JP2023515385A - アデノ随伴ウイルス用安定化剤及びこれを用いたアデノ随伴ウイルスの安定化方法 - Google Patents

アデノ随伴ウイルス用安定化剤及びこれを用いたアデノ随伴ウイルスの安定化方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）用安定化剤及びこれを用いたアデノ随伴ウイルスの安定化方法に関し、より具体的には、界面活性剤又はアルブミンを含むアデノ随伴ウイルス用安定化剤、アデノ随伴ウイルス及び前記安定化剤を含むアデノ随伴ウイルス液状製剤、並びに安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法に関する。本発明による技術は、アデノ随伴ウイルスを用いて遺伝子伝達ウイルス及び治療用ナノ粒子を製造し、このための追加のポリフェノール結合体を形成するときにウイルス間の過剰な凝集を阻害して粒子を薬物伝達に効果的な大きさに維持させ、液状での安定性を高めるので、遺伝子治療のための薬物送達技術分野で非常に有用に活用できると期待される。

Description

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）用安定化剤及びこれを用いたアデノ随伴ウイルスの安定化方法に関し、より具体的には、界面活性剤又はアルブミンを含むアデノ随伴ウイルス用安定化剤、アデノ随伴ウイルス及び前記安定化剤を含むアデノ随伴ウイルス液状製剤、並びに安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法に関する。
遺伝子治療法（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）は、遺伝子伝達及び発現によって疾患を治療する技術であって、薬物治療とは異なり、疾患を引き起こす特定の遺伝子を標的として遺伝的欠陥を矯正する治療法である。遺伝子治療の究極の目標は、生きている細胞を遺伝的に改変させて有益な治療効果を得ることである。遺伝子治療の主な研究分野は、特定の疾患に対して治療効果を示す遺伝子を導入したり、抗がん剤などに抵抗性を示すように正常細胞の抵抗機能を増強させたり、各種遺伝性疾患患者において改変又は消失した遺伝子を置き換えたりする分野とまとめることができる。
遺伝子治療のための遺伝子伝達技術は、大きく、ウイルスを輸送体として使用する方法（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）、合成リン脂質やカチオン性高分子などを用いる非ウイルス性方法（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）、及び細胞膜に一時的な電気刺激を加えて遺伝子を導入する電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）などの物理的方法に区分することができる。前記伝達技術の中でも、ウイルス輸送体を使用する方法は、治療遺伝子に置き換えられた遺伝子を有する、一部又は全体の複製能力が欠損したベクターとして遺伝因子の伝達が効率よく行われ得るため、遺伝子治療のために選好される方法である。ウイルス輸送体又はウイルスベクターとして使用されるウイルスには、ＲＮＡウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなど）とＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）があり、この他にも、単純ヘルペスウイルスベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、アルファウイルスベクター（ａｌｐｈａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）などがある。これらの中でも、最近は、レンチウイルスとアデノ随伴ウイルスに関する研究が盛んに行われている（ＢＲＩＣ Ｖｉｅｗ ２０１６－Ｔ２２）。
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）は、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する一本鎖のプロウイルス（Ｐｒｏｖｉｒｕｓ）であって、単独では増殖能力を持たないため、複製のためにアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）などの補助ウイルスとの共存が必要である。アデノ随伴ウイルスの製造の際には、ｒｅｐ部分とｃａｐ部分を発現させる他のプラスミドＤＮＡと共にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、アデノウイルスは、補助ウイルスとして添加する。
アデノ随伴ウイルスは、感染した細胞内で再生されないという点、比較的軽い免疫反応を誘導するという点、及び遺伝子を挿入する位置がある程度予測可能であるという点のため、遺伝子治療で非常に広く使われるベクターである。しかし、アデノ随伴ウイルスの場合は、生産効率性或いは感染効率性及びターゲット伝達化能力を向上させるために、野生型タンパク質殻の遺伝子変異型を生産することが多く、このようなウイルス表面の変化は、外部環境に対する安定性を低下させるおそれがある。特に、組換えアデノ随伴ウイルスの場合は、水溶液内で不安定であるため、時間の経過に伴って凝集及び表面吸着問題が生じてこれを長期間保管することに問題があった。特に、このような不安定な性質は、アデノ随伴ウイルスの表面に機能性分子を導入するときにも問題となり、導入過程でほとんどのアデノ随伴ウイルスが凝集してしまう現象が起こる。このように凝集したウイルスは、結晶形態を成しながら１０μｍ以上の大きさに成長して、血管を塞ぐ塞栓症（ｅｍｏｂｌｉｓｍ）を誘導し、その結果として、注入された個体を死亡に至らせる可能性があるという問題点がある。
既存のアデノ随伴ウイルスの安定性を向上させる技術は、アデノ随伴ウイルスの感染性を最大限失うことなく長期保管する方法に焦点を合わせており、機能性分子を表面に導入するときに引き起こされる結晶化現象を防ぐための研究は、多く行われていない。したがって、アデノ随伴ウイルス自体の安定性を高めながらも、機能性分子を導入する場合にも安定性を維持させるための技術の開発が求められる。
従来の遺伝子伝達体としてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いる場合、体内外溶液内でのＡＡＶの不安定な特性のため、ＡＡＶ間で凝集及び表面吸着が起こって安定性が低下し、さらにＡＡＶをポリフェノールなどの物質で表面改質する場合、過剰な凝集現象が起こって体内で塞栓症などを誘発する可能性のある結晶形粒子が形成されるという問題点があったが、本発明者らは、界面活性剤又はアルブミン処理によってＡＡＶ間の凝集及び結晶形粒子の形成が著しく抑制され、長期間安定性が維持されることを確認し、本発明を完成するに至った。
そこで、本発明は、界面活性剤又はアルブミンを含む、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）用安定化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）及び安定化剤を含み、前記安定化剤は、界面活性剤又はアルブミンを含有することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス液状製剤を提供することを他の目的とする。
また、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓａｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）に安定化剤を処理する段階を含み、前記安定化剤は、界面活性剤又はアルブミンを含むことを特徴とする、安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法を提供することを別の目的とする。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上述の課題に限定されず、上述していない別の課題は、以降の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
上記の目的を達成するために、本発明は、界面活性剤又はアルブミンを含む、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）用安定化剤を提供する。
本発明の一実施形態において、前記界面活性剤は、５～２０の親水性－親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ、ＨＬＢ）値を有することができる。
本発明の他の実施形態において、前記界面活性剤は、アニオン性（Ａｎｉｏｎｉｃ）、カチオン性（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）、非イオン性（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ）及び両性イオン型（ Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）よりなる群から選択されることができる。
本発明の別の実施形態において、前記安定化剤は前記アデノ随伴ウイルスの凝集を阻害することができる。
本発明の別の実施形態において、前記アデノ随伴ウイルスは、ポリフェノール系物質で表面改質されていることができる。
本発明の別の実施形態において、前記ポリフェノール系物質はタンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、又は没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）であることができる。
本発明の別の実施形態において、前記アルブミンは１０～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができる。
また、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）及び安定化剤を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含有することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス液状製剤を提供する。
本発明の一実施形態において、前記液状製剤はｐＨ３．０～８．０に維持されることができる。
また、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓａｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）に安定化剤を処理する段階を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含むことを特徴とする、安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法を提供する。
本発明によれば、遺伝子伝達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それ自体で不安定であり、ウイルス間で容易に凝集が起こり、しかも、追加の機能性付与のためにポリフェノールで表面改質する場合にＡＡＶ間で過剰な凝集が起こって塞栓症などを誘発する可能性のある結晶形粒子が形成できる。しかし、界面活性剤及び／又はアルブミンを一緒に処理する場合には、このようなＡＡＶ間の凝集が顕著に抑制されて結晶形粒子が形成されず、ＡＡＶの体外安定性を増進させ、界面活性剤とアルブミンとを組み合わせて処理する場合には、顕著な相乗効果が現れることを確認した。したがって、本発明による技術は、アデノ随伴ウイルスを用いて遺伝子伝達ウイルス及び治療用ナノ粒子を製造し、このための追加のポリフェノール結合体を形成するときにウイルス間の過剰な凝集を阻害して粒子を薬物伝達に効果的な大きさに維持させ、液状での安定性を高めるので、遺伝子治療のための薬物送達技術分野で非常に有用に活用できると期待される。
界面活性剤の種類によるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の安定性の変化を検証するために、非イオン性（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ８０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ、両性イオン（Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＣＨＡＰＳ、カチオン性（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＣＴＡＢ、及びアニオン性（Ａｎｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）それぞれが処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、動的光散乱法によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で結晶形成有無を観察した結果である。 ＣＴＡＢ、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＣＨＡＰＳそれぞれが含まれたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、ＦＢＳを混合して結晶形成有無を観察して血清混合による潜在的結晶形粒子の形成有無を確認した結果である。 各界面活性剤の処理濃度によるＡＡＶの安定性の変化を検証するために、Ｔｗｅｅｎ ８０がそれぞれ０．２％、０．０５％、０．０１２５％及び０．００３％の濃度で処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、散乱度測定のためにＵＶ吸光度を測定した結果である。 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘがそれぞれ０．０５％、０．０１２５％、０．００３％及び０．０００８％の濃度で処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、散乱度測定のためにＵＶ吸光度を測定した結果である。 ＣＨＡＰＳがそれぞれ０．４％、０．１％、０．０２５％及び０．００６％の濃度で処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、散乱度測定のためにＵＶ吸光度を測定した結果である。 ＣＴＡＢがそれぞれ０．４％、０．１％、０．０２５％及び０．００６％の濃度で処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、散乱度測定のためにＵＶ吸光度を測定した結果である。 デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）がそれぞれ０．２％、０．０５％、０．０１２５％及び０．０００３％の濃度で処理したＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、散乱度測定のためにＵＶ吸光度を測定した結果である。 ｐＨ条件によるＡＡＶの安定性の変化を検証した結果であって、ｐＨが異なるそれぞれの緩衝溶液を用いてＴｗｅｅｎ ８０及びＣＨＡＰＳがそれぞれ存在するＡＡＶ溶液を製造し、タンニン酸溶液と混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果である。 界面活性剤の処理によるＡＡＶの体外安定性を検証するためのものであって、Ｔｗｅｅｎ ８０が処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察したものであり、それぞれ０分、２０分、１日目の平均粒子サイズを測定した結果である。 Ｔｗｅｅｎ ８０、ＣＨＡＰＳ及びデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）がそれぞれ処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、０分（ｍｉｎ）、３０分（ｍｉｎ）、及び１日（ｄａｙ）目にそれぞれＵＶ吸光度を測定し、初期値に対する散乱度の増加様相を介して時間経過に伴う粒子のサイズ変化を確認した結果である。 アルブミン処理によるＡＡＶの安定性増進効果を検証した結果であって、アルブミンが様々な濃度（１０％、１％、０．１％、０．０１％）で処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果である。 界面活性剤とアルブミンの組み合わせによるＡＡＶの安定性増進効果を検証した結果であって、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＣＨＡＰＳ及びＣＴＡＢそれぞれが処理されたＡＡＶ溶液と、タンニン酸溶液とを混合し、アルブミン溶液をさらに添加した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果である。 界面活性剤とタンニン酸との結合効果によってＡＡＶの他に無機ナノ粒子である金ナノ粒子の安定性も維持されるか否かを検証した結果であって、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＣＨＡＰＳ及びＣＴＡＢそれぞれが処理された金ナノ粒子溶液と、タンニン酸溶液とを混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果である。
本発明者らは、遺伝子伝達体としてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いる場合、体外溶液内でのＡＡＶの不安定な特性のため、ＡＡＶ間で凝集及び表面吸着が起こって安定性が低下し、さらには、ＡＡＶをポリフェノールなどの物質で表面改質する場合に過剰な凝集現象が起こって体内で塞栓症などを誘発する可能性のある結晶形粒子が形成できるが、界面活性剤又はアルブミン処理によってＡＡＶ間の凝集及び結晶形粒子の形成が著しく抑制され、長期間安定性を高めることを確認したので、これにより本発明を完成するに至った。
このため、本発明は、界面活性剤又はアルブミンを含む、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）用安定化剤を提供する。
本発明で使用される用語「安定化剤（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）」は、物質を製造、放置又は保存するときに状態変化や化学変化を防止するために添加する物質を意味する。本発明において、安定化剤は、ＡＡＶ間の凝集を阻害し、ポリフェノールなどの物質で表面改質するときに過剰な凝集による結晶形粒子の形成を抑制し、さらには、ＡＡＶの体内投与時まで水溶液内で長期間サイズと形状を維持することができるように安定化させる機能を有するものであり得る。
本発明において、「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」は、希薄溶液中で界面に吸着してその表面張力を減少させる物質であって、通常、１分子中に親油基と親水基が一緒に含まれている両親媒性の物質は、界面活性剤であり得る。本発明において、界面活性剤は、親水性－親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ、ＨＬＢ）値が５～２０であるものを含むことができ、より好ましくは、アニオン性（Ａｎｉｏｎｉｃ）、カチオン性（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）、非イオン性及び両性イオン型（Ｚｗｉｔｔｅｒ ｉｏｎｉｃ）よりなる群から選択されるものであり得る。
前記ＨＬＢ値は、界面活性剤の親水性及び親油性の度合いを示す尺度であって、１９５４年に開発された非イオン性界面活性剤に対するグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）の計算式によって計算すると、０～２０の間のＨＬＢ値が得られ、値が０であれば、完全な親油性／疎水性分子であり、ＨＬＢ値が２０であれば、完全な親水性／疎油性分子であることを意味する。ＨＬＢ値を介して界面活性剤分子の特性をある程度推測可能である。
前記アニオン性界面活性剤は、水に溶かすと、電離して界面活性を示す原子団がアニオンとなる界面活性剤を意味する。その種類が非常に様々であり、石鹸、高級アルコールの硫酸エステル型と、アルキルアリールスルホン酸塩型に大別され、本発明では、デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）を用いたが、使用可能な種類がこれに限定されるものではない。本発明において、アニオン界面活性剤は、全溶液の０．１～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含まれることができ、好ましくは、０．０７～０．０３％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができるが、これに限定されるものではない。
前記カチオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤とは逆に、水に溶かすと、電離して界面活性を示す原子団がカチオンとなる界面活性剤をいう。親水及び親油原子団を有し、強力な殺菌剤、消毒剤、沈降促進剤、帯電防止剤などの多方面に用いられ、大部分は、窒素化合物（アミン塩、第四級アンモニウム塩）であるが、その他に硫黄の第三級スルホニウム塩（ｓｕｌｐｈｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）又は第四級スルホニウム塩もあり、本発明では、セトリモニウムブロミド（Ｃｅｔｒｉｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ）を用いたが、これに限定されるものではない。本発明において、カチオン界面活性剤は、全溶液の０．３～０．００７％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができ、好ましくは０．２～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができ、さらに好ましくは０．１～０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができるが、これに限定されるものではない。
前記非イオン性界面活性剤は、極性を有するものの、水に溶かしてもイオンに分離されない界面活性剤であって、弱い親水基を多数持っており、これらの親水基の数によって界面活性剤の親水性、すなわちＨＬＢが変わる。気泡安定性が高く、肌への反応が無害であり、低温での安定性の向上、洗浄作用に優れるうえ、泡立ちが少ないなどの特性があるため、徐々にその用途が広がっている。非イオン性界面活性剤は、大きく、酸化エチレン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅ）系、ジエタノールアミン（Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）系、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）系、グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）系に分類することができ、本発明では、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘを使用したが、種類がこれに限定されるものではない。本発明において、非イオン性界面活性剤は、全溶液の０．０５～０．０００１％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含まれることができ、好ましくは０．０４～０．０００５％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができ、より好ましくは０．０３～０．０００８％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができ、さらに好ましくは０．０２～０．００１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができるが、これに限定されるものではない。
前記両性イオン型界面活性剤は、分子内にカチオン性原子団とアニオン性原子団を同時に持っている界面活性剤であって、各種両性電解質構造を持つ有機化合物があるため、シャンプー、リンス、柔軟剤、殺菌消毒剤等として用いられる。両性イオン型界面活性剤は、様々な種類が知られており、本発明では、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］－１－ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を用いたが、種類がこれに限定されるものではない。本発明において、両性イオン型界面活性剤は、全溶液の０．０８～０．００５％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含まれることができ、好ましくは０．０６～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含まれることができ、さらに好ましくは０．０４～０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができるが、これに限定されるものではない。
前記アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）は、生体細胞又は体液中に広く分布している単純タンパク質であって、グロブリンと共に細胞の基礎物質を構成し、動植物の組織内に広く存在する。アルブミンは、界面活性剤などの両親媒性物質であって、親水性と疎水性部位を持っており、生体工学で難溶性薬物を水に溶かすのに多く用いられてきた物質である。本発明において、アルブミンは、全溶液の１０～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができ、好ましくは１０～０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることができるが、これに限定されるものではない。
本発明者らは、具体的な実施形態によって、上述した界面活性剤がＡＡＶの凝集を効果的に阻害して結晶粒子の形成を抑制することを確認した。
本発明の一実施形態では、それぞれ異なる種類の界面活性剤が処理されたＡＡＶ溶液と、ＡＡＶの表面改質物質であるタンニン酸溶液とを混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶粒子の形成有無を顕微鏡で観察した結果、界面活性剤が処理されていない場合には、結晶形の粒子が多数形成されるのに対し、前記界面活性剤を処理した場合には、効果的にＡＡＶの凝集が阻害されて結晶形の粒子が観察されておらず、マウスに注入した場合にも特に影響を及ぼさないことを確認した。また、血漿と混合されるとき、血管を塞ぐ可能性のある潜在的な結晶構造が形成されるかを、ＦＢＳを処理して追加的に検証した結果、ＦＢＳ処理に関係なく結晶が形成されないことを確認した（実施例２参照）。
本発明の他の実施形態では、ＡＡＶ、タンニン酸及び界面活性剤間の好ましい濃度比率を調べるために、各界面活性剤の種類別に様々な濃度で処理してＡＡＶの安定性を検証した結果、界面活性剤の種類によって、結晶を形成させない有効な濃度がそれぞれ異なることが分かり、共通的に濃度があまり高い或いは低い場合には、効果的にＡＡＶの凝集を阻害することができないため結晶形の粒子が形成される傾向が現れることが分かった（実施例３参照）。
本発明の別の実施形態では、ｐＨによって粒子形成の様相が変わることができるので、様々なｐＨの緩衝液を用いて、界面活性剤が含まれているＡＡＶ及びタンニン酸溶液を混合し、平均粒子サイズ及び結晶形粒子の形成有無を分析した。その結果、ｐＨ３．０を前後に粒子形成の様相が変わっておリ、これにより、好ましくはｐＨ３．０～８．０の範囲が適切であると確認した（実施例４参照）。
本発明の別の実施形態では、界面活性剤の処理時にＡＡＶの体外安定性が長期間維持されるかを検証するために、界面活性剤が処理されたＡＡＶとタンニン酸溶液とを混合し、１日後まで放置しながら、粒子のサイズ変化を測定して比較した結果、１日後までおおむね粒粒が維持され、非イオン性界面活性剤として用いたＴｗｅｅｎ ８０を処理した場合には、ＡＡＶの安定性が最も高く維持されることを確認した（実施例５参照）。
本発明の別の実施形態では、界面活性剤のようにＡＡＶの安定性を向上させることができる物質でアルブミンの効果を検証した。このために、ＡＡＶ溶液とタンニン酸溶液とを混合した後、アルブミンを様々な濃度（１０％、１％、０．１％、０．０１％）で処理して平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果、０．１％の濃度範囲でマイクロサイズの粒子が形成されたことを確認した（実施例６－１参照）。さらに、界面活性剤と一緒に処理する場合の効果を調べるために、各界面活性剤が処理されたＡＡＶ溶液とタンニン酸溶液とを混合し、ここにアルブミン溶液をさらに混合した後、平均粒子サイズを測定し、結晶形粒子の形成有無を観察した結果、既に形成された粒子がアルブミン処理によって数百ナノメートルサイズにさらに小さくなっており、結晶構造も形成されないことにより、ＡＡＶの安定性に対する界面活性剤とアルブミンの組み合わせによる相乗効果を確認した（実施例６－２参照）。
本発明の別の実施形態では、上記の結果に基づいて、界面活性剤がＡＡＶではなく無機ナノ粒子である金ナノ粒子の安定性も増進させるかを検証した結果、金ナノ粒子の場合、界面活性剤の種類に関係なく、全ての場合に結晶構造が形成されたことが分かった（実施例７参照）。
このような本発明の実施例の結果から、様々な種類の界面活性剤は、有効な濃度が異なるだけであり、ＡＡＶの凝集を抑制して結晶形粒子の形成を効果的に阻害してＡＡＶを安定化させる効果に優れるうえ、アルブミンもこのような効果を示し、界面活性剤と組み合わせる場合にはさらに相乗効果を示すことが分かった。
したがって、本発明の他の態様として、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）及び安定化剤を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含有することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス液状製剤を提供する。
本発明において、前記液状製剤は、ｐＨ３．０～８．０に維持されることができる。
本発明の別の態様として、本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）に安定化剤を処理する段階を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含むことを特徴とする、安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法を提供する。
本発明において、アデノ随伴ウイルスを製造する方法は、当該技術分野で通常用いられている方法を採用することができ、当業者が適宜選択して製造することができる。
前記アデノ随伴ウイルスは、前記ウイルスに心臓標的指向性を導入するために、ポリフェノール系物質で表面改質されたものであることができ、ポリフェノール系物質は、タンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）又は没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｉｎ ｇａｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）であることができ、好ましくはタンニン酸であるが、これに限定されるものではない。
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容はこれらの実施例によって限定されるものではない。
［実施例］
実施例１．実験材料及び実験方法
本発明の実施例で用いたタンニン酸（Ｔ０２００）及び金ナノ粒子（９００４８４）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製から購入した。
本実施例で用いられた遺伝子組換えＡＡＶ９（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９）は、一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって製造した。
簡略に説明すると、ＡＡＶ９のカプシド遺伝子であるｃａｐ３．４５を有する同質量のＡＡＶヘルパープラスミド、ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を有するＣＭＶ ＧＦＰベクタープラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミド（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）をリン酸カルシウムを用いてＡＡＶ－２９３細胞に感染（トランスフェクション）させて製造した。その後、製造されたウイルスベクターを先行研究に記載されている通りに回収し、超遠心分離（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行って不純物を除去した。ＡＡＶのゲノムタイター（ｔｉｔｅｒ）は、ＱＰＣＲを用いて導出した。
実施例２．界面活性剤の種類によるＡＡＶ安定性変化の検証
本発明者らは、ＡＡＶを用いた遺伝子伝達体を製造する場合、ＡＡＶの凝集が起こる問題点を改善するために、界面活性剤を処理し、これによるＡＡＶ安定性の変化を確認しようとしたとともに、このために、当該技術分野で知られている様々な種類の界面活性剤を対象に効果を検証しようとした。より具体的には、それぞれのＴｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ＣＨＡＰＳ、セトリモニウムブロミド（Ｃｅｔｒｉｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ）、及びデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）が０．０５％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約１０分後に動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で血管閉塞現象をもたらす可能性のある結晶が形成されるか否かを観察した。この際、界面活性剤を処理していない条件としては、１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）５０μＬに０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、上記と同様の方法で平均粒子サイズの測定及び顕微鏡観察を行った。
その結果、図１ａに示すように、界面活性剤が存在しない場合には、数十～数百マイクロメートルに及ぶ結晶形の粒子が形成されたことが観察されたのに対し、非イオン性（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ８０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ、両性イオン（Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＣＨＡＰＳ、カチオン性（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるＣＴＡＢなどの界面活性剤が処理された場合には、ＡＡＶが凝集した結晶形の粒子が観察されなかった。また、アニオン性（Ａｎｉｏｎｉｃ）界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）が処理された場合には、繊維状の大きな粒子が形成されたことが観察されたが、界面活性剤が処理されていない場合と比較してはさらに良好な様相が現れたことを確認した。
一方、このような結晶性粒子の形成有無は、動物実験において実験動物の生存に影響を及ぼす主な要因の一つである。１０μｍ以上の結晶粒子は、体内の毛細血管などを塞ぐことができ、詰まった血管により虚血性疾患、心筋梗塞、脳梗塞、血管の破裂などが誘発され、ひどい場合は死亡に至ることもある。したがって、本発明者らは、図１ａの結果から確認された結晶性がマウスの生存にどのような影響を及ぼすかを実験的に確認しようとした。このために、Ｔｗｅｅｎ ８０が０．０１％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の濃度で含まれている２×１０９ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液５０μＬに０．５ｍＭ又は０．２５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約３０分以内にマウス尾静脈に１００μＬを注射して生存有無を確認した（０．０１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０＋０．５ｍＭ ＴＡ＋ＡＡＶ／０．０１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ ８０＋０．２５ｍＭＴＡ＋ＡＡＶ）。また、界面活性剤のない条件としては、Ｔｗｅｅｎ ８０を含まない２×１０９ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液５０μＬにタンニン酸を同じ条件で混合し、マウスの尾静脈に注射した（０．５ｍＭ ＴＡ＋ＡＡＶ／０．２５ｍＭ ＴＡ＋ＡＡＶ）。また、ウイルスのみを注入した条件を比較するために、２×１０９ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液５０μＬにＰＢＳ溶液５０μＬを製造し、同じ条件で注入した（Ｖｉｒｕｓ）。また、それぞれ０．５ｍＭのタンニン酸溶液１００μＬ（ＴＡ）及びＰＢＳ１００μＬ（ＰＢＳ）をそれぞれ注入した。
その結果、下記表１に示すように、ＡＡＶをタンニン酸と混合して注入した場合には、タンニン酸の濃度に関係なく、マウスが直ちに死亡した。ＡＡＶ又はタンニン酸のみを単独で注射した場合にはマウスが死亡しなかったが、混合して注入した場合にはマウスが死亡したことからみて、混合による結晶の形成のためと判断された。界面活性剤が含まれた条件でＡＡＶをタンニン酸と混合した場合には、マウスが生存した。したがって、結晶の形成を阻害する界面活性剤の役割が、深刻な血管閉塞現象を抑制する上で非常に重要であると判断された。
Figure 2023515385000002
また、本発明者らは、界面活性剤の処理を介して、血漿と混合されるときに血管を塞ぐ可能性のある潜在的な結晶構造の形成までも抑制することができるかをさらに検証しようとした。このために、ＣＴＡＢ、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＣＨＡＰＳそれぞれが０．０５％（ｗ／ｗ）で含まれている１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）５０μＬに０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に、１０％ＦＢＳ溶液５０μＬを混合し、顕微鏡で１０μｍ以上の結晶が形成されたかを観察した。その結果、図１ｂに示すように、ＦＢＳを混合した後にも、混合の前と同様に結晶が形成されない状態を維持することを確認した。
実施例３．界面活性剤の濃度によるＡＡＶ安定性変化の検証
前記実施例２の結果より、界面活性剤を一緒に処理することにより、ＡＡＶとタンニン酸とを混合する場合、凝集して結晶が形成されることを抑制することができることを確認した。したがって、これに加えて、界面活性剤の好ましい濃度比率を確認するために、界面活性剤の濃度別粒子形成様相を分析した。
３－１．非イオン性界面活性剤
非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ８０がそれぞれ０．２％、０．０５％、０．０１２５％、０．００３％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に散乱度測定のために６００ｎｍ波長帯のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度を測定し、顕微鏡で結晶形成有無を観察した。
また、別の非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘがそれぞれ０．０５％、０．０１２５％、０．００３％、０．０００８％（ｗ／ｗ）で存在する条件で上記と同様にＡＡＶとタンニン酸溶液とを混合して同様の実験を行い、結果を観察した。
その結果、図２ａに示すように、Ｔｗｅｅｎ ８０は、０．２％及び０．００３％で含まれる場合には結晶構造が形成されたが、０．０５％及び０．０１２５％で含まれる場合にはそれぞれマイクロ及びナノサイズの粒子が形成されたことを確認した。また、図２ｂに示すように、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘは、０．０５％及び０．０１２５％で含まれる場合には結晶構造が形成されたが、０．００３％及び０．０００８％の濃度で含まれる場合にはナノサイズの粒子が形成されたことが分かった。
３－２．両性イオン界面活性剤
両性イオン界面活性剤であるＣＨＡＰＳがそれぞれ０．４％、０．１％、０．０２５％、０．００６％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に、散乱度測定のために６００ｎｍ波長帯のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度を測定し、顕微鏡で結晶形成有無を観察した。
その結果、図２ｃに示すように、ＣＨＡＰＳが０．４％、０．１％及び０．００６％で含まれる場合には結晶構造が形成されたが、ＣＨＡＰＳが０．０２５％で含まれる場合にはナノサイズの粒子が形成されたことを確認した。
３－３．カチオン界面活性剤
カチオン界面活性剤であるＣＴＡＢがそれぞれ０．４％、０．１％、０．０２５％、０．００６％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混ぜた後、約５分後に散乱度測定のために６００ｎｍ波長帯のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度を測定し、顕微鏡で結晶形成有無を観察した。
その結果、図２ｄに示すように、ＣＴＡＢが０．４％及び０．００６％で含まれる場合には結晶構造が形成されたが、ＣＴＡＢが０．１％及び０．０２５％で含まれる場合にはそれぞれマイクロ及びナノサイズの粒子が形成されたことを確認した。
３－４．アニオン界面活性剤
アニオン界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）がそれぞれ０．２％、０．０５％、０．０１２５％、０．０００３％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混ぜた後、約５分後に、散乱度測定のために６００ｎｍ波長帯のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度を測定し、顕微鏡で結晶形成有無を観察した。
その結果、図２ｅに示すように、デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）の場合には、全ての濃度で結晶構造が形成されたことを確認した。
これらの結果より、界面活性剤の種類によって結晶を形成させない有効な濃度がそれぞれ異なり、濃度があまり高い或いは低い場合にはタンニン酸とＡＡＶの結合を効果的に制御できないため、結晶形の粒子が形成される傾向が現れることを確認することができた。
実施例４．ｐＨ条件によるＡＡＶ安定性変化の検証
マイクロ又はナノ粒子の形成は、外部環境の影響によって形成される様相が変わることができ、特にｐＨ条件によって粒子形成の様相が変わることができる。したがって、本発明者らは、ｐＨ条件によるＡＡＶの安定性の変化有無を検証しようとした。このために、ｐＨが異なるそれぞれの異なる緩衝溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、クエン酸ｐＨ４．６、ＤＤＷ ｐＨ３．０）を用いて、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＣＨＡＰＳがそれぞれ０．０５％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液を製造し、ここに０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に動的光散乱法によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で結晶形粒子の形成有無を観察した。
その結果、図３に示すように、ｐＨ３．０を前後にして形成される粒子のサイズ及び結晶形態の程度が変わることを確認することができた。ｐＨ３．０以下の条件では、過剰な凝集が起こって結晶形の粒子が形成されることが分かった。また、ポリフェノールの場合は、塩基性のｐＨ条件では酸化反応が促進されるので、粒子の長期的な安定性を考慮したとき、好ましいｐＨ範囲は約３．０～８．０の間と判断された。
実施例５．体外安定性の検証
ＡＡＶ粒子は、混合後から注入に至る時間までそのサイズと形状を一定に維持しなければならない。したがって、混合後から注入までにかかる時間として推定される３０分及び十分な時間である１日が経過した後まで粒子サイズが維持されるか否かを分析した。このために、Ｔｗｅｅｎ ８０が０．０１％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に、動的光散乱法を用いてそれぞれ０分（ｍｉｎ）、２０分、１日（ｄａｙ）目の平均粒子サイズを測定し、初期値に比べて粒子のサイズ増加を比較した。
その結果、図４ａに示すように、１日目までに粒子サイズに多少の差はあるが、初めて作られた後、概ね粒子のサイズが維持されることを確認した。
これに加えて、様々な種類の界面活性剤、すなわち、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）がそれぞれ０．０５％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニンＬ溶液５０μＬを混ぜた後、約５分後に０分（ｍｉｎ）、３０分、及び１日（ｄａｙ）目にそれぞれ６００ｎｍ波長帯のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度を測定して散乱度を測定し、初期値に対する散乱度増加様相から時間経過による粒子サイズの変化を分析した。
その結果、図４ｂに示すように、各界面活性剤別に形成された粒子のサイズ変化を比較したとき、Ｔｗｅｅｎ ８０が添加された条件で最も安定的に粒子サイズが維持されることを確認した。
実施例６．アルブミンによる安定性増進効果の検証
本発明者らは、ポリフェノールと界面活性剤との結合を用いた粒子形成の際に追加の添加物を処理することにより、粒子のサイズをさらに縮小しようとした。このために、前記添加物としてアルブミンを選定してこれによる効果を検証した。
６－１．アルブミン単独による効果の検証
アルブミンが様々な濃度１０％、１％、０．１％、０．０１％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約１０分後に、動的光散乱法によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で粒子形成有無を観察した。
その結果、図５に示すように、アルブミンを１０％、１％及び０．０１％の濃度で添加した場合には、結晶構造が形成されたのに対し、アルブミンを０．１％の濃度で添加した場合には、マイクロサイズの粒子が形成されたことを確認した。
６－２．界面活性剤とアルブミンの組み合わせによる安定性増進効果の検証
次に、アルブミンが各界面活性剤を用いて既に形成された粒子のサイズをさらに縮小することができるかを調べるために、Ｔｗｅｅｎ ８０が０．０１％（ｗ／ｗ）、ＣＨＡＰＳ及びＣＴＡＢそれぞれが０．０５％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する１×１０８ｇｅｎｏｍｅ／μｌ ＡＡＶ溶液に０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合し、約５分後に１０％（ｗ／ｗ）アルブミン溶液５０μＬを混合した後、動的光散乱法によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で観察した。
その結果、図６に示すように、界面活性剤と一緒にアルブミンを添加することにより、各界面活性剤を用いて既に形成された粒子が、アルブミン処理によって数百ナノメートルサイズに小さくなり、血管閉塞をもたらすおそれのある１０μｍ以上の結晶構造も形成されていないことを確認した。上記の結果から、界面活性剤とアルブミンの組み合わせによってＡＡＶの安定性がさらに増進することが分かった。
実施例７．ＡＡＶ特異的安定性効果の検証
本発明者らは、界面活性剤とタンニン酸との結合効果を用いて、ＡＡＶの他に遺伝子伝達体として利用できる無機ナノ粒子である金ナノ粒子の安定性も維持されるかを調べるために、次の実験を行った。具体的には、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＣＨＡＰＳ及びＣＴＡＢがそれぞれ０．０５％（ｗ／ｗ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で存在する４５０ｎｍ吸光度０．１ＡＵ濃度の金ナノ粒子溶液５０μＬに０．５ｍＭのタンニン酸溶液５０μＬを混合した後、約５分後に動的光散乱法によって平均粒子サイズを測定し、顕微鏡で観察した。また、対照群として界面活性剤が添加されていない同一の条件で実験を行った。
その結果、図７に示すように、金ナノ粒子は、界面活性剤の種類に関係なく、全ての場合に結晶構造が形成されたことが分かり、粒子自体の重さによりＡＡＶに比べてよりひどい凝集現象が現れたことを確認した。これにより、金ナノ粒子などの無機粒子の場合は、界面活性剤を処理して粒子の安定性を維持させる技術を適用することは適しないと判断された。
上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができるであろう。したがって、上述した実施形態は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの安定化技術は、アデノ随伴ウイルスを用いて遺伝子伝達ウイルス及び治療用ナノ粒子を製造し、このための追加のポリフェノール結合体を形成する際にウイルス間の過剰な凝集を阻害して粒子のサイズを薬物送達に有効な大きさに維持させ、液状での安定性を高めるので、アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子治療及び関連分野で有用に利用可能である。

Claims (12)

  1. 界面活性剤又はアルブミンを含む、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）用安定化剤。
  2. 前記界面活性剤は５～２０の親水性－親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ、ＨＬＢ）値を有することを特徴とする、請求項１に記載の安定化剤。
  3. 前記界面活性剤は、アニオン性（Ａｎｉｏｎｉｃ）、カチオン性（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）、非イオン性（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ）及び両性イオン型（Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の安定化剤。
  4. 前記安定化剤は前記アデノ随伴ウイルスの凝集を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の安定化剤。
  5. 前記アデノ随伴ウイルスはポリフェノール系物質で表面改質されていることを特徴とする、請求項１に記載の安定化剤。
  6. 前記ポリフェノール系物質はタンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、又は没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）であることを特徴とする、請求項５に記載の安定化剤。
  7. 前記アルブミンは１０～０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の安定化剤。
  8. アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）及び安定化剤を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含有することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス液状製剤。
  9. 前記液状製剤はｐＨ３．０～８．０に維持されることを特徴とする、請求項８に記載の液状製剤。
  10. アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓａｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）に安定化剤を処理する段階を含み、前記安定化剤は界面活性剤又はアルブミンを含むことを特徴とする、安定性が増進したアデノ随伴ウイルスの製造方法。
  11. 前記アデノ随伴ウイルスはポリフェノール系物質で表面改質されていることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 前記ポリフェノール系物質はタンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、又は没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
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