善并且rAAV载体聚集减少。本文公开的数据显示，单独或组合地为UF/DF过程创建的新制剂和操作参数使得从初始rAAV载体制备中回收的总体rAAV载体的显著增加。事实上，rAAV载体可以浓缩至5E+13vg/ml(5×1013载体基因组/ml)而没有显著的载体损失，并且载体主要是单体，从而表明聚集减少。
本文公开的发明制剂和/或操作参数将使rAAV载体能够浓缩至高浓度，例如高达5E+13(5×1013)载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。此外，本文公开的发明制剂和/或操作参数将改善来自缓冲液交换的rAAV载体回收或使用切向流过滤技术(TFF)浓缩载体。当需要高浓度的rAAV制备物时，本文公开的发明制剂和/或操作参数可以支持使用rAAV载体的任何基因疗法临床应用，例如用于溶酶体贮积病(例如神经元蜡样脂褐质沉积症2(CLN2))的rAAV介导的基因疗法，用于血液凝固缺陷(血友病A和血友病B)的rAAV介导的基因疗法等。通过使用TFF的超滤(UF)和渗滤(DF)过程的改进的载体回收也将降低rAAV载体制造的商品的成本，并且还提供更稳健和一致的rAAV载体或临床应用。
因此，本发明为rAAV制造过程提供了各种益处。在一实施方案中，rAAV载体回收增强，并且可以显著增强，从而从开始到结束提供改善的产量(例如，从开始到结束提供70％或更高的rAAV载体产量)。在另一实施方案中，减少、最小化或预防rAAV聚集，特别是当rAAV载体浓缩至高rAAV载体滴度时。在进一步的实施方案中，rAAV载体以高浓度(例如，至少以1E+12，5E+12，1E+13或5E+13vg/ml)产生，这适用于需要rAAV载体的高滴度和/或小给药量(例如注射或输注)的临床应用。在另外的实施方案中，本发明提供以下单独的或彼此任意组合实施方案、或与本文公开的其他实施方案的任何组合中的一种或多种：
(1)用于制造rAAV载体的高度可靠/一致的UF/DF过程，其可根据操作变化降低制造风险；
(2)从UF/DF过程中进行有效的rAAV载体回收，从而提供rAAV载体产量的总体增加(例如，从开始到结束的70％或更高的产量)；
(3)避免显著的rAAV载体丢失；
(4)减少、最小化或防止rAAV载体聚集(例如，通过诸如尺寸排阻色谱和/或动态光散射之类的技术无法检测到rAAV载体聚集)；
(5)允许将rAAV载体浓缩至高浓度，例如5E+13vg/ml，同时减少、最小化或很少或不能检测到rAAV载体聚集(通过诸如尺寸排阻色谱和/或动态光散射的技术)；和/或
(6)提供高效价的rAAV载体制备物，以在临床应用中实现小体积给药。
附图说明
图1显示了在TFF过程中剪切速率的增加如何显著改善rAAV载体回收率。首先使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)。对于一个渗滤循环，将25mL渗滤缓冲液加入到50mL稀释的载体中，然后开始渗滤直至体积减少至50mL。渗滤步骤重复24次。在25个循环的渗滤过程后，将载体超滤至5mL。收集5mL载体用于测定。(A)qPCR分析显示，当在TFF过程中使用较高的剪切速率(约10,000秒-1(sec-1))时，载体滴度为4.81E+13vg/mL，这表明载体回收率超过90％；在低剪切速率(约3000sec-1)下达到1.38E+13vg/mL，这表示约30％的载体回收率。(B)动态光散射(DLS)分析表明，来自较高剪切速率(约10,000sec-1)或低剪切速率(约3000sec-1)的载体直径是相似的。
图2显示了跨膜压(TMP)如何影响来自TFF过程的rAAV恢复。首先使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)并开始DF过程，对于每个渗滤循环，添加25mL渗滤缓冲液至50mL稀释的载体，并将体积减少至50ml。渗滤步骤进行25次以实现充分的缓冲液交换。然后将载体超滤至5mL。Q-PCR分析(A)显示，当使用TMP(约10.5psig)时，载体滴度为3.43E+13vg/mL，并且在较高TMP(约15.5psig)下滴度为2.90E+13vg/mL。DLS分析显示，对于低TMP(约10psig)和相对高的TMP(约15.5psig)，载体制备物的直径分别为29.07nm和38.2nm。较大直径代表制备物中更多聚集的rAAV载体。
图3显示了指示在UF/DF过程后没有循环的载体的收集避免了载体制备中聚集的rAAV颗粒的回收的数据。使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)并使其经历UF/DF过程。通过直接排出浓缩的载体(推出)或通过在几分钟的闭合循环(cyculation)(循环)后排出浓缩的载体，以低于UF/DF流速收集载体。Q-PCR分析(A)显示载体滴度与两种不同的载体回收方法相似。然而，DLS分析(B)显示，在循环制备中载体的直径显著更大，这表明更多聚集的rAAV载体。
图4显示了指示稀释低滴度载体(约5E+12vg/mL)通过UF/DF过程显著减少载体聚集的数据。将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)直接渗滤或首先使用渗滤缓冲液稀释，然后渗滤25个循环。在渗滤过程之后，将两种渗滤的载体都超滤至5mL。DLS分析显示，在没有稀释的情况下从渗滤过程中回收的载体(左侧柱)的直径显著大于在稀释的情况下的载体(右侧柱)的直径。
图5显示了指示Pluronic F-68减少、最小化或防止rAAV载体形成较大颗粒(即聚集体)的数据。作为模型病毒颗粒的在CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1空颗粒最初用含有pluronic F-68(称为缓冲液1)或不含pluronic F-68(称为缓冲液2)的渗滤缓冲液稀释。然后在每个循环中用稀释缓冲液1或缓冲液2将稀释的空颗粒渗滤25个循环。在渗滤过程之后将空颗粒超滤至5mL。收集5mL空颗粒用于测定。(A)DLS分析显示，具有pluronic F-68的情况下(右侧柱)的空颗粒的平均计数(kcps)显著高于没有pluronic F-68的情况下(左侧柱)的空颗粒的平均计数，这表明在存在pluronic F-68的情况下实现了更好的恢复。(B)在没有pluronic F-68(左侧柱)的情况下的空颗粒的直径大于在具有pluronic F-68的情况下(左侧柱)的空颗粒的直径。
具体实施方式
切向流过滤是广泛使用的技术，用于对生物产品进行缓冲液交换(渗滤，DF)和浓缩(超滤，UF)。然而，当TFF技术用于rAAV载体缓冲液交换和最终制剂时，发现在UF/DF过程中损失了大量载体。通常需要高rAAV载体滴度/浓度来治疗某些人类疾病。然而，UF/DF的当前的制剂和操作参数不能产生达到所需浓度的rAAV载体，例如1E+13vg/ml或更高的载体滴度。另外，当浓缩至1E+13vg/ml或更高的水平时，rAAV载体倾向于聚集。
为了克服制造高滴度rAAV载体的这些实质性技术限制，在本发明中，产生了用于rAAV载体的TFF过程的新制剂。另外，在本发明中，创建了用于TFF过程的新的操作参数。当新开发的制剂用于新创建的TFF过程(使用新开发的参数)以经历最终的UF/DF过程来配制rAAV载体制备物时，发现rAAV载体回收率显著提高并且rAAV载体仍然是单体。特别地，使用新的TFF制剂与新的TFF操作技术结合时，rAAV载体被浓缩而没有实质的rAAV载体聚集，即使浓缩至5E+13vg/ml也是如此。此外，rAAV载体回收率(总产量)显著提高。
本发明提供了能够将rAAV载体产物浓缩至高浓度而没有可检测到的rAAV载体聚集(高达5E+13vg/ml而没有可检测到的rAAV聚集)的解决方案。本发明还提供了一种使用TFF技术对rAAV载体进行UF/DF过程而不会丢失大量载体的解决方案，例如，从UF/DF过程中回收的rAAV载体从开始到结束在70％至最高95％的范围内。本发明使TFF成为rAAV制造工艺的有效技术，特别是当要制造浓缩的rAAV载体时。
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)或可通过插入或并入核酸操纵的其它载体。此类载体可用于基因操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，并在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。“表达载体”是一种专用载体，其包含具有宿主细胞中的表达所需的必要调节区的基因或核酸序列。载体核酸序列通常至少包含用于在细胞中增殖的复制起点以及任选的附加元件，诸如转基因、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR、聚腺苷酸化信号。
病毒载体来源于或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。具体的病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体。
作为载体的修饰语，诸如重组病毒，例如细小病毒(例如rAAV)载体，以及作为序列的修饰语，诸如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组载体例如rAAV载体的具体示例将是通常在野生型病毒(例如AAV)基因组中不存在的多核苷酸插入病毒基因组中的情况。尽管在本文提及载体，诸如AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，并不总是使用术语“重组”，但重组形式明确地被包括，尽管存在任何此类省略。
通过使用分子方法从病毒(例如AAV)中移除野生型基因组，并用非天然核酸取代，由病毒(诸如AAV)的野生型基因组衍生重组病毒“载体”或“rAAV载体”。通常，对于AAV而言，AAV基因组中的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在rAAV载体中。“重组”病毒载体(例如，rAAV)区别于病毒(例如AAV)基因组，因为病毒基因组的全部或一部分已用关于病毒(例如AAV)的基因组核酸的非天然序列取代。因此，并入非天然序列将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，其在AAV的情况下可被称为“rAAV载体”。
可以包装重组载体序列-本文中称为“颗粒”以用于后续体外、试管内或体内感染(转导)细胞的。在将重组载体序列壳体化或包装成AAV颗粒的情况下，该颗粒也可称为“rAAV”。此类颗粒包括壳体化或包装载体基因组的蛋白。具体的示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下为衣壳蛋白。
载体“基因组”或为方便而缩写的“vg”指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成病毒(例如rAAV)颗粒。在使用重组质粒构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包含不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增而言是重要的，这是繁殖和重组AAV载体生产所需的过程，但其本身不被包装或衣壳化成病毒(例如AAV)颗粒。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如AAV)包装或衣壳化的核酸。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，以指称所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如变体核酸)。多核苷酸可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论多核苷酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
本文使用“转基因”以方便地表示旨在或已被引入细胞或生物体的核酸或多核苷酸。转基因包括任何核酸，诸如编码多肽或蛋白的基因。
由“核酸”或“多核苷酸”序列”或“转基因”编码的“多肽”、“蛋白”或“肽”包括全长天然序列，如天然存在的野生型蛋白，以及功能性序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留一定程度的天然全长蛋白的功能性即可。此类由核酸序列编码的多肽、蛋白和肽可以与但不要求与内源蛋白相同，所述内源蛋白是缺陷的，或其在经处理哺乳动物表达不充分或不足。
重组AAV载体包括任何病毒株或血清型。举非限制性示例而言，rAAV载体可基于任何AAV基因组或AAV衣壳，诸如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8。此类载体可基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)，或者彼此不同。举非限制性示例而言，基于一种血清型基因组的重组AAV载体可与包装载体的ITR或衣壳蛋白中的一种或多种相同。此外，重组AAV载体基因组可基于不同于包装载体的AAV ITR或衣壳蛋白中的一种或多种的AAV(例如AAV2)血清型基因组。例如，AAV载体基因组可以基于AAV2，然而三种衣壳蛋白中的至少一种可以为例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8或其变体。
在具体实施方案中，rAAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8、及其变体(例如，ITR和衣壳变体，诸如氨基酸插入、添加、取代和缺失)，例如如WO 2013/158879(国际专利申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际专利申请PCT/US2014/047670)和US 2013/0059732(美国申请13/594,773，其公开了LK01、LK02、LK03等)中所示的。
AAV变体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8ITR和衣壳的变体和嵌合体。因此，包含了AAV载体和AAV变体(例如，ITR和衣壳变体)。
在各种示例性实施方案中，与参考血清型相关的AAV载体具有包括与一个或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8(例如ITR，或VP1,VP2,和/或VP3序列)至少80％或更多(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同的序列或由组成的多核苷酸(例如ITR)、或多肽(例如衣壳)。
如本文所使用的，短语“真正的AAV载体”或“真正的rAAV载体”是指包含能够感染靶细胞的目的转基因的AAV载体。该短语不包括空AAV载体(不存在转基因)，以及缺乏完整插入物的AAV载体(例如转基因片段)或含有宿主细胞核酸的那些AAV载体。
术语“分离的”当用于组合物的改性剂时是指组合物通过人工制备和/或完全或至少部分地从其天然存在的体内环境分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种它们通常与其天然结合的物质，例如，一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。例如，“分离的核酸”可包含插入载体中的DNA或cDNA分子，例如rAAV载体。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献、基因库(GenBank)引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起控制作用。
上文并且整个说明书和权利要求书中使用了涉及本发明的生物分子的各种术语。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似用途的替代的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构是具有等同或相似特征结构的示例。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及的“核酸”包括多种此类核酸，提及“载体”包括多种此类载体，并且提及“病毒”或“颗粒”包括多种此类病毒/颗粒。
如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值和整数的分数，以及此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此提及1-50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的边界的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如范围1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850，包括范围1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等。
本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1，可以解释rAAV载体损失和/或聚集的许多假设之一是凝胶层可以在非优化的UF/DF过程中在TFF装置中建立，这可能是rAAV载体损失的原因。这种凝胶层构建的假设也可以解释当rAAV载体浓缩至高浓度时更多rAAV载体丢失的现象，因为当载体更加浓缩时，可以建立更紧凑的(severe)凝胶层。凝胶层构建也可能引起rAAV聚集，这种现象在UF/DF过程中经常观察到，特别是当rAAV载体浓缩至高浓度时。
实施例2，除了TFF操作参数之外，许多假设之一是，对于当前UF/DF过程中使用的大多数溶液/缓冲液，制剂可在减少凝胶层和防止rAAV聚集中起重要作用，缓冲液/溶液中使用的化学物质是盐，以及化学物质控制pH值。如果通过该过程在UF/DF溶液中使用表面活性剂，则其可以减少rAAV载体之间的结合以及rAAV载体和UF/DF装置表面之间的结合。这反过来可以通过UF/DF过程减少或防止rAAV载体的凝胶层。此外，表面活性剂可以通过在经历UF/DF过程时减少或防止疏水相互作用进一步减少rAAV结合，从而减少、最小化或防止rAAV聚集。进一步的假设是在UF/DF过程中增加剪切速率和控制跨膜压力(TMP)可以减少凝胶层的构建。基于所有这些假设，进行了一系列研究，这些研究产生了本文公开的特定发明制剂和操作参数。
实施例3，根据本发明，新的UF/DF操作参数减少、最小化或防止rAAV聚集并提高rAAV载体的回收率(总产量)，这在需要高滴度的rAAV载体制剂时特别相关。第一个操作参数是以低rAAV滴度开始UF/DF过程，特别是例如，在UF/DF步骤之前的CsCl梯度离心中，当rAAV载体制剂含有高浓度的rAABV时。使用在pH7.3下产生的含有10mM的磷酸钠、180mM的NaCl和0.001％的pluronic F-68的渗滤缓冲液将CsCl中的高度浓缩的rAAV首先稀释至5E+12vg/ml的滴度或低于5E+12vg/ml的滴度。使用创建的渗滤缓冲液以剪切速率为约8,000sec-1或更高的流速操作DF工艺。完成渗滤过程以实现有效的缓冲液交换，然后启动UF过程以将rAAV载体浓缩至所需的滴度。
在新产生的UF/DF制剂中具有的一种组分是Pluronic F-68，其获得高滴度的rAAV制备物。尽管不希望受理论束缚，但相信这种新制剂(渗滤缓冲液)减少了凝胶层的形成。
当在UF/DF过程中新制剂与新操作参数组合时，将rAAV载体浓缩至5E+13vg/ml，而没有可检测到的载体聚集。此外，rAAV载体回收率很高，通常在70％或更高的水平。

Claims (52)

1.一种以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获包含rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液；
(b)任选地通过切向流过滤任选地浓缩在步骤(a)中收获的所述细胞和/或所述细胞培养物上清液，以产生浓缩的收获物；
(c)任选地通过微流化裂解在步骤(a)中产生的所述收获物或在步骤(b)中产生的所述浓缩收获物以产生裂解物；
(d)过滤步骤(c)中产生的所述裂解物以产生澄清的裂解物；
(e)将步骤(d)中产生的所述澄清的裂解物进行离子交换柱层析，以产生包含纯化的rAAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以产生浓缩的柱洗脱液；
(f)将在步骤(e)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液与氯化铯混合以产生混合物，并使所述混合物进行梯度超速离心以基本上从空衣壳AAV颗粒和其他AAV载体相关杂质分离出真正的rAAV载体颗粒；
(g)(1)收集在步骤(f)中分离的所述真正的rAAV载体颗粒，以及(g)(2)在具有非离子表面活性剂的缓冲液中配制所收集的所述真正的rAAV载体颗粒；
(h)将步骤(g)(2)中的所述真正的rAAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换以产生AAV载体制剂；以及
(i)过滤步骤(h)中产生的所述AAV载体制剂，从而以高回收率或高滴度产生真正的rAAV载体颗粒制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲剂包含氯化钠和/或磷酸钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约10mM至浓度为约500mM的氯化钠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约5mM至浓度为约50mM的磷酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括聚亚烷基二醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含至少一个聚乙二醇嵌段和至少一个聚丙二醇嵌段。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括烷基多糖苷，十六十八醇，十六醇，椰油酰胺DEA，椰油酰胺MEA，癸基葡糖苷，乙氧基化物，IGEPALCA-630，Isoceteth-20，葡萄糖苷，麦芽糖苷，甘油一月桂酸酯，乙基苯基聚乙二醇(nonidetP-40)，壬基酚聚醚(nonoxynols)，如壬基酚聚醚-9，NP-40，八乙二醇单十二烷基醚，N-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷，辛基葡糖苷，油醇，PEG-10向日葵甘油酯，五乙二醇单十二烷基醚，泊洛沙姆，如泊洛沙姆407，泊洛沙姆188(聚(环氧乙烷-共-聚环氧丙烷))，聚甘油聚蓖麻油酸酯，脱水山梨糖醇，硬脂醇，Triton X-100和吐温80。
8.根据权利要求7的方法，其中所述乙氧基化物包括乙氧基化脂肪酸、醇乙氧基化物、三苯乙烯基苯酚乙氧基化物或乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
9.根据权利要求7的方法，其中所述脱水山梨糖醇包括脱水山梨糖醇单硬脂酸酯或脱水山梨糖醇三硬脂酸酯。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括西土马哥(cetomacrogol 1000)，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)，聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)，聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)，聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)；聚甘油聚蓖麻油酸酯，十八烷酸[2-[(2R,3S,4R)-3,4-二羟基-2-四氢呋喃基]-2-羟乙基]酯，十八烷酸[(2R,3S,4R)-2-[1,2-双(1-氧代十八烷氧基)乙基]-4-羟基-3-四氢呋喃基]酯；C8至C22长链醇，如1-十八烷醇，十六烷硬脂醇，十六烷-1-醇和顺式-9-十八烯-1-醇；经取代或未经取代的辛基酚，其中取代基能包括聚乙氧基乙醇基团(例如，以形成辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)或将与辛基酚形成非离子表面活性剂的任何其它取代基；聚乙二醇单异十六烷基醚；十二烷酸2,3-二羟丙基酯；葡糖苷能包括月桂基葡糖苷，辛基葡糖苷和癸基葡糖苷；脂肪酸酰胺，如椰油酰胺二乙醇胺和椰油酰胺单乙醇胺；以及具有亲水性聚环氧乙烷链和芳香烃亲油或亲水基团的非离子表面活性剂，如壬基酚聚醚-9和Triton X-100。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇或由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成的三嵌段共聚物，该中心链侧接两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇或三嵌段共聚物包含SYNPERONIC F108(Aldrich)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂具有约0.0001％的浓度至约0.1％的浓度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂具有约0.0001％的浓度至约0.01％的浓度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒以约1015个颗粒/mL的浓度至约1018个真正的rAAV载体颗粒/mL的浓度存在于步骤(i)中产生的所述制剂中。
16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约5×1012个真正的rAAV载体颗粒/ml。
17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约1×1013个真正的rAAV载体颗粒/ml。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约5×1013个真正的rAAV载体颗粒/ml。
19.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的回收率是步骤(a)的总rAAV载体颗粒的至少约60％。
20.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的回收率是步骤(a)的总rAAV载体颗粒的至少约70％。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒衍生自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和Rh74的AAV。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV颗粒包含编码抑制性核酸的转基因。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抑制性核酸选自siRNA、反义分子、miRNA、核酶和shRNA。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒包含编码用于校正天然存在的代谢错误的蛋白的转基因，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述蛋白是因子VIII或因子IX。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒包含编码能用于矫正神经变性疾病的蛋白的转基因。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白是三肽基肽酶1(TPP1)。
30.根据权利要求1所述的方法，其包括在步骤(f)中分别收集所述空衣壳颗粒。
31.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液中的所述真正的rAAV载体颗粒的纯度为至少约80％。
32.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液中的所述真正的rAAV载体颗粒的纯度为至少约90％。
33.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液中的所述真正的rAAV载体颗粒的纯度为至少约95％。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述空衣壳颗粒以10％或更少的量存在于步骤(i)的所述滤液中。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述空衣壳颗粒以5％或更少的量存在于步骤(i)的所述滤液中。
36.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液含有不大于约10％的聚集的rAAV颗粒。
37.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液含有不大于约5％的聚集的rAAV颗粒。
38.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液含有少于约3％的聚集的rAAV颗粒。
39.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述滤液含有约1-3％的聚集的rAAV颗粒。
40.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的所述离心在单一步骤中进行。
41.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的所述离心是密度梯度超速离心。
42.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中的所述柱洗脱液通过切向流过滤浓缩，以产生浓缩的柱洗脱液。
43.根据权利要求1所述的方法，其还包括将核酸酶添加到步骤(c)中产生的裂解物中。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法产生具有比在通过步骤(h)的切向流过滤进行缓冲液交换后将非离子表面活性剂加入到AAV载体制剂中的情况下产生的rAAV载体颗粒的回收率大的回收率的rAAV载体颗粒。
45.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法产生具有比在通过步骤(h)的切向流过滤进行缓冲液交换后将非离子表面活性剂加入到AAV载体制剂中的情况下产生的rAAV载体颗粒的滴度高的滴度的rAAV载体颗粒。
46.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，在步骤(g)(2)之前、与步骤(g)(2)基本上同时或在步骤(g)(2)之后，将步骤(g)(1)的所收集的所述真正的rAAV载体颗粒稀释至小于约5×1012个rAAV载体颗粒/ml的浓度。
47.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的切向流过滤在约2psig-15psig之间的跨膜压强下进行。
48.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的所述切向流过滤在约4psig-12psig之间的跨膜压强下进行。
49.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的所述切向流过滤在大于约3000sec-1的剪切速率下进行。
50.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的所述切向流过滤在大于约5000sec-1的剪切速率下进行。
51.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的所述切向流过滤在约5000-15,000sec-1之间的剪切速率下进行。
52.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(e)和/或(h)的所述切向流过滤在约8,000-12,000sec-1之间的剪切速率下进行。
CN201780045164.8A 2016-07-21 2017-07-21 生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体 Pending CN109790549A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662365312P 2016-07-21 2016-07-21
US62/365,312 2016-07-21
PCT/US2017/043291 WO2018017956A2 (en) 2016-07-21 2017-07-21 Scalable high recovery methods for producing high yield recombinant adeno-associated viral (raav) vector and recombinant adeno-associated viral (raav) vectors produced thereby

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109790549A true CN109790549A (zh) 2019-05-21

Family

ID=60992897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780045164.8A Pending CN109790549A (zh) 2016-07-21 2017-07-21 生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20190284576A1 (zh)
EP (1) EP3488007B1 (zh)
JP (1) JP7153009B2 (zh)
KR (2) KR20190045174A (zh)
CN (1) CN109790549A (zh)
AU (1) AU2017299779B2 (zh)
BR (1) BR112019001146A2 (zh)
CA (1) CA3031095A1 (zh)
DK (1) DK3488007T3 (zh)
FI (1) FI3488007T3 (zh)
IL (2) IL301963A (zh)
MX (1) MX2019000882A (zh)
MY (1) MY194198A (zh)
PT (1) PT3488007T (zh)
RU (1) RU2768045C2 (zh)
SG (1) SG11201900366QA (zh)
WO (1) WO2018017956A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499287A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3356390T3 (pl) 2015-09-28 2021-07-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Sposoby i kompozycje dla wektorów wirusowych unikających przeciwciał
JP2019530737A (ja) 2016-08-23 2019-10-24 アコーオス インコーポレイテッド ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法
JP7406677B2 (ja) 2018-04-03 2023-12-28 ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド 抗体を回避するウイルスベクター
CA3157700A1 (en) 2019-10-17 2021-04-22 Stridebio, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of niemann-pick disease type c
KR102167829B1 (ko) * 2020-02-10 2020-10-20 주식회사 이노테라피 아데노연관바이러스용 안정화제 및 이를 이용한 아데노연관바이러스의 안정화 방법
AU2021225035A1 (en) 2020-02-21 2022-10-13 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
WO2023085382A1 (ja) * 2021-11-12 2023-05-19 Ａｇｃ株式会社 ウイルスの精製方法
JP2023141423A (ja) * 2022-03-24 2023-10-05 国立大学法人 東京大学 ウイルスの精製方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101107022A (zh) * 2005-01-25 2008-01-16 惠氏研究爱尔兰有限公司 用于渗滤的方法
CN102947453A (zh) * 2010-01-28 2013-02-27 费城儿童医院 用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体
CN103189507A (zh) * 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经系统细胞导入基因的腺相关病毒粒子

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0511764B8 (pt) * 2004-06-01 2021-05-25 Avigen Inc método de prevenção de agregação de vírions de vírus adeno-associado recombinante (raav) em uma preparação purificada de virions raav
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
CN102257134B (zh) * 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
RU2015103990A (ru) * 2008-09-24 2015-10-27 Медиммун, Ллк Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов
LT2970948T (lt) * 2013-03-15 2019-03-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna gryninimo būdai
EP3054007A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101107022A (zh) * 2005-01-25 2008-01-16 惠氏研究爱尔兰有限公司 用于渗滤的方法
CN102947453A (zh) * 2010-01-28 2013-02-27 费城儿童医院 用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体
CN103189507A (zh) * 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经系统细胞导入基因的腺相关病毒粒子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIRK GRIMM ET AL.: "Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors", 《HUMAN GENE THERAPY》 *
伍志坚等: "一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统", 《中国科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499287A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
CN110499287B (zh) * 2019-08-30 2021-07-23 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3031095A1 (en) 2018-01-25
WO2018017956A2 (en) 2018-01-25
BR112019001146A2 (pt) 2019-04-30
SG11201900366QA (en) 2019-02-27
RU2019104759A (ru) 2020-08-21
JP7153009B2 (ja) 2022-10-13
PT3488007T (pt) 2024-03-14
MY194198A (en) 2022-11-21
RU2019104759A3 (zh) 2020-11-17
WO2018017956A3 (en) 2018-03-08
FI3488007T3 (fi) 2024-03-19
IL301963A (en) 2023-06-01
AU2017299779B2 (en) 2021-12-02
JP2019524101A (ja) 2019-09-05
US20190284576A1 (en) 2019-09-19
RU2768045C2 (ru) 2022-03-23
AU2017299779A1 (en) 2019-01-31
IL264270A (en) 2019-02-28
DK3488007T3 (da) 2024-02-19
KR20220162834A (ko) 2022-12-08
MX2019000882A (es) 2019-08-12
EP3488007A4 (en) 2020-01-01
EP3488007A2 (en) 2019-05-29
KR20190045174A (ko) 2019-05-02
EP3488007B1 (en) 2023-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109790549A (zh) 生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体
JP6991095B2 (ja) ウイルスベクター精製における拡張可能な製造プラットフォームおよび遺伝子治療における使用のための高純度ウイルスベクター
US20210079422A1 (en) Aav vector column purification methods
US11702639B2 (en) Column-based fully scalable rAAV manufacturing process
CA3221540A1 (en) Aav vector column purification methods
RU2772876C2 (ru) Колоночные способы очистки вектора на основе aav
CN117794629A (zh) Aav载体的柱纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination