JP2023513302A - 治療的に活性な作用物質を内皮へと送達するための脂質組成物およびその使用 - Google Patents

治療的に活性な作用物質を内皮へと送達するための脂質組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、脂質組成物、トリカルボン酸、および核酸分子を含む組成物であって、該脂質組成物が、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、該組成物中の該核酸分子によってもたらされる、より少数の負電荷と比較した、該組成物中の該カチオン性脂質分子によってもたらされる、より多数の正電荷から引き起こされる正電荷過剰が、該トリカルボン酸によってもたらされる電荷によって相殺されている、前記組成物と；そのような組成物の使用方法とに関連する。

Description

本発明は、以下に関連する：脂質組成物を含む組成物；疾患を処置するための方法における使用のための、脂質組成物を含む組成物；疾患を処置および／または予防するための医薬を製造するための、脂質組成物を含む組成物の使用；脂質組成物を含む組成物を含む、薬学的組成物；脂質組成物を含む組成物を含む、キット；疾患を処置および／または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、脂質組成物を含む組成物の有効量を投与する段階を含む方法、ならびに組成物を調製するための方法。
分子生物学および分子医学は両方とも、生物学的に活性な化合物を細胞内に導入することに、大幅に依存している。そのような生物学的に活性な化合物は、とりわけ、DNAやRNAとともに、ペプチドおよびタンパク質のそれぞれを、典型的には包含している。突破しなくてはならない障壁は、典型的には脂質二重層であり、これは負に荷電した外面を有している。当技術分野においては、細胞膜を通過させるための、そしてその結果、生物学的に活性な化合物を導入するための、いくつかの技術が開発されている。いくつかの方法は、実験室使用が開始されているが、それらは医学分野において使用することはできず、かつ、薬剤送達用としては極めて不適切である。たとえば、当技術分野において公知のエレクトロポレーションおよび弾道法（ballistic method）は、仮に使用したとしても、生物学的に活性な化合物の局所送達を可能にするのみであろう。前述の脂質二重層とは別に、細胞膜はまた、トランスポーターシステムをも含んでいる。そのため、生物学的に活性な化合物を、細胞膜を通過させて移行させるために、この種のトランスポーターシステムを使用しようとする努力がなされた。しかしながら、そのようなトランスポーターシステムの特異性または交差反応性に起因して、それらを使用することは、広く適用可能な方法ではない。
当技術分野において記述されている、生物学的に活性な化合物を細胞内へと移行させるためにより広く適用可能なアプローチは、ウイルスベクターの使用である。しかしながらウイルスベクターは、いくつかの細胞型へと遺伝子を効率良く移行させるためにしか、使用することができない；ウイルスベクターは、化学合成された分子を細胞内へと導入するために使用することはできない。
別のアプローチは、いわゆるリポソームの使用であった（Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252（非特許文献1））。リポソームは、水中で両親媒性脂質が会合した際に生成される、小胞である。リポソームは典型的には、同心性に配置された、リン脂質の二重層を含む。リポソームは、層の数に応じて、小型単層小胞、多層小胞、および大型多層小胞に分類することが可能である。リポソームは、中間の水性の層の中に親水性の化合物を組み込むことが可能であり、一方で疎水性の化合物は、脂質層の中に組み込まれるため、リポソームは、効果的な送達剤であることが証明されている。脂質製剤の組成、およびその調製方法の両方が、結果的に得られる脂質凝集体の、およびしたがってリポソームの、構造およびサイズに対して影響を及ぼすことは、当技術分野において周知である。リポソームがカチオン性脂質を包含することもまた、公知である。
カチオン性脂質は、リポソームの構成要素である点とは別に、細胞への生体高分子の送達に使用され得るようなものである点でも、興味を引く重要な特徴を有している。カチオン性脂質を用いれば、静電相互作用に起因して、本質的にはいかなるアニオン性化合物も、定量的な様式で封入することが可能である。加えてカチオン性脂質は、負に荷電した細胞膜と相互作用して、細胞膜輸送を開始させると考えられている。生物学的に活性な化合物と組み合わされるような、カチオン性脂質を含むリポソーム製剤の使用、またはカチオン性脂質の使用は、試行錯誤的なアプローチを必要とすることが判明している、これは、典型的にはそれぞれの製剤が、通常は血清の非存在下において、全てではないいくつかの細胞型へとプラスミドを送達可能である、というものであるために、それぞれの製剤の用途が限定されていることによる。
脂質、およびそれらによって輸送されようとする生物学的に活性な化合物の、電荷および／または質量比は、さまざまなタイプの前記生物学的に活性な化合物の送達において、重要な因子であることが判明している。たとえば、塩基5,000～10,000個のサイズのプラスミドを送達するのに適している脂質製剤は、典型的には塩基約10～約50個を含むオリゴヌクレオチドの送達には、たとえばsiRNA分子、合成リボザイム、またはアンチセンス分子などの送達には、概して有効ではないことが、示されている。加えて最近、アンチセンスオリゴヌクレオチドのための最適な送達条件、およびリボザイムのための最適な送達条件は、同じ細胞型であっても異なることが示されている。
米国特許第6,395,713号（特許文献1）は、カチオン性脂質ベースの組成物であって、該カチオン性脂質が、親油基、リンカー、および頭部基からなる、組成物、ならびに、生物学的に活性な化合物を細胞内へと移行させるための、そのような組成物の使用を、開示している。
国際特許出願WO 2005/105152（特許文献2）は、機能的な核酸分子を、たとえばsiRNA分子などを送達するのに特に有効であることが証明された、カチオン性脂質ベースの別の組成物を開示している。
処置される疾患、および送達される薬剤に合わせて、特定の臓器または特定の細胞型へと薬剤を送達する必要性が、存在している。そのような特定の臓器の1つは肺であり、かつそのような特定の細胞型の1つは、肺の内皮細胞である。肺、および肺の内皮細胞を標的とすることは、疾患を、たとえば、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症などを、処置するための薬剤の送達において、有益である。
米国特許第6,395,713号 WO 2005/105152
Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252
本発明の基礎をなす課題は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺へと送達することが可能である手段を、提供することである。本発明の基礎をなすさらなる課題は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺組織へと送達することが可能である手段を、提供することである。本発明の基礎をなす、よりさらなる課題は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺の内皮細胞へと送達することが可能である手段を、提供することである。これらのあらゆる課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、肺疾患を処置するための手段を提供することであり、肺疾患は好ましくは、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、肺疾患である。この課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、肺疾患を処置するための手段の一部としての、送達ビヒクルを提供することであり、肺疾患は好ましくは、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、肺疾患である。この課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、薬学的組成物を提供することである。好ましくは薬学的組成物は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺へと送達するのに適している。本発明の基礎をなすさらなる課題は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺組織へと送達するのに適している薬学的組成物を、提供することである。本発明の基礎をなす、よりさらなる課題は、作用物質を、好ましくは治療的に活性な作用物質を、より好ましくは薬剤を、肺の内皮細胞へと送達するのに適している薬学的組成物を、提供することである。これらのあらゆる課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、医薬の製造において使用することができる手段を提供することであり、ここで医薬は、肺疾患の処置において使用するのに適しているか、または肺疾患の処置において使用するためのものであり、肺疾患は好ましくは、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、肺疾患である。この課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、疾患を処置するための方法および／または予防を提供することであり、該方法は、それを必要とする対象に、治療的または薬学的に活性な作用物質を含む、好ましくは薬剤を含む、有効量の組成物を投与する段階を含む。本発明の基礎をなすさらなる課題は、肺疾患を処置および／または予防するための方法を提供することであり、該方法は、それを必要とする対象に、治療的または薬学的に活性な作用物質を含む、好ましくは薬剤を含む、有効量の組成物を投与する段階を含む。本発明の基礎をなす、よりさらなる課題は、疾患を、好ましくは肺疾患を、処置および／または予防するための方法を提供することであり、該方法において、処置は、治療的または薬学的に活性な作用物質を、肺へと、好ましくは肺の内皮細胞へと、送達することを含む。これらのあらゆる課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、キットを提供することである。好ましくは、キットは以下の使用に適している：(a) 疾患を、好ましくは肺疾患を、処置および／または予防するための方法における使用、(b) 生物学的に活性な作用物質、治療的に活性な作用物質、および／もしくは薬学的に活性な作用物質を、細胞内へと移行させる、または細胞膜を通過して移行させる方法における使用であって、好ましくはそのような細胞が肺の内皮細胞である、使用、ならびに／または(c) 医薬の、好ましくは疾患を処置および／もしくは予防するための医薬の、より好ましくは肺疾患を処置および／もしくは予防するための医薬の、ならびに最も好ましくは、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される肺疾患を処置および／もしくは予防するための医薬の、製造における使用。これらのあらゆる課題に関して、作用物質および薬剤はそれぞれ、好ましくはmRNAである。
本発明の基礎をなす別の課題は、複数の細胞への、好ましくは肺の複数の内皮細胞への、効果的なトランスフェクションのための手段を提供することであり、ここで、所定の量の脂質組成物、および所定の量の核酸、たとえばmRNAなどから開始して、該所定の量の核酸は、複数の細胞のうちの大部分にトランスフェクトされる。好ましくは手段は、本発明の基礎をなす他の課題にしたがった手段である。
本発明の基礎をなす、よりさらなる課題は、所定の量の、好ましくは所定のモル量の、核酸、たとえばmRNAなどにおいて作製可能な、脂質ナノ粒子の数を増加させるための手段を提供することであり、ここで、そのような脂質ナノ粒子は、細胞へと、好ましくは肺の内皮細胞へと、効率良くトランスフェクトされることが可能であり、および／またはそのような脂質ナノ粒子は、細胞へと、好ましくは肺の内皮細胞へと、有効量の核酸を効率良く導入することが可能である。
本発明の基礎をなす別の課題は、単分散のサイズ分布を有する脂質ナノ粒子を作製する手段を提供することである。
本発明の基礎をなす、よりさらなる課題は、所定の量の、好ましくはモル量の、核酸、たとえばmRNAなどにおいて作製可能な、脂質ナノ粒子の数を増加させる手段を提供することであり、ここで、そのような脂質ナノ粒子は、細胞へと、好ましくは肺の内皮細胞へと、効率良くトランスフェクトされることが可能であり、および／またはそのような脂質ナノ粒子は、細胞へと、好ましくは肺の内皮細胞へと、有効量の核酸を効率良く導入することが可能であり、かつここで脂質ナノ粒子は、単分散のサイズ分布を有する。
本発明の基礎をなすさらなる課題は、細胞のエンドソームからの、核酸分子の、たとえばmRNAなどの、放出を増大させることを可能にする手段を提供することである。好ましくはそのような手段は、核酸を含む、好ましくはmRNAを含む、脂質製剤であり、より好ましくは脂質ナノ粒子であり、それらの、エンドソームからの放出は、インビトロまたはインビボでの細胞へのトランスフェクションの際に増大する。
これらの課題および他の課題は、添付の独立請求項に記載の事項によって解決される。好ましい態様は、添付の従属請求項から理解され得る。これらの課題および他の課題はまた、以下の態様によっても解決される。
態様1．脂質組成物、トリカルボン酸、および核酸分子を含む組成物であって、該脂質組成物が、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質（shielding lipid）を含む、前記組成物。
態様2．前記組成物中の前記核酸分子によってもたらされる、より少数の負電荷と比較した、該組成物中の前記カチオン性脂質分子によってもたらされる、より多数の正電荷
から引き起こされる正電荷過剰が、前記トリカルボン酸によってもたらされる電荷によって相殺されている、態様1の組成物。
態様3．核酸分子がmRNA分子である、態様1～2のいずれかの組成物。
態様4．単分散組成物である、態様1、2、および3のいずれかの組成物。
態様5．前記組成物中の前記トリカルボン酸の量が、該組成物が単分散組成物であるような量である、態様4の組成物。
態様6．前記組成物中の前記トリカルボン酸の量が、該組成物が多分散組成物である場合のトリカルボン酸の濃度よりも多い、態様4および5のいずれかの組成物。
態様7．前記組成物中の核酸分子の質量に対する、好ましくはmRNA分子の質量に対する、製剤中の全脂質の質量の比（m/m比（全脂質／mRNA））が、10～140である、態様1～6のいずれかの組成物。
態様8．m/m比（全脂質／mRNA）が10～20であり、好ましくは12～16であり、およびより好ましくは14である、態様7の組成物。
態様9．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様8の組成物。
態様10．m/m比（全脂質／mRNA）が20～40であり、好ましくは24～32であり、およびより好ましくは28である、態様7の組成物。
態様11．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様10の組成物。
態様12．m/m比（全脂質／mRNA）が40～80であり、好ましくは48～64であり、より好ましくは56である、態様7の組成物。
態様13．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.15 mg/mlである、態様12の組成物。
態様14．m/m比（全脂質／mRNA）が80～140であり、好ましくは96～128であり、より好ましくは112である、態様7の組成物。
態様15．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約0.65 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.5 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.3 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.1 mg/mlである、態様14の組成物。
態様16．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が1.35μmol/ml～3.23μmol/mlであり、好ましくは1.72μmol/ml～2.86μmol/mlである、態様7～15のいずれかの、好ましくは態様8および9のいずれかの、組成物。
態様17．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が2.76μmol/ml～6.40μmol/mlであり、好ましくは3.55μmol/ml～5.73μmol/mlである、態様7～15のいずれかの、好ましくは態様10および11のいずれかの、組成物。
態様18．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が5.52μmol/ml～12.80μmol/mlであり、好ましくは6.87μmol/ml～11.45μmol/mlである、態様7～15のいずれかの、好ましくは態様12および13のいずれかの、組成物。
態様19．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が10.98μmol/ml～25.66μmol/mlであり、好ましくは13.64μmol/ml～22.90μmol/mlである、態様7～15のいずれかの、好ましくは態様14および15のいずれかの、組成物。
態様20．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物のmRNA分子の量が約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様1～15のいずれかの、好ましくは態様7～19のいずれかの、より好ましくは態様16～19のいずれかの、組成物。
態様21．脂質組成物が粒子を形成している、態様1～20のいずれかの、好ましくは態様7～20のいずれかの、より好ましくは態様16～20のいずれかの、組成物。
態様22．粒子がトリカルボン酸を含む、態様21の組成物。
態様23．トリカルボン酸が粒子に含まれている、態様22の組成物。
態様24．トリカルボン酸が脂質組成物と複合体を形成している、態様1～23のいずれかの組成物。
態様25．トリカルボン酸が、粒子の内部に結合しているか、または粒子と結合している、態様22～24のいずれかの組成物。
態様26．前記組成物および／または粒子の透析後に、トリカルボン酸が粒子に結合されているか、または粒子と結合している、態様25の組成物。
態様27．粒子が核酸分子を、好ましくはmRNA分子を含む、態様21の組成物。
態様28．核酸分子が、好ましくはmRNA分子が、粒子の一部を形成している、態様21～27のいずれかの組成物。
態様29．核酸分子が、好ましくはmRNA分子が、治療的に活性である、態様1～28のいずれかの組成物。
態様30．粒子のサイズが30 nm～200 nmであり、好ましくは約40 nm～約140 nmであり、およびさらにより好ましくは約60 nm～120 nmである、態様1～29のいずれかの組成物。
態様31．粒子のサイズが動的光散乱法によって決定される、態様30の組成物。
態様32．粒子がゼータ電位を有しており、該粒子の該ゼータ電位が約+0 mV～約+80 mVであり、好ましくは該粒子の該ゼータ電位が約+0 mV～約+45 mVである、態様21～31のいずれかの組成物。
態様33．ゼータ電位がレーザードップラー電気泳動測定法によって測定される、態様32の組成物。
態様34．トリカルボン酸が、クエン酸、イソクエン酸（1-ヒドロキシプロパン-1,2,3-トリカルボン酸）、cis-アコニット酸、trans-アコニット酸、cis-アコニット酸およびtrans-アコニット酸の両方の混合物、プロパン-1,2,3-トリカルボン酸（トリカルバリル酸）、アガリン酸、トリメシン酸、ならびにそれらの任意の混合物を含む群より選択される、態様1～33のいずれかの、好ましくは態様7～20のいずれかの、組成物。
態様35．トリカルボン酸がクエン酸である、34の組成物。
態様36．担体を、好ましくは薬学的に許容される担体を含む、態様1～35のいずれかの組成物。
態様37．担体が、水、水溶液、好ましくは等張水溶液、スクロース溶液、好ましくは等張スクロース溶液、塩溶液、好ましくは等張塩溶液、緩衝液、好ましくは等張緩衝液、および水混和性の溶媒を含む群より選択される、態様36の組成物。
態様38．担体が、等張水溶液、等張水溶液、等張スクロース溶液、等張塩溶液、および等張緩衝液を含む群より選択される、態様37の組成物。
態様39．担体がスクロース水溶液であり、好ましくは270 mMのスクロース水溶液であるか、または緩衝液中の270 mMのスクロース溶液であり、好ましくは該緩衝液がpH 7.4の10 mM TRIS緩衝液である、態様36～38のいずれかの組成物。
態様40．カチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、好ましくはカチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、態様1～39のいずれかの組成物。
態様41．中性脂質が、
(a)ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
(b) コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、
好ましくは、リン脂質であるジフィタノイル-PEである、
態様1～40のいずれかの、好ましくは態様40の、組成物。
態様42．遮蔽脂質が、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、およびメトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質である、態様1～41のいずれかの、好ましくは態様41の、組成物。
態様43．遮蔽脂質がPEG化脂質であり、好ましくは該PEG化脂質がメトキシPEG2000-DSPEである、態様1～42のいずれかの、好ましくは態様40～42のいずれかの、より好ましくは態様42の、組成物。
態様44．脂質組成物中の脂質のモル比が、
- 約20 mol%～約80 mol%のカチオン性脂質、
- 約10 mol%～約70 mol%の中性脂質、および
- 約0.1 mol%～10 mol%の、好ましくは約1 mol%～約10 mol%の、遮蔽脂質であって、好ましくはPEG化脂質である、遮蔽脂質
であり、
全体の脂質含量が100%である、
態様1～43のいずれかの組成物。
態様45．PEG化脂質のPEGの分子量が約750 Da～約5000 Daであり、好ましくは約1500 Da～3000 Daである、態様44の組成物。
態様46．脂質組成物中の脂質のモル比が、
約35 mol%～約65 mol%のカチオン性脂質、
- 約35 mol%～約65 mol%の中性脂質、および
- 約0.1 mol%～5 mol%の遮蔽脂質、好ましくはPEG化脂質
であり、
全体の脂質含量が100%である、
態様45の組成物であって、
好ましくは、組成物中の脂質のモル比が、
- 約45 mol%～約55 mol%のカチオン性脂質、
- 約45 mol%～約55 mol%の中性脂質、および
- 約0.5 mol%～2 mol%
であり、
全体の脂質含量が100%である、
前記組成物。
態様47．脂質組成物のモル比が、
- 50 mol%のカチオン性脂質であって、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、カチオン性脂質、
- 49 mol%の中性脂質であって、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）である、中性脂質、および
- 1 mol%の遮蔽脂質であって、mPEG-2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（好ましくはナトリウム塩として））である、遮蔽脂質
である、態様1～46のいずれかの、好ましくは態様44～46のいずれかの、組成物。
態様48．前記組成物中の核酸分子の質量に対する、好ましくはmRNA分子の質量に対する、製剤中の全脂質の質量の比（m/m比（全脂質／mRNA））が、10～140である、態様47の組成物。
態様49．m/m比（全脂質／mRNA）が10～20であり、好ましくは12～16であり、およびより好ましくは14である、態様48の組成物。
態様50．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり；および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様49の組成物。
態様51．m/m比（全脂質／mRNA）が20～40であり、好ましくは24～32であり、およびより好ましくは28である、態様48の組成物。
態様52．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり；および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様51の組成物。
態様53．m/m比（全脂質／mRNA）が40～80であり、好ましくは48～64であり、より好ましくは56である、態様48の組成物。
態様54．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり；および最も好ましくは約0.15 mg/mlである、態様53の組成物。
態様55．m/m比（全脂質／mRNA）が80～140であり、好ましくは96～128であり、より好ましくは112である、態様48の組成物。
態様56．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約0.65 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.5 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.3 mg/mlであり；および最も好ましくは約0.1 mg/mlである、態様55の組成物。
態様57．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が1.35μmol/ml～3.23μmol/mlであり、好ましくは1.72μmol/ml～2.86μmol/mlである、態様48～56のいずれかの、好ましくは態様49および50のいずれかの、組成物。
態様58．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が2.76μmol/ml～6.40μmol/mlであり、好ましくは3.55μmol/ml～5.73μmol/mlである、態様48～56のいずれかの、好ましくは態様51および52のいずれかの、組成物。
態様59．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が5.52μmol/ml～12.80μmol/mlであり、好ましくは6.87μmol/ml～11.45μmol/mlである、態様48～56のいずれかの、好ましくは態様53および54のいずれかの、組成物。
態様60．製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が10.98μmol/ml～25.66μmol/mlであり、好ましくは13.64μmol/ml～22.90μmol/mlである、態様48～56のいずれかの、好ましくは態様55および56のいずれかの、組成物。
態様61．前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～約0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、態様44～60のいずれかの、好ましくは態様47～60のいずれかの、より好ましくは態様57～60のいずれかの、組成物。
態様62．治療的に活性な作用物質を内皮細胞へと送達するのに適している、態様1～61のいずれかの組成物。
態様63．内皮細胞が肺の内皮細胞である、態様62の組成物。
態様64．治療的に活性な作用物質を、血管系へと、好ましくは肺血管系へと、より好ましくはヒトの肺血管系へと、送達するのに適している、態様1～63のいずれかの組成物。
態様65．脂質組成物を含む組成物であって、該脂質組成物がカチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、
該カチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、
該中性脂質が、
ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho））を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、
該遮蔽脂質が、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、メトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質であり、かつ
該組成物がmRNAを含む、
前記組成物。
態様66．脂質組成物を含む組成物であって、該脂質組成物がカチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、
該カチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、
該中性脂質が、
ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、かつ
該遮蔽脂質が、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、およびメトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質であり、かつ
該脂質組成物が粒子を形成しており、粒子のサイズが(a) 30 nm～200 nmであり、好ましくは約40 nm～約140 nmであり、およびさらにより好ましくは約60 nm～120 nmであるか、または(b) 約30 nm～約100 nmであり、好ましくは約30 nm～約60 nmである、
前記組成物。
態様67：mRNAを含む、態様66の組成物。
態様68：脂質組成物が粒子を形成しており、粒子のサイズが約30 nm～約200 nmであり、好ましくは粒子のサイズが約40 nm～約140 nmであり、およびさらにより好ましくは約60 nm～120 nmであるか、または(b) 約30 nm～約100 nmであり、好ましくは約30 nm～約60 nmである、態様65の組成物。
態様69：粒子がmRNAを含む、態様66～68のいずれかの組成物。
態様70：粒子のサイズが動的光散乱法によって決定される、態様65～69のいずれかの組成物。
態様71：粒子のゼータ電位が約+0 mV～約+80 mVであり、好ましくは粒子のゼータ電位が約+0 mV～約+45 mVである、態様1～70のいずれかの組成物。
態様72：ゼータ電位がレーザードップラー電気泳動測定法によって測定される、態様71の組成物。
態様73：mRNAが粒子の一部を形成している、態様65および67～72のいずれかの組成物。
態様74：前記組成物のmRNAの質量に対する該組成物の全脂質含量の質量の比が、約2～約50であり、好ましくは約5～40であり、およびより好ましくは約10～約30である、態様65および66～73のいずれかの組成物。
態様75：治療的に活性な作用物質を内皮細胞へと送達するのに適している、態様65～74のいずれかの組成物。
態様76：内皮細胞が肺の内皮細胞である、態様75の組成物。
態様77：治療的に活性な作用物質を、血管系へと、好ましくは肺血管系へと、より好ましくはヒトの肺血管系へと、送達するのに適している、態様65～76のいずれかの組成物。
態様78：治療的に活性な作用物質がmRNAであり、好ましくは治療的に活性な作用物質が、前記組成物に含まれるmRNAである、態様65～77のいずれかの組成物。
態様79：mRNAが脂質組成物と複合体を形成している、態様65～78のいずれかの組成物。
態様80：担体を、好ましくは薬学的に許容される担体を含む、態様65～79のいずれかの組成物。
態様81：担体が、水、水溶液、好ましくは等張水溶液、スクロース溶液、好ましくは等張スクロース溶液、塩溶液、好ましくは等張塩溶液、緩衝液、好ましくは等張緩衝液、および水混和性の溶媒を含む群より選択される、態様80の組成物。
態様82：担体が、等張水溶液、等張水溶液、等張スクロース溶液、等張塩溶液、および等張緩衝液を含む群より選択される、態様81の組成物。
態様83：担体がスクロース水溶液であり、好ましくは270 mMのスクロース水溶液であるか、または緩衝液中の270 mMのスクロース溶液であり、好ましくは該緩衝液がpH 7.4の10 mM TRIS緩衝液である、態様80～82のいずれかの組成物。
態様84：PEG化脂質のPEGの分子量が約750 Da～約5000 Daであり、好ましくは約1500 Da～3000 Daである、態様65～83のいずれかの組成物。
態様85：脂質組成物中の脂質のモル比が、
- 約20 mol%～約80 mol%のカチオン性脂質、
- 約10 mol%～約70 mol%の中性脂質、および
- 約0.1 mol%～10 mol%のPEG化脂質
であり、
全体の脂質含量が100%である、
態様65～84のいずれかの組成物。
態様86．脂質組成物中の脂質のモル比が、
- 約35 mol%～約65 mol%のカチオン性脂質、
- 約35 mol%～約65 mol%の中性脂質、および
- 約0.1 mol%～5 mol%のPEG化脂質
であり、
全体の脂質含量が100%である、
態様85の組成物。
態様87：カチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、態様65～86のいずれかの組成物。
態様88：中性脂質が、リン脂質であるジフィタノイル-PEである、態様65～87のいずれかの、好ましくは態様84の、組成物。
態様89：PEG化脂質がメトキシPEG2000-DSPEである、態様65～88のいずれかの、好ましくは態様87および88のいずれかの、より好ましくは態様88の、組成物。
態様90：脂質組成物のモル比が、
- 50 mol%のカチオン性脂質であって、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、カチオン性脂質、
- 49 mol%の中性脂質であって、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）である、中性脂質、および
- 1 mol%の遮蔽脂質であって、mPEG-2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（好ましくはナトリウム塩として））である、遮蔽脂質
である、態様65～89のいずれかの組成物。
態様91：疾患を処置および／または予防するための方法における使用のための、態様1～90のいずれかの組成物。
態様92：処置および／または予防が、内皮細胞への、好ましくは血管系の内皮細胞への、より好ましくは肺血管系の内皮細胞への、組成物の投与、または組成物のmRNAの投与を含む、態様91の使用のための組成物。
態様93：内皮がヒト内皮である、態様92の使用のための組成物。
態様94：疾患が、該疾患の根底にある病理メカニズムに関連する標的分子が肺血管系の内皮細胞に存在する疾患であり、かつmRNAの提供が治療効果をもたらす、態様92～93のいずれかの使用のための組成物。
態様95：疾患が、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、態様91～94のいずれかの使用のための組成物。
態様96：静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、硝子体内投与、髄腔内投与、血管周囲投与、鼻腔内投与、および／または吸入による投与のための、好ましくは静脈内投与のための、態様91～95のいずれかの組成物。
態様97：疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、態様1～90のいずれかの組成物の使用。
態様98：疾患の処置および／または予防が、内皮細胞への、好ましくは血管系の内皮細胞への、より好ましくは肺血管系の内皮細胞への、組成物の投与または組成物の核酸分子の投与を、好ましくは組成物のmRNA分子の投与を含む、態様97の使用。
態様99：内皮がヒト内皮である、態様98の使用。
態様100：疾患が、該疾患の根底にある病理メカニズムに関連する標的分子が肺血管系の内皮細胞に存在する疾患であり、かつ核酸分子の提供が、好ましくはmRNA分子の提供が、治療効果をもたらす、態様98～99のいずれかの使用。
態様101：疾患が、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、態様97～100のいずれかの使用。
態様102：医薬が、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、硝子体内投与、髄腔内投与、血管周囲投与、鼻腔内投与、および／または吸入による投与のための医薬であり、好ましくは該医薬が静脈内投与のための医薬である、態様97～101のいずれかの使用。
態様103：態様1～90のいずれかの組成物と薬学的に活性な作用物質とを含む、薬学的組成物。
態様104：態様1～90のいずれかの組成物の核酸分子、および好ましくはmRNAが、何らかの治療的に活性な作用物質であるか、または前記治療的に活性な作用物質である、態様103の薬学的組成物。
態様105：疾患の処置および／または予防における使用のための、態様103～104のいずれかの薬学的組成物であって、該疾患が、好ましくは、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、前記薬学的組成物。
態様106：態様1～90のいずれかの組成物と使用指示書とを含む、キット。
態様107：疾患を処置および／または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、態様1～90のいずれかの組成物を投与する段階を含み、該組成物の核酸分子が、好ましくはmRNA分子が、治療的に活性であり、より好ましくは、核酸分子が、より好ましくはmRNA分子が、疾患を処置するのに適している、前記方法。
態様108：疾患が、好ましくは、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、態様107の方法。
態様109：対象が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマを含む群より選択され、好ましくは対象がヒトである、態様107～108のいずれかの方法。
態様110：態様1～90のいずれかの組成物を調製するための方法であって、脂質組成物の脂質成分を含む溶液を、核酸分子を含む、好ましくはmRNA分子を含む溶液と、混合する段階を含み、より好ましくは、該混合がインライン混合である、前記方法。
態様111：混合が、非乱流かつ拡散ベースの混合であり、好ましくは非乱流かつ拡散ベースの急速な混合である、態様111の方法。
態様112：混合がマイクロ流体混合であり、好ましくはマイクロ流体混合装置を用いるマイクロ流体混合である、態様110～111のいずれかの方法。
態様113：マイクロ流体混合装置が、スタガードヘリンボーンミキサー（staggered herringbone mixer）、マイクロ流体の流体力学的混合装置（microfluidic hydrodynamic mixing device）、またはディーン渦分岐混合装置（Dean Vortex bifurcating mixing device）を含む群より選択される、態様112の方法。
態様114：脂質成分を含む溶液が、水混和性の有機溶媒中に、脂質組成物の成分を含む、態様110～113のいずれかの方法。
態様115：水混和性の有機溶媒が、エタノール、アセトン、1-ブタノール、2-ブタノール、tert-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、1-プロパノール、2-プロパノール、ジメチルスルホキシドを含む群より選択され、好ましくは該水混和性の溶媒が、エタノール、tert-ブタノール、および1-ブタノールを含む群より選択される、態様114の方法。
態様116：核酸分子を含む、好ましくはmRNA分子を含む、溶液が、水中または水性緩衝液中に核酸分子を、好ましくはmRNA分子を含む、態様110～115のいずれかの方法。
態様117．
(a) 前記組成物が、態様1～64のいずれかの組成物である場合、水性緩衝液が、トリカルボン酸の緩衝液である；および
(b) 該組成物が、態様65～90のいずれかの組成物である場合、該緩衝液が、酢酸塩緩衝液、TRIS緩衝液（2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール）、またはHEPES緩衝液（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸）である、
態様116の方法。
態様118．緩衝液が、クエン酸の緩衝液、イソクエン酸（1-ヒドロキシプロパン-1,2,3-トリカルボン酸）の緩衝液、cis-アコニット酸の緩衝液、trans-アコニット酸の緩衝液、cis-アコニット酸およびtrans-アコニット酸の両方の混合物の緩衝液、プロパン-1,2,3-トリカルボン酸（トリカルバリル酸）の緩衝液、アガリン酸の緩衝液、トリメシン酸の緩衝液、ならびにそれらの任意の混合物を含む群より選択される緩衝液であり、好ましくは緩衝液がクエン酸塩緩衝液である、態様117の方法。
態様119．緩衝液がトリカルボン酸の緩衝液であり、好ましくはクエン酸塩緩衝液であり、該緩衝液が0.1 mM～300 mMであり、好ましくは1～150 mMであり、およびより好ましくは10 mM～80 mMである、態様117～118のいずれかの方法。
態様120．緩衝液がトリカルボン酸の緩衝液であり、好ましくはクエン酸塩緩衝液であり、該緩衝液のpHが3～7であり、好ましくは4～6であり、およびより好ましくは4.5～5.7である、態様117～119のいずれかの方法。
態様121：核酸分子を含む、好ましくはmRNA分子を含む、溶液の、脂質組成物の脂質成分を含む溶液に対する、体積での混合比が、約1:1～約6:1であり、好ましくは約2:1～約4:1である、態様110～120のいずれかの方法。
態様122：混合後に、有機溶媒が混合物から除去される、態様110～121のいずれかの方法。
態様123：混合後に、透析、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、および／またはダイアフィルトレーションによって、有機溶媒が混合物から除去される、態様122の方法。
態様124：透析、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、および／またはダイアフィルトレーションが、50%未満の、45%未満の、40%未満の、35%未満の、30%未満の、25%未満の、20%未満の、15%未満の、10%未満の、5%未満の、1%未満の、または0%のトリカルボン酸を、組成物から、好ましくは脂質組成物から、より好ましくは、該脂質組成物によって形成された粒子から、除去する、態様123の方法。
態様125：タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、ダイアフィルトレーション、および／または透析において使用される限外ろ過膜が、約1,500 Da～約500,000 Daの、好ましくは約1,500 Da～約100,000 Daの、およびより好ましくは約1,500 Da～約30,000 Daの、分子量カットオフを有する、態様123～124のいずれかの方法。
態様126：混合後に、好ましくは有機溶媒が除去された後に、反応混合物が濃縮される、態様110～125のいずれかの方法。
態様127：反応混合物が、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、および／またはダイアフィルトレーションによって濃縮される、態様126の方法。
態様128：濃縮後の反応混合物が、すぐに使用可能な組成物である、態様126～127のいずれかの方法。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、脂質組成物、トリカルボン酸、およびmRNAを含む組成物によって解決され、ここで脂質組成物は、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含むものであり；中でも特に、上述の態様1にしたがったこの組成物は、発明（本発明）の第1の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、脂質組成物を含む組成物によっても解決され、ここで脂質組成物は、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、
ここでカチオン性脂質は、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、
ここで中性脂質は、
ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho））を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、
ここで遮蔽脂質は、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、メトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質であり、かつ
ここで組成物は、mRNAを含むものであり；
中でも特に、上述の態様65にしたがったこの組成物は、発明（本発明）の第2の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、脂質組成物を含む組成物によっても解決され、ここで脂質組成物は、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、
ここでカチオン性脂質は、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、
ここで中性脂質は、
ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、かつ
ここで遮蔽脂質は、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、およびメトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質であり、かつ
ここで脂質組成物は粒子を形成しており、粒子のサイズは(a) 30 nm～200 nmであり、好ましくは約40 nm～約140 nmであり、より好ましくは約60 nm～約120 nmであるか；または(b) 約30 nm～約100 nmであり、好ましくは約30 nm～約60 nmであり；
中でも特に、上述の態様66にしたがったこの組成物は、発明（本発明）の第3の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、疾患を処置および／または予防するための方法における使用のための、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物によって解決され；中でも特に、上述の態様91にしたがった、そのような使用のための組成物は、発明（本発明）の第4の局面とも称される。
相反するように指定されない限り、本発明の第1の局面のいずれの態様も、本発明の第2および第3の態様のうちの1つの態様と等しく、かつ逆もまた同じであることが、理解されるべきである。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面の組成物の使用によって解決され；中でも特に、上述の態様97にしたがったこの使用は、発明（本発明）の第5の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物と、薬学的に活性な作用物質とを含む、薬学的組成物によって解決され；中でも特に、上述の態様103にしたがったこの薬学的組成物は、発明（本発明）の第6の局面とも称される。第6の局面による薬学的組成物はまた、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物を含む、薬学的組成物でもあり、ここで、核酸は、好ましくはmRNAは、該薬学的組成物の治療的作用物質であり、かつ、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面によるそのような組成物の、残余の部分、またはその一部は、該薬学的組成物に含まれる、前記薬学的に許容される賦形剤、または何らかの薬学的に許容される賦形剤を、形成している。好ましくは、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面によるそのような組成物のうちの、脂質組成物を除く、好ましくはその脂質を除く、残余の部分は、該薬学的組成物に含まれる、前記薬学的に許容される賦形剤、または何らかの薬学的に許容される賦形剤を、形成している。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物と、使用指示書とを含む、キットによって解決され；中でも特に、上述の態様106にしたがったこのキットは、発明（本発明）の第7の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、疾患を処置および／または予防するための方法によって解決され、ここで該方法は、それを必要とする対象に、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物を投与する段階を含み、ここで、組成物の核酸分子は、好ましくはmRNAは、治療的に活性であり、好ましくは、核酸分子は、より好ましくはmRNAは、疾患を処置するのに適しており；中でも特に、上述の態様107にしたがったこの方法は、発明（本発明）の第8の局面とも称される。
本発明によれば、本発明の基礎をなす課題は、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物を調製するための方法によって解決され、ここで該方法は、脂質組成物の脂質成分を含む溶液を、核酸分子を含む、好ましくはmRNA分子を含む溶液と、混合する段階を含み、ここで好ましくは、混合がインライン混合であり；中でも特に、上述の態様110にしたがったこの方法は、発明（本発明）の第9の局面とも称される。
本発明によれば、第1、第2、および第3の局面による組成物はまた、発明（本発明）の組成物、または発明（本発明）による組成物とも称される。
特に本発明の第1の局面に関連して、先行技術の脂質ナノ粒子が参照される場合、先行技術のそのような脂質ナノ粒子は、本発明の組成物および脂質ナノ粒子のようなトリカルボン酸を、含まない脂質ナノ粒子であることが、理解されるべきである。
本発明、および特にそのいずれの態様をも含めたその第1の局面は、脂質組成物と、トリカルボン酸とを、たとえばクエン酸とを含む組成物が、所定の一定量の前記核酸分子において、該脂質組成物から形成される脂質粒子の数の増加をもたらしつつ、同時に単分散の粒子サイズ分布を維持するという、驚くべき発見に基づいている。後者は、組成物が核酸分子を、たとえばmRNAなどを含む場合に、特に顕著である。言い換えると、脂質粒子を含む組成物、および特に脂質ナノ粒子（LNP）を含む組成物が形成されるように、所定の量の脂質組成物、および所定の量の核酸が提供される際、トリカルボン酸は、形成された脂質粒子の全体にわたって、核酸分子が均一に分布することを可能にしており、加えて、形成された脂質粒子は、全脂質の核酸分子に対するモル質量比であって、トリカルボン酸の非存在下では組成物が多分散の粒子サイズ分布を示すであろうモル質量比においてさえも、単分散の粒子サイズ分布を示す。このようにして作製された脂質ナノ粒子は、典型的には増加した質量比を有しており、本明細書において使用される場合、質量比とは、組成物中の核酸の質量に対する、および特にmRNAの質量に対する、組成物の全脂質の質量として定義される（たとえばm/m比（全脂質／mRNA））。上述の発見は、核酸分子の負電荷の量、およびしたがって核酸分子の負電荷の数が、組成物中の脂質の正電荷の総数よりも低い場合に、好ましくは有意に低い場合に、特に観察される。そのような状況は、ときおり、組成物において核酸分子の量が限定されている状況とも称される。
何らかの理論に拘束されることを希望するものではないが、トリカルボン酸は、多数の脂質粒子の全体にわたって、および特に多数の脂質ナノ粒子の全体にわたって、所定の － 限定された － 量の核酸分子を均一に分布させるために、スタッファー分子として作用し、かつそのような範囲で使用可能であると、本発明者らは推測している。これは、トリカルボン酸が非毒性および／または非免疫原性である場合に、特に有益である。
本発明者らはまた、驚くべきことに、脂質組成物および核酸分子を含む組成物であって、脂質組成物がカチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含む組成物であり、かつ、組成物中の核酸分子によって、および場合によってはそれと遮蔽脂質とによってもたらされる、より少数の負電荷と比較した、組成物中のカチオン性脂質分子によってもたらされる、より多数の正電荷から引き起こされる正電荷過剰を示す組成物に、トリカルボン酸を添加すると、単分散の粒子分布を有するものから多分散の粒子分布を有するものへの組成物の移行が回避されることを発見した。
1つの態様において、本発明の組成物におけるトリカルボン酸の含量、および特にクエン酸の含量は、実施例6に開示されるアッセイの手段によって決定され得、該開示は、参照により、本説明の広範な部分に組み入れられる。
そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面の1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、電荷（charge）とは、電荷（electrical charge）である。それと一致して、負電荷（negative charge）とは負電荷（negative electrical charge）であり、かつ正電荷（positive charge）とは正電荷（positive electrical charge）である。
本発明の組成物の、単分散の粒子サイズ分布に関して、そのような単分散の粒子サイズ分布は、多分散の粒子サイズ分布よりも有益であることが、理解されるべきである。そのような利点は特に、対象への投与の際の、好ましくは治療目的での、診断目的での、および／またはセラノスティクス目的での対象への投与の際の、対象における、組成物のより均一な分布、および特にそのような組成物の粒子の、より均一な分布にある。対象における、そのようなより均一な分布は、より制御されかつより効果的である、標的細胞へのトランスフェクションを可能にし、かつしたがって、組成物および粒子それぞれのペイロードの送達、たとえば核酸の送達、および特にmRNAの送達における、有効性の増大を可能にする。典型的には、対象における、より制御されかつより効果的である、標的細胞へのトランスフェクションは、対象において副作用の低下をもたらす。さらに、粒子のより均一な分布は、ナノ粒子の製造プロセス内でのバッチ間での比較可能性を、より信頼性のあるものにすることを可能にする。
本発明、および特にそのいずれの態様をも含めたその第1の局面は、脂質組成物における、トリカルボン酸の、たとえばクエン酸などの使用が、該組成物の細胞へのトランスフェクションの際に、そのようなトリカルボン酸を含む脂質組成物からの、核酸分子の放出の増大をもたらすという、さらに驚くべき発見に基づいている。何らかの理論に拘束されることを希望するものではないが、核酸分子の放出のそのような増大は、典型的には約6であるエンドソームのpHにおける、トリカルボン酸の高い緩衝能によって生じると、本発明者らは推測している。そのような高い緩衝能に起因して、エンドソームの酸性化、およびそれによるエンドソームの成熟が防止され得、そして結果的に、エンドソームによる、細胞質内へのインタクトな核酸分子の放出が、増大する。インタクトな核酸分子の、そのような放出の増大には、該核酸分子が治療的に活性な分子である場合、核酸分子のより迅速でかつより広範囲にわたる効果が、たとえば治療効果などが、付随する。
本発明者らは、驚くべきことに、以下の組成物：
脂質組成物を含む組成物であって、脂質組成物がカチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含み、
カチオン性脂質が、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩））、およびDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール）を含む群より選択され、
中性脂質が、
ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE（（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、POPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン））、およびDSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を含む群より選択される、双性イオン性リン脂質であるか、または
コレステロールおよびスチグマステロールを含む群より選択される、非荷電のステロール脂質であり、
遮蔽脂質が、メトキシPEG-DSPE（（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（アンモニウム塩またはナトリウム塩として）、メトキシPEG-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-DSG（1,2-ジステアロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール）、メトキシPEG-c-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール))カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol))carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））、メトキシPEG-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）、メトキシPEG-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)]}）を含む群より選択されるPEG化脂質である、
組成物
が、内皮細胞を、好ましくは血管系の内皮細胞を、およびより好ましくは肺血管系の内皮細胞を標的とするのに、特に有効であることを発見した。
肺血管系の内皮細胞によって形成される内皮に関して、血管内皮は、動脈、毛細血管、および静脈の内壁を覆う、最も内側の構造であることが、当業者に理解されている。内皮細胞（EC）は、80 nmの厚さの基底層（BL）へのアンカーとして、記述されている。ECおよびBLは両方とも、血管内膜を構成しており、人体において全てを合わせて3000～6000 m2の表面面積と推定され、1～6 x 1013個のECを含む、血液適合性の表面を樹立している（Kruger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R.-P. & Jung, F. Vascular Endothelial Cell Biology: An Update. Int J Mol Sci 20, 4411 (2019)）。
加えて本発明者らは、驚くべきことに、そのような標的化が、前記内皮細胞へのmRNAの送達を可能にすることを発見した、ここで、そのようなmRNAは、本発明の組成物の一部であり、好ましくはそのようなmRNAは、本発明の組成物の脂質組成物と会合している。より好ましくは、そのようなmRNAは、本発明の組成物の脂質組成物によって形成される粒子の、一部である。
やはり何らかの理論に拘束されることを希望するものではないが、内皮細胞へのmRNAの前記送達は、部分的には、本発明の組成物の脂質組成物によって形成される粒子のサイズ分布によって引き起こされると、本発明者らは推測している。
カチオン性脂質ナノ複合体の典型的な全身性の挙動は、通常、肝臓組織において広範囲な遺伝子ノックダウンを示すが、肺においてはsiRNAの一過性の蓄積しか示さないというものであり（Polach, KJ et al. (2012), Mol Ther 20: 91-100; Schroeder, A et al. (2010), J Intern Med 267: 9-21; Tao, W et al. (2010), Mol Ther 18: 1657-1666）、これと対照的であるという点において、上述の発見は、驚くべきものである。
本明細書において好ましく使用される場合、送達剤または送達ビヒクルは、本発明の脂質組成物を含む、組成物である。また、本明細書において好ましく使用される場合、送達剤または送達ビヒクルは、本発明の組成物である。送達剤または送達ビヒクルは、本明細書において好ましく使用される場合、ある構造へと化合物を送達するのに適している、作用物質またはビヒクル、たとえば組成物などであり；好ましくは、そのような構造は、臓器、組織、または細胞であり；より好ましくは、そのような構造は、臓器、組織、または細胞である。1つの好ましい態様において、そのような化合物は、治療的に活性な作用物質であるか、生物学的に活性な作用物質であるか、または薬学的に活性な作用物質である。
本明細書において好ましく使用される場合、治療的に活性な作用物質とは、宿主生物において、治療効果、または治療上有益な効果を誘発するのに適している、化合物である。1つの好ましい態様において、治療的に活性な作用物質は、核酸分子であり、およびより好ましくはmRNAである。
そのいずれの態様をも含めた、本発明のあらゆる局面の、1つの態様において、核酸分子はmRNA分子である。
そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面の1つの態様において、トリカルボン酸は、本発明の組成物中の脂質組成物によって形成される粒子の内部に結合しているか、または該粒子と結合している。そのような結合は安定であり；より具体的には、そのように結合しているトリカルボン酸は、透析の手段によって除去することができない。そのような透析のための条件は、好ましくは以下のものである：本発明の組成物、および本発明の脂質組成物は、それぞれ、1つの態様において、3.5 kDのMWカットオフを有する透析膜を用いて、10 mM TRIS／9% スクロースに対して透析され得る。好ましくはそのような透析は、そのような透析条件下で可能な範囲で、望ましくない成分の全てが除去されるまで実施される。別の態様において、本発明の組成物、および本発明の脂質組成物は、それぞれ、標準的な透析カセットを用いて、以下の条件下で透析され得る：本発明の組成物を含む試料、および本発明の脂質組成物を含む試料は、それぞれ、透析緩衝液を穏やかに撹拌しながら、浮かべた透析カセット中で、室温または4℃で2時間透析される；透析緩衝液は交換され、そして透析はさらに2時間継続される；次に、透析緩衝液は交換され、そして透析は一晩継続される；1つ1つの透析段階は全て、室温または4℃で実施されるべきである；透析処理の過程において、全量が、試料の量の少なくとも300倍となる透析緩衝液を、使用するべきである。好ましくはそのような透析段階の目的は、脂質組成物の調製において使用された溶媒の除去である。同じ目的のために、およびより具体的には、同じ結果を達成するために、特に、脂質組成物の調製において使用される溶媒を除去するために、他の透析条件が使用され得ることを、当業者は理解するであろう。
そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面の1つの態様において、脂質組成物は、少なくとも、脂質種に関して、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質を含む。本発明の組成物の脂質組成物が、該3種類の脂質種のそれぞれである、個々の脂質分子を複数含むことを、当業者は理解するであろう。
脂質組成物が、異なる種の中性脂質を2種以上含む点は、本発明の範囲内であり、かつ、そのいずれの態様をも含めた、本発明のあらゆる局面の1つの態様の範囲内である。
脂質組成物が、異なる種のカチオン性脂質を2種以上含む点は、本発明の範囲内であり、かつ、そのいずれの態様をも含めた、本発明のあらゆる局面の1つの態様の範囲内である。
脂質組成物が、異なる種の遮蔽脂質を2種以上含む点は、本発明の範囲内であり、かつ、そのいずれの態様をも含めた、本発明のあらゆる局面の1つの態様の範囲内である。
組成物が、異なる種の核酸分子を2種以上含む点は、本発明の範囲内であり、かつ、そのいずれの態様をも含めた、本発明のあらゆる局面の1つの態様の範囲内である。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、核酸との用語、および核酸分子との用語は、互換性をもって使用される。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、mRNAとの用語、およびmRNA分子との用語は、互換性をもって使用される。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、特に、任意の質量比に関連して、全脂質への言及がなされる場合、全脂質とは、脂質組成物の全脂質の質量の合計、および本発明の組成物に含まれる全脂質の質量の合計のそれぞれを指すことが、意図される。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、特に、任意の質量比に関連して、本発明の組成物に含まれる核酸の質量または核酸分子の質量への言及がなされる場合、核酸の質量および核酸分子の質量とはそれぞれ、本発明の組成物に含まれる全核酸の全質量の合計、および本発明の組成物に含まれる核酸分子の全質量の合計の、それぞれである。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、特に、任意の質量比に関連して、本発明の組成物に含まれるmRNAの質量またはmRNA分子の質量への言及がなされる場合、mRNAの質量およびmRNA分子の質量とはそれぞれ、本発明の組成物に含まれる全mRNAの全質量の合計、および本発明の組成物に含まれるmRNA分子の全質量の合計の、それぞれである。
そのいずれの態様をも含めた、さまざまな局面によって定義される本発明の1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、m/m比（全脂質／mRNA）との表現は、m/m比（全脂質／mRNA分子）と同じであり、m/m比（全脂質／核酸）と同じであり、かつm/m比（全脂質／核酸分子）と同じである。したがって、m/m比（全脂質／mRNA）との用語は、核酸がmRNAであるか、または任意の他の核酸および核酸分子のそれぞれであるかどうかに関わらず、好ましくは包括的な様式で、使用される。しかしながら、より好ましい態様において、m/m比（全脂質／mRNA）との用語は、実際には、本発明の組成物に含まれる、mRNA、およびmRNA分子それぞれの、質量を指す。
1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、すぐに使用可能な組成物とは、意図される目的のために速やかに使用可能である組成物であり、好ましくは、組成物に対していかなるさらなる手段も、ここで手段とは、組成物の物理的特徴（たとえば固体の状態かもしくは液体の状態か）、化学的特徴（たとえば、定量的および／もしくは定性的な化学的組成、純度、もしくは無菌性）ならびに化学的活性、ならびに／または生物学的特徴および生物学的活性（たとえば治療上の有効性など）に対する影響を有するかまたは影響を有し得る手段であるが、そのようないかなるさらなる手段の適用も必要とすることなく、意図される目的のために速やかに使用可能である、組成物である。1つの好ましい態様において、本発明の組成物は、対象への投与のために、好ましくは、治療適用、診断適用、および／またはセラノスティクス適用としての投与のために、すぐに使用可能な組成物である。
そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面による組成物を調製するための方法の、1つの態様において、すぐに使用可能な組成物が得られる。そのようなすぐに使用可能な組成物が、1つまたは複数のさらなる反応段階の後で、たとえば透析段階および／またはダイアフィルトレーション段階などの後で、得られる点は、本発明の範囲内である。しかしながら、そのようなすぐに使用可能な組成物が、何らかの別の反応段階または前記の別の反応段階の後で、好ましくは透析段階および／またはダイアフィルトレーション段階の後で実施される濃縮段階の後で、得られる点もまた、本発明の範囲内である。
脂質組成物の脂質成分を含む溶液を、トリカルボン酸の緩衝液中にmRNAを含む溶液と、混合することから得られる反応混合物が、1つまたは複数のさらなる反応段階に供される点は、本発明の範囲内である。好ましくはそのような反応段階は、透析段階またはダイアフィルトレーション段階である。そのようなさらなる反応段階の、ならびに透析段階および／またはダイアフィルトレーション段階の目的は、本発明の組成物の脂質組成物の調製のためにまたは調製において使用された、全ての有機溶媒を除去すること、使用された水性緩衝液を除去し、そして該水性緩衝液を、意図される用途に適しておりかつ適切なpHおよび張性をもたらす緩衝液で、置き換えることである。さらなる反応段階、および、透析段階、ダイアフィルトレーション段階、または両方のいずれかの後に、別の反応段階が続くという点は、本発明の範囲内であり、好ましくはそのような別の反応段階は、濃縮段階である。そのような濃縮段階の目的は、好ましくは、意図される適用および用途に適した値へと、核酸分子およびmRNAそれぞれの最終濃度を調節することである。
本発明に関して、治療および処置とはそれぞれ、予防をも包含する。これと一致して、治療的に活性な作用物質とは、1つの態様において、疾患の予防において活性である作用物質でもある。別の態様において、治療的に活性な作用物質は、疾患の予防においては活性ではない。
本発明の組成物は、カチオン性脂質を含む。該脂質中に存在するNH基またはNH2基はいずれも、好ましくはプロトン化型で存在することを、当業者は理解するであろう。典型的には、前記脂質の正電荷はいずれも、アニオンの存在によって相殺される。そのようなアニオンは、一価または多価のアニオンであり得る。好ましいアニオンは、ハロゲン化物、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩である。ハロゲン化物は、本明細書において使用される場合、好ましくは、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、および臭化物である。最も好ましいのは、塩化物である。カチオン性脂質と、細胞内へと移行されようとする、治療的に、または薬学的に、または生物学的に活性な化合物とが会合する際に、ハロゲン化物のアニオンは、該活性な化合物によって、好ましくは1つまたはいくつかの負電荷を示す該活性な化合物によって、置き換えられるが、生物学的に活性な化合物の全体的な電荷は必ずしも負ではないことが、理解されるべきである。同じ見解は、本発明の組成物の他の化合物に対しても、等しく適用可能である。そのような化合物が、アニオン性の化合物であるか、または1つまたはいくつかの負電荷を帯びている場合、そのような負電荷は、カチオンの存在によって相殺され得る。そのようなカチオンは、一価または多価のカチオンであり得る。好ましいカチオンは、アンモニウム、ナトリウム、またはカリウムである。
本発明の組成物のステロール化合物は、合成であるか、または羊毛もしくは植物などの天然の供給源から入手されるかの、いずれかであってよい。
本発明の組成物のPEG化脂質は、商業的供給源から利用可能であり、これはたとえば、日油株式会社、日本；Avanti Polar Lipids、米国；またはCordon Pharma、スイス、等である。
1つの態様において、化合物であるβ-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000001
1つの態様において、化合物であるL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドは、以下の式のものである：
Figure 2023513302000002
1つの態様において、化合物であるDOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-クロリド）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000003
1つの態様において、化合物であるDOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（好ましくは塩化物塩として））は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000004
1つの態様において、化合物であるDC-コレステロール（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000005
1つの態様において、化合物であるDPhyPE（1,2-(7R,11R)ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000006
1つの態様において、化合物であるDOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000007
1つの態様において、化合物であるDLPE（1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000008
1つの態様において、化合物であるDMPE（1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000009
1つの態様において、化合物であるPOPE（（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000010
1つの態様において、化合物であるDSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000011
1つの態様において、化合物であるコレステロールは、以下の式のものである：
Figure 2023513302000012
1つの態様において、化合物であるスチグマステロール（スチグマスタ-5,22-ジエン-3-オール）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000013
1つの態様において、化合物であるmPEG-500-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-500]（好ましくはアンモニウム塩として）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000014
1つの態様において、化合物であるmPEG-1000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-1000]（好ましくはアンモニウム塩として）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000015
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（好ましくはアンモニウム塩として）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000016
1つの態様において、化合物であるmPEG-5000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000]（好ましくはアンモニウム塩として）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000017
1つの態様において、化合物であるmPEG-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]（好ましくはアンモニウム塩として）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000018
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-DPG（1,2-ジパルミトイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000019
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-DMG（1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000020
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-DLG（1,2-ジラウロイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000021
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-C8-セラミド（N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000022
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-C16-セラミド（N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}）は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000023
1つの態様において、化合物であるmPEG-2000-C-DMA（N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバミル]-1,2-ジミリスチルオクスルプロピル-3-アミン（N-[(Methoxy poly(ethylene glycol)2000)carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine））は、以下の式のものである：
Figure 2023513302000024
そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面の1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、単分散組成物とは、組成物の脂質組成物によって形成される粒子が、単分散である粒子の分布を示す、組成物である。そのいずれの態様をも含めた、本発明の第1、第2、および第3の局面の1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、多分散組成物とは、組成物の脂質組成物によって形成される粒子が、多分散である粒子の分布を示す、組成物である。
1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、粒子サイズの分布は単分散であり、標準的な動的光散乱法アプローチを用いた場合に、約0.005～約0.17の、好ましくは約0.01～約0.10の、多分散指数（PDI）を有する、単一のピークが測定される。個々の方法は、たとえば、Stetfeldら（前記）およびThomas JCら（前記）に記載されている。1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、粒子サイズの分布は多分散であり、動的光散乱法アプローチを用いた場合に、複数のピーク、および／または> 0.17の多分散指数（PDI）が測定される。個々の方法は、たとえば、Stetfeldら（後述）に記載されている。
1つの態様において、本発明の組成物の脂質組成物によって形成される粒子の、粒子サイズは、Zetasizer Ultra（Malvern Panalytical Ltd、Malvern、英国）を用いて、動的光散乱法により決定される。全ての測定は、分散剤として、pH 7.4の10 mM TRISを用いて緩衝された270 mM スクロース溶液である水性緩衝液中で、実施することが好ましい。動的光散乱法は、たとえば以下に、より詳細に記載されており：Stetefeld, J., McKenna, S. A. & Patel, T. R. "Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences". Biophys Rev 8, 409-427 (2016)；およびThomas, J. C. "The determination of log normal particle size distributions by dynamic light scattering". Journal of Colloid and Interface Science 117, 187-192 (1987)；該文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
より具体的には、すなわちより好ましい態様においては、粒子のサイズは、測定および解析のためのソフトウェアであるZX Explorer（Malvern Panalytical Ltd、Malvern、英国）によって算定される、「強度平均ピーク（Intensity Mean Peak）」として決定される。mRNAを含む本発明の組成物の、動的光散乱法での測定による「強度平均ピーク」は、(a) 約30 nm～約200 nmの範囲内であり、好ましくは約40 nm～約140 nmの範囲内であり、およびより好ましくは約60 nm～約120 nmの範囲内であるか、または(b) 約30 nm～約100 nmの範囲内であり、および好ましくは約30 nm～60 nmの範囲内である。
1つの態様において、本発明の組成物の脂質組成物によって形成される粒子のゼータ電位は、Zetasizer Ultra（Malvern Panalytical Ltd、Malvern、英国）を用いて、レーザードップラー電気泳動法により決定される。全ての測定は、好ましくは、分散剤として、pH 7.4の10 mM TRISを用いて緩衝された270 mM スクロース溶液である水性緩衝液中で、実施される。レーザードップラー電気泳動法は、たとえば以下に、より詳細に記載されている：Clogston, J. D. & Patri, A. K. "Characterization of Nanoparticles Intended for Drug Delivery" 697中の 63-70 (Humana Press, 2011)；およびSze, A., Erickson, D., Ren, L. & Li, D. "Zeta-potential measurement using the Smoluchowski equation and the slope of the current-time relationship in electroosmotic flow", Journal of Colloid and Interface Science 261, 402-410 (2003)、該文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
より具体的には、すなわちより好ましい態様においては、ゼータ電位は、「ゼータ平均ピーク（Zeta Mean Peaks）」として決定される。これら両方の表現様式は、測定および解析のためのソフトウェアであるZX Explorer（Malvern Panalytical Ltd、Malvern、英国）によって算定される。mRNAを含む本発明の組成物の、レーザードップラー電気泳動法での測定による「ゼータ平均ピーク」は、約+0 mV～約+80 mVの範囲内であり、かつ好ましくは約+0 mV～約+45 mVの範囲内である。
1つの態様において、かつ本明細書において好ましく使用される場合、mRNAは好ましくは、約200～約100,000個のヌクレオチドを、好ましくは約750～約5000個のヌクレオチドを、より好ましくは約1000～3000個のヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。その1つの態様において、mRNAは1本鎖核酸であり、そのいくつかのストレッチは、ポリヌクレオチド内の1つまたは複数の2本鎖構造の、一部であり得る。そのような2本鎖構造は、典型的には、ポリヌクレオチドの2つ以上のストレッチによって形成されており、そのヌクレオチド配列は、少なくとも部分的には、互いに相補的である。該2本鎖構造は、ワトソン・クリック型塩基対によって、形成されるかまたは安定化されることが好ましい。
さらなる1つの態様において、mRNAは、真核細胞におけるごく基本的な構造を示し、かつ典型的には、5'から3'の方向で以下を含む：キャップ構造、5'非翻訳領域（5' UTR）、典型的にはコーディング配列（CDS）に接するAUGコドンで始まり終止コドンで終結する、コーディング配列、3'非翻訳領域（3' UTR）、およびポリAテール。
よりさらなる1つの態様において、mRNAは、該mRNAが自己を折りたたんだ2次構造または3次構造を形成し得る、1本鎖分子である。
本発明によれば、mRNAは、1つの態様において、治療的に活性な作用物質である。疾患の処置および／または予防において有用。原理上、投与されたmRNA配列は、細胞にタンパク質を作らせることができ、該タンパク質は次に、疾患を直接的に処置し得、またはワクチンとして機能し得る；より間接的には、タンパク質は、ある経路が阻害されるかまたは刺激されるいずれかの様式で、該経路の構成要素を妨害し得、それにより、疾患を処置するかまたは改善させる。
本発明の1つの態様において、mRNAは、以下の組み換え核酸構築物とは異なっている：
5'から3'の方向で、
- 5' UTR、
- エフェクター分子をコードするコーディング領域、および
- 3' UTR
を含む組み換え核酸構築物であって、
5' UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ガレクチン-9をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70m5をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、E-セレクチンをコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ICAM-1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびvWFをコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群より選択され；
3' UTRが、vWFをコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、MCP-1をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびIL-6をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群より選択され、
該エフェクター分子が、細胞の細胞性機能を回復させる点で有効であるか、または細胞中もしくは細胞上で治療効果を発揮する点で有効であり、かつ、
該組み換え核酸構築物が、該エフェクター分子をコードする野生型mRNAとは異なっている、
組み換え核酸構築物。
本発明の1つの態様において、mRNAは、以下の組み換え核酸構築物である：
5'から3'の方向で、
- 5' UTR、
- エフェクター分子をコードするコーディング領域、および
- 3' UTR
を含む組み換え核酸構築物であって、
5' UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ガレクチン-9をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70m5をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、E-セレクチンをコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ICAM-1をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6をコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびvWFをコードする遺伝子の5' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群より選択され；
3' UTRが、vWFをコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、MCP-1をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびIL-6をコードする遺伝子の3' UTRかまたは少なくとも85%のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群より選択され、
該エフェクター分子が、細胞の細胞性機能を回復させる点で有効であるか、または細胞中もしくは細胞上で治療効果を発揮する点で有効であり、
該エフェクター分子が変異体エフェクター分子であり、該変異体エフェクター分子が、機能獲得型の変異体エフェクター分子、および／またはハイパーモルフ型変異体エフェクター分子であり、かつ、
該組み換え核酸構築物が、該エフェクター分子をコードする野生型mRNAとは異なっている、
組み換え核酸構築物。
本発明の組成物、および特に本発明の脂質組成物は、1つの態様において、担体を含み得る。そのような担体は、好ましくは液体の担体である。好ましい液体の担体は、水性の担体、および非水性の担体である。好ましい水性の担体は、水、塩水溶液、水性緩衝系であり、より好ましくは、緩衝系および／または塩水溶液は、生理的緩衝強度および生理的塩濃度を有する。好ましい非水性の担体は溶媒であり、好ましくは有機溶媒であり、これはたとえば、エタノール、tert-ブタノールなどである。何らかの理論に拘束されることを希望するものではないが、原則としては、任意の水混和性の有機溶媒が使用され得る。したがって、組成物は、より具体的には脂質組成物は、リポソームとして存在してよく、またはリポソームを形成してもよいことが、理解されるべきであり；全体として負に荷電した化合物と、好ましくは本発明の脂質組成物によって送達されようとする化合物と、および特にmRNAと、ならびに／または本発明の組成物と、接触した際に、本発明の脂質組成物と、本発明の組成物とは、リポプレックスを形成するが、ここで、リポプレックスとはすなわち、ポリアニオンが、たとえば核酸分子などが、カチオン性脂質と、または他の脂質成分とともに少なくとも1種のカチオン性脂質成分を含む脂質系と、相互作用する際に、対イオンおよび水の放出に基づく静電相互作用およびエントロピー効果によって形成される、複合体である。
さらなる1つの態様において、本発明の脂質組成物、および／または本発明の組成物は、凍結乾燥された組成物として存在する。そのような凍結乾燥された組成物とすれば、室温での、組成物の効果的な長期保存が可能になる。
本発明によれば、薬学的組成物は、本発明の組成物を含む。本発明の薬学的組成物は、薬学的に活性な化合物、および任意で、薬学的に許容される担体を含む。そのような薬学的に許容される担体は、好ましくは、本発明による組成物に関して、本明細書において定義される担体の群より選択され得る。本明細書において記載されるいずれの組成物も、原則として、その成分およびその任意の組み合わせが薬学的に許容される場合に、薬学的組成物としても使用され得ることを、当業者は理解するであろう。薬学的組成物は、薬学的に活性な化合物を含む。そのような薬学的に活性な化合物は、1つの態様において、本発明の組成物に包含される、または本発明の組成物に含まれる、mRNAである。
本発明による組成物は、特に薬学的組成物は、さまざまな形態の投与に使用することが可能であって、そのため該組成物をそのような形態の投与に適合させる、という点は、当業者の通常の技量の範囲内である。
mRNAを含む本発明の組成物を調製するための、本発明の方法は、脂質組成物の脂質成分を含む溶液を、mRNAを含む溶液と混合することに依存しており、ここで混合は、インライン混合である。混合段階は、マイクロ流体混合装置を適用することによって実施され、かつ特に、スタガードヘリンボーン混合装置、ディーン渦分岐混合装置、またはマイクロ流体の流体力学的混合装置のいずれかの使用によって、なされ得る。これらの装置は、特別に設計されたそれらのマイクロチャンネルに起因して、非乱流かつ拡散ベースの急速な混合プロセスを可能にする。スタガードヘリンボーンミキサー、および、本発明の組成物に好ましく含まれるような粒子の調製における、その使用は、たとえば以下に記載されており：Zhigaltsev, I. V. et al. "Bottom-Up Design and Synthesis of Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride Cores Using Millisecond Microfluidic Mixing". Langmuir 28, 3633-3640 (2012)、該文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。マイクロ流体の流体力学的混合、および、本発明の組成物に好ましく含まれるような粒子の調製における、その使用は、たとえば以下に記載されており：Krzyszton, R. et al. "Microfluidic self-assembly of folate-targeted monomolecular siRNA-lipid nanoparticles." Nanoscale 9, 7442-7453 (2017)、該文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。最後に、ディーン渦分岐混合、および、本発明の組成物に好ましく含まれるような粒子の調製における、その使用は、たとえば以下に記載されており：Chen, J. J., Chen, C. H. & Shie, S. R. "Optimal designs of staggered dean vortex micromixers." Int J Mol Sci 12, 3500-3524 (2011)、該文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、本発明のさらなる特徴、態様、および利点がそれから理解され得る、以下の実施例および図面によって、さらに例示される。
図1は、多角度動的光散乱法（MADLS）により決定された、全脂質のmRNAに対する質量比が5、7、14、および28である、異なるサイズ（nm）（「サイズ（d.nm）」として示される）を有する脂質組成物の粒子のサイズ分布（「強度（パーセント）」として示される）を示す、4つのグラフのパネルを表している。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図2は、全脂質のmRNAに対する質量比が28であるさまざまな脂質組成物についての、異なるサイズ（nm）（「サイズ（d.nm）」として示される）を有する粒子のサイズ分布（「強度（パーセント）として示される」を示す、3つのグラフのパネルを表しており、ここで、脂質組成物と混合された際に、mRNAは、50 mM 酢酸塩緩衝液中に（図2A）、0.1 mM EDTA含有50 mM 酢酸塩緩衝液中に（図2B）、または50 mM クエン酸塩緩衝液中に（図2C）溶解された；粒子のサイズは、多角度動的光散乱法（MADLS）により決定された。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図3Aは、2種類の異なる脂質組成物についての、異なるサイズ（nm）（「サイズ（d.nm）」として示される）を有する粒子のサイズ分布（「強度（パーセント）として示される」を示すグラフであり、ここで、第1の脂質組成物は、5という、全脂質のmRNAに対する質量比を含み、かつ第2のものは、28という、全脂質のmRNAに対する質量比を含む；粒子のサイズは、多角度動的光散乱法（MADLS）により決定された。 図3Bは、図3Aで用いられた2種類の異なる組成物の、粒子の数を示すグラフである。 図4は、全脂質のmRNAに対する質量比がそれぞれ28および5であって、組成物のmRNA含量が0.2 mg/mlである、本発明による組成物を、2 mg/kgで尾静脈へと注入した6時間後のCOMP-Ang1タンパク質の発現を評価するための、ウェスタンブロット解析の結果を示す；mRNAは、COMP-Ang1、または関連のないエリスロポエチンをコードするものであった；CD31は、ローディング対照として使用された。 図5は、COMP-Ang 1をコードするmRNA配列のヌクレオチド配列を示しており（SEQ ID NO: 1）、ここで該mRNAは、MCP-1由来の5'-UTR配列、MCP-1のシグナル配列、COMP-Ang1をコードする配列、およびフォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'-UTRを含み、ここでCOMP-Ang1は、アンジオポエチン-1（Ang1）の、設計されたバリアントである。 図6は、ヒトエリスロポエチン（EPO）をコードするmRNA配列のヌクレオチド配列を示しており（SEQ ID NO: 2）、ここで該mRNAは、MCP-1由来の5'-UTR配列、MCP-1のシグナル配列、EPOをコードする配列、およびフォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'-UTRを含む。 図7は、Cleancap EGFP-mRNA（Trilink Biotechnologies、米国より利用可能）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を示す。かつ 図8は、本発明の組成物のさまざまな態様を挙げた表を示しており、ここでは、組成物における、全脂質の、全核酸分子に対する、好ましくはmRNAに対する、質量比（「製剤中のmRNAのm/m比（全脂質／mRNA）」）、組成物における、核酸分子の、好ましくはmRNAの、濃度（「製剤中のmRNAの濃度」）、組成物におけるクエン酸の、mg/mlで表す濃度（「製剤中のクエン酸の濃度」）、および組成物におけるクエン酸のモル濃度（「製剤中のクエン酸のモル濃度」）を示しており；挙げられたm/m比、mRNA濃度、およびクエン酸濃度を有する組成物の脂質組成物に関して、そのような脂質組成物は、そのいずれの態様をも含めた、第1、第2、および第3の局面による組成物に関連して、本明細書において開示される脂質組成物であり、好ましくは、脂質組成物中の脂質のモル比が、 - 約35 mol%～約65 mol%のカチオン性脂質、 - 約35 mol%～約65 mol%の中性脂質、および - 約0.1 mol%～5 mol%の遮蔽脂質、好ましくはPEG化脂質であり、 全体の脂質含量が100%である、組成物であり、 好ましくは、脂質組成物中の脂質のモル比が、 - 約45 mol%～約55 mol%のカチオン性脂質、 - 約45 mol%～約55 mol%の中性脂質、および - 約0.5 mol%～2 mol%であり、 全体の脂質含量が100%である、組成物であり；かつ、 より好ましくは、脂質組成物中の脂質のモル比が、 - 50 mol%のカチオン性脂質であって、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、カチオン性脂質、 - 49 mol%の中性脂質であって、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）である、中性脂質、および - 1 mol%の遮蔽脂質であって、mPEG-2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（好ましくはナトリウム塩として））である、遮蔽脂質である、組成物である。
実施例1：静脈内投与によるインビボ適用のための、カチオン性脂質ナノ粒子（LNP）中のmRNA製剤
インビボ実験のため、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドをカチオン性脂質として用いる製剤プロセスにおいて、mRNA-LNPが調製される。あるいは同一の手順において、カチオン性脂質であるL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドが、mRNA-LNPを調製するために使用可能である。
脂質は、適切なモル比（たとえば、50:49:1の、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド：DPyPE：mPEG-2000-DSPE）でエタノール中に溶解される。脂質混合物は、mRNAの水溶液と、2:1（水溶液：エタノール）の体積比で、マイクロ流体混合器（NanoAssemblr（登録商標）；Precision Nanosystems, Vancouver, BC）を用いて、かつ18 ml／分の流速で、組み合わせられる。LNP製剤は、クエン酸塩緩衝または酢酸塩緩衝mRNA溶液（pH 3～4）を用いて、同様に取得可能である。全脂質のmRNAに対する最終的な質量比は、28である。
混合プロセスの後で、製剤は、3.5 kDaのMWCOのSlide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific）を用いて、10 mMのHEPESまたはTRISで緩衝された等張スクロース溶液に対して透析される。浮かべた透析カセット中の製剤は、透析緩衝液を穏やかに撹拌しながら、室温で2時間透析された；透析緩衝液は交換され、そして室温でさらに2時間透析された。透析緩衝液は再度交換され、そして4℃で一晩透析された。透析処理の過程において、全量が、試料の量の少なくとも300倍となる透析緩衝液が、使用された。スクロースの代わりに、トレハロースまたはグルコースなどの他の糖を、製剤プロセス中で同様に使用することが可能である。
次に製剤は、粒子サイズ（Zetasizer Ultra機器（Malvern Instruments Ltd、Malvern、英国）、RNA封入（Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキット、製造元（Thermo Fisher Scientific）のプロトコルにしたがう）、およびエンドトキシンに関して試験され、そして、> 0 mVのゼータ電位を有する80～120 nmのサイズであること、90%超のmRNA封入、および< 1 EU/mlのエンドトキシンを示すことが確認される。
このようにして得られたmRNA-LNP製剤は、インビトロまたはインビボでのさらなる使用まで、-80℃で保管される。
実施例2：マウスでの試験における、mRNAの肺特異的な送達
実施例1において調製された組成物は、製剤として、マウスでの試験において使用される。組成物中に含まれるmRNAは、ルシフェラーゼをコードする。
製剤は、それぞれ1 mg mRNA／kg体重の用量で、尾静脈へのボーラス注入により、静脈内投与される。注入の4時間後、マウスを犠死させ、そして臓器（たとえば、肝臓、肺、脾臓、心臓、脳、腎臓）からの組織試料が採取される。組織試料中のルシフェラーゼ活性は、提供元（Promega GmbH、Walldorf、ドイツ）のプロトコルにしたがって、ルシフェラーゼアッセイシステムにより測定される。
ルシフェラーゼ活性は、脾臓組織、心臓組織、脳組織、腎臓組織、および肝臓組織と比較して、肺組織において有意に増大した。
実施例3：カニクイザルでの試験における、血管系特異的なmRNAの送達
実施例1に記載されるように調製された脂質系である、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド／DPhyPE／mPEG-2000-DSPE（50 mol% : 49 mol% : 1 mol%）中に製剤化された、ヒトCOMP-アンジオポエチン-1をコードするmRNA（PTX_RNA）の、単回の静脈内注入は、異なる用量でカニクイザルに施される（用量群1つにつきサル4匹、1時間の注入）。血液試料は、投薬前および投薬後のタイムポイント（投薬前：第1日、第0日、投薬後：t = 0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間）において採取され、そして薬力学（PD）的解析およびサイトカイン解析のために分注される。
異なるタイムポイントにおける、アンジオポエチン1およびアンジオポエチン2のレベルは、標準化されかつ市販されているELISAアッセイによって、または関心対象である該分泌タンパク質を検出するカスタムメイドのELISAによって、測定される。関連する薬力学的パラメーターが解析される。
該分泌タンパク質は、処置された動物の血清試料において、用量および時間に依存性の様式で測定可能である。発現は、注入の2時間後に始まり、かつ発現のピークにはおよそ6～10時間で到達する。該タンパク質のクリアランスは、該分泌タンパク質の血清半減期、および／または該タンパク質の安定性に応じて変わる。
このデータは、本発明の製剤が、非ヒト霊長類（NHP）およびヒトの血管系においてタンパク質を発現させるのに適しているmRNA製剤であることを示す。
実施例4：静脈内投与によるインビボ適用のための、カチオン性脂質ナノ粒子（LNP）中のmRNA製剤、m/m比（全脂質／mRNA） = 28
インビボ実験のため、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドをカチオン性脂質として、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を補助脂質（co-lipid）として、およびメトキシPEG(2000)-DSPEをPEG脂質として用いる製剤プロセスにおいて、mRNA-LNPが調製される。
最初の段階において、3種類全ての脂質は、50 mol% β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、49 mol% DPyPE、および1 mol% mPEG-2000-DSPEのモル比でエタノール中に溶解され、これにより、予混合されている全脂質の濃度は18.47 mg/mlとなる。同時に、mRNA（COMP-Ang1-mRNA；1273ヌクレオチド；SEQ ID NO:1）はクエン酸塩緩衝液（10 mM、pH 5.5）中に溶解され、これにより、予混合されているmRNAの濃度は0.33 mg/mlとなる。
次に、予混合脂質溶液は、予混合mRNA溶液と、1:2の体積比で、マイクロ流体混合器（NanoAssemblr（登録商標）；Precision Nanosystems, Vancouver, BC）を用いて18 ml／分の流速で、組み合わせられる。脂質溶液およびmRNA溶液の、規定されている予混合濃度、ならびに混合処理の間に適用される体積比に起因して、結果的に得られるmRNA-脂質ナノ粒子（LNP）製剤は、とりわけ、28という、全脂質のmRNAに対する質量比（m/m比（全脂質／mRNA） = 28）によって、特徴付けられる。
混合プロセスの直後、製剤は、3.5 kDaのMWCOのSlide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific）を用いて、TRIS緩衝等張スクロース溶液（10 mM TRIS、9% スクロース、pH 7.5）に対して透析される。浮かべた透析カセット中の製剤は、透析緩衝液を穏やかに撹拌しながら、室温で2時間透析された；透析緩衝液は交換され、そして室温でさらに2時間透析された。透析緩衝液は再度交換され、そして4℃で一晩透析された。透析処理の過程において、全量が、試料の量の少なくとも300倍となる透析緩衝液が、使用された。
透析処理後の製剤の全mRNA濃度は、製造元（Thermo Fisher Scientific）のプロトコルにしたがって、Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキットにより定量され、そしてLNP製剤の適切な最終mRNA濃度は、TRIS緩衝等張スクロース溶液（10 mM TRIS、9% スクロース、pH 7.5）を用いた希釈により調節される（0.2 mg/ml mRNAに調節）。
次に製剤は、粒子サイズ（Zetasizer Ultra機器（Malvern Instruments Ltd、Malvern、英国）、RNA封入および全RNA濃度（Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキット、製造元（Thermo Fisher Scientific）のプロトコルにしたがう）、ならびにエンドトキシンに関して試験され、そして、80～120 nmのサイズであること、90%超のmRNA封入、および< 1 EU/mlのエンドトキシンを示すことが確認される。
このようにして得られたmRNA-LNP製剤は、インビトロまたはインビボでのさらなる使用まで、-80℃で保管される。
実施例5：静脈内投与によるインビボ適用のための、カチオン性脂質ナノ粒子（LNP）中のmRNA製剤、m/m比（全脂質／mRNA） = 5
インビボ実験のため、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドをカチオン性脂質として、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を補助脂質として、およびメトキシPEG(2000)-DSPEをPEG脂質として用いる製剤プロセスにおいて、mRNA-LNPが調製される。
最初の段階において、3種類全ての脂質は、50 mol% β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、49 mol% DPyPE、および1 mol% mPEG-2000-DSPEのモル比でエタノール中に溶解され、これにより、予混合されている全脂質の濃度は3.32 mg/mlとなる。同時に、mRNA（COMP-Ang1-mRNA；1273ヌクレオチド；SEQ ID NO:1）はクエン酸塩緩衝液（10 mM、pH 5.5）中に溶解され、これにより、予混合されているmRNAの濃度は0.33 mg/mlとなる。
次に、予混合脂質溶液は、予混合mRNA溶液と、1:2の体積比で、マイクロ流体混合器（NanoAssemblr（登録商標）；Precision Nanosystems, Vancouver, BC）を用いて18 ml／分の流速で、組み合わせられる。脂質溶液およびmRNA溶液の、規定されている予混合濃度、ならびに混合処理の間に適用される体積比に起因して、結果的に得られるmRNA-LNP製剤は、とりわけ、5という、全脂質のmRNAに対する質量比（m/m比（全脂質／mRNA） = 5）によって、特徴付けられる。
混合プロセスの直後、製剤は、3.5 kDaのMWCOのSlide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific）を用いて、TRIS緩衝等張スクロース溶液（10 mM TRIS、9% スクロース、pH 7.5）に対して透析される。浮かべた透析カセット中の製剤は、透析緩衝液を穏やかに撹拌しながら、室温で2時間透析された；透析緩衝液は交換され、そして室温でさらに2時間透析された。透析緩衝液は再度交換され、そして4℃で一晩透析された。透析処理の過程において、全量が、試料の量の少なくとも300倍となる透析緩衝液が、使用された。
透析処理後の製剤の全mRNA濃度は、製造元（Thermo Fisher Scientific）のプロトコルにしたがって、Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキットにより定量され、そしてLNP製剤の適切な最終mRNA濃度は、TRIS緩衝等張スクロース溶液（10 mM TRIS、9% スクロース、pH 7.5）を用いた希釈により調節される（0.2 mg/ml mRNAに調節）。
次に製剤は、粒子サイズ（Zetasizer Ultra機器（Malvern Instruments Ltd、Malvern、英国）、RNA封入および全RNA濃度（Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキット、製造元（Thermo Fisher Scientific）のプロトコルにしたがう）、ならびにエンドトキシンに関して試験され、そして、70～100 nmのサイズであること、90%超のmRNA封入、および< 1 EU/mlのエンドトキシンを示すことが確認される。
このようにして得られたmRNA-LNP製剤は、インビトロまたはインビボでのさらなる使用まで、-80℃で保管される。
実施例6：クエン酸リアーゼに基づく酵素反応を用いたカチオン性脂質ナノ粒子（LNP）中のクエン酸の定量
実施例4に記載されるように作製されたmRNA-脂質ナノ粒子におけるクエン酸含量の定量のため、Megazymeが提供する、クエン酸リアーゼに基づく酵素キット（K-CITR；Megazyme、アイルランド）が、製造元の取扱説明書にしたがって使用された。それにしたがい、ナノ粒子を破壊するため、実施例4において調製された、50μlのLNP試料（0.2 mg/ml COMP-Ang1-mRNA）は、950μlの2% Triton X 100水溶液中に希釈された。次に、250μlの緩衝液（キット内で提供される）、100μlのNADH溶液、ならびに、キット内で提供される、10μlの、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびD-乳酸デヒドロゲナーゼの混合物が、希釈された試料に添加された。5分後、水のブランク試料に対する、そのようにして得られた混合物の光学密度が、340 nmにおいて読み取られた。次に、キットとして提供される10μlのクエン酸リアーゼが混合物に添加され、そして5分後に、OD340 nmが再度読み取られた。両方の測定における吸光度の差異は、以下の式を用いて試料におけるクエン酸含量を算定するために使用された：
Figure 2023513302000025
ここで、Vは最終的な量（1.37 ml）であり、MWはクエン酸の分子量であり（192.1 g/mol）、εは340 nmにおけるNADHの吸光係数であり（6300 L * mol-1 * cm-1）、dは光路長であり（1 cm）、vは試料の量であり（50μl）、かつΔAは、測定された吸光度の差異である（ΔOD(340) = 1.065）。この計算式を用いて、クエン酸の含量はおよそ4.6μmol/ml（0.88 mg/ml）であると測定された。
実施例7：COMP-Ang1またはエリスロポエチンのいずれかをコードするmRNAを含むカチオン性LNP（m/m = 28、およびm/m = 5）を尾静脈へと静脈内注入した後の、COMP-Ang1およびエリスロポエチンのインビボタンパク質発現
COMP-Ang1タンパク質をコードするmRNA［SEQ ID NO: 1］の、ヒトエリスロポエチンをコードするmRNA［SEQ ID NO:2］の、いずれかを含むLNPは、実施例4および実施例5に記載されるように、28というm/m比（高い粒子濃度）、および5というm/m比（低い粒子濃度）で調製された（m/m = 全脂質の質量／mRNAの質量）。LNPは、さらなる使用まで、-80℃で保管された。次に、8～10週齢の雄のマウス（C57Bl/6系統）には、300μl／マウス（2 mg/kg mRNAに相当）の調製されたLNP製剤が、尾静脈から注入された。注入の6時間後に動物を犠死させた、そして処置された動物の肺組織試料は、速やかに瞬間凍結された。ウェスタンイムノブロット解析のため、20～80 mgの凍結肺組織試料は、T-PER Tissue Protein Extraction Reagent（20μl/mg 組織）（Thermo Scientific、米国）中で、50 Hzでビーズミル（TissueLyser LT、Qiagen、ドイツ）を用いてホモジナイズされた。
肺組織タンパク質溶解物は次に、SDS-PAGE（4～12%ゲル）を用いて分離され、そしてタンパク質レベルは、抗Ang1抗体（組み換え抗アンジオポエチン1抗体［EPR2888(N)］（ab183701）、Abcam、Cambridge、英国）、およびローディング対照として抗CD31抗体（CD31 (PECAM-1) (D8V9E) XP（登録商標）ウサギmAb #77699；Cell Signaling Technologies、Danvers、MA、米国）を用いたイムノブロット解析によって評価された。結果は図4に示される。LNP製剤の尾静脈注入から6時間後、COMP-Ang1タンパク質の非常に強力な発現が、28というm/mを有するLNPについての肺組織試料で検出可能であったが、一方で、5というm/mを有するLNPは、COMP-Ang1のいかなる発現も示さなかった。
実施例8：脂質組成物の粒子サイズの分布に対する、全脂質／mRNAの質量比の影響
質量比［全脂質／mRNA］の影響を評価するため、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドをカチオン性脂質として、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）を補助脂質として、およびメトキシPEG(2000)-DSPEをPEG脂質として用いる製剤プロセスにおいて、mRNA-LNPが調製された。
最初の段階において、3種類全ての脂質は、50 mol% β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、49 mol% DPyPE、および1 mol% mPEG-2000-DSPEのモル比でエタノール中に溶解された、これは、0.5 mg/ml、0.7 mg/ml、1.4 mg/ml、および2.8 mg/mlという全脂質の濃度を有する4種類の異なる予混合脂質溶液が得られる様式で実施された。同時に、mRNA（CleanCap EGFP、Trilink Biotechnologies、San Diego、CA、米国、SEQ ID NO: 3）は水に溶解された、これにより、予混合されているmRNAの濃度は0.15 mg/mlとなった。
次に、4種類全ての予混合脂質溶液は、予混合mRNA溶液と、1:2の体積比で、マイクロ流体混合器（NanoAssemblr（登録商標）；Precision Nanosystems, Vancouver, BC）を用いて18 ml／分の流速で、組み合わせられた。脂質溶液およびmRNA溶液の、規定されている予混合濃度、ならびに混合処理の間に適用される体積比に起因して、結果的に得られたmRNA-LNP製剤は、とりわけ、5、7、14、および28という、全脂質のmRNAに対する質量比によって、特徴付けられた。
混合プロセスの直後、製剤は、3.5 kDaのMWCOのSlide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific）を用いて、TRIS緩衝等張スクロース溶液（10 mM TRIS、9% スクロース、pH 7.5）に対して透析された。浮かべた透析カセット中の製剤は、透析緩衝液を穏やかに撹拌しながら、室温で2時間透析された；透析緩衝液は交換され、そして室温でさらに2時間透析された。透析緩衝液は再度交換され、そして4℃で一晩透析された。透析処理の過程において、全量が、試料の量の少なくとも300倍となる透析緩衝液を、使用する必要があった。この脂質組成物は、脂質ナノ粒子（LNP）と称される粒子を形成している。
この脂質組成物を用いた場合に、さまざまな、全脂質のmRNAに対する質量比が確認され、そして多角度動的光散乱法（MADLS）によって決定された。質量比m/mは、5、7、14、および28であった。
結果は図1に示される。図1から理解され得るように、多角度動的光散乱法（MADLS）によって測定された際、m/m比 = 5における、単分散の粒子分布は、m/m比が7、14、28と大きくなると、多分散の分布へと変化した。これらの変化の原因は、核酸（mRNA）を担持していない、「空」の不均一な脂質凝集体の数の増加にあるように見受けられる。
さらなる実験において、全脂質のmRNAに対する質量比は28とされた、そしてmRNAは、LNPを調製するための方法において使用するために、(a) 50 mM 酢酸塩緩衝液中に、(b) 0.1 mM EDTA含有50 mM 酢酸塩緩衝液中に、または(c) 50 mM クエン酸塩緩衝液中に溶解された。粒子のサイズは、多角度動的光散乱法（MADLS）を用いて決定された。
結果は、図2A、2B、および2Cに示される。
脂質の有機性溶液とのマイクロ流体混合段階の間に、mRNAが50 mM クエン酸塩緩衝液（pH = 5.5）に溶解された場合、結果的に得られた粒子サイズの分布は、28という、全脂質／mRNAの高いm/m比であってさえも、強固に単分散のままであり続ける。他の有機酸緩衝液では、たとえば酢酸塩緩衝液等では、そのような効果を達成することはできない。加えてこの効果は、多価のカチオン性脂質の使用に、たとえばβ-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドなどの使用に、限定されていた。
そのように調製されたLNPのさらなる特徴付けにより、クエン酸塩がLNP中に安定的に内包化されていたこと、および、脂質の有機溶媒を除去するために使用された、10 mM TRIS／9% スクロースに対する透析段階（MWカットオフ 3.5 kDa）の過程で、クエン酸塩が除去可能ではなかったことが、明らかとなった。内包化されたクエン酸塩の量は、実施例6に記載されるように、クエン酸リアーゼに基づく酵素キット（K-CITR；Megazyme、アイルランド）を用いて、最終的な透析されたLNPにおいてさらに定量することが可能である。
図3に例示されるように、本発明者らはまた、5という全脂質／mRNAのm/m比と比較して、>10倍多い数の、高度に単分散である脂質ナノ粒子が、28という全脂質／mRNAのm/m比を用いることにより得られたことを、発見した。
本明細書、特許請求の範囲、および／または実施例に開示される本発明の特徴は、別個の場合と、その任意の組み合わせの場合の両方において、本発明をそのさまざまな形態において認識するための素材となり得る。

Claims (19)

  1. 脂質組成物、トリカルボン酸、および核酸分子、好ましくはmRNA分子を含む組成物であって、
    該脂質組成物が、カチオン性脂質、中性脂質、および遮蔽脂質（shielding lipid）を含み、
    該組成物中の該核酸分子によってもたらされる、より少数の負電荷と比較した、該組成物中の該カチオン性脂質分子によってもたらされる、より多数の正電荷
    から引き起こされる正電荷過剰が、該トリカルボン酸によってもたらされる電荷によって相殺されている、
    前記組成物。
  2. 単分散組成物である、請求項1に記載の組成物であって、好ましくは、該組成物中の前記トリカルボン酸の量が、該組成物が単分散組成物であるような量である、前記組成物。
  3. 前記組成物中の前記トリカルボン酸の量が、該組成物が多分散組成物である場合のトリカルボン酸の濃度よりも多い、請求項1および2のいずれか一項に記載の組成物。
  4. 前記組成物中の核酸分子の質量に対する、好ましくはmRNA分子の質量に対する、製剤中の全脂質の質量の比（m/m比（全脂質／mRNA））が、10～140である、請求項1～3のいずれか一項に記載の組成物。
  5. (a) m/m比（全脂質／（核酸もしくはmRNA））が10～20であり、好ましくは12～16であり、およびより好ましくは14である、
    (b) m/m比（全脂質／（核酸もしくはmRNA））が20～40であり、好ましくは24～32であり、およびより好ましくは28である、
    (c) m/m比（全脂質／（核酸もしくはmRNA））が40～80であり、好ましくは48～64であり、より好ましくは56である、または
    (d) m/m比（全脂質／（核酸もしくはmRNA））が80～140であり、好ましくは96～128であり、より好ましくは112である、
    請求項4記載の組成物。
  6. 製剤中の前記トリカルボン酸の濃度が、
    (a) 1.35μmol/ml～3.23μmol/mlであり、好ましくは1.72μmol/ml～2.86μmol/mlである；
    (b) 2.76μmol/ml～6.40μmol/mlであり、好ましくは3.55μmol/ml～5.73μmol/mlである；
    (c) 5.52μmol/ml～12.80μmol/mlであり、好ましくは6.87μmol/ml～11.45μmol/mlである；または
    (d) 10.98μmol/ml～25.66μmol/mlであり、好ましくは13.64μmol/ml～22.90μmol/mlである、
    請求項4および5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記組成物が、ある量の核酸分子を、好ましくはある量のmRNA分子を含み、該組成物の該核酸分子の量が、好ましくは該mRNA分子の量が、約0.01 mg/ml～約1.5 mg/mlであり、好ましくは約0.05 mg/ml～0.8 mg/mlであり、より好ましくは約0.075 mg/ml～約0.4 mg/mlであり、および最も好ましくは約0.2 mg/mlである、請求項1～6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 脂質組成物が粒子を形成している、請求項1～7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 粒子がトリカルボン酸を含み、好ましくは、トリカルボン酸が脂質組成物と複合体を形成しているか、またはトリカルボン酸が粒子に結合されているか、粒子の内部に結合しているか、もしくは粒子と結合している、請求項8に記載の組成物。
  10. 粒子のサイズが30 nm～200 nmであり、好ましくは約40 nm～約140 nmであり、およびさらにより好ましくは約60 nm～120 nmである、請求項1～9のいずれか一項に記載の組成物。
  11. トリカルボン酸が、クエン酸、イソクエン酸（1-ヒドロキシプロパン-1,2,3-トリカルボン酸）、cis-アコニット酸、trans-アコニット酸、cis-アコニット酸およびtrans-アコニット酸の両方の混合物、プロパン-1,2,3-トリカルボン酸（トリカルバリル酸）、アガリン酸、トリメシン酸、ならびにそれらの任意の混合物を含む群より選択される、請求項10に記載の組成物。
  12. 脂質組成物中の脂質のモル比が、
    - 約20 mol%～約80 mol%のカチオン性脂質、
    - 約10 mol%～約70 mol%の中性脂質、および
    - 約0.1 mol%～約10 mol%の、好ましくは約1 mol%～約10 mol%の、PEG化脂質
    であり、
    全体の脂質含量が100%である、
    請求項1～11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 脂質組成物のモル比が、
    - 50 mol%のカチオン性脂質であって、β-(L-アルギニル)-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであるか、またはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドである、カチオン性脂質、
    - 49 mol%の中性脂質であって、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）である、中性脂質、および
    - 1 mol%の遮蔽脂質であって、mPEG-2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（好ましくはナトリウム塩として））である、遮蔽脂質
    である、請求項1～12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 核酸分子がmRNA分子である、請求項1～13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 疾患を処置および／または予防するための方法における使用のための、請求項1～14のいずれか一項に記載の組成物であって、好ましくは、該疾患が、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、肺がん、肺転移、肺高血圧症、および肺動脈性肺高血圧症を含む群より選択される、前記組成物。
  16. 請求項1～15のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に活性な作用物質とを含む、薬学的組成物。
  17. 請求項1～16のいずれか一項に記載の組成物を調製するための方法であって、脂質組成物の脂質成分を含む溶液を、トリカルボン酸の緩衝液中に核酸分子を含む、好ましくはmRNA分子を含む溶液と、混合する段階を含み、好ましくは該混合がインライン混合である、前記方法。
  18. 混合が、非乱流かつ拡散ベースの混合であり、好ましくは非乱流かつ拡散ベースの急速な混合である、請求項17に記載の方法。
  19. 混合の際に得られた反応混合物が、(a) 透析段階、(b) ダイアフィルトレーション段階、および／または(c) タンジェンシャルフロー・フィルトレーション段階に供され、任意で、該透析段階、ダイアフィルトレーション段階、および／またはタンジェンシャルフロー・フィルトレーション段階の後に、最終的な反応混合物をもたらす後続の濃縮段階が続き、該最終的な反応混合物が、すぐに使用可能な組成物である、請求項17～18のいずれか一項に記載の方法。
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