NO783154L - Nytt materiale for reversibel fiksering av biologiske makromolekyler samt fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Description

Nytt materiale for reversibel fiksering av biologiske makromolekyler samt fremstilling og anvendelse derav. Foreliggende oppfinnelse gjelder et nytt materiale som reversibelt kan fiksere biologiske makromolekyler, fremstilling av det og dets anvendelse.

Foreliggende oppfinnelse gjelder mer spesielt nye, faste, porøse materialer som kan anvendes som stasjonære faser i kromatografikolonner, og som erkarakterisert vedat de består av et porøst, mineralsk bærermateriale dekket med en polysakkarid-polymer, eller en modifisert polysakkaridpolymer med den skjematiske formel I:

hvor R betyr en polysakkaridpolymer-rest, n er et helt tall som kan variere fra 1 til 10 og fortrinnsvis fra 2 til 5, og R2er identiske eller forskjellige og betyr en lavere alkylradikal eller en lavere hydroksylert alkylradikal, nevnte polysakkarid-belegg er om nødvendig i fornettet tilstand for å fremme dets stabilitet, og ved at det på nevnte polysakkarid-belegg eller modifiserte polysakkaridbelegg finnes podede aminerte molekyler eller makromolekyler som kan utgjøre en reaktiv stilling ved kromatografi, nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl har formelen R^N^, hvor R' er nevnte aminerte molekyl- eller makromolekylrest, podeforbindelsen mellom nevnte aminmolekyl eller -makromolekyl tilsvarer den . skjematiske formel:

Jhvor R er som foran definert og R^- - betyr resten av nevnte polysakkaridpolymer eller nevnte modifiserte polysakkaridpolymer etter at de er underkastet en oksyderende behandling fulgt av en reduksjon. Det som foran er betegnet som "lavere alkyl", skal betegne alkyl med 1 til 4, fortrinns, vis 1 eller 2, karbonatomer.

De polysakkaridpolymerer eller modifiserte polysakkaridpolymerer som kan anvendes ved fremstilling av det faste, porøse materialet ifølge oppfinnelsen, er de polysakkaridmaterialer, modifiserte eller ikke, som kan underkastes kjente oksydasjons-reaksjoner med oksydasjonsmidler som f.eks. perjodatene eller blytetraacetat.

Ifølge foretrukne utførelsesformer:

består det porøse, mineralske bærermateriale spesielt av et metalloksyd som f.eks. silisium-, aluminium-, magnesium-eller titanoksyd, eller av syntetiske eller naturlige derivater av disse oksyder, som f.eks. glass, silikater, borsilikater, kaolin osv.,

polysakkaridpolymeren er spesielt cellulose,

den modifiserte polysakkaridpolymeren er en polymer med formel I, der R er en dekstran-, stivelse- eller cellulose-rest og spesielt dietylaminoetylcellulose,

- polysakkaridpolymerbelegget stabiliseres om nødvendig ved fornetning, og fornetningsmidlet er eksempelvis en dikarbonyl-forbindelse, et halogenhydrin eller et diepoksyd, særlig 1,4-butandioldiglycidyleter, epiklorhydrin, epibromhydrin eller et epoksyd med formelen:

hvor R[- er alkyl med 1 til 20 karbonatomer, fortrinnsvis en lavere alkyl med 1 til 4 karbonatomer og R^og Rg betyr en hydrokarbonkjede med 1 til 10 atomer, fortrinnsvis en lavere alkylenradikal med 1 til 4 karbonatomer,

den aminerte molekyl eller makromolekyl med formel R<1>- , som kan tjene som reaktiv stilling ved kromatografi, I kan være enhver molekyl som har Nl^-funksjoner som kan utnyttes

ved kromatografi med biospesifikk, kjemisk eller fysikalsk-kjemisk affinitet, Det gjelder molekyler som er egnet til å muliggjøre reversible reaksjoner av biospesifikk, kjemisk eller fysikalsk-kjemisk type, eksempelvis ioniske reaksjoner, reaksjoner som omfatter hydrofobe egenskaper, reaksjoner som omfatter biospesifikk eller kjemisk affinitet, eksempelvis dannelse av reversible komplekser. Den aminerte molekyl eller makromolekyl kan ha en kationisk karakter som er egnet til utnyttelse i anionveksel-reaksjoner, den kan omfatte anioniske grupper som f.eks. karboksyl- eller sulfonyl-

grupper og muliggjøre kationveksleir-reaksjoner, den kan også være et aminert molekyl eller makromolekyl som kan tjene .som reaktiv stilling ved biospesifikk kromatografi og eksempelvis utgjøre et substrat eller en inhibitor for enzymer,

en mottager av hormoner, proteiser, virus eller bakterier,

et aitigen eller antistoff. Nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl kan spesielt være et polyamin som f.eks. 3-dietylaminopropylamin eller N,N-dietyletylendiamin, taurin, £-aminokapronsyre, lysin, fenylalanin, fenylhydrazin. meta-aminofenylborsyre, bakterielle antigener, globuliner, særlig gammaglobuliner, bakterielle toksiner, virus eller deres nedbrytningsprodukter som f.eks. forskjellige virus-antigener, cellulære mottagere

som f.eks. hydrolyseproduktene av gangliosider som har NH2-funksjoner, spesielt hydrolyseproduktene av gangliosid GM^

som f.eks. lysogangliosid , eller de spesielle hydrolyseproduktene av gangliosid G , .

Det er kjent at gangliosidene har en N-acyl-gruppe (acyl oppnådd fra en fettsyre som f.eks. stearinsyre) og minst en N-acetyl-gruppe (i 3-stilling i et galaktose-fragment), andre N-acetyl-grupper på sialinsyremolekyler kan eventuelt være til stede. Disse N-acyl- eller N-acetyl-grupper er delvis eller helt hydroliserbare ved Nf^-gruppene. I analogi med den nomen-

klatur som er foreslått av Svennerholm for gangliosidet G^ betegnes heretter med "lysogangliosider" de produkter som oppnås ved totalhydrolyse av N-acyl- og N-acetyl-gruppene i gangliosidene ved Nt^-gruppene. Produktene ved delvis hydrolyse av gangliosider, i hvilke visse NH2_grupper er des-acylert eller desacetylert ved alkalisk hydrolyse, utgjør i derivater som likeledes er anvendbare som aminierte molekyler

som kan tjene som reaktive stillinger i materialet ifølge oppfinnelsen. Det kan også bemerkes at materialene ifølge oppfinnelsen, til hvilke lysogangliosidet GMler festet, er i stand til å tilbakeholde koleratoksinet selv etter behandling i sterkt surt miljø, eksempelvis ved pH 1. Men det er kjent at gangliosidene taper en eller flere sialinsyremolekyler i surt miljø og kan omdannes til mono-sialo- eller a-sialo-gangliosider (eller -lysogangliosider). Som resultat av dette kan det for å fiksere koleratoksinet utnyttes et materiale ifølge oppfinnelsen, på hvilket det er festet, som aminert molekyl med formel R' - NH2, et hvilket som helst gangliosid-derivat (hvis N-acetyl- og N-acyl-grupper er helt eller delvis hydrolysert for å få NH2~gruppene til å forsvinne) i stand til deretter å underkaste dette materiale en syrebehandling i tilstrekkelig lang tid til at poly-sialogangliosid-derivatene omdannes til mono- og a-sialogangliosid-:

.derivater.

Oppfinnelsen gjelder likeledes en fremgangsmåte for fremstilling av det nye materiale som er definert ovenfor.

Denne fremgangsmåte erkarakterisert vedat det gjennomføres en belegning av det porøse, mineralbærermaterialet med poly-sakkaridpolymerene eller de modifiserte polysakkaridene, og om ønsket omdannes belegget av polysakkarider til et belegg av modifiserte polysakkarider, om nødvendig utføres en fornetning for å stabilisere belegget, nevnte belegg av polysakkarider eller modifiserte polysakkarider underkastes en oksyderende behandling, nevnte oksydasjonsprodukt som er oppnådd slik, omsettes med et aminert molekyl eller makromolekyl med formelen R<1>- NH,,, det oppnådde iminderivat behandles så med et reduksjonsmiddel som kan redusere imin-foreningen til en amin-forening.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte består således særlig i

å fiksere den aminerte molekyl eller makromolekyl på polysakkarid- eller det modifiserte polysakkarid-belegget ved følgende reaksjonsrekkefølge: Li a)oksydasjonsbehandling av alfa-glykol-grupper for oppnåelse!i

av karbonylderivater som kan angis skjematisk med formelen - CHO, vhro R^ er polysakkaridmolekyl-resten etter oksydasjonsreaksjonen, b) reaksjon mellom det aminerte molekyl eller makromolekyl og karbonylgruppene ifølge reaksjonen:

c) reduksjon av iminbindingen til en stabil amin-binding, eksempelvis ved hjelp av hydrogen in statu nascendi, ifølge

reaksjonen

hvor R^er definert tidligere.

Disse forskjellige kjemiske omdannelser kan gjennomføres ved omgivelsestemperatur i en kromatografikolonne.

For oksydasjonsreaksjonen, som er i og for seg kjent, kan det eksempelvis anvendes blytetraacetat, perjodsyre eller en av dens derivater, som f.eks. et alkalisk perjodat.

I tilfelle av at den modifiserte polysakkaridpolymeren er et aminert polysakkarid analogt med "DEAE"-dekstran. er det etter oksydasjonsreaksjonen nyttig å mette disse kationiske grupper med ioner, som f.eks. halogenid-ioner, for å unngå enhver risiko for forstyrrelse av den følgende reaksjon mellom den aminerte molekyl eller makromolekyl og aldehydgrupper på bæreren.

For reduksjonsreaksjon kan det eksempelvis brukes et hydrid som natriumborhydrid.

For gjennomføring av belegningen av den porøse mineralbæreren med polysakkaridpolymeren eller den modifiserte polysakkaridpolymeren kan det gås frem eksempelvis som beskrevet i hovedpatentet, dvs. at det porøse, mineralske bærermaterialet inn-føres på en kromatograf ikolonne i pulverform,, en buffer med j pH 3 til 12 får renne gjennom inntil likevekt, en løsning av I nevnte polymer i samme buffer innføres og deretter elueres inn-j i til det ikke foreligger polymer i eluatet, eller den porøse mineralske bæreren impregneres ved hjelp av en vandig løsning av nevnte polymer ved pH mellom 3 og 12 og tørkes deretter i tørkeskap mellom 50 og 120° C til konstant vekt.

Da den aminerte molekyl R' - NI^/som er fiksert på den

porøse bæreren, ved hjelp av den metode som skal beskrives,

er et delvis eller totalt hydrolyseprodukt av et poly- eller mono-sialogangliosid, omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blant annet et fritt valgt sluttstadium med syrebehandling av det materiale som er oppnådd i løpet av en tid som er tilstrekkelig til å omdanne nevnte hydrolyseprodukt til et hydrolyseprodukt som tilsvarer et mono- eller a-sialogangliosid. For å gjennomføre denne syrebehandling kan det eksempelvis anvendes en vandig saltsyreløsning med konsentra-sjon over eller lik 0,ln.

For oppnåelse av et cellulosebelegg er det fordelaktig å arbeide på følgende måte: det porøse, mineralske bærermateriale impregneres med en celluloseesterløsning. det tørkes og den belagte bærer utsettes for innvirkning av et hydrolysemiddel, f.eks. en vandig alkaliløsning, på en slik måte at estergruppene hydroliseres. På denne måten oppnås en porøs, mineralsk bærer som er belagt med en således regenerert cellulose. Det cellulosebelegg som er oppnådd, er meget stabilt og dekker porene i den porøse, mineralske bæreren fullstendig. Det er unødvendig å stabilisere dette belegget ved fornetning.

På dette stadium er det mulig å omdanne cellulosebelegget til

et modifisert cellulosebelegg ved å få det til å reagere med et passende middel, eksempel med en forbindelse med formelen:

hvor n, R^og R2er definert som tidligere og X er et halogenatom.

(Eksempelvis kan den celluloseimpregnerte, porøse, mineralske I

boæpprenråes n poå mdseentnte es mmåeted n 2-ekt lboerltergieg tyav lamdiien tyveld amainlkoealtyislk -cpeHll. uolog sede.t

Oppfinnelsen gjelder likeledes en fremgangsmåte for belegning

av en porøs, mineralsk bærer med cellulose eller modifisert cellulose slik det skal beskrives.

Den porøse, mineralske bæreren som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, kan ha en vel definert, regulert porositet. Bærerens inneroverflate kan være mindre eller lik 100 m 2/g, og om mulig ligge mellom 5 og 80 m 2/g. Middeldiameteren for porene kan være over eller like 25 nm, og om mulig ligge mellom 50 og 1000 nm, de mer presise intervaller kan anbefales avhengig av hvilken anvendelse bæreren er tiltenkt. For større overflater eller mindre porediametere blir bærerens inneroverflate util-gjengelig for den aminerte polysakkaridpolymeren og også for makro-molekylene som skal separeres. Ved en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen er den porøse, mineralske bæreren silisiumoksyd eller aluminiumoksyd og fortrinnsvis en porør silisium-oksydbærer med anionisk karakter fremstilt eksempelvis ifølge de fremgangsmåter som er beskrevet i de franske patenter 1.473.239, 1.473.240, 1.475.929 og 1.482.867. Det anvendes eksempelvis det porøse silisiumoksyd som fås i handelen fra Rhone-Poulenc Chimie Fine under varemerkene "Spherosil XOB 030, XOB 015 og XOC 005", med overflater på respektive 50, 25 og 10 m<2>/g.

Det polymere polysakkarid eller modifiserte polysakkarid

som tjener til å impregnere og dekke den porøse, mineralske bærers indre overflate har en molekylvekt på minst 10 dalton og ligger fortrinnsvis mellom 10 og 10 dalton.

Oppfinnelsen har likeledes som formål å anvende de ovenfor beskrevne nye materialer for rensing eller separering av biologiske makromolekyler.

Generelt består denne anvendelse i å utnytte affinitetsegenskapene til de aminerte molekyler eller makromolekyler som er podet på bæreren i en kromatografikolonne, til selektivt å!fiksere de biologiske makromolekyler som detønskes å isolere eller rense, eller til selektivt å tilbakeholde forurensninger eller andre proteiner som er uønsket.

Denne anvendelse erkarakterisert vedat det gjennom en kolonne som inneholder materialet ifølge oppfnnelsen, føres en løsning som inneholder de biologiske makromolekyler som det er ønsket å isolere eller rense. I tilfelle av at materialet fikserer de biologiske makromolekyler som det erønskelig å rense eller isolere, elueres disse deretter med en egnet løsning som ved kjente metoder kan separere de nevnte biologiske makromolekyler fra molekylen R<1>- NH2til hvilken de er fiksert ved affinitet. Eksempelvis kan de biologiske makromolekyler som skal isoleres, når de er fiksert ved biospesifikk affinitet til en ligand, separeres ifølge kjente metoder fra sin ligand. Selvsagt velges, avhengig av hvilken biologisk makromolekyl som skal isoleres, eller renses, et porøst materiale til hvilket er .festet en R1 - NH2- molekyl som har affinitet for nevnte biologiske makromolekyl.

Når materialet fikserer forurensninger, oppnås den ønskede biologiske makromolekyl direkte i løsningen, det porøse materiale er således dekket av et R<1>- NH2- aminert molekyl som har affinitet for den forurensning som skal fjernes. Forurensningenen kan deretter elueres med en passende løsning

og således regenerere materialet for en ny operasjon.

Mens det biologiske makromolekyl som skal isoleres, eller forurensningen som skal tilbakeholdes, er fiksert på materialet ifølge oppfinnelsen, kan det ved å benytte materialets ione-bytteregenskaper gjennomføres en eluering av det således fik-serte molekyl ved hjelp av en løsning med passende pH og mola-ritet.

Dersom det ikke ønskes å utnytte ioneveksleregenskapene til materialene ifølge oppfinnelsen, eksempelvis dersom bare de . biospesifikke affinitetsegenskapene skal utnyttes, skal det brukes løsninger i kolonnen som har tilstrekkelig ionestyrke til å nøytralisere ionevekslerfunksjonene. Når således materialene ifølge oppfinnelsen har kationiske stilline ger, skal de kationis1ke[gruppene nøytraliseres, eksempelvis, ved Cl -ioner for å eliminere

enhver uspesifikk innvirkning av ionisk type.

I visse tilfeller er det mulig å utnytte både ionerveksler-egenskapene og de andre affinitetsegenskapene, eksempelvis de biospesifikke affinitetsegenskapene, til materialene ifølge oppfinnelsen for å separere mange forskjellige proteiner ved en eneste kromatografering. Med et materiale som har både kationiske stillinger og stillinger med biospesifikk affinitet, kan det eksempelvis lett utføres en separering av en blanding av tre proteiner: et første protein med elektropositiv karakter- et andre protein med elektronegativ karakter, og et tredje protein som kan fikseres til stillinger med biospesifikk affinitet. Når en slik behandling kromatograferes, fikseres faktisk ikke det første proteinet, og det gjenfinnes således ved utløpet av kolonnen. Det andre proteinet fikseres til de kationiske stillingene og kan elueres ved hjelp av en løsning som inneholder anioner som kan fjerne det fra de kationiske stillinger, f.eks. én natriumkloridløsning. Det tredje protein er festet til de stillinger som har biospesifikk affinitet,

kan separeres fra disse ved hjelp av et passende elueringsmiddel.

Det skal nå angis en del anvendelseseksempler ifølge oppfinnelsen, hvilke ikke skal anses som noen begrensning.

A. Rensing av koleratoksin.

Det er kjent av koleravibrio i et passende kulturmiljø ut-skiller et toksin som kalles koleragen eller enterotoksin,

som er ansvarlig for den diare som fremkalles hos mennesker av denne smittekilde. Etter sentrifugering og filtrering av det endelige kulturmiljø, er det mulig å oppnå et "råkultur-filtrat" som inneholder koleratoksinet blandet med flere andre makromolekyler fra det oppfinnelige kulturmiljøet eller utskilt fra vibrionene.

Koleratoksinet omdannes delvis og progressivt til en ikke-toksisk form som kalles koleragenoid. Koleragenoidet har en struktur som er lik koleragenets, men koleragenet har i til-

legg en polypeptidkjede A som er ansvarlig for toksisiteten.

Koleragenet og koleragenoidet fikseres begge to selektivt på

en mottaker som ble identifisert i 19 73, og som er kalt "Gangliosid GM1"•

Mange forfattere har vist interesse for koleragenet og loleragenoidet for fremstilling av vaksine og erkjent nytten av å kunne oppnå betydelige mengder av dette produkt.

Rensing av koleragen og koleragenoid er beskrevet av mange forfattere, men den krever ofte mange trinn for oppnåelse av produkter som er korrekt renset og standardisert. Av denne grunn kan disse metoder vanskelig anvendes industrielt. Ved kromatografi med biospesifikk affinitet er det teoretisk mulig å oppnå det ønskede produktet i meget renset tilstand i ett trinn. I denne ånd har Cuatrecasas (1973) beskrevet en metode for selektivt å oppnå koleratoksin ved affinitetskromatografi'. Agarosekromatografikolonner er kjemisk modifisert for å feste gangliosidet GM^ ved kovalentbinding. Takket være sin affinitet for GM^ var en effektiv fiksering av koleratoksinet mulig, men utvinningen av dette toksin ble vanskelig-gjort på grunn av den ekstremt sterke affinitet mellom G^

bundet til agarosen og toksinet. Dette gjorde benyttelse av et denaturerende miljø obligatorisk for å dissosiere komplekset, hvilket innebar en denatuering og dårlig utbytte ved slutten av operasjonen. På den annen side krever den anbefalte metode for aktivering av agarosen anvendelse av cyanbromid som er meget farlig å håndtere og den kan således innebære uønskede komplikasjoner ved en eventuell industriell anvendelse. Dess-uten har de derivater som er fremstilt på agarose med cyanbromid-metoden, vist seg ganske ustabile, særlig ved surt pH (pH 3). Idet surgjøring av miljøet er nødvendig for utvinning av koleratoksinet, forstår man at levetiden for bæreren risikerer å bli kort ved industriell utnyttelse.

Foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å utnytte effektivi-teten og hurtigheten ved kromatografi med biospesifikk affinitet, men ved å anvende en kromatografibærer som passer utmerket for industriell bruk.

i i Utnyttelsen av denne bærer med biospesifikk affinitet er ikke

mulig før den valgte ligand på porenes indre overflate er im-mobilisert.

To forskjellige typer ligander som begge er spesifikke for koleratoksin, er anvendt. Den første er et gangliosid GMl~derivat som har en sterk og spesifikk "biokjemisk affinitet" for koleragen eller koleragenoid. Den andre er anti-legemet kolera-antitoksin, som har en spesifikk "immunologisk affinitet" vis å vis koleragenet,og koleragenoidet. Toksinets affinitet for gangliosidet er kjent å være meget sterk og sannsynligvis sterkere enn affiniteten for antilegemet. Etter påpoding av gangliosid G^ på overflaten til silisium-oksydet ved hjelp av metoder som skal angis, er det imidlertid oppdaget at den oppnådde affinitet mellom G^som er podet slik, og koleratoksinet er helt reversibel. I motsetning til re-sultatene til Cuatrecasas er det således mulig å utvinne koleratoksinet under relativt milde elueringsbetingelser. Dette kan ikke forklares teoretisk, og er et overraskende resultat.

For å eluere koleratoksin som er fiksert på materialet ifølge oppfinnelsen, kan det anvendes en sur buffer, eksempelvis en sur citratbuffer, en sterkt konsentrert løsning av urea, guanidin, jodid (eksempelvis natriumjodid), tiocyanat ( eksempelvis kalium-tiocyanat) eller ethvert annet kaotropisk eller denatureringsmiddel.

Når det gjelder stabiliteten av de podede ligander, er det likeledes oppnådd en viktig forbedring takket være foreliggende oppfinnelse. Det er faktisk mulig å vaske bærerne regelmessig med løsninger som f.eks. 0,ln HC1 eller 0,ln NaOH, dvs. ved pH fra 1 til 13 uten at den biospesifikke affiniteten skades av det. Slike stabiliteter forekommer ikke hos kjente bærere som f.eks. er basert på agarose, som må unngå ekstreme pH-verdier.

På det mekaniske plan har endelig de mulig vannmengder på

200 til 400 ml/cm 2/time og fravær av nedsiging av bæreren bekreftet nytten av disse nyt metoder for utvikling av indu-strielle anvendelser.

B. Andre anvendelser

Med materialer ifølge oppfinnelsen, som er fremstilt med .lysin som aminert molekyl, er det mulig å utnytte lysin-plasminogen-affiniteten for å isolere og rense blodplasminogen.

Med materialet ifølge oppfinnelsen, som er fremstilt med meta-aminofenylborsyre som aminert molekyl, er det mulig reversibelt å fiksere sukkere og makromolekyler som omfatter med en cis-c£-glykolf unks jon (glykolproteiner , nukleinsyrer og lipopolysakkarider).

På samme måte er det ved å anvende bakterielle antigeren som aminert molekyl, mulig reversibelt å fiksere tilsvarende antilegemer. Ved å bruke gammaglobuliner som aminert molekyl er det mulig reversibelt å fiksere de tilsvarende antigener.

Ved å bruke bakterielle toksiner som aminert molekyl, er

det mulig spesielt å fiksere tilsvarende antilegemer, osv.

Eksemplene illustrerer oppfinnelsen uten å begrense den.

Eksempel 1

Poding av lysiogangliosid G^^ på en porøs, mineralsk bærer

som er impregnert med sekundært fornettet dietylaminoetyldekstran.

1.1. Bæreren på basis av "DEAE Dextran" er fremstilt ifølge en av de teknikker som er beskrevet i hovedpatentet.

10 g "Spherosil XOB 030" tilsettes 30 ml 7,5%-ig "DEAE

Dextran" med pH 11,5. Blandingen tørkes en natt ved 80° C, deretter tilsettes 30 ml av en 1,5%-ig butandioldiglycidyleter i etyleter. Eteren fordampes under en luftstrøm, deretter holdes blandingen i 15 timer ved 80° C for å oppnå fornetning av "DEAE Dekstran".

1.2. Gangliosidløsningen fremstilles ved ioneveksler-kromatografi på porøst silisiumoksyd som er impregnert med "DEAE Dekstran" ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 8 i

2.1.Impregnering med cellulose. 10 g "Spherosil XOC 005"

(eller enhver annen porøs, mineralsk bærer) tilsettes 30 ml av en 3%-ig celluloseacetat-løsning i aceton (cellulose-propionat eller andre estere som er løselige i organiske løsningsmidler, og som er hydrolyserbare, kan brukes like godt, forutsatt at de kan gi den opprinnelige cellulose til-

bake ved alkalisk hydrolyse).

Blandingen tørkes i en varm luftstrøm. Pulveret kan så siktes om nødvendig og påføres på en kolonne.

Vaskin med 10 1 0,ln vandig NaOH-løsning gjennomføres så kontinuerlig i en mengde av 500 ml/time i en hel natt. Etter denne alkaliske hydrolyse kan kolonnen vaskes med aceton eller vann, hvorved det fås et pH der den således regenererte cellulose ikke lenger er løselig og forblir fullstendig i det

.indre av porene i den porøse, mineralske bæreren, som den dekker så godt at den opprinnelige polymeren lett .får adgang til hele den indre overflaten. Anvendelse av celluloseestere med så

lave molekylvekter som mulig tilrås av denne grunn.

2.2. Fremstilling av en løsning av lysogangliosid med aminfunksjoner. Samme betingelser som i avsnitt 1.2.

'2.3. Perjodat- oksydasjon av bæreren. Samme betingelser som i 1.3.

2.4. Poding av lysogangliosid. Samme betingelser som i 1.4.

2.5. Reduksjon med natriumborhydrid, NaBH^. Samme betingelser som i avsnitt 1.5.

Angående forskjeller fra den bærer som ble fremstilt i foregående eksempel, har ikke bæreren i foreliggende eksempel ioneveksler-egenskaper, og kan da eventuelt brukes for mindre ionestyrker, i de tilfeller der dette kan være en fordel.

For affiniteten mellom lysogangliosidet og koleratoksinet er dette likegyldig.

2.6. Ved strengt å følge samme teknikk har det vært mulig å Lpode ionevekslerfunksjoner, spesielt med 3-dietylaminopropylamin

eller N,N-dietyletylendiamin og anvende disse således oppnådde bærere ved kromatografi av proteiner.

2.7. Ved hele tiden å følge samme teknikk har det vært mulig å pode forskjellige amin-funksjoner som f.eks. lysin, fenylalanin, fenylhydrazin, meta-aminofenylborsyre og anvende de bærere som er oppnådd på denne måten, ved kromatografi med biospesifikk affinitet.

På samme måte kan enhver molekyl med amin-funksjoner podes,

som f.eks.: et substrat eller en inhibitor for enzymer, en mottaker for hormoner, proteiner, virus eller bakterier, et antigen eller et antilegeme, og hver av disse bærere kan utnyttes ved kromatografi med biospesifikk affinitet.

Eksempel 3. Anvendelse ved isolering og rensing av koleratoksin.

De kolonner som er beskrevet i foregående eksempler (unntatt 2.6. anvendes ved kromatografi med biospesifikk affinitet. Nærvær av 10 til 20 g/l "NaCl i kromatografibufferen anbefales for å eliminere enhver reaksjon av ionisk, ikke-spesifikk type med elektriske ledninger hos ionevekslerfunksjonene, ligandene eller proteinene som forekommer på bæreren.

Ved å kjøre et filtrat av koleravibrio-kulturer med 10 g/l

NaCl gjennom hver av disse kolonner er det lett å verifisere

at koleragenet og koleragenoidet blir hengende fast på bæreren. Ved betingelser der mindre enn den maksimale fiksering på kolonnen utnyttes, er det filtrat som oppnås ved utløpet av kolonnen, fullstendig fritt for målbar toksisk aktivitet målt ved kjente metoder.

Etter vasking med kromatografibufferen for å eliminere proteiner som ikke er fiksert, er det mulig å utvinne fiksert koleragen og koleragenoid ved eluering med 0,05m citrat-citronsyre-buffer med pH 2,8. Den oppnådde denaturering er tilsynelatende neglisjerbar siden utbyttene varierer mellom 50 og 100%, målt med de klassiske tester for bestemmelse av koleratoksin.

I-Preparatets renhet kan vurderes ved kromatograf i på "Sephadex J

G-200" (koleragenet gir en topp tilsvarende en molekylvekt på 84000, koleragenoidet gir en topp tilsvarende en molekylvekt på 56000) , eller ved immunokjemiske metoder med kontroll-antiserum. (Et antiserum av kultur-anti-filtrat som ikke har kolera-anti-toksin-antilegemer bør ikke gi vanlig utfelning med disse rensede preparater).

En kolonne på 10 g fremstilt ifølge en av metodene som er beskrevet i de foregående eksempler, muliggjør behandling av mengder av kulturfiltrater på fra 500 ml til 10 1, idet den nøyaktige mengde tydeligvis avhenger av mange parametre, for å utvinne den mengde toksin som foreligger i kulturfiltratet og mengden G M, i den rå gangliosidløsningen.

De mulige anvendelser er som følger:

Fremstilling av en løsning av renset koleragen eller koleragenoid som kan tjene til fremstilling av en vaksine.

Frigjøring av et kulturfiltrat av koleravibrioner for ethvert spor av koleragen og koleragenoid.

Fremstilling av antisera mot disse to. typer løsninger.

Eksempel 4. Separering av bestanddelene i en blanding av gamma- globuliner, albumin og koleratoksiner ved en eneste kromatografering.

Dette eksempel har som formål å vise mulighetene for samtidig anvendelse av materialene som er beskrevet i eksempel 1, for ionevekslerkromatografi og affinitetskromatografi. I motsetning til det som gjennomføres i eksempel 3 foran, tilsettes ikke natriumklorid i kromatografiløsningen som inneholder en kunstig blanding av de tre proteiner: gamma-glbbuliner, albumin og kolera-toksin. Gamma-globulinene, som har en elektropositiv karakter, absorberes ikke på det modifiserte "DEAE Dextran"-sjiktet, mens albuminet som har en elektro-negativ karakter, fikseres på dette sjikt. Når det gjelder koleratoksinet, fikseres det til lysogangliosid G^-stillingene. Ved å be-I nytte en kromatograf i-buf f er med svak ionestyrke (0,01m fosfat-j buffer, pH 6,8) gjenfinnes gamma-globulinene ved utløpet av kolonnen i form av en ikke absorbert topp. Ved etterfølgende eluering med en buffer inneholdende 10 g/l natriumklorid blir albuminet utbyttet og eluert. Den endelige eluering med en citratbuffer med pH 2,8 muliggjør deretter eluering av koleratoksinet.

Claims (23)

1. Fast, porøst materiale for anvendelse i kromatografikolonner, som reversibelt kan fiksere biologiske makromolekyler, karakterisert ved at det består av en porøs, mineralsk bærer belagt med en polysakkaridpolymer eller en modifisert polysakkaridpolymer, idet nevnte polysakkarid-belegg om nødvendig er i fornettet tilstand for å fremme sta-.biliteten, og at nevnte belegg av polysakkarid eller modifisert polysakkarid er påpodet aminerte molekyler lier makromolekyler som kan utgjøre en reaktiv stilling for kromatografi, idet nevnte aminérte molekyl eller makromolekyl tilsvarer formelen R' - NH2 , hvor R <1> er resten til nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl og podebindingen for nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl tilsvarer den skjematiske formelen

hvor R' er som definert foran og R^ - CH2 _ representerer resten av nevnte polysakkaridpolymer eller nevnte modifiserte polysakkaridpolymer, hvoretter denne utsettes for en oksydasjonsbehandling fulgt av en reduksjon.

2. Materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at den porøse, mineralske bæreren er et metalloksyd som f.eks. silisiumoksyd, aluminiumoksyd, magnesiumoksyd, titanoksyd eller et syntetisk eller naturlig derivat av disse oksyder, som f.eks. glass, silikater, borsilikater eller kaolin.

3. Materiale ifølge et av de foregående krav, k a r a k t e- , r i s e r t ved at polysakkaridpolymeren eller den modifi-Lserte polysakkaridpolymeren er en polymer som kan medvirke ved I en kjent oksydasjonsreaksjon.

4. Materiale ifølge foregående krav, karakterisert ved at nevnte polymer velges blant dekstran, cellulose, stivelse og tilsvarende modifiserte polymerer.

5. Materiale ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at nevnte polymer er et modifisert polysakkarid med følgende generelle formel:

hvor R betyr en polysakkaridpolymer-rest, n er et helt tall som kan variere fra 1 til 10 og R-^ og R2 betyr en lavere alkylradikal eller en lavere, hydroksylert alkylradikal.

6. Materiale ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte modifiserte polysakkarid-polymer velges blant dietylaminoetyldekstran, dietylaminoetyl-stivelse eller dietylaminoetyl-cellulose.

7. Materiale ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte polumer er fornettet.

8. Materiale ifølge krav 7, karakterisert ved at fornetningsmidlet er en dikarbonyl-forbindelse, et halogen-hydrid eller et diepoksyd.

9. Materiale ifølge krav 8, karakterisert ved at fornetningsmidlet er 1,4-butan-dioldiglycidyleter, epiklorhydrin, epibromhydrin eller et epoksyd med formelen:

hvor R,- er en alkyl med 1 til 20 karbonatomer, fortrinnsvis med lavere alkyl med fra 1 til 4 karbonatomer, og R^ og Rg betyr en hydrokarbonkjede med 1 til 10 karbonatomer, fortrinnsvis en jlavere alkylenradikal med 1 til 4 karbonatomer. j

10. Materiale ifølge et av kravene 1, 2 og 7 til 9, j karakterisert ved at nevnte polysakkarid- i polymer er cellulose.

11. Materiale ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl er et substrat eller en inhibitor for enzymer, en mottaker for hormoner, proteiner, virus eller bakterier, et antigen eller et antilegeme.

12. Materiale ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte aminerte molekyl eller makromolekyl velges blant polyaminer som f.eks. 3-dietylamino-propylamin eller N,N-dietyletylendiamin, lysin, fenylalanin, fenylhydrazin, taurin, E-aminokapronsyre, meta-aminofenylborsyre, bakterielle antigeren. globulinene, særlig gamma-globulinene, bakterielle toksiner, virus eller deres nedbrytningsprodukter som forskjellige virus-antigener, og deres cellulære mottakere.

13. Materiale ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte cellulære mottaker er et produkt som oppnås ved total eller delvis hydrolyse av N-acyl- og N-acetylgruppene i et gangliosid..

14. Materiale ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte cellulære mottaker er lysogangliosid GM1 .

15. Fremgangsmåte for fremstilling av materialet ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det påføres et belegg på den porøse, mineralske bæreren av en polysakkaridpolymer eller en modifisert polysakkarid-polymer, og om ønsket omdannes belegget av polysakkaridpolymer til et belegg av modifisert polysakkaridpolymer, at det om nødvendig utføres en fornetning for å stabilisere belegget, at nevnte belegg av polysakkarider eller modifiserte polysakkarider underkastes en oksydasjonsreaksjon med perjodat, at det således fremstilte oksydasjonsprodukt omsettes med en aminert molekyl eller makromolekyl med formelen R <1> - NH2/ at det oppnådde iminderivatet deretter underkastes innvirkningen av et reduksjonsmiddel som kan redusere iminbindingen til en aminbinding.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et fast, porøst materiale belagt med cellulose, karakterisert ved at en porøs, mineralsk bærer impregneres med en løsning av en hydrolyserbar cellulose-ester, det tørkes og den således oppnådde, belagte bærer utsettes for innvirkning av en vandig alkaliløsning for å hydrolysere ester- gruppene, og det oppnås således en porøs, mineralsk bærer som er belagt med cellulose, hvoretter cellulosebelegget om ønsket omdannes til et modifisert cellulosebelegg.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at cellulosebelegget omdannes til et modifisert cellulosebelegg ved å omsette materialet som er belagt med cellulose, med en forbindelse med formelen X - (CH2 ^n~ NRi^R2^ ' hvor n, R, og R2 er som definert i krav 5, og X er et halogenatom. .

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at oksydasjonsreaksjonen utføres.ved hjelp av perjodsyre eller en av dens derivater.

19. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 15 og 18, karakterisert ved at reduksjonsreaksjonen utføres ved hjelp av et hydrid, som f.eks. natriumborhydrid.

20. Anvendelse av et materiale som definert i et av kravene 1 til 14, karakterisert ved at det fremstilles en kolonne inneholdende nevnte materiale, at en løs-ning inneholdende biologiske makromolekyler som skal isoleres eller renses, føres gjennom nevnte kolonne, idet nevnte materiale er belagt med et R'N^-molekyl med affinitet for forurensningene som skal elimineres eller for den biologiske makromolekyl som skal isoleres, og deretter i det siste tilfelle å eluere nevnte biologiske makromolekyl.

21. Anvendelse ifølge krav 17, karakterisert , ved at nevnte materiale er belagt med lysogangliosid , og at en uren løsning av koleratoksin føres gjennom kolonnen, hvoretter nevnte toksin elueres. .

22. Anvendelse ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte løsning inneholdende den makromolekyl som skal renses, utsettes for en ionestyrke som er tilstrekkelig til å unngå enhver uspesifikk reaksjon av ionetypen med bærermaterialet.

23. Anvendelse ifølge krav 20, karakterisert ved at en løsning med svak ionestyrke som inneholder en første biologisk makromolekyl med ionisk affinitet for nevnte materiale, og en andre biologisk makromolekyl med biospesifikk affinitet for R'Nl^ -molekylet føres gjennom kolonnen, at nevnte første makromolekyl elueres med en løsning med en ionestyrke som er tilstrekkelig til å hindre reaksjoner av ionetypen, at den nevnte andre makromolekyl elueres med en løsning som kan dissosiere det kompleks som er dannet mellom nevnte andre makromolekyl og de reaktive stillingene i R^I^-molekylet.