KR20190045174A - 재조합 아데노신 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 고수율로 생산하기 위한 확장 가능한 고회수 방법 및 이에 의해 생산된 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 - Google Patents

재조합 아데노신 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 고수율로 생산하기 위한 확장 가능한 고회수 방법 및 이에 의해 생산된 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 Download PDF

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Abstract

고회수 또는 고역가로 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 입자를 생산하는 방법이 제공된다. 또한, rAAV 벡터를 임의의 rAAV 응집체가 거의 없이 고농도로, 예를 들어 밀리미터당 5E+13(5x1013) 벡터 유전체(Vg/ml) 이하로 농축시키는 방법이 제공된다.

Description

재조합 아데노신 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 고수율로 생산하기 위한 확장 가능한 고회수 방법 및 이에 의해 생산된 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터
관련 출원
본 출원은 2016년 7월 21일자로 출원된 미국 가특허출원 62/365,312호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 본문, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여, 본원에 참조로서 포함된다.
도입
접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)(TFF)는 생물공학 산업에서 한외여과 공정(ultrafiltration process)(UF)을 통해 생성물을 농축하기 위해, 그리고, 생성물을 제형화하기 위한 투석여과(diafiltration)(DF)를 통한 완충액 교환에 사용되는 기술이다. 그러나, TFF가 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 위한 UF/DF를 수행하기 위해 사용되는 경우, 공정 중에 상당량의 rAAV 벡터가 손실된다. rAAV 벡터가 매우 농축되어 있다면, 훨씬 더 많은 벡터가 손실될 것이다. UF/DF 공정에서 벡터 손실량은 rAAV 관련 유전자 치료 제품 개발에 매우 요망되는 고농도 rAAV 벡터 조제물을 만드는 것을 거의 불가능하게 만든다.
rAAV 벡터의 제조시 종종 관찰되는 다른 현상은, 특히 벡터의 조제물이 ml 당 1E+13 vg(1x1013 벡터 유전체/ml; vg: 벡터 유전체) 이상과 같이 매우 농축되어 있는 경우, rAAV 벡터가 UF/DF 공정에서 응집되는 경향이 있다는 것이다. rAAV 벡터 응집은 역가 의존성이고, 역가가 높을 수록 벡터 응집이 더 많은 것으로 보인다. 벡터 응집은 또한 제조 중에 벡터 손실을 초래한다. 또한, 응집된 벡터는 병원에서 사용되는 경우 환자 안전에 대한 우려가 있다.
상기 기술된 TFF 기술을 사용하는 UF/DF 공정에서 rAAV 벡터 응집 및 벡터 손실에 의한 문제점은 rAAV 벡터의 제조 및/또는 정제에서 상당한 공정상 어려움을 나타낸다. 본 발명은 본원에서 이러한 문제점들을 해결한다.
요약
다수의 여러 가설들 중에서, TFF 기술을 사용하는 UF/DF 공정에서의 rAAV 벡터 응집 및 벡터 손실은 공정 의존적 및/또는 제형 의존적일 수 있다. 이러한 가설에 기초하여, 벡터 회수를 향상시키고, rAAV 벡터의 응집을 감소시키거나 최소화하거나 방지하기 위해 UF/DF 공정에 대한 신규 제형이 설계되었고, 신규 조작 파라미터가 생성되었다. UF/DF 공정에 대한 본 발명의 제형 및 조작 파라미터에서, rAAV 벡터 회수가 향상되고, rAAV 벡터 응집은 감소되었다. 본원에서 기술된 데이터는 UF/DF 공정에 대해 생성된 신규 제형 및 조작 파라미터가 단독으로 또는 조합하여, 초기 rAAV 벡터 제조물로부터 회수되는 전체 rAAV 벡터를 상당히 증가시킴을 보여준다. 실제로, rAAV 벡터는 유의한 벡터 손실 없이 5E+13 vg/ml(5x1013 개의 벡터 유전체/ml)로 농축될 수 있으며, 벡터는 주로 모노머이고, 이는 응집의 감소를 나타낸다.
본원에 기술된 본 발명의 제형 및/또는 조작 파라미터는 rAAV 벡터의 농도를 고농도, 예를 들어, rAAV 응집체가 거의 존재하지 않는 밀리리터 당 5E+13(5x1013) 벡터 유전체(Vg/ml)가 되게 할 것이다. 또한, 본원에 기술된 본 발명의 제형 및/또는 조작 파라미터는 접선 유동 여과 기술(TFF)을 사용하여 완충액 교환으로부터 rAAV 벡터 회수를 향상시키거나 벡터를 농축시킬 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 제형 및/또는 조작 파라미터는 고농도의 rAAV 제조물이 요망되는 경우, 신경 세로이드-리포푸신증 2(Neuronal Ceroid-Lipofuscinosis 2)(CLN2)와 같은 리소좀성 저장 질환을 위한 rAAV 매개된 유전자 치료, 혈액 응고 결함(혈우병 A 및 혈우병 B)에 대한 rAAV 매개 유전자 치료 등과 같은, rAAV 벡터를 사용하는 임의의 유전자 치료 임상 적용을 지원할 수 있다. TFF를 사용하는 한외여과(UF) 및 투석여과(diafiltration)(DF) 공정을 통한 향상된 벡터 회수는 또한 rAAV 벡터 제조 상품의 비용을 감소시킬 것이고, 또한 보다 강력하고 일관성있는 rAAV 벡터 또는 임상 응용 적용을 제공할 것이다.
따라서, 본 발명은 rAAV 제조 공정에 대한 여러 이점을 제공한다. 일 구체예에서, rAAV 벡터 회수가 향상되고, 현저히 향상될 수 있음으로써 시작부터 끝까지의 수율(예를 들어, 시작부터 끝까지 70% 이상의 rAAV 벡터 수율)을 향상시킨다. 다른 구체예에서, rAAV 응집이 특히 rAAV 벡터가 고 rAAV 벡터 역가로 농축되는 경우, 감소되거나, 최소화되거나, 방지된다. 추가의 구체예에서, rAAV 벡터는 rAAV 벡터의 고역가 및/또는 소량의 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)가 요구되는 임상 적용에 적합한, 고농도로(예를 들어, 적어도 1E+12, 5E+12, 1E+13, 또는 5E+13 vg/ml로) 생산된다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 단독으로, 또는 서로 임의의 조합으로, 또는 본원에 기술된 다른 구체예와의 임의의 조합으로 하기 중 하나 이상을 제공한다:
(1) 조작 변동성에 기초하여 제조 위험을 줄일 수 있는 rAAV 벡터를 제조하기 위한 매우 신뢰성있고 일관된 UF/DF 공정;
(2) rAAV 벡터 수율에서의 전체적인 증가(예를 들어, 시작부터 끝까지 70% 이상)를 제공하는, UF/DF 공정으로부터 효율적인 rAAV 벡터 회수;
(3) 유의한 rAAV 벡터 손실을 피함;
(4) rAAV 벡터 응집을 감소시키거나, 최소화하거나, 방지함(예를 들어, rAAV 벡터 응집이 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 동적 광산란과 같은 기술에 의해 검출할 수 없음)
(5) 감소되거나, 최소화되거나, 거의 또는 전혀 검출할 수 없는 rAAV 벡터 응집(크기 배제 크로마토그래피 및/또는 동적 광산란과 같은 기술에 의해)으로 rAAV 벡터의 농도를 고농도, 예를 들어 5E+13 vg/ml로 가능하게 함; 및/또는
(6) 임상 적용에서 소량 투여를 가능하게 하는 고역가의 rAAV 벡터 제조물을 제공함.
도 1은 TFF 공정 동안 전단 속도의 증가가 어떻게 rAAV 벡터 회수를 상당히 향상시켰는지를 나타낸다. CsCl 초원심분리 후의 AAV2-hTPP1v1 벡터(2.5E+14 vg)를 투석여과 완충액을 사용하여 50mL(5.0E+12 vg/mL)로 초기에 희석하였다. 투석여과의 한 사이클 동안, 25 mL 투석여과 완충액을 50 mL 희석된 벡터에 첨가한 후, 부피가 50 mL로 감소할 때까지 투석여과를 시작하였다. 투석여과 단계를 24회 반복하였다. 벡터를 투석여과 공정의 25회 사이클에 이어 5mL로 한외 여과시켰다. 5 mL 벡터를 검정을 위해 수집하였다. (A) qPCR 분석은, 보다 높은 전단 속도(~10,000 s- 1)가 TFF 공정 중에 사용된 경우 벡터 역가는 4.81E+13 vg/mL임을 나타냈으며, 이는 벡터 회수가 90% 초과임을 시사하고, 1.38E+13 vg/mL는 낮은 전단 속도(약 3000 s- 1)에서 달성되어 약 30%의 벡터 회수를 나타냈다. (B) 동적 광산란(DLS) 분석은 보다 높은 전단 속도(~ 10,000 s-1) 또는 낮은 전단 속도(~ 3000 s-1)로부터의 벡터 직경이 유사함을 나타냈다.
도 2는 막투과 압력(Trans-Membrane Pressure)(TMP)이 어떻게 TFF 공정으로부터 rAAV 회수에 영향을 미치는 지를 나타낸다. CsCl 초원심분리 후의 AAV2-hTPP1v1 벡터(2.5E+14 vg)를 투석여과 완충액을 사용하여 초기에 50 mL(5.0E+12 vg/mL)로 희석하고, DF 공정을 시작하고, 각각의 투석여과 사이클에 대해, 25 mL 투석여과 완충액을 50 mL 희석된 벡터에 첨가하고, 부피를 50 ml로 감소시켰다. 투석여과 단계를 25회 수행하여 충분한 완충액 교환을 달성하였다. 이후, 벡터를 5 mL로 한외여과시켰다. Q-PCR 분석(A)은 TMP(~10.5 psig)가 사용된 경우 벡터 역가가 3.43E+13 vg/mL이고, 보다 높은 TMP(~15.5 psig)에서 역가가 2.90E+13 vg/mL임을 나타냈다. DLS 분석은 벡터 조제물의 직경이 낮은 TMP(~10 psig) 및 비교적 높은 TMP(~15.5 psig) 각각에 대해 29.07 nm 및 38,2 nm임을 나타냈다. 보다 큰 직경은 제조시 보다 많이 응집된 rAAV 벡터를 나타낸다.
도 3은 UF/DF 공정 후 순환 없이 이루어진 벡터 수집이 벡터 제조시 응집된 rAAV 입자의 회수를 피함을 시사하는 데이터를 나타낸다. CsCl 초원심분리 후의 AAV2-hTPP1v1 벡터(2.5E+14 vg)를 투석여과 완충액을 사용하여 50 mL(5.0E+12 vg/mL)로 희석하고, UF/DF 공정을 거쳤다. 농축된 벡터를 직접 배출시킴으로써(푸쉬-아웃(push-out)) 또는 UF/DF 유속보다 낮게 하여, 수분의 사이큘레이션(cyculation)(순환) 후 농축된 벡터를 배출함으로써 벡터를 수집하였다. Q-PCR 분석(A)은 벡터 역가가 두 개의 상이한 벡터 회수 방법과 유사함을 나타냈다. 그러나, DLS 분석(B)은 벡터의 직경이 순환 제조시보다 현저히 더 큼을 나타냈으며, 이는 rAAV 벡터가 보다 많이 응집됨을 시사한다.
도 4는 희석된 낮은 역가 벡터(~5E+12 vg/mL)가 UF/DF 공정을 통해 벡터 응집을 현저히 감소시킴을 나타내는 데이터를 나타낸다. CsCl 초원심분리 후의 AAV2-hTPP1v1 벡터(2.5E+14 vg)를 직접 투석여과하거나, 먼저 투석여과 완충액을 사용하여 희석한 후, 25회 사이클에 대해 투석여과하였다. 투석여과된 벡터 둘 모두를 투석여과 공정 후에 5 mL로 한외여과시켰다. DLS 분석은 희석하지 않은 투석여과 공정으로부터 회수된 벡터의 직경(좌측 막대)이 희석한 벡터의 직경(우측 막대)보다 현저히 더 큼을 나타냈다.
도 5는 플루로닉 F-68(Pluronic F-68)이 rAAV 벡터가 보다 큰 입자(즉, 응집체)를 형성하는 것을 감소시키거나, 최소화하거나, 방지함을 나타내는 데이터를 나타낸다. 모델 바이러스 입자로서, CsCl 초원심분리 후의 AAV2-hTPP1v1 빈 입자를 초기에 플루로닉 F-68을 함유하거나(완충액 1이라고 명명함) 플루로닉 F-68를 함유하지 않는(완충액 2라고 명명함) 투석여과 완충액으로 희석시켰다. 이후, 희석된 빈 입자를 각 사이클에 대해 투석여과 완충액 1 또는 완충액 2를 사용하여 25회 사이클에 대해 투석여과하였다. 빈 입자를 투석여과 공정 후 5 mL로 한외여과시켰다. 5 mL 빈 입자를 검정을 위해 수집하였다. (A) DLS 분석은 플루로닉 F-68을 지닌 빈 입자의 평균 카운트(ksps)(우측 막대)가 플루로닉 F-68를 함유하지 않는 것(좌측 막대)보다 현저히 높았음을 나타냈으며, 이는 플루로닉 F-68의 존재 하에서 회수가 보다 우수하였음을 시사한다. (B) 플루로닉 F-68가 없는 빈 입자의 직경(좌측 막대)이 플루로닉 F-68를 함유하는 빈 입자의 직경(좌측 막대)보다 더 컸다.
상세한 설명
접선 유동 여과는 바이오 제품에 대해 완충액을 교환하고(투석여과, DF), 농축하기 위해(한외여과, UF)을 널리 사용되는 기술이다. 그러나, TFF 기술이 rAAV 벡터 완충액 교환 및 최종 제형에 대해 사용되는 경우, 상당량의 벡터가 UF/DF 공정에서 손실되는 것으로 나타났다. 고 rAAV 벡터 역가/농도는 종종 특정 인간 질병을 치료하는데 필요하다. 그러나, UF/DF에 대한 현재의 제형 및 조작 파라미터는 rAAV 벡터를 1E+13 vg/ml 이상의 벡터 역가와 같이 요망하는 농도로 생산할 수 없었다. 또한, rAAV 벡터는 1E+13 vg/ml 이상의 수준으로 농축될 때 응집되는 경향이 있다.
고역가의 rAAV 벡터의 제조에 대한 이러한 실질적인 기술적 한계를 극복하기 위해, 본 발명에서는 rAAV 벡터의 TFF 공정을 위한 신규 제형을 생성하였다. 또한, 본 발명에서는 TFF 공정을 위한 신규 조작 파라미터를 생성하였다. rAAV 벡터 조제물을 제형화하기 위해 최종 UF/DF 공정을 거치도록 신규 개발된 제형이 신규 생성된 TFF 공정(신규 개발된 파라미터를 갖는)에 사용된 경우, rAAV 벡터 회수가 현저히 개선되고, rAAV 벡터가 모노머로서 남아 있는 것으로 나타났다. 특히, 신규 TFF 제형을 신규 TFF 조작 기술과 함께 사용한 경우, rAAV 벡터가 5E+13 vg/ml까지 농축되는 경우에도 실질적인 rAAV 벡터 응집 없이 농축되었다. 또한 rAAV 벡터 회수(전체 수율)가 현저히 향상되었다.
본 발명은 rAAV 벡터 생성물을 검출 가능한 rAAV 벡터 응집 없이 고농도로, 검출 가능한 rAAV 벡터 응집 없이 5E+13 vg/ml까지, 농축시킬 수 있는 용액을 제공한다. 본 발명은 또한 상당량의 벡터 손실 없이 rAAV 벡터에 대해 TFF 기술을 사용하여 UF/DF 공정을 수행하는 해결책을 제공하며, 예를 들어, UF/DF 공정으로부터 회수된 rAAV 벡터는 시작부터 끝까지 70% 내지 95% 이하의 범위에 있다. 본 발명은 특히 농축된 rAAV 벡터를 제조하려는 경우, TFF를 rAAV 제조 공정을 위한 효율적인 기술로서 가능하게 한다.
용어 "벡터"는 소형 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터), 또는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 다른 비히클을 지칭한다. 이러한 벡터는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입/전달하고, 삽입된 폴리뉴클레오티드를 세포에서 전사 또는 번역하기 위해, 유전자 조작(즉, "클로닝 벡터")에 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 특수화된 벡터이다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서 증식을 위한 복제 기점 및 임의로 추가 요소, 예를 들어, 트랜스진(transgene), 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들), 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
바이러스 벡터는 바이러스 유전체를 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이에 기반한다. 특정 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스, 예를 들어, 렌티- 또는 파보-바이러스(예를 들어, rAAV) 벡터의 수식어, 뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. rAAV 벡터와 같은 재조합 벡터의 특정 예는 야생형 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체에 정상적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 유전체 내에 삽입되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 재조합 형태는 임의의 그러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 바이러스(예를 들어, AAV)로부터 야생형 유전체를 제거하기 위해 분자 방법을 사용함에 의해, 그리고 비-천연 핵산으로 대체함에 의해, AAV와 같은 바이러스의 야생형 유전체로부터 유래된다. 전형적으로, AAV의 경우, AAV 유전체의 하나 또는 둘 모두의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열은 rAAV 벡터에서 보유된다. "재조합" 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV)는 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체와 구별되는데, 그 이유는 바이러스 유전체의 전부 또는 일부가 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체 핵산에 대해 비-천연 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 "재조합" 벡터로 정의하며, AAV의 경우에 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다.
재조합 벡터는 패키징될 수 있고- 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 본원에서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 캡시드화되거나 AAV 입자로 패키징되는 경우, 입자는 또한 "rAAV"로서 지칭될 수 있다. 그러한 입자는 벡터 유전체를 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는 바이러스 외피 단백질을 포함하고, AAV의 경우에 캡시드 단백질을 포함한다.
벡터 "유전체" 또는 편의상 약어로 "vg"는 바이러스(예를 들어, rAAV) 입자를 형성하기 위해 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 플라스미드 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터를 작제 또는 제조하는데 사용되는 경우, 벡터 유전체는 재조합 플라스미드의 벡터 유전체 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비 벡터 유전체 부분은 증식 및 재조합 AAV 벡터 생산에 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에는 중요하지만, 자체적으로 바이러스(예를 들어, AAV) 입자로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 "플라스미드 백본"으로 지칭된다. 따라서, 벡터 "유전체"는 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드화된 핵산을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 유전체 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭(si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변이체 핵산)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일, 이중, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규정에 따라 본원에 기술될 수 있다.
"트랜스진"은 본원에서 세포 또는 유기체에 의도되거나 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 편리하게 지칭하기 위해 사용된다. 트랜스진은 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자와 같은 임의의 핵산을 포함한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 서열" 또는 "트랜스진"에 의해 인코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 야생형 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열을 포함함은 물론, 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체가 천연 전장 단백질의 어느 정도의 기능을 보유하는 한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 핵산 서열에 의해 인코딩되는 그러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 그의 발현이 불충분하거나, 또는 처리된 포유 동물에서 결핍인 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.
재조합 AAV 벡터는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, rAAV 벡터는 임의의 AAV 유전체 또는 AAV 캡시드, 이를 테면, 예컨대, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8에 기반할 수 있다. 그러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)에 기반할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 한 혈청형 유전체에 기반한 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 ITR 또는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 유전체는 벡터를 패키징하는 AAV ITR 또는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 별개인 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 유전체에 기반할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 유전체는 AAV2에 기반할 수 있지만, 세 개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 예를 들어 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 또는 이들의 변이체일 수 있다.
특정 구체예에서, rAAV 벡터는 WO 2013/158879(국제 출원 PCT/US2013/037170), WO 2015/013313(국제 출원 PCT/US2014/047670) 및 US 2013/0059732(US 출원 번호 제13/594,773호는 LK01, LK02, LK03 등을 개시함)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 뿐만 아니라 이들의 변이체(예를 들어, ITR 및 캡시드 변이체, 예컨대 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.
AAV 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8 ITR 및 캡시드의 변이체 및 키메라를 포함한다. 따라서, AAV 벡터 및 AAV 변이체(예를 들어, ITR 및 캡시드 변이체)가 포함된다.
다양한 예시적인 구체예에서, 기준 혈청형에 관련된 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(이를 테면, 예컨대 ITR, 또는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)과 적어도 80% 이상(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드(예를 들어, ITR), 또는 폴리펩티드(예를 들어, 캡시드)를 갖는다.
본원에서 사용되는 어구 "보나 파이드(bona fide) AAV 벡터" 또는 "보나 파이드 rAAV 벡터"는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 고려되는 트랜스진을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 상기 어구는 빈 AAV 벡터(트랜스진이 존재하지 않음), 및 완전 삽입체(예를 들어, 트랜스진 단편)가 결여된 AAV 벡터 또는 숙주 세포 핵산을 함유하는 그러한 AAV 벡터를 배제한다.
용어 "분리된"은 조성물의 수식어로 사용될 때, 조성물이 사람의 손에 의해 만들어지고/거나 이들의 자연 발생 생체 내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물은 자연 상태에서 이들이 정상적으로 결합하는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막을 실질적으로 갖지 않는다. 예를 들어, "분리된 핵산"은 rAAV 벡터와 같은 벡터에 삽입되는 DNA 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 전체적으로 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 생물학적 분자와 관련된 다양한 용어는 상기에서, 및 또한 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 개시된 특징은 동등하거나 유사한 특징의 속의 예이다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 그러한 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 그러한 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 그러한 바이러스/입자를 포함한다.
본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 그러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등, 뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등을 포함한다.
초과(더 큰) 또는 미만에 의한 정수의 언급은 각각 참조 숫자보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 숫자 일(1)까지의 모든 99, 98, 97 등을 포함하고; 10 미만은 숫자 일(1)까지의 모든 9, 8, 7 등을 포함한다.
본원에 사용된 모든 수치 값 또는 범위는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 그러한 범위 내의 값 및 정수의 분수 및 그러한 범위 내의 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 1-10과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 최대 50 및 50을 포함하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등을 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은 계열 내의 다른 범위의 경계 값을 조합시킨 범위를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850의 일련의 범위에 대한 언급은 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150-300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500, 등의 범위를 포함한다.
본 발명은 본원에서 다수의 구체예 및 양태를 설명하기 위해 긍정적인 언어를 사용하여 일반적으로 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계는 배제된다. 따라서, 비록 본 발명이 본 발명에서 명백하게 배제되지 않은 양태를 포함하지 않는 것에 관하여 본 발명에서 일반적으로 표현하지는 않지만, 그럼에도 불구하고 본원에 개시된 것이다.
본 발명의 많은 구체예가 개시되었다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며, 다양한 용도 및 조건에 본 발명을 채용하기 위해 이를 다양하게 변형하고 수정할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위한 것이며 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 rAAV 벡터 손실 및/또는 응집에 대해 설명할 수 있는 많은 가설 중 하나는 rAAV 벡터 손실의 원인이 될 수 있는 최적화되지 않은 UF/DF 공정에서 TFF 장치에 겔층이 형성될 수 있다는 것이다. 겔층 형성의 이러한 가설은 또한 벡터가 더욱 농축되는 경우에 보다 심한 겔층이 형성될 수 있기 때문에, rAAV 벡터가 고농도로 농축되었을때 보다 많은 rAAV 벡터가 손실되는 현상을 설명할 수 있다. 겔층 형성은 또한 rAAV 응집을 일으킬 수 있는데, 이 현상은 특히 rAAV 벡터가 고농도로 농축되는 경우에 UF/DF 공정에서 상당히 흔히 관찰되었다.
실시예 2 TFF 조작 파라미터 이외에, 많은 가설 중 하나는 제형이 겔층을 감소시키고, 또한 현재의 UF/DF 공정에서 사용되는 대부분의 용액/완충액에 대해 rAAV가 응집되지 않도록 하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 것이며, 완충액/용액에 사용되는 화학 물질은 염이고, 화학 물질은 pH를 조절한다. 계면 활성제가 공정을 통해 UF/DF 용액에 사용되면, 그것은 rAAV 벡터들 간의 회합 및 rAAV 벡터와 UF/DF 장치의 표면 간의 회합을 감소시킬 수 있다. 이는 또한 UF/DF 공정을 통해 rAAV 벡터의 겔층을 감소시키거나 방지할 수 있다. 또한, 계면활성제는 UF/DF 공정을 거치면서 소수성 상호작용을 감소시키거나 방지함으로써 rAAV 회합을 추가로 감소시킬 수 있으며, 이로써 rAAV의 응집을 감소시키거나, 최소화하거나, 방지할 수 있다. 추가의 가설은 UF/DF 공정 중에 전단 속도를 높이고 막투과 압력(TMP)을 조절하면 겔층 형성을 감소시킬 수 있다는 것이다. 이들 모든 가설에 기초하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 제형 및 조작 파라미터를 유도하는 일련의 연구가 수행되었다.
실시예 3 본 발명에 따르면, rAAV 벡터 제조물의 고역가가 요망되는 경우에 특히 관련이 있는, rAAV 벡터의 응집을 감소시키고, 최소화하거나, 방지하고, rAAV 벡터의 회수(전체 수율)를 증가시키는 신규 UF/DF 조작 파라미터가 생성된다. 제1 조작 파라미터는 특히 rAAV 벡터 제조물이 예를 들어 UF/DF 단계 전에 CsCl 구배 원심분리에서 고농도의 rAAB를 함유하는 경우, 낮은 rAAV 역가로 UF/DF 공정을 개시하는 것이다. CsCl 중의 고농축 rAAV를 먼저 pH 7.3에서 10 mM 인산나트륨, 180 mM NaCl 및 0.001% 플루로닉 F-68을 함유하여 생성된 투석여과 완충액을 사용하여 5E+12 vg/ml 이하의 역가로 희석시켰다. 생성된 투석여과 완충액을 사용하여 약 8,000 s-1 이상의 전단 속도의 유속으로 DF 공정을 작동시켰다. 효과적인 완충액 교환을 달성하기 위해 투석여과 공정을 완료한 후, UF 공정을 개시하여 rAAV 벡터를 요망하는 역가로 농축시켰다.
신규 생산된 UF/DF 제형이 갖는 한가지 성분은 rAAV 조제물의 고역가를 달성하는 플루로닉 F-68이다. 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이 신규 제형(투석여과 완충액)은 겔층 형성을 감소시키는 것으로 여겨진다.
신규 제형이 UF/DF 공정에서 신규 조작 파라미터와 조합되는 경우, rAAV 벡터는 검출가능한 벡터 응집 없이 ml 당 5E+13 vg로 농축되었다. 추가로, rAAV 벡터 회수가 상당하였으며, 전형적으로 70% 이상의 수준이었다.

Claims (52)

  1. 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus)(rAAV) 벡터 입자를 고회수 또는 고역가로 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법이
    (a) rAAV 벡터 입자를 포함하는 세포 및/또는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계;
    (b) 임의로 단계 (a)에서 수집된 상기 세포 및/또는 상기 세포 배양 상청액을, 임의로 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 통해 농축시켜 농축된 수확물을 생산하는 단계;
    (c) 단계 (a)에서 생산된 상기 수확물 또는 단계 (b)에서 생산된 상기 농축된 수확물을 임의로 미세유체화(microfluidization)에 의해 용해시켜 용해물(lysate)을 생산하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생산된 상기 용해물을 여과하여 정화된(clarified) 용해물을 생산하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 생산된 상기 정화된 용해물을 이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 정제된 rAAV 벡터 입자로 구성된 컬럼 용출액을 생산하고, 임의로 상기 컬럼 용출액을 접선 유동 여과에 의해 농축시켜 농축된 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
    (f) 단계 (e)에서 생산된 상기 컬럼 용출액 또는 상기 농축된 컬럼 용출액을 염화세슘과 혼합하여 혼합물을 생산하고, 상기 혼합물을 구배 초원심분리로 처리하여 보나 파이드(bona fide) rAAV 벡터 입자를 빈 캡시드 AAV 입자 및 다른 AAV 벡터 관련 불순물로부터 실질적으로 분리시키는 단계;
    (g)(1) 단계 (f)에서 분리된 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자를 수집하고, (g)(2) 상기 수집된 보나 파이드 rAAV 벡터 입자를 비-이온성 계면활성제를 지닌 완충액 중에서 제형화시키는 단계;
    (h) 단계 (g)(2)의 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자를 접선 유동 여과에 의해 완충액 교환 처리하여 AAV 벡터 제형을 생산하는 단계; 및
    (i) 단계 (h)에서 생산된 상기 AAV 벡터 제형을 여과함으로써 보나 파이드 rAAV 벡터 입자를 고회수 또는 고역가로 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (g)(1)의 상기 완충액이 염화나트륨, 및/또는 인산나트륨을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (g)(1)의 상기 완충액이 약 10mM의 농도 내지 약 500 mM의 농도의 염화나트륨을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (g)(1)의 상기 완충액이 약 5mM의 농도 내지 약 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 블록 및 적어도 하나의 폴리프로필렌 글리콜 블록을 포함하는 블록 코폴리머를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 알킬 폴리글리코사이드, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 코카미드 DEA, 코카미드 MEA, 데실 글루코사이드, 에톡실레이트, IGEPAL CA-630, 이소세테쓰-20(Isoceteth-20), 글리코사이드, 말토사이드, 모노라우린, 노니데트 P-40, 논옥시놀, 예컨대 논옥시놀-9, NP-40, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-옥실 베타-D-티오글리코피라노사이드, 옥틸 글루코사이드, 올레일 알코올, PEG-10 해바라기 글리세라이드, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴록사머, 예컨대 폴록사머 407, 폴록사머 188(폴리(에틸렌-코-폴리프로필렌 옥사이드)), 폴리글리세롤 폴리리시놀레에이트, 소르비탄, 스테아릴 알코올, 트리톤 X-100(Triton X-100), 및 트윈 80(Tween 80)을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 에톡실레이트가 에톡실화된 지방산, 알코올 에톡실레이트, 트리스티릴페놀 에톡실레이트, 또는 에톡실레이트화된 소르비탄 지방산 에스테르를 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 소르비탄이 소르비탄 모노스테아레이트 또는 소르비탄 트리스테아레이트를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 세토마크로골 1000, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 60(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트); 폴리글리세롤 폴리리시놀레에이트, 옥타데칸산 [2-[(2R,3S,4R)-3,4-디하이드록시-2-테트라하이드로푸라닐]-2-하이드록시에틸] 에스테르, 옥타데칸산 [(2R,3S,4R)-2-[1,2-비스(1-옥소옥타데콕시)에틸]-4-하이드록시-3-테트라하이드로푸라닐] 에스테르; C8 내지 C22 장쇄 알코올, 예컨대 1-옥타데칸올, 세틸스테아릴 알코올, 헥사데칸-1-올 및 시스-9-옥타데센-1-올; 치환기가 폴리에톡시에탄올 기(예를 들어 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 형성하기 위해) 또는 옥틸페놀을 지닌 비-이온성 계면활성제를 형성하는 임의의 그 밖의 치환기를 포함할 수 있는 치환되거나 비치환된 옥틸페놀; 폴리에틸렌 글리콜 모노이소헥사데실 에테르; 도데칸산 2,3-디하이드록시프로필 에스테르; 라우릴 글리코사이드, 옥틸글루코사이드 및 데실 글루코사이드를 포함할 수 있는 글리코사이드; 지방산 아미드, 예컨대 코카미드 디에탄올아민 및 코카미드 모노에탄올아민; 및 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 사슬 및 방향족 탄화수소 친유성 또는 친수성 기, 예컨대 논옥시놀-9 및 트리톤 X-100를 지니는 비이온성 계면활성제를 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥사이드))의 두 개의 친수성 사슬이 측면에 있는 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬로 구성된 폴리에틸렌 글리콜-블록-폴리프로필렌 글리콜-블록-폴리에틸렌 글리콜 또는 트리블록 코폴리머를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-블록-폴리프로필렌 글리콜-블록-폴리에틸렌 글리콜 또는 트리블록 코폴리머가 SYNPERONIC F108(Aldrich)를 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 약 0.0001%의 농도 내지 약 0.1%의 농도를 갖는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (g)(2)의 상기 비-이온성 계면활성제가 약 0.0001%의 농도 내지 약 0.01%의 농도를 갖는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자가 단계 (i)에서 생산된 상기 제형 중에 mL 당 약 1015 개의 입자의 농도 내지 mL 당 약 1018 개의 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 농도로 존재하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 수율이 적어도 약 5x1012 개의 보나 파이드 rAAV 벡터 입자/ml인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 수율이 적어도 약 1x1013 개의 보나 파이드 rAAV 벡터 입자/ml인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 수율이 적어도 약 5x1013 개의 보나 파이드 rAAV 벡터 입자/ml인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 회수가 단계 (a)의 총 rAAV 벡터 입자의 적어도 약 60%인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 회수가 단계 (a)의 총 rAAV 벡터 입자의 적어도 약 70%인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 Rh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 입자가 억제 핵산을 인코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 억제 핵산이 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, 리보자임 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 입자가 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모생식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 입자가 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β, 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자가 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노석시네이트 합성효소, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, RPE65, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 막횡단 조절제(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 선천성 이상의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단백질이 인자 VIII 또는 인자 IX인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자가 신경 퇴행성 질환의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 단백질이 트리펩티딜 펩티다제 1(TPP1)인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 단계 (F)에서 별도로 빈 캡시드 입자를 수집하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 순도가 적어도 약 80%인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 순도가 적어도 약 90%인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액에서 상기 보나 파이드 rAAV 벡터 입자의 순도가 적어도 약 95%인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 빈 캡시드 입자가 단계 (i)의 상기 여액에서 10% 이하의 양으로 존재하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 빈 캡시드 입자가 단계 (i)의 상기 여액에서 5% 이하의 양으로 존재하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액이 약 10% 이하의 응집된 rAAV 입자를 갖는 방법.
  37. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액이 약 5% 이하의 응집된 rAAV 입자를 갖는 방법.
  38. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액이 약 3% 이하의 응집된 rAAV 입자를 갖는 방법.
  39. 제1항에 있어서, 단계 (i)의 상기 여액이 약 1 내지 3%의 응집된 rAAV 입자를 갖는 방법.
  40. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 상기 원심분리가 단일 단계로 수행되는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 상기 원심분리가 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation)인 방법.
  42. 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 상기 컬럼 용출액이 접선 유동 여과에 의해 농축되어 농축된 컬럼 용출액을 생산하는 방법.
  43. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 생산된 용해물에 뉴클레아제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 비이온성 계면활성제가 단계 (h)의 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환 후 AAV 벡터에 첨가되어 생산된 rAAV 벡터 입자보다 더 큰 회수를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 비이온성 계면활성제가 단계 (h)의 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환 후 AAV 벡터 제형에 첨가되어 생산된 rAAV 벡터 입자보다 더 높은 역가를 갖는 rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (g)(1)의 수집된 보나 파 이드 rAAV 벡터 입자가 단계 (g)(2) 전에, 실질적으로 동시에 또는 후에 약 5x1012 개의 rAAV 벡터 입자/ml 미만의 농도로 희석되는 방법.
  47. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 2 내지 15 psig의 막투과 압력에서 수행되는 방법.
  48. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 4 내지 12 psig의 막투과 압력에서 수행되는 방법.
  49. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 3000 s-1 초과의 전단 속도로 수행되는 방법.
  50. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 5000 s-1 초과의 전단 속도로 수행되는 방법.
  51. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 5000 내지 15,000 s-1 초과의 전단 속도로 수행되는 방법.
  52. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (e) 및/또는 (h)의 접선 유동 여과가 약 8,000 내지 12,000 s-1 초과의 전단 속도로 수행되는 방법.
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