JP2024509844A - プラスミノーゲンを調節するための方法および組成物 - Google Patents

プラスミノーゲンを調節するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示はプラスミノーゲンに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子を提供する。ｓｉＲＮＡ分子は修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有する。二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。さらに、プラスミノーゲンに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有し、２５～３５ヌクレオチド長であるｓｉＲＮＡ分子が提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、「プラスミノーゲンに対するｓｉＲＮＡを用いて出血性疾患を管理するための線維素溶解（fibrinolytics）の阻害」という発明の名称の２０２１年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１４９，７２０号の利益を主張する。
本開示は、プラスミノーゲンを標的とするための核酸およびその医薬製剤に関する。
出血性疾患では、患者が、安定した血餅（clots）を形成し、維持することが困難である。出血性疾患は、凝固因子（coagulation factors）、抗線維素溶解性タンパク質、または血小板の遺伝性または後天性の欠損または欠陥によって引き起こされる。これらには、血友病ＡおよびＢ、フォン・ヴィレブランド病（von Willebrand Disease (VWD)）、血小板疾患、および他のまれな出血性疾患が含まれる。重度の血友病は、典型的には欠損または欠陥因子の頻繁な静脈内注射を伴う因子補充療法の予防的レジメンで治療される。これは、血栓症の高いリスクをもたらし、患者のコンプライアンスを困難にする。主要な合併症は、この治療を無効にする、注入された因子に対する中和抗体の生成である。
これを克服するための１つの戦略は、欠陥または欠損因子の下流の凝固カスケードを活性化する「バイパス剤」を使用することによる。バイパス剤は、活発な出血エピソードを治療するのに有用であるが、血栓症のリスクを伴い、長期の予防薬としての使用には適していない。対照的に、「軽度の」血友病は、血栓症のリスクが出血よりも高いので、予防的にではなく、必要に応じて治療される。しかしながら、軽度の血友病によって引き起こされる出血エピソードは検出するのが困難であることが多く、その結果、患者は手遅れになるまで内出血に気づかず、関節および筋肉への重篤な損傷をもたらす。血友病ＡおよびＢにおけるＸ連鎖遺伝により、女性に対するこれらの疾患の負担は大幅に過小評価されている。重度の血友病はまれであるが、治療センターにおける軽度の血友病患者の最大２３％が女性であり、血友病キャリアの約３０％が異常な出血を経験する。出血性疾患を有する女性は、利用可能な治療法または臨床試験に適格でないことが多い。彼女らの凝固因子レベルが、適格とするには高すぎる可能性があるからである。しかしながら、生活の質に深刻な影響を及ぼす月経過多を経験することが多く、生殖年齢期に子宮摘出をもたらし、その多くは、適切な治療で出血を適切に管理することによって回避することができる。トラネキサム酸（ＴＸＡ）などの抗線維素溶解薬は、広範囲の出血性疾患を有する患者における短期予防および急性出血のために使用される。しかしながら、ＴＸＡは、わずか３時間の短い活性寿命のため、長期使用には適していない。いくつかの臨床研究は長期予防のための限定的な有効性を示したが、吐き気や胃腸障害などの軽度から中等度の有害事象は、それを上回る。
長期的に線維素溶解を減少させることは、広範囲の出血性疾患における出血を管理するための代替戦略であり得る。出血に対する遺伝子治療は臨床試験中であるが、それらは血友病ＡまたはＢに特異的であり、これらの治療のいずれも線維素溶解を対象としない。ｓｉＲＮＡを使用する遺伝子サイレンシング療法は、抗凝固タンパク質の発現を減少させ、血栓形成（clotting）を長期的に制御することに成功した。しかしながら、臨床試験は、致死的および非致死的な血栓性合併症のために以前に中止されており、治療用途で抗凝固因子を標的とすることには大きな制限があることが示されている。
本開示は、従来技術に記載された１つ以上の課題に対処し、および／または出血性疾患を治療または予防するための公知のアプローチの有用な代替手段を提供する。
いくつかの実施形態における本開示は、プラスミノーゲンの発現を改変し、それによって、１つまたは複数の出血性疾患を治療および／または予防するための方法を提供する。
本開示の第１の態様によれば、プラスミノーゲンｍＲＮＡに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子が提供され、ｓｉＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有し、二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。
本開示の第２の態様によれば、プラスミノーゲンｍＲＮＡに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子が提供され、ｓｉＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有し、２５～３５ヌクレオチド長である。
別の実施形態では、配列の少なくとも１つの鎖は、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または配列同一性を有するか、またはそのような配列のいずれか１つから本質的になる。
さらなる実施形態では、配列は、配列番号１～８または２１～２８（非修飾または修飾ヒトｓｉＲＮＡ配列）のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
さらなる実施形態では、配列は、コンジュゲート分子（conjugate molecule）の一部である。一実施形態では、コンジュゲート分子は、ＧａｌＮＡｃを含むがこれに限定されない糖基を含む。
さらなる実施形態では、上記実施形態の態様のいずれか１つに記載の二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子が提供される。
さらなる態様では、プラスミノーゲンの発現を阻害または低減するための核酸と、１０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％で存在するイオン化可能なカチオン性脂質と、リン脂質およびトリグリセリドのうちの少なくとも１つから選択される中性小胞形成脂質（neutral vesicle-forming lipid）と、ステロールと、０．５ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％で存在する親水性ポリマー－脂質コンジュゲート（hydrophilic polymer-lipid conjugate）と、を含む脂質ナノ粒子が提供される。核酸は、前述の態様または実施形態のいずれか１つに記載のｓｉＲＮＡ分子を含んでもよい。
別の実施形態では、上述のｓｉＲＮＡ分子または脂質ナノ粒子を含む医薬組成物が提供され、医薬組成物は、薬学的に許容される塩および／または賦形剤を含む。
さらなる実施形態は、出血性疾患の治療を必要とする患者における出血性疾患を治療するための、上記の医薬組成物の使用を含む。
別の実施形態は、出血性疾患を治療するための医薬品の製造における、上記の医薬組成物の使用を含む。
さらに、出血性疾患を有する患者を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に上記の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
別の実施形態では、哺乳動物プラスミノーゲンを標的とするためのｓｉＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、血友病および他の出血性疾患において、線維素溶解を減少させ、および／または出血を管理する。
別の実施形態では、本開示は、プラスミノーゲンをコードするｍＲＮＡと相互作用し、プラスミノーゲンの発現の低下をもたらすオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意に、３’－オーバーハングを含み、および／または２’－Ｏ－メチル化されていてもよい。
さらなる実施形態では、本開示は、全部で１０～４０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、１０～４０核酸塩基長のオリゴヌクレオチドを含む。連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするように標的化される。
別の実施形態では、本開示は、凝固を調節する方法であって、それを必要とする対象にｓｉＲＮＡを投与して、プラスミノーゲンの発現を阻害することを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、プラスミノーゲンの発現を阻害するための、配列番号１～２０およびその二本鎖から選択される任意の１つまたは複数の例示的なｓｉＲＮＡ配列の使用を含む。
別の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子中にｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を提供し、ｓｉＲＮＡは、プラスミノーゲンの発現を阻害する。
別の実施形態において、本開示は、プラスミノーゲンをコードするｍＲＮＡと相互作用するオリゴヌクレオチドを提供し、これは、本明細書の実施例に記載されるように、ウェスタンブロッティングおよび／または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してインビトロで測定されるように、プラスミノーゲンの発現の減少をもたらす。
別の実施形態では、本開示は、凝固因子の発現を阻害する方法であって、プラスミノーゲン（ｓｉＰＬＧ／ｓｉＰｌｇ）の発現を減少させるために、プラスミノーゲンの発現を阻害する必要がある対象に、脂質ナノ粒子中のｓｉＲＮＡの医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
ｓｉＲＮＡは、場合により、３’－オーバーハングを含んでもよく、および／または２’－Ｏ－メチル化されていてもよい。
さらなる実施形態では本発明が１０～４０核酸塩基長のオリゴヌクレオチドを含み、これは合計１０～４０、１５～３５または２５～３５ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、表１および２の配列（例えば、配列番号１～２０）、またはチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている対応するＲＮＡ配列からなる群から選択される配列にハイブリダイズするように標的化される。
明細書を通して、文脈が別途必要としない限り、単語「含む」、「含んでいる」などは、排他的な意味ではなく、包括的な意味であり、すなわち、「含むが、これに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
図１Ａは、インビトロでＨＵＨ７細胞に添加した後の、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡコントロール（Ｃｔｒｌ）と、二本鎖ｓｉＲＮＡ配列である、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．２（配列番号１および２の二本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．４（配列番号３および４の二本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．６（配列番号５および６の二本鎖ｓｉＲＮＡ）、およびｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．１０（配列番号７および８の二本鎖ｓｉＲＮＡ）（表１）とについて、コントロールと比較したプラスミノーゲンｍＲＮＡの割合（％）を示す。 図１Ｂは、インビトロでイヌの肝細胞に加えた後の、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡコントロール（Ｃｔｒｌ）と、二本鎖ｓｉＲＮＡ配列である、ｃｓ．ＰＬＧ．１（配列番号９および１０の二本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｃｓ．ＰＬＧ．２（配列番号１１および１２の二本鎖ｓｉＲＮＡ）およびｃｓ．ＰＬＧ．３（配列番号１３および１４の二本鎖ｓｉＲＮＡ）とについて、コントロールと比較したプラスミノーゲンｍＲＮＡの割合（％）を示す。 図２Ａは、マウスの肝組織における、ルシフェラーゼに対する二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）と、ｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６の二本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｍｓ．ＰＬＧ．２（配列番号１７および１８の二本鎖ｓｉＲＮＡ）およびｍｓ．ＰＬＧ．３（配列番号１９および２０の二本鎖ｓｉＲＮＡ）とについて、コントロールと比較したプラスミノーゲンｍＲＮＡの割合を示す。 図２Ｂは、コントロールＬＮＰｓｉルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃ）およびプラスミノーゲンを標的とするＬＮＰｓｉＲＮＡ（ｓｉＰｌｇ）、すなわち、ルシフェラーゼに対する二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）と、ｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）、ｍｓ．ＰＬＧ．２（配列番号１７および１８）およびｍｓ．ＰＬＧ．３（配列番号１９および２０）とについて、マウスへの注射の３日後の血漿中のプラスミノーゲンを検出するウェスタンブロットである。 図２Ｃは、線維素溶解促進状態（profibrinolytic conditions）において、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）で処理されたマウスからの血液中のエクスビボで血餅特性を測定するための、振幅（ｍｍ）対時間（時間）におけるトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）の結果を示す。 図２Ｄは、表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）に対応するｓｉＰｌｇで処理されたマウスからの血液中のエクスビボで血餅特性を測定するための振幅（ｍｍ）対時間（時間）におけるトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）の結果である（右のバー）。 図２Ｅは、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）でマウスを処理した後の血餅強度（ｍｍ）（コントロール；左のバー）、および表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）に対応するｓｉＰｌｇでマウスを処理した後の血餅強度（ｍｍ）（右のバー）を示す。 図２Ｆは、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）でマウスを処理した後の３０分後の血餅溶解（％）（コントロール；左のバー）、および表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）に対応するｓｉＰｌｇでマウスを処理した後の３０分後の血餅溶解（％）（右のバー）を示す。 図２Ｇは、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）でマウスを処理した後の総血餅溶解時間（分）（コントロール；左のバー）、および表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）に対応するｓｉＰｌｇでマウスを処理した後の総血餅溶解時間（分）（右のバー）を示す。 図３Ａは、３～４週間の間隔でｓｉＰｌｇを投与した後の血漿中のプラスミノーゲンタンパク質レベルを示す（表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）に対応する）。 図３Ｂは、表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）（塗りつぶされた記号）に対応するｓｉＰｌｇおよびｓｉＬｕｃコントロール（白抜きの記号）で処理されたマウスにおける、長期のノックダウンの経過にわたるマウス体重を示す。 図４Ａは、マウスのｓｉＬｕｃ、１０倍、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）（図４Ａ）の肝組織像（liver histology images）を示す。 図４Ｂは、マウスの代表的なｓｉＰｌｇ、１０倍、Ｈ＆Ｅ染色（図４Ｂ）の肝組織像を示す。 図４Ｃは、マウスのｓｉＬｕｃ、１０倍、フィブリン染色（図４Ｃ）の肝組織像を示す。 図４Ｄは、マウスの代表的なｓｉＰｌｇ、１０倍、フィブリン染色（図４Ｄ）の肝組織像を示す。 図４Ｅは、小病変ｓｉＬｕｃ、４０倍、Ｈ＆Ｅ染色（図４Ｅ）の肝組織像を示す。 図４Ｆは、小病変ｓｉＰｌｇ、４０倍、フィブリン染色（図４Ｆ）の肝組織像を示す。 図４Ｇは、１２ヶ月のｓｉＰｌｇ媒介ノックダウン後のマウスにおける歯周骨損失を示し、画像は、薄い太線で輪郭が描かれた測定領域を示している。 図４Ｈは、図４Ｇに輪郭が描かれた領域において測定された、ｓｉＰｌｇおよびｓｉＬｕｃコントロールで処理されたマウス間の骨損失（ｍｍ）の定量化を示す。 図５Ａは、ｓｉＰｌｇ（Ｆ８－／－）無しおよびｓｉＰｌｇ（Ｆ８－／－＋ｓｉＰｌｇ）有りで、血友病（第ＶＩＩＩ因子を欠く）のＦ８－／－マウスモデルおよび野生型マウス（ＷＴ）についての血液損失（μＬ／ｍｇ）を示すグラフである。 図５Ｂは、ｓｉＰｌｇ（Ｆ８－／－）無しおよびｓｉＰｌｇ（Ｆ８－／－＋ｓｉＰｌｇ）有りで、血友病（第ＶＩＩＩ因子を欠く）のＦ８－／－マウスモデルおよび野生型マウス（ＷＴ）の出血時間（分）を示すグラフである。 図６Ａは、血友病を有する２匹のイヌ（Ｐ３９およびＷ２６）へのｓｉＲＮＡの投与後のウェスタンブロットによって評価されるプラスミノーゲンノックダウンを示す。プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）およびＩｇＧの両方を、ｓｉＰｌｇの投与前および投与後のウェスタンブロットによって評価した。 図６Ｂは、図示されるように処理前および処理後のＰ３９イヌ（左グラフ）およびＷ２６イヌ（右グラフ）の血餅強度を測定するための振幅（ｍｍ）対時間（時間）におけるトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）の結果を示す。 図７Ａは、ベースラインおよびトラネキサム酸（ＴＸＡ）処理と比較して、ｓｉＰｌｇで処理された血友病（ＨＡ）イヌからの血液中に６０分後に残存する血餅（％）を定量化する。イヌは、ＴＸＡおよびｓｉＰｌｇのいずれも使用せず（最も左のバー）、ＴＸＡのみ（左中央のバー）、ｓｉＰｌｇのみ（右中央のバー）、またはＴＸＡおよびｓｉＰｌｇの両方（右のバー）で処理された。 図７Ｂは、ベースラインおよびトラネキサム酸（ＴＸＡ）処理と比較して、ｓｉＰｌｇで処理されたＨＡイヌからの血液中の血餅溶解時間（分）を定量化する。イヌは、ＴＸＡおよびｓｉＰｌｇのいずれも使用せず（最も左のバー）、ＴＸＡのみ（左中央のバー）、ｓｉＰｌｇのみ（右中央のバー）、またはＴＸＡおよびｓｉＰｌｇの両方（右のバー）で処理された。 図７Ｃは、２匹のイヌ（丸、四角形）における、ｓｉＰｌｇによる治療前（明るい色調）および治療中（黒色）のＨＡイヌからの年間出血率（年間平均事象）を示す。
明細書を通して、文脈が別途必要としない限り、単語「含む」、「含んでいる」などは、排他的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
本開示の一実施形態は、血栓形成を変化させるために凝固因子の発現を減少させるｓｉＲＮＡ配列を提供する。一実施形態では、凝固因子はプラスミノーゲンである。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。そのような実施形態では、ｓｉＲＮＡがセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドであり、センス鎖およびアンチセンス鎖は少なくとも部分的な相補性を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、一本鎖である。本開示のさらなる非限定的な例は、以下により詳細に記載される。
ｓｉＲＮＡ
本明細書で使用される「プラスミノーゲンに対するｓｉＲＮＡ分子（siRNA molecule against plasminogen）」という表現は、インビトロまたはインビボで測定されるように、ｓｉＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することまたは翻訳を阻害することなどによって、プラスミノーゲンの発現を低減または阻害することができる、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ）を含む。ｓｉＲＮＡは、プラスミノーゲンもしくは配列をコードする遺伝子に対して実質的もしくは完全な同一性を有し得るか、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでもよい。ｓｉＲＮＡの配列は、全長の標的配列またはその部分配列に対応することができる。
本明細書で使用される「プラスミノーゲンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ分子」という表現は、インビトロまたはインビボで測定されるように、ｓｉＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介するかまたは翻訳を阻害することによって、プラスミノーゲンの発現を低減または阻害する、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１５～４０または２０～３５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチド長、例えば、２５～４０ヌクレオチド長または２５～３５ヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の範囲である。ｓｉＲＮＡが二本鎖である場合、ヌクレオチド長は、アンチセンス鎖またはセンス鎖の長さに対応する。
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは、「ミスマッチモチーフ（mismatch motif）」または「ミスマッチ領域」を含んでもよく、これは、その標的配列に対して１００％の相補性を有さないｓｉＲＮＡ配列の一部分を指す。干渉ＲＮＡは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のミスマッチ領域を有し得る。ミスマッチ領域は、連続していてもよく、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくはそれ以上のヌクレオチドによって分離されていてもよい。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、単一のヌクレオチドを含んでもよく、または２、３、４、５、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、インビトロまたはインビボで測定されるようにプラスミノーゲンの発現を阻害する。標的遺伝子または標的配列の発現の阻害または減少は、関連するコントロールと比較して干渉ＲＮＡで得られた値が約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または０％である場合に達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための適切なアッセイには、例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ウェスタンブロット、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能などの当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはＲＮＡレベルの検査、ならびに当業者に公知の表現型アッセイ（phenotypic assays）が含まれる。インビトロでの発現の減少は、実施例に記載のアッセイを用いて測定することができる。表現型アッセイには、出血性疾患の治療または予防を評価するための実施例において本明細書に記載のモデル生物における血栓形成または他のアッセイが含まれる。
「プラスミノーゲンの発現を阻害または減少させる」という表現は、上記アッセイのいずれか１つを用いて、関連するコントロールと比較して干渉ＲＮＡで得られた値が、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または０％であるときに達成される、プラスミノーゲン発現の阻害または減少を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれかをアッセイすることができる。
ｓｉＲＮＡのヌクレオチドは、修飾されてもよい。修飾の例としては、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾などの２’－Ｏ－アルキル修飾および２’－フルオロ修飾などの２’－ハロゲン修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
ｓｉＲＮＡは、以下の表１、表２および表３に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つに対して配列同一性を有し得る。本明細書において２つの核酸に言及する場合の「配列同一性」という表現は、既知の比較アルゴリズムを使用して、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定された指定領域、または比較ウィンドウ上で最大対応するために比較および位置合わせされた場合に、同一であるかまたは同一である特定の割合のヌクレオチドを有する２つの配列または部分配列を指す。
配列同一性を決定するために、典型的には、１つの配列が、参照配列として機能し、参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。配列同一性は、典型的には当業者に周知であるＢＬＡＳＴによって測定される。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下の表１、表２および表３の配列番号１～２８のいずれか１つに対して、少なくとも３０％～１００％の配列同一性を有する。例えば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１～２８のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有し得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡの鎖が、配列番号１～２８のいずれか１つから本質的になり、これは、鎖が４ヌクレオチド以下だけ異なるが、メチル化またはハロゲン修飾（後述）などのヌクレオチドの修飾を除外することを意味する。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖が配列番号１～２８に示されるように、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド以下だけ異なる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡが１０ヌクレオチド以下だけ、または５ヌクレオチド以下だけ異なる。一実施形態では、これは、メチル化またはハロゲン修飾（後述）などの所与のヌクレオチドの修飾による差異を除外する。
別の実施形態では、本開示は、プラスミノーゲンの発現を阻害または減少させるために、配列番号１～８または配列番号２１～２８（ヒト配列）から選択される１つ以上の例示的なｓｉＲＮＡ配列またはその二本鎖を提供する。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下の表１の配列番号１～８または表３の配列番号２１～２８のいずれか１つに対して、少なくとも３０％～１００％の配列同一性を有する。例えば、ｓｉＲＮＡは、以下の表１の配列番号１～８または表３の配列番号２１～２８のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有し得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、表１の配列番号１～８または以下の表３の配列番号２１～２８のいずれか１つから本質的になり、これは、メチル化またはハロゲン修飾（後述）などのヌクレオチドの修飾を除いて、４ヌクレオチド以下だけ異なることを意味する。
本明細書における配列同一性は、２つのヌクレオチドの正確な一致を必要としないことが理解されるべきである。例示のために、所与のヌクレオチドはメチル化され、それは非メチル化ヌクレオチドと同一性を有するとされる。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖は、以下の表１の配列番号１～８および表３の配列番号２１～２８に示されるように、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド以下だけ異なる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下の表１および表３の配列と、１０ヌクレオチド以下だけ、または８、７、６、または５ヌクレオチド以下だけ異なる。一実施形態では、これは、メチル化またはハロゲン修飾（後述）などの所与のヌクレオチドの修飾による差異を除外する。
別の実施形態では、本開示は、プラスミノーゲンの発現を阻害または低減するために、配列番号１～８（表１）および配列番号２１～２８（表３）から選択される１つまたは複数のｓｉＲＮＡ配列またはその二本鎖を提供する。
別の実施形態では、本開示は、プラスミノーゲンの発現を阻害または低減するために、配列番号１～８（表１）から選択される１つまたは複数のｓｉＲＮＡ配列またはその二本鎖を提供し、ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖が、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド以下だけ異なり、および／または０～５０％または１０～４０％のヌクレオチドが、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／または２’－ハロゲン修飾などの２’－Ｏ－アルキル修飾を有する。
限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ配列は、以下の表２または表３に記載される修飾パターンと同様の修飾パターンを示し得る。
配列表に記載される配列と類似の配列を有するｓｉＲＮＡは、場合により、以下に記載されるように、リガンドなどであるが、これに限定されない別の部分とコンジュゲートされてもよいことが理解されるべきである。
ｓｉＲＮＡ内で、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、それらが、塩基対の相補性に起因して二本鎖を形成するとき、それらが、オーバーハングなしでアニーリングし、したがって二本鎖の両端に平滑末端を形成するように、または、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の１つまたは複数にオーバーハングを有するように、設計され得る。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは存在せず、３’アンチセンスオーバーハングは存在しないが、３’センスオーバーハングは存在する。他の態様において、５’オーバーハングは存在しないが、３’アンチセンスオーバーハングおよび３’センスオーバーハングが存在する。
オーバーハングが存在する場合、それらは、例えば、１～６ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの態様では、オーバーハングはジヌクレオチドである。非限定的な例として、一態様では、ｄＴｄＴである３’センスオーバーハングが存在し、アンチセンス鎖上にオーバーハングは存在せず、５’センスオーバーハングも存在しない。別の非限定的な例として、別の態様において、ｄＴｄＴである３’センスオーバーハングおよびｄＴｄＴである３’アンチセンスオーバーハングが存在するが、アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれにも５’オーバーハングは存在しない。別の非限定的な例として、一態様では、ｄＴｄＴである３’センスオーバーハング、および二本鎖内のアンチセンス鎖の領域が相補的である標的分子の領域に隣接する標的分子上の２つのヌクレオチドに相補的である３’ジヌクレオチドアンチセンスオーバーハングが存在する。この態様において、アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれにも５’オーバーハングは存在しない。オーバーハングが存在する場合、その中のヌクレオチドは、各鎖について１８～３０ヌクレオチドの前述の範囲に含まれる。
いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の他の分子に共有結合して、コンジュゲートを形成する。いくつかの態様において、コンジュゲートは、生物または細胞へのｓｉＲＮＡの供給を促進するために選択される。ｓｉＲＮＡは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、またはいずれかの鎖の３’末端でも５’末端でもない位置のヌクレオチドで、コンジュゲートに結合され得る。
コンジュゲートの例としては、抗体、ペプチド、アミノ酸、アプタマー、リン酸基、コレステロール部分、脂質、細胞透過性ペプチドポリマー、ならびに、糖モノマー、オリゴ糖およびそれらの修飾を含む糖基のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、コンジュゲートは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
脂質ナノ粒子
一実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子内に封入されたプラスミノーゲンｍＲＮＡに対する核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、プラスミノーゲンの発現を阻害または低減するためのものである。
本発明は、脂質ナノ粒子内の核酸の取り込みの位置または性質によって限定されないことが理解されうる。すなわち、「封入された（encapsulated）」という用語は、核酸と脂質ナノ粒子との間の特定の相互作用に限定されることを意味しない。核酸は、水性部分に、任意の脂質層内に、またはその両方に組み込まれ得る。
本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、核酸と会合または複合体化し得るイオン化可能な脂質を含んでもよい。「イオン化可能な脂質（ionizable lipid）」という用語は、そのｐＫａ未満の選択されたｐＨで正味の正電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、アミノ基を含む頭部基を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能である）頭部基、Ｃ１６～Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、および０～３個の二重結合を含む。
特定の実施形態では、カチオン性脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％または３０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％または３５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％である。
本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能な脂質に加えてヘルパー脂質を含んでもよい。本開示の文脈において、「ヘルパー脂質（helper lipid）」という用語は、ホスファチジルコリン脂質、スフィンゴミエリン、またはそれらの混合物から選択され得る任意の小胞形成脂質（例えば、二重層形成脂質）を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、スフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびジパルミトイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から選択される。特定の実施形態では、ヘルパー脂質がＤＯＰＣ、ＤＳＰＣまたはスフィンゴミエリンである。一実施形態では、ヘルパー脂質はＤＳＰＣである。ヘルパー脂質含量は、２つ以上の異なる種類の異なるヘルパー脂質の混合物を含んでもよい。
例えば、特定の実施形態では、ホスファチジルコリン含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％または２５ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％または３０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％または３５ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％または４０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％である。ホスファチジルコリン脂質含量は、ステロールを含む脂質ナノ粒子中の脂質の総量に基づいて決定される。
一実施形態では、ＬＮＰは、ステロール、親水性ポリマー－脂質コンジュゲート、またはその両方を含む。
ステロールの例としては、コレステロール、またはコレステロール誘導体、例えばコレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、β－シトステロール、フコステロールなどが挙げられる。一実施形態では、ステロールは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に基づいて、１５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％、１８ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、または３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％で存在する。別の実施形態において、ステロールは、コレステロールであり、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質およびステロールに基づいて、１５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％、１８ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、または３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％で存在する。
一実施形態では、親水性ポリマー脂質コンジュゲートは、（ｉ）極性頭部群を有する小胞形成脂質、および（ｉｉ）頭部群に共有結合した、親水性であるポリマー鎖を含む。親水性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリサルコシンおよびポリアスパルタミドが挙げられる。一実施形態では、親水性ポリマー脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートである。
親水性ポリマー脂質コンジュゲートは、全脂質の０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～３ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～２．５ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～２．０ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～１．８ｍｏｌ％でナノ粒子中に存在し得る。別の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～３ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～２．５ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～２．０ｍｏｌ％、または０．５ｍｏｌ％～１．８ｍｏｌ％でナノ粒子中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、または０ｍｏｌ％～３ｍｏｌ％、または０ｍｏｌ％～２．５ｍｏｌ％、または０ｍｏｌ％～２．０ｍｏｌ％、または０ｍｏｌ％～１．８ｍｏｌ％でナノ粒子中に存在し得る。
出血性疾患を治療または予防するための方法
別の態様では、本開示は、プラスミノーゲン発現の減少から利益を受けうる任意の疾患または状態を有する対象を治療する方法を提供する。
これは、本明細書で使用される「出血性疾患」を含み、限定されないが、血栓形成疾患（blood clotting disorder）などの、対象における異常な量の出血をもたらす任意の重症度の任意の状態を含む。出血性疾患には、血友病ＡおよびＢ、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）、血小板疾患、月経過多および他のまれな出血性疾患または状態が含まれるが、これらに限定されない。本方法は、場合により脂質ナノ粒子中に封入された、治療有効量のｓｉＲＮＡを対象に投与し、それによって対象を治療するか、または予防効果を提供することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、その処理の欠如と比較して、プラスミノーゲン発現の減少から利益を得る、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を含む。これには、いくつかの実施形態における予防的利益が含まれる。
一実施形態では、本開示は、プラスミノーゲン発現の減少から利益を受けうる出血性疾患を有する対象において、少なくとも１つの症状、例えば出血を予防する方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量のｓｉＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、またはそのベクターを投与し、それによって、プラスミノーゲン発現の減少から利益を受けうる疾患を有する対象における少なくとも１つの症状を予防することを含む。
一実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、血栓形成の増加および／またはプラスミノーゲンタンパク質の発現および／または蓄積の減少を引き起こす。
別の実施形態では、本開示は、凝固を調節することによって患者を治療する方法であって、それを必要とする対象にｓｉＲＮＡを投与して、プラスミノーゲンの発現を阻害することを含む方法を提供する。凝固または血栓形成（coagulation or clotting）の調節は、本明細書の実施例に記載されるように評価することができる。
プラスミノーゲン発現のノックダウン、阻害および／または減少を評価するためのさらなる方法は、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）、血餅強度アッセイ、血餅溶解アッセイおよび／または血漿プラスミノーゲンタンパク質濃度の定量化を含む。標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は、関連するコントロールと比較してｓｉＲＮＡで得られた値が約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％である場合に達成される。
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、インビトロまたはインビボで細胞を処理するために使用される。細胞は、哺乳動物対象、例えば、出血性疾患に罹患しているヒト対象などの対象内にあってもよい。本開示の一実施形態は、肝細胞に供給されるｓｉＲＮＡを使用してプラスミノーゲンをノックダウンする方法を提供する。
医薬製剤
いくつかの実施形態では、発現プラスミノーゲンを減少させる核酸を含むｓｉＲＮＡまたは脂質ナノ粒子が、医薬組成物の一部であり、疾患状態を治療および／または予防するために投与される。治療は、出血性疾患を治療するための予防的（阻止的）、改善的または治療的利益を提供し得る。医薬組成物は、任意の適切な投薬量で投与される。
一実施形態では、医薬組成物は、非経口的に、すなわち、動脈内、静脈内、皮下または筋肉内に投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、硝子体内、網膜下、髄腔内、または他の局所経路を介して投与される。
医薬組成物は、薬学的に許容される塩および／または賦形剤を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、当技術分野で周知の様々な有機および無機の対イオンから誘導される薬学的に許容される塩を指し、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムを含み、分子が塩基性官能基を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、およびシュウ酸塩などの有機酸または無機酸の塩を含む。適切な塩としては、「P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Salts Properties, Selection, and Use; 2002」に記載されているものが挙げられる。
本明細書で使用するとき、「賦形剤」という用語は、活性医薬成分（ＡＰＩ）を医薬製剤に配合するために使用される物質を意味する。非限定的な例としては、マンニトール、カプチゾール（登録商標）、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク（talcum）、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。許容される賦形剤は、非毒性であり、当業者に一般的に利用可能な任意の固体、液体、半固体の賦形剤であってもよい。
実施例は、本発明の調製および特性を例示することを意図するが、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
材料および方法
ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰの調製、解析および投与
市販の２’Ｏ－メチル化ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＷ）を、２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４緩衝液に、アミン対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比３で溶解した。イオン化可能なカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＧを、それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％のモル比でエタノールに溶解して、２０ｍＭの総脂質の最終濃度を達成した。２つの溶液を、前述のように、Ｔ－ジャンクションミキサーを使用して混合した。得られた脂質ナノ粒子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に対して１０００倍過剰で透析した。コレステロール含量は、コレステロールＥアッセイキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて測定し、そこから総脂質濃度を外挿した。核酸捕捉を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて決定した。ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰをマウスおよびイヌに静脈内投与した。プラスミノーゲンを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＧ）を処理として使用し、ＰＢＳまたはルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）をコントロールとして使用した。
マウス採血
マウス研究は、ブリティッシュコロンビア大学およびシンシナティ大学動物管理委員会が承認したプロトコールに従って実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、およびＢ６；１２９Ｓ－Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ｓｔｏｃｋ ＃０００６６４、＃１０１０４５、＃００４４２４）マウスを全ての研究において利用した。血漿タンパク質レベルを評価するために使用した血液試料を、伏在静脈穿刺（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を介し、２５Ｇ針を介してヘパリン処理したキャピラリに収集した。血液を、全血中で１０％の最終ｖ／ｖ濃度まで、クエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）を含有する２３Ｇ針を使用する心臓穿刺によって、イソフルラン麻酔したマウスから、凝固アッセイのために採取した。血漿を採取するために、全血を８００×ｇで１０分間回転させた。
ｍＲＮＡ定量化
細胞を培養プレートから収集するか、または肝臓組織を麻酔したマウスから外科的に除去し、Ｔｒｉｚｏｌ（サーモフィッシャー、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で均質化した。フェノール－クロロホルム沈殿により核酸を抽出した。試料を、ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（サーモフィッシャー）とともに３７℃で１時間インキュベートすることにより、ＤＮＡを消化した。トリゾール－クロロホルム抽出を繰り返すことにより、ＤＮアーゼを除去した。逆転写は、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（バイオ・ラッド、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて行い、続いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（サーモフィッシャー）およびＤＮＡプライマー（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を用いてｑＰＣＲを行った。
ウェスタンブロッティング
試料を還元、煮沸し、４～１５％アクリルアミド勾配ゲル（バイオ・ラッド）上で分離した。電気泳動後、試料をニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）でブロックした。膜をプラスミノーゲンに対する一次抗体（１：１０００；確認された交差反応性：ヒト、ラット、マウス、ウサギ、イヌ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｃａｓｔｅｒ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で処理し、洗浄して、ＨＲＰ標識抗宿主二次抗体（HRP-labeled anti-host secondary antibody）（１：１５，０００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で処理した。特異的バンドを、Ｃｌａｒｉｔｙ ＥＣＬ（バイオ・ラッド）を用いて、フィルム（Ｍａｎｄｅｌ、Ｇｕｅｌｐｈ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）に画像化した。ウェスタンブロットの定量化は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて行い、バックグラウンドおよびローディングコントロールに対するバンド強度を測定した。
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）
ＴＥＧ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ５０００（Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ Ｃｏｒｐ，Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）を使用して、３７℃でせん断弾性率を評価した。クエン酸処理したマウス全血またはイヌ血漿を、塩化カルシウム（１０ｍＭ）、トロンビン（０．０３ｎＭ、Ｉｎｎｏｖｉｎ，ＭｅｄＣｏｒｐ、ブラジル）、および組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ；３．８ｎＭ）と３時間かけて組み合わせた。
伏在静脈穿刺出血モデル
ｓｉＰＬＧ投与の２週間後、マウスを１０～１５％イソフルランで麻酔し、加熱パッド上に保持した。毛皮除去後、１０倍のステレオスコープで静脈を可視化した。静脈を動脈および神経から単離し、約５分間の休止期間後、２６ゲージ針のベベルを用いて穿刺創を作った。血液を、予め秤量した濾紙上に集めた。血液損失は、血液吸収後の紙の重量によって測定した。
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０．１を用いて統計解析を行った。グラフに示された全ての結果は、平均値±ＳＥＭである。Ｎは、生物学的複製の数を示す。十分なサイズ（Ｎ≧３）の群について、有意性を評価した。両側の対応のないスチューデントｔ検定を用いて、２つのデータセットを比較した。２元配置分散分析（Two-way ANOVA）を用いて２つのデータセットを経時的に比較し、１元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて複数のデータセットを１つの変動と比較した。分散が等しくなく（Ｂｒｏｗｎ－Ｆｏｒｓｙ）、すべてのデータが正規分布である（Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ）場合に、ウェルチの分散分析を使用した。有意性はＰ値＜０．０５と指定した。
実施例１：インビトロでのｓｉＲＮＡノックダウン
本実施例は、ｓｉＲＮＡが、インビトロで、ヒトおよびイヌの肝細胞中のプラスミノーゲンをノックダウンすることを実証する。
ヒト（図１Ａ）またはイヌ（図１Ｂ）の培養中の肝細胞にプラスミノーゲンを標的とする異なるｓｉＲＮＡ配列を投与した後、材料および方法に記載されている定量的ＰＣＲを使用して、プラスミノーゲンｍＲＮＡを測定した。
図１Ａに示されるように、ヒトＨＵＨ７細胞における陰性コントロール（黒色）と比較して、表１に示される選択されたｓｉＲＮＡ配列、すなわち、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．２（配列番号１および２）、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．４（配列番号３および４）、ｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．６（配列番号５および６）ならびにｈｓ．Ｒｉ．ＰＬＧ．１３．１０（配列番号７および８）での処理後に、インビトロで、プラスミノーゲンｍＲＮＡの有意な枯渇が観察された。
同様に、イヌ肝細胞において、プラスミノーゲンｍＲＮＡの有意な枯渇が、表２の配列で観察された。図１Ｂに見られるように、配列ｃｓ．ＰＬＧ．１（配列番号９および１０）、ｃｓ．ＰＬＧ．２（配列番号１１および１２）ならびにｃｓ．ＰＬＧ．３（配列番号１３および１４）ｓｉＲＮＡは、コントロールと比較してプラスミノーゲンｍＲＮＡの枯渇を示した。
実施例２：インビボでのプラスミノーゲンのｓｉＲＮＡノックダウンおよび血餅安定性
本実施例は、ｓｉＲＮＡが、マウスにおいてプラスミノーゲンをノックダウンし、線維素溶解状態においてエクスビボで、血餅をより安定にすることを示す。
ルシフェラーゼを標的とするコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）と比較して、組織採取の３日前にマウスにプラスミノーゲンを標的とする３つの異なるマウスｓｉＲＮＡ配列を投与した後、材料および方法に記載されているＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、肝プラスミノーゲンｍＲＮＡを定量した。
結果を図２Ａに示す。図２Ａに見られるように、コントロール（ｓｉＬｕｃ）と比較したプラスミノーゲンｍＲＮＡは、以下のｓｉＲＮＡ配列、表２のｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）、ｍｓ．ＰＬＧ．２（配列番号１７および１８）ならびにｍｓ．ＰＬＧ．３（配列番号１９および２０）の投与後、マウスの肝臓組織において有意に減少した。
プラスミノーゲンのタンパク質レベルも、上記ｓｉＲＮＡ配列およびコントロールルシフェラーゼの投与後にマウスにおいて評価した。プラスミノーゲンタンパク質レベルを、処理の３日後にマウスから採取した血漿中のウェスタンブロットによって評価した。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂは、コントロール（ｓｉＬｕｃ）処理が、高レベルのプラスミノーゲンを有する一方、マウスｓｉＲＮＡ配列による処理が、プラスミノーゲンタンパク質濃度の有意な減少を示すことを示す（右矢印）。
材料および方法に記載されているようなトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）を使用して、線維素溶解促進状態において、ｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）（灰色）またはｓｉＬｕｃ（黒色）で処理されたマウスからの血液中のエクスビボで血餅特性を測定した。結果を図２Ｃ（ｓｉＬｕｃコントロール）と図２Ｄ（ｓｉＰｌｇ＝ｍｓ．ＰＬＧ．１）に示す。
ｍｓ．ＰＬＧ．１（配列番号１５および１６）について、材料および方法に記載された手順を用いて、血餅強度および血餅溶解を調査した。血餅強度の結果を図２Ｅに示し、血餅溶解の傾向を図２Ｆおよび図２Ｇに示す。
図２Ｅの結果は、ｓｉＲＮＡ ｓｉＰｌｇが、マウスにおいてプラスミノーゲンをノックダウンし、ｓｉＬｕｃコントロールと比較して、線維素溶解状態においてエクスビボで、血餅をより安定にすることを示す。
図２Ｆは、ｓｉＬｕｃコントロールと比較したｓｉＰｌｇについて、３０分後の血餅溶解（％）が減少したことを示す。同様に、図２Ｇは、ｓｉＬｕｃと比較したｓｉＰｌｇについて、総血餅溶解時間（分）が延長されたことを示す。
実施例３：インビボでのプラスミノーゲンの長期ノックダウン
本実施例は、マウスにおいて、毒性が観察されずに、ｓｉＲＮＡを用いて長期ノックダウンを達成することができることを示す。
マウスにｓｉＰｌｇ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰｌｇ＝表２のｍｓ．ＰＬＧ．１二本鎖ｓｉＲＮＡ）またはｓｉＬｕｃコントロールを投与した。プラスミノーゲンの血漿濃度を、投与後の様々な時点でアッセイした。さらに、マウスの体重を注射後の様々な時点で測定して、毒性を評価した。
図３Ａに示されるように、血漿中のプラスミノーゲンタンパク質レベルは、ノックダウンが、ｓｉプラスミノーゲンの単回投与後３週間持続し、３週間間隔での定期的な投与で無期限に延長され得ることを示す。図３Ｂに示されるように、長期ノックダウンの過程にわたる体重増加は、ｓｉＰｌｇ（塗りつぶされた記号）およびｓｉＬｕｃ（白抜きの記号）で処理されたマウス間で差異を示さない。
実施例４：プラスミノーゲンのノックダウンは、プラスミノーゲン欠乏病態を引き起こさないこと
本実施例は、プラスミノーゲンのｓｉＲＮＡノックダウンが、完全なプラスミノーゲン欠乏に関連する病態を引き起こさないことを実証する。
ｓｉＬｕｃコントロールまたはｓｉＰｌｇ（ｓｉＰｌｇ＝表２のｍｓ．ＰＬＧ．１二本鎖ｓｉＲＮＡ）で処理した後、マウスの肝臓から肝組織像を得た。
図４Ａ～図４Ｆに示されるように、肝組織構造（liver histology）は、プラスミノーゲン欠乏症で通常観察される広範な線維性病変を示さなかった。
プラスミノーゲン欠乏症の症状である歯周骨損失（Periodontal bone loss）もマウスで検討した。図４Ｇおよび図４Ｈに示されるように、ｓｉＰｌｇ媒介ノックダウンの１２ヶ月後、歯周骨損失は観察されなかった。
実施例５：プラスミノーゲンノックダウンは、マウスにおいて、血餅を安定化し、出血を改善すること
本実施例は、血友病Ａを有するマウス（凝固第ＶＩＩＩ因子を欠くＦ８－／－マウス）において、プラスミノーゲンノックダウンが、線維素溶解に対して血餅を安定化し、出血を改善することを実証する。
第ＶＩＩＩ因子を欠くＦ８－／－マウスを未処理またはｓｉＰｌｇ（表２のｓｉＰｌｇ＝ｍｓ．ＰＬＧ．１二本鎖ｓｉＲＮＡ）で処理した。また、野生型マウスも、試験においてコントロールとして使用した。
結果は、血友病Ａのマウスモデルにおける出血の伏在静脈穿刺モデルの後、ｓｉＰｌｇが、総血液損失（図５Ａ）および出血時間（図５Ｂ）の両方を減少させたことを示している。
実施例６：イヌにおけるインビボでのプラスミノーゲンノックダウンは、エクスビボで血餅を安定化させること
本実施例は、イヌにおけるインビボでのプラスミノーゲンノックダウンが、エクスビボで血餅を安定化させることを示す。さらに、本実施例は、血友病Ａを有する２匹のイヌにおいて、ｓｉＰｌｇ（ｓｉＰｌｇ＝表２のｍｓ．ＰＬＧ．１二本鎖ｓｉＲＮＡ）によるプラスミノーゲンノックダウンが、血餅を効果的に安定化し、出血事象を減少させたことを示す。
ｓｉＲＮＡを２匹のイヌ（Ｐ３９およびＷ２６）に投与した。試料をｓｉＰｌｇ処理の前後に採取し、材料および方法に記載されているように、ウェスタンブロット分析によってプラスミノーゲンノックダウンを評価した。プラスミノーゲンおよびＩｇＧタンパク質レベルを、ウェスタンブロット分析においてアッセイした。
図６Ａは、プラスミノーゲンノックダウンが２匹のイヌ（Ｐ３９およびＷ２６）におけるｓｉＲＮＡの投与後３週間まで有効であったことを示す。図６Ｂは、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）であり、ベースラインコントロール（より暗い黒線）と比較して、プラスミノーゲンノックダウン（より明るい線）後の血漿血餅安定性（plasma clot stability）の増加を示している。
実施例７：イヌにおけるインビボでのプラスミノーゲンノックダウンは、血餅を安定化させ、出血事象を減少させたこと
本実施例は、血友病Ａ（ＨＡ）を有する２匹のイヌにおいて、ｓｉＰｌｇによるプラスミノーゲンノックダウンが血餅を効果的に安定化し、出血事象を減少させたことを示す。
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）は、ベースラインおよびトラネキサム酸（ＴＸＡ）処理と比較して、ｓｉＰｌｇで処理されたＨＡイヌからの血液中の血餅安定性の増加を示した。
図７Ａ－図７Ｃは、血友病Ａの２匹のイヌにおいて、ｓｉＰｌｇによるプラスミノーゲンノックダウンが血餅を効果的に安定化し、出血事象を減少させたことを示す。
本発明は、前述の詳細な説明および実施例を参照して説明および図示されてきたが、本発明から逸脱することなく、様々な修正および変更が行われ得ることが明らかであろう。

Claims (22)

  1. プラスミノーゲンｍＲＮＡに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有し、前記二本鎖または前記一本鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、ことを特徴とする二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
  2. プラスミノーゲンｍＲＮＡに対する二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含有し、２５～３５ヌクレオチド長であることを特徴とする二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
  3. 前記ｓｉＲＮＡ分子が２０～３５ヌクレオチド長である請求項１に記載の二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
  4. 前記ｓｉＲＮＡ分子が２５～３５ヌクレオチド長である請求項１に記載の二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
  5. 前記ｓｉＲＮＡ分子が２５～３５ヌクレオチド長である請求項２に記載の二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
  6. 前記配列の少なくとも１つの鎖が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  7. 前記配列が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  8. 前記配列が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  9. 前記配列が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  10. 前記配列が、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  11. 前記配列が、配列番号１～２８のいずれか１つの配列から本質的になる、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  12. 前記配列が、コンジュゲート分子である請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  13. 前記コンジュゲート分子が糖基を含む、請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  14. 前記糖基がＧａｌＮＡｃを含む、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  15. 前記配列が、配列番号１～８または２１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の前記二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含むことを特徴とする脂質ナノ粒子。
  17. プラスミノーゲンの発現を阻害または低減するための核酸と、
    １０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％で存在するイオン化可能なカチオン性脂質と、
    リン脂質およびトリグリセリドの少なくとも１つから選択される中性小胞形成脂質と、
    ステロールと、
    ０．５ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％で存在する親水性ポリマー－脂質コンジュゲートと、
    を含むことを特徴とする脂質ナノ粒子。
  18. 前記核酸が、請求項１～１５のいずれか一項に記載の前記ｓｉＲＮＡ分子である請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。
  19. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の前記ｓｉＲＮＡ分子、または請求項１６、１７もしくは１８のいずれか一項に記載の前記脂質ナノ粒子を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される塩および／または賦形剤を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
  20. 出血性疾患の治療を必要とする患者において前記出血性疾患を治療するための、請求項１９に記載の前記医薬組成物の使用。
  21. 出血性疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１９に記載の前記医薬組成物の使用。
  22. 出血性疾患を有する患者を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、請求項１９に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
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