JPH07311189A - 光学分割用充填剤、及びこの充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる光学異性体の分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 充填剤に天然物を利用して、カラム法で試料
を簡便に光学分割する。 【構成】 羊毛、羽毛などのケラチン組成物を可溶化処
理した可溶化ケラチンを、無機担体上に表面修飾した無
機担体のケラチン修飾物をカラム用の充填剤とすること
により、液体クロマトグラフィーの手法で、フェニルア
ラニン、マンデル酸などの光学活性体を簡単な操作で直
接分割する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は光学分割用の充填剤、並
びにこの充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる
光学異性体の分離法に関し、フェニルアラニンやマンデ
ル酸などの光学活性を有する化合物を操作が容易な液体
クロマトグラフィーで直接・簡便に光学分割できるもの
を提供する。

【０００２】

【発明の背景】近年、研究開発の精密化に伴い、医薬
品、農薬、食品、飼料、香料などの分野で光学活性体を
取り扱うことの重要性が高まっている。光学活性体は夫
々生理活性が異なるため、その混合物を光学異性体ごと
に分割する必要があるが、当該光学分割は物質の分離技
術の中でもかなり難しい部類に属する。光学異性体の分
離法にはカラム法、ジアステレオマー法、酵素法、結晶
化法、包接化合物法などがあるが、カラム法では、分割
対象の化合物を移動相とともにクロマトカラムの固定相
に通すだけの簡単な操作で光学異性体を直接的に分離で
きるのに対して、他の方法では、反応性の見地から分割
に用いられる試薬が特定の化合物のみに有効であった
り、塩などの形成に支障の出る場合もあるなどの点や、
分割操作の手順が複雑になる点などの問題がある。

【０００３】

【従来の技術】そこで、上記カラム法による光学分割の
従来技術１を挙げると、特開平２―１０１０５０号公報
に、シリカゲルなどの無機担体に光学活性なクラウンエ
ーテル類を吸着担持した充填剤を用いて、液体クロマト
グラフィーにより所定のアミン類を光学分割することが
開示されている。

【０００４】また、従来技術２として、特開昭６３―４
２７３６号公報に、結晶性酢酸セルロースを含水アルコ
ールで煮沸処理したものをカラムクロマト用の充填剤と
して、芳香環を含む化合物などを光学分割することが開
示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術１では、
担体にクラウンエーテルのような特殊で高価な合成化合
物を吸着担持させ、当該合成物で光学分割しているが、
より一般的な天然物をシリカゲルなどに担持すること
で、天然物を利用した液体クロマトグラフィーによる光
学分割が考えられる。

【０００６】因みに、上記従来技術２の公報には、澱
粉、セルロース、羊毛などの天然物を光学分割に用いた
例があり、その分割例によると、いずれも極めてわずか
の効率しか有しないことなどが記載されており(同公報
第１頁右欄参照)、分割の実効性への疑問が示唆されて
いるが、特に、羊毛は、繊維表面を複雑なクチクル細胞
で覆われているうえ、シスチン結合や、静電、水素、疎
水結合などによる高次の架橋構造のために安定であり、
化学反応などにも抵抗を示すので、容易には活性な機能
を引き出せないことが考えられる。本発明は、上記諸事
情を勘案したうえで、カラム法による光学異性体の分割
にあたり、羊毛や羽毛を初めとする天然のケラチン組成
物を利用して、有効な光学分割能を備えた充填剤と、こ
れを用いる液体クロマトグラフィーによる分離法を新た
に開発することを技術的課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ケラチンはコラーゲンと
並ぶ硬蛋白質であり、羊毛、羽毛、毛髪などに高率で含
有され、そのペプチド鎖やその周辺構造などに係わるシ
スチン残基、アミノ基、水酸基などの多くの官能基を有
するため、本来的には反応性に富む多機能性高分子素材
と考えられる。しかしながら、前述したように、例え
ば、羊毛や羽毛などは、その繊維形態の複雑な特殊性と
構造の安定性などが障害となって、上記ケラチン本来の
有効な機能を容易に引き出せない。

【０００８】そこで、本発明者らは、ケラチン組成物を
単にそのまま利用するのではなく、例えば、羊毛、羽毛
繊維などを可溶化処理してケラチン蛋白質を抽出し、こ
の抽出ケラチンをシリカゲルなどの無機担体にカップリ
ング剤を介して化学修飾するなどの操作によって、いわ
ばケラチン組成物に化学的な加工を施して、羊毛や羽毛
などの繊維構造を破壊或は変性し、ケラチン組成物本来
の機能を有効に引き出せるようにしたうえで、これをカ
ラム用の充填剤として、液体クロマトグラフィーによる
光学分割に利用することを着想した。

【０００９】因みに、上記ケラチン組成物の化学的加工
では、主に、シスチン結合を開裂してケラチン組成物を
可溶化するため、有効な吸着サイトの表面への露出が促
進され、ケラチン蛋白質由来の特性が引き出されること
が期待でき、もって、クロマトカラム用の固定相として
の吸着能が活性化されると推測できる。

【００１０】即ち、本発明１は、ケラチン組成物を可溶
化処理した可溶化ケラチンを、無機担体上に表面修飾し
た無機担体のケラチン修飾物を主成分として、カラム用
の充填剤を構成することを特徴とする光学分割用充填剤
である。本発明２は、上記本発明１の充填剤を固定相に
用いて、液体クロマトグラフィーにより光学活性体を分
割することを特徴とする液体クロマトグラフィーによる
光学異性体の分離法である。

【００１１】上記ケラチン組成物は、羊毛、羽毛、ミン
ク毛、カシミヤ毛、毛髪などの動物や人の毛を始め、
爪、角、蹄、鱗などの種々のものをいう。このケラチン
組成物の中では、羊毛や羽毛が好ましいが、例えば、食
肉用ブロイラーから排出される羽毛は、その乾燥重量が
わが国では年間略３.５万トンにも達し、ごく一部が家
畜用の飼料又は肥料などに利用されるだけで、残りの大
部分は廃棄処分にされているという現状があるので、光
学分割用充填剤への利用は、資源の有効活用と未利用分
野への開拓などの観点からきわめて望ましい。

【００１２】前述したように、自然状態のケラチン蛋白
質は高次の架橋構造を備えているために安定で不溶傾向
が強いので、上記ケラチン組成物の可溶化処理は、主
に、ケラチン蛋白質のシスチン結合を開裂して可溶化す
ることを基本原理とする。例えば、羊毛や羽毛などの繊
維では、後述するように、主に、錯化剤の存在下で、尿
素、チオグリコール酸、乳酸などにより膨潤・変性させ
るとともに、亜硫酸塩、チオン酸塩などにより還元処理
して可溶化を行い、原料繊維の内部に薬剤を充分に拡散
・浸透させて、繊維の中からケラチンをＳ―スルホン化
ケラチンなどとして抽出するのである。

【００１３】上記無機担体は、カラム用の担体として常
用されるシリカゲル、アルミナ、ゼオライトなどを初
め、バーミキュライト、カオリナイト、モンモリロナイ
トなどの無機鉱物などでも良い。当該無機担体上への表
面修飾は、化学修飾や物理吸着などの従来公知の方式、
或は他の方式で目的の化合物を無機担体上に担持して無
機担体のケラチン修飾物を製造することをいい、化学修
飾方式の一例としては、カップリング剤などを用いて無
機担体上に前記可溶化ケラチンを化学反応で結合させる
ものがあり、このためには、水酸基などの反応基を多く
有する無機担体が好ましい。

【００１４】例えば、羊毛や羽毛ケラチンでは、後述す
るように、無機担体にシリカゲルを用い、このシリカゲ
ルにシランカップリング剤を浸漬―撹拌法などにより化
学結合させるとともに、膨化溶液中で前記可溶化ケラチ
ンと当該シランカップリング剤処理をしたシリカゲルと
を接触させ、ジスルフィド結合によりケラチンをシリカ
ゲル表面に化学修飾し、ケラチン修飾シリカゲルを得
る。尚、本発明１のカラム用充填剤は上記無機担体のケ
ラチン修飾物を主成分とするもので、外の一般的な吸着
剤を初め、他の薬剤が多少混在することを排除するもの
ではない。

【００１５】

【作用】ケラチン組成物の主鎖には、官能基-R、-H、-C
O-、-NH-を有するキラルな炭素が多く存在し、また、天
然蛋白質であるケラチンはＬ-アミノ酸のみにより構成
され、後述の試験例からも判るようにα-ヘリックス構
造をとっている。従って、ケラチン修飾した無機担体
や、ケラチン組成物の単独組成物などをカラム用充填剤
に使用すると、このキラリティーを初め、ケラチン蛋白
質の結合位置の立体的な環境(例えば、ケラチン表面に存
在する官能基を主とする吸着サイトの立体構造性など)
に起因して、立体選択相互作用により光学活性体に対し
て高い不斉識別能を持つと一応推測できるが、尚、詳し
い作用機構は研究の余地が大きい。

【００１６】

【発明の効果】

(1)天然物である羊毛や羽毛などのケラチン組成物をカ
ラム用充填剤に利用することにより、液体クロマトグラ
フィーでフェニルアラニンやマンデル酸などの光学活性
体を簡単に光学分割できる新規の方式を提供できる。ま
た、本発明のカラム用充填剤は、可溶化処理したケラチ
ン組成物をシリカゲルなどの無機担体上に表面修飾し
て、無機担体のケラチン修飾物という形態でケラチンを
有効利用するものなので、下記の(a)〜(b)の手法などに
より、試料或は用途に合わせて充填剤の種類を適正に制
御して、光学分割可能な試料の適用範囲を拡大できる。 (a)ケラチン修飾工程での反応時間、反応温度、ケラチ
ン濃度などにより、ケラチンの修飾量を変える。 (b)液体クロマトグラフィーの操作条件(例えば、圧力や
流速など)を適正に変化させる。

【００１７】(2)羊毛や羽毛などのケラチン組成物をカ
ラム用充填剤とすることで、ほとんどが廃棄処分にされ
ている羽毛を初め、羊毛などの天然資源を有効に利用で
きるとともに、カラム法による光学分割という未利用の
分野を開拓できる。

【００１８】(3)一般的な天然物である羽毛、羊毛など
のケラチン組成物を利用するので(特に、羽毛はほとんど
が廃棄処分されているので)、高価なクラウンエーテル
類を使用する冒述の従来技術１などに比べても、安価に
実施できる。

【００１９】

【実施例】以下、羊毛ケラチン修飾シリカゲルを成分と
するカラム用充填剤の調製実施例を述べるとともに、こ
の充填剤を用いた中圧液体クロマトグラフィーによるフ
ェニルアラニンとマンデル酸の光学分割例を夫々示す。
但し、本発明は下記の実施例や試験例に拘束されるもの
ではない。

【００２０】《羊毛ケラチン修飾シリカゲルの調製実施
例》当該実施例は、ケラチン組成物に羊毛、無機担体に
シリカゲルを各々選択し、羊毛ケラチンを可溶化処理
し、この可溶化ケラチンをシリカゲルの表面にシランカ
ップリング剤を介して化学修飾した、いわばシリカゲル
の羊毛ケラチン修飾物に関するものであって、下記の手
順(a)〜(c)で調製されるので、これらの工程を以下に順
次説明する。 (a)羊毛繊維からのケラチン蛋白質の抽出 (b)シリカゲルのシランカップリング剤処理 (c)シリカゲルへの羊毛ケラチンの化学修飾

【００２１】〈羊毛繊維からのケラチン抽出工程〉メリ
ノ種羊毛をアセトン及びメチルアルコールで、夫々１２
時間かけて不純物をソックスレー抽出したものを水洗
し、１００μｍ前後に細かく裁断して原料羊毛とした。
この原料羊毛６ｇを下記組成の８Ｍ尿素溶液３００ｍｌ
中に入れ、５０℃で３０分間撹拌し、膨潤処理を施し
た。

【００２２】 〔尿素溶液の組成〕 尿素(8M) ４８０.４８ ｇ／ｌ トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(0.01M) １.２１１ｇ／ｌ ＥＤＴＡ・2ナトリウム塩(0.001M) ０.３７２ｇ／ｌ

【００２３】上記溶液を２５℃の恒温撹拌装置に移し、
遮光して窒素気流中でｐＨが９.５になるまで亜硫酸ナ
トリウム飽和溶液を加え、次いで、４チオン酸ナトリウ
ム０.９ｇを加え、２４時間撹拌した。所定時間後、ナ
イロン布で遠心濾過し、クチクルの不溶物を濾別し、濾
液は透析膜(セロファンチューブ(36/32インチ);ユニオ
ンカーバイド製)に７分目まで入れ、イオン交換水で２
日間透析した。尚、外部溶液は１日２回取り換えた。透
析後、空気中(暗室)で濃縮し、その溶液を５分間遠心分
離(8000回/分)して水不溶性のHigh-Gly-Tyr蛋白を除去
するとともに、その可溶分の上澄み液を凍結乾燥し、白
色粉末のＳ−スルホン化ケラチン(Bunte塩)を得て、ケ
ラチン抽出を終えた。

【００２４】当該抽出例では、可能な限り細かく裁断し
た原料羊毛を抽出処理前に膨潤剤を加えた尿素溶液中で
時間をかけて充分に膨潤させたので、原料羊毛からのケ
ラチンの平均抽出率は４３.９％に達し、抽出したケラ
チンのスルホン化度は、シスチン残基に対して９０％以
上であった。

【００２５】〈Ｓ−スルホン化ケラチンの分子量測定〉
前記抽出例において、凍結乾燥前のＳ−スルホン化ケラ
チン溶液を分取して１００μｌ／ｍｌ水溶液を調製し、
これを試料として下記に示すゲル浸透クロマトグラフィ
ー(以下、ＧＰＣという)で測定するとともに、標準蛋白
質の分子量とそのＧＰＣ測定による保持時間とから得ら
れた検量線を使って、Ｓ−スルホン化ケラチンの保持時
間に基づいてその分子量を求めた。

【００２６】〔ＧＰＣ装置〕TOSOH高速液クロシステム
(カラムオーブンCO-8010、オートサンプラーAS-8010、UV
検出器UV-8011、示差屈折計RI-8010、システムコントロー
ラーSC-8010)、ゲルはTSK gel G2000SW_XLを使用。

【００２７】上記ＧＰＣ測定の結果、Ｓ−スルホン化ケ
ラチンの保持時間は略７.４８分を示したので、その平
均分子量は２〜３万であった。尚、前記検量線の作成に
用いた標準蛋白質の種類、その分子量及び保持時間は次
の通りである。 種類 分子量 保持時間(分) フェリチン ４５０,０００ ５.０６ アルドラーゼ ２４０,０００ ５.９８ カタラーゼ １５８,０００ ５.９４ 牛血清アルブミン ６８,０００ ６.５０ 卵アルブミン ４５,０００ ７.１０ キモトリプシノーゲンＡ ２５,０００ ８.２６ チトクロームＣ １２,５００ ８.５４

【００２８】〈Ｓ−スルホン化ケラチンのヘリックス量
測定〉上記Ｓ−スルホン化ケラチンの０.１％８Ｍ尿素
溶液と０.１％水溶液を調製して試料とし、各溶液につ
いて円偏光二色性(ＣＤ)の測定を行った。測定波長領域
は３６０〜２１０ｎｍ、測定回数は８回とした。また、
このＣＤ測定では、円二色性分散計(日本分光Ｊ−５０
０型)、及びデータプロセッサー(日本分光ＤＰ−５０
０)を使用した。

【００２９】この場合、ＣＤ曲線の２２２ｎｍの極値が
ヘリックス構造では［θ］₂₂₂＝40000であり、不規則構
造では［θ］₂₂₂≒０になることが推定されているの
で、この値を標準にすると、ケラチンのヘリックス含量
は次式(即ち、遠紫外部でのCotton効果からの診断式)で
求められる。 ヘリックス含量＝［θ］₂₂₂／−４００００ …

【００３０】また、ポリ-Ｌ-リジンの基本構造のＣＤ曲
線において、β構造及び不規則構造はともに２０８ｎｍ
では［θ］₂₀₈＝−4000に過ぎず、α-ヘリックスはこの
波長では［θ］₂₀₈＝−33000であるので、α-ヘリック
スの含量は次式(即ち、Greenfield＆Fasmanの式)で求め
られる。 α-ヘリックス含量＝［θ］₂₀₈−(−4000)／−33000−(−4000) …

【００３１】この結果、ＣＤ測定による２２２ｎｍの極
値は、０.１％尿素溶液では［θ］₂₂₂＝−6000であり、
０.１％水溶液では［θ］₂₂₂＝−27600であった。そこ
で、上記式にこれらの値を代入してヘリックス含量を
求めると、尿素溶液中では１５％であり、水溶液中では
６９％であった。同様に、２０８ｎｍの極値は、尿素溶
液中では［θ］₂₀₈＝−5500であり、水溶液では［θ］
₂₀₈＝−22000であった。そこで、上記式にこれらの値
を代入してα-ヘリックス含量を求めると、尿素溶液中
では５％であり、水溶液中では７６％であった。

【００３２】従って、ケラチン抽出分離に際して、可溶
化するために用いた尿素溶液中ではケラチンは変性され
てヘリックス構造をとっていないことが明らかになると
ともに、水溶液中ではヘリックス構造は再生することも
判った。この結果、得られたケラチン誘導体は可溶化さ
れてはいるが、α-ヘリックスなどの原初的な高次構造
を有しており、高機能な天然高分子材料としての性格を
強く保持していることが確認された。

【００３３】〈シリカゲルのシランカップリング剤処理
工程〉本処理工程は、前記羊毛繊維からケラチンを抽出
する工程とは別に、無機担体に選択したシリカゲルにシ
ランカップリング剤を反応させる工程であり、工業的な
シランカップリング剤の処理手法である浸漬―撹拌法(I
mmersion-Filtration)に準拠して行った。

【００３４】即ち、メタノール８０ｍｌに水２０ｍｌを
加えた混合溶媒を調製し、この溶媒９５ｍｌに５ｍｌの
シランカップリング剤(メルカプトプロピルトリメトキ
シシラン;信越シリコーン製 KBM-803P)を加え、撹拌し
ながら溶解した。この５％シランカップリング剤溶液１
００ｍｌにシリカゲル(シリカゲル Davisil：等級643、
200〜425メッシュ 150Å;アルドリッチ化学製)１０ｇを
加えて２４時間撹拌し、さらに５０℃の湯浴中で２時間
撹拌した。所定時間後、吸引濾過して濾液を濾別し、残
渣を８０℃で２時間乾燥させ、水、メタノールの順で洗
浄し、未固着のシランカップリング剤を除去した。その
残渣を真空乾燥させ、シランカップリング処理したシリ
カゲルの白色粉末を得た。

【００３５】因みに、上記シランカップリング剤の一般
的な反応機構を説明すると、図１に示すように、シラン
カップリング剤は水溶液中ではアルコキシ基が加水分解
してシラノール基になるので、本処理工程ではこのシラ
ノール基が、他のシランカップリング剤の分子、或はシ
リカゲル上のシラノール基に吸着し、競争脱水縮合反応
によってシロキサン結合(Si-O-Si)を形成するものと推
測できる。さらに、シリカゲル表面上のシランカップリ
ング剤は単分子層で結合し、次々とシロキサン連鎖をな
して多層構造を形成すると考えられる。

【００３６】〈シランカップリング化シリカゲルの確認
試験例〉そこで、ＦＴ-ＩＲ拡散反射法(Diffuse Reflec
tance Spectroscopy,DRS)により、シリカゲル表面に化
学結合したシランカップリング剤の確認試験を、無処理
のシリカゲルを比較例として行った。

【００３７】上記ＦＴ-ＩＲでは、分光分析装置(パーキ
ンエルマー製 1600型)、及び拡散反射装置(スペクトラ・
テック製)を使用した。測定においては、ＫＢｒ粉末を
バックグラウンドとし、試料はＫＢｒ粉末に対して３％
の処理シリカゲルを加えたものを使用し、測定条件は、
分解能４ｃｍ^-1、積算回数６４回とした。

【００３８】図３はその結果を示し、同図ｂは１０％シ
ランカップリング剤処理をしたシリカゲルのスペクト
ル、同図ａは無処理のシリカゲルのそれであり、同図ｃ
はｂとａの差をとったもので、当該差スペクトルには11
00ｃｍ^-1付近にシロキサン結合に相当する吸収ピークが
明確に現れていることから、シランカップリング剤のシ
リカゲルへの化学結合は明らかである。また、図３ｃの
差スペクトルにおいて、3000〜3200ｃｍ^-1付近に負のピ
ークが生成しているのは、シリカゲル表面のＯＨ基がシ
ランカップリング剤との置換反応で消滅したものと推測
できる。この場合、化学結合しているシランカップリン
グ剤の量的比較は、図２に示すシランカップリング剤の
持つアルキル基とチオール基の吸収帯の面積から推測で
きる。

【００３９】尚、当該差スペクトル図３ｃに現れた吸収
帯に帰属する官能基を下記に示す。 波数(ｃｍ^-1) 官能基 １０９８ Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ １４００〜１７００ Ｈ₂Ｏ ２３５８ −ＣＯ₂ ２５６０ −ＳＨ ２９３０ −ＣＨ₂−

【００４０】〈シリカゲルへの羊毛ケラチン化学修飾工
程〉本処理工程は、上記シランカップリング剤処理をし
たシリカゲルと前記羊毛繊維から抽出したケラチン(即
ち、Ｓ−スルホン化ケラチン)を結合させて、羊毛ケラチ
ン修飾シリカゲルを製造するもので、これにより最終的
に本発明１に係わるカラム用の充填剤が調製される。

【００４１】先ず、リン酸二水素カリウム１.３６ｇを
水１００ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨ８のリ
ン酸緩衝溶液をつくり、この溶液５０ｍｌに尿素２４ｇ
を溶かして膨化用の８Ｍ尿素・リン酸緩衝溶液を調製し
た。そして、上記Ｓ−スルホン化ケラチン０.５ｇを０
〜５℃に冷した当該８Ｍ尿素・リン酸緩衝溶液５０ｍｌ
に撹拌しながら溶かし、この溶液にホルマリン２ｍｌを
加えた。その後速やかに前記のシランカップリング処理
したシリカゲル３ｇを加えて２時間撹拌し、さらに室温
で２時間撹拌した。所定時間後、ガラスフィルターを用
いて吸引濾過し、残滓は熱を加えずに２４時間真空乾燥
させた。乾燥後、８ｍｏｌ／ｌの尿素溶液２００ｍｌで
洗浄し、さらに水洗して、残滓を再び真空乾燥させ、羊
毛ケラチン修飾シリカゲルの白色粉末を得た。

【００４２】即ち、膨化溶液中でＳ−スルホン化ケラチ
ン(Ｋ-ＳＳＯ₃Ｎａ;Ｋ＝ケラチン)にシランカップリン
グしたシリカゲルを撹拌・接触させると、図４に示すよ
うに、シリカゲル上のシランカップリング剤のチオール
基がＳ−スルホン化ケラチンのチオール基の開裂部位を
攻撃し、シランカップリング剤と当該ケラチンとの間に
ジスルフィド結合が生成して、シリカゲルはシランカッ
プリング剤を介して羊毛ケラチンで化学修飾されると推
測できる。

【００４３】〈羊毛ケラチン修飾シリカゲルの確認試験
例〉そこで、前記ＦＴ-ＩＲ拡散反射法により、羊毛ケ
ラチン修飾シリカゲルの確認試験を、シランカップリン
グしただけのシリカゲルとの比較において行った。測定
条件は、前記シランカップリング化シリカゲルの確認試
験例と基本的に同様とした。

【００４４】図５はその結果を示し、図５ｂは羊毛ケラ
チン修飾シリカゲルのスペクトル、図５ａはシランカッ
プリングしただけのシリカゲルのそれであり、図５ｃは
ｂとａの差をとったもので、当該差スペクトルには化学
修飾したケラチンに特有のアミドに係わる吸収ピークが
1474〜1717ｃｍ^-1の波数範囲に明確に現れていることか
ら、シリカゲル表面への羊毛ケラチンの化学修飾は明ら
かである。この場合、化学修飾したケラチンの量的比較
は、図５に示すケラチン蛋白質に帰属するアミドI、ア
ミドIIの吸収帯の面積から推測できる。

【００４５】〈シリカゲルのケラチン修飾変形例〉上記
シリカゲルのケラチン修飾処理法で得られた白色粉末
は、シリカゲル上にケラチンが化学修飾したものと判断
する以外にも、ケラチン同士の結合によるＫ-Ｓ-Ｓ-Ｋ
のパウダーではないかと解する余地があるので、この問
題をも含めて、ケラチン修飾処理における反応時間、反
応温度、或はシランカップリング剤の処理濃度によるケ
ラチン修飾の量的比較を行うため、次の〜の修飾変
形試験を行った。

【００４６】無処理のシランカップリングを用いて、
０〜５℃で２時間撹拌した。 １％シランカップリング剤で処理したシリカゲルを用
いて、０〜５℃で２時間撹拌した。 ５％シランカップリング剤で処理したシリカゲルを用
いて、０〜５℃で２時間撹拌した。 １０％シランカップリング剤で処理したシリカゲルを
用いて、０〜５℃で２時間撹拌した。 ５％シランカップリング剤で処理したシリカゲルを用
いて、０〜５℃で２時間、さらに２５℃で２時間撹拌し
た。 ５％シランカップリング剤で処理したシリカゲルを用
いて、０〜５℃で２時間、さらに２５℃で４８時間撹拌
した。

【００４７】図６はその結果を示し、試料のシリカゲ
ルでは、予想通りケラチンのアミド吸収帯は確認され
ず、ケラチンはシリカゲルに直接化学修飾はせず、物理
的吸着も無視できることが判明した。また、長時間の撹
拌においてもケラチン同士の重合による沈殿は生じなか
った。試料は１％シランカップリング剤なので、光音
響ＦＴ-ＩＲ測定ではケラチンは検出されたが、拡散反
射法では微量のため検出不可能であった。また、試料
及びのように、シランカップリング剤の濃度を増加さ
せると、所定の吸収帯面積の増加を示し、ケラチン修飾
量も増大することが判明した。これは、シリカゲル表面
に結合するシランカップリング剤が増加するためである
と推測できる。そして、試料、及びでは、ともに
シランカップリング剤が５％と一定であるが、Ｓ−スル
ホン化ケラチンの反応温度を室温まで上げたり(試料
参照)、さらには４８時間反応を行う(試料参照)こと
により、ケラチン修飾量は増大した。

【００４８】この結果、シリカゲル表面に化学結合する
ケラチン量は、修飾処理の条件を変化させることで制御
できるとともに、上記ケラチン修飾処理法で得られた白
色粉末は、Ｋ-Ｓ-Ｓ-Ｋパウダーではなく、確かにシリ
カゲルとケラチンとの反応物であることが明らかになっ
た。また、当該修飾処理では、その変性やコンホメーシ
ョン変化に留意することも肝要であるが、いずれにせ
よ、本発明の光学分割では、分割対象となる化合物、或
は、液体クロマトグラフィーの条件に合わせて、ケラチ
ン修飾量を制御すると、適正なカラム用充填剤を製造で
きることが判明した。

【００４９】以上は羊毛ケラチン修飾シリカゲルの調製
実施例、並びに当該ケラチン修飾物に係わる種々の試験
例などであるが、次いで、このシリカゲルのケラチン修
飾物から成る充填剤を固定相に利用して、中圧液体クロ
マトグラフィーによる光学分割試験例を順次述べる。

【００５０】《羊毛ケラチン修飾シリカゲルによるＤＬ
-フェニルアラニンの光学分割試験例》即ち、分割対象
試料をＤＬ-フェニルアラニンとして、一般的な中圧液
体クロマトグラフィーに準じて試験を行うとともに、使
用した測定装置及び測定条件は次の通りであった。ま
た、予め、マルチパーパス自記分光光度計(島津製作所
製 MPS-2000)を用いて対象試料をＵＶ測定し、得られた
フェニルアラニンの吸収波長２５７ｎｍを当該クロマト
グラフィーにおけるＵＶ検出器の測定波長に設定した。

【００５１】(a)測定装置 カラム：内径×外径(3×9mm)、内部有効長(150mm)(オム
ニフィット製クロマトグラフカラム ＯＭ−6312型) ポンプ：ＦＭＩ定量注入ポンプ(山善製 RP-SY-ICSC型) ダンパー：圧力安全回路付きパルスダンパー(山善製 PD
-60-SCB型) 検出器：紫外線吸収計(東洋化学産業製 UVICON UV-500) レコーダー：１ペンレコーダー(東洋化学産業製 R-01) フラクションコレクター：ミニフラクション(東洋化学
産業製 SF-100G) (b)測定条件 移動相：０.１Ｍ、ｐＨ７.０のリン酸緩衝溶液 流速：０.２０ｍｌ／分 圧力：５〜６ｋｇ／ｃｍ² 試料濃度：５０ｍｍｏｌ／ｌ 注入量：１００μｌ 測定波長：２５７ｎｍ チャート速度：１ｃｍ／分

【００５２】測定においては、先ず、上記充填剤を充填
したクロマトカラムに移動相溶液を流し、流速、レコー
ダーを安定させた後に、試料として光学活性体である５
０mmol/lのＤＬ-フェニルアラニン溶液をシリンジを使
い、１００μｌ六方コックを通して移動相溶液の流れの
中に注入し、このカラムの光学分割能を調べた。図７は
得られたクロマトグラムであり、吸収ピークは二つに明
確に別れた。尚、カラム中の充填剤の質量は０.４６９
ｇ、カラムの理論段数は１６７であった。

【００５３】そこで、最初のピークと後のピークの流出
液をフラクションコレクターを使って分取し、夫々の流
出液の旋光度をＣＤ測定した。図８はその結果を示し、
図８Ｂは最初のピークの流出液のＣＤ曲線であり、図８
Ａは後のピークの流出液のＣＤ曲線を示し、基準線を中
心に略反転していることが判る。一方、図８Ｄは標準試
料としてのＤ-フェニルアラニン、図８Ｃは標準試料と
してのＬ-フェニルアラニンの夫々ＣＤ曲線を示したも
ので、分取した流出液と標準試料の曲線を比較すると、
最初のピーク成分中にはフェニルアラニンのＤ体、後の
ピーク成分中にはＬ体がより多く存在することが明らか
であり、羊毛ケラチン修飾シリカゲルを充填剤としたカ
ラム法では、ＤＬ-フェニルアラニンを有効に光学分割
できることが判明した。

【００５４】《羊毛ケラチン修飾シリカゲルによるＤＬ
-マンデル酸の光学分割試験例》光学分割の対象試料を
ＤＬ-フェニルアラニンからＤＬ-マンデル酸に変えて、
上記カラム用充填剤を固定相とする中圧液体クロマトグ
ラフィーによる分割試験を述べる。但し、クロマトグラ
フィーの測定装置及び条件は次の項目を除き、ＤＬ-フ
ェニルアラニンの場合と同様であった。 流速：０.２５ｍｌ／分 圧力：５.５〜６.５ｋｇ／ｃｍ² 測定波長：２５５ｎｍ

【００５５】図９はそのクロマトグラムであり、吸収ピ
ークは二つに別れた。また、図１０は分取した最初のピ
ークと後のピークの流出液のＣＤ測定結果である。図１
０Ｂは最初のピークの流出液、図１０Ａは後のピークの
流出液のＣＤ曲線を各々示し、やはり基準線を中心に略
反転していることが判る。一方、図１０Ｄは標準試料と
してのＤ-マンデル酸のＣＤ曲線を示すので、最初のピ
ーク成分中にはマンデル酸のＤ体、後のピーク成分中に
はＬ体がより多く存在することが明らかであり、ＤＬ-
マンデル酸も同様に、羊毛ケラチン修飾シリカゲルを充
填剤としたカラム法で有効に光学分割できることが判明
した。

【図面の簡単な説明】

【図１】シランカップリング剤の反応式である。

【図２】シリカゲルとシランカップリング剤との結合状
態を示す模式図である。

【図３】ＦＴ-ＩＲの吸収図であり、図３ａは無処理の
シリカゲル、図３ｂはシランカップリングしたシリカゲ
ル、図３ｃは両者の吸収差を各々現す相当図である。

【図４】羊毛ケラチンによるシランカップリング化した
シリカゲルの化学修飾反応式である。

【図５】ＦＴ-ＩＲの吸収図であり、図５ａはシランカ
ップリングしたシリカゲル、図５ｂは羊毛ケラチン修飾
シリカゲル、図５ｃは両者の吸収差を各々現す相当図で
ある。

【図６】羊毛ケラチン修飾シリカゲルの修飾変形試験結
果を示す図表である。

【図７】羊毛ケラチン修飾シリカゲルを充填剤とするＤ
Ｌ-フェニルアラニンの液体クロマトグラムである。

【図８】同ＤＬ-フェニルアラニンのＣＤ曲線であり、
図８Ｂは最初のピークの流出液、図８Ａは後のピークの
流出液、図８ＣはＬ-フェニルアラニンの標準試料、図
８ＤはＤ-フェニルアラニンの標準試料の夫々相当図で
ある。

【図９】羊毛ケラチン修飾シリカゲルを充填剤とするＤ
Ｌ-マンデル酸の液体クロマトグラムである。

【図１０】同ＤＬ-マンデル酸のＣＤ曲線であり、図１
０Ｂは最初のピークの流出液、図１０Ａは後のピークの
流出液、図１０ＤはＤ-マンデル酸の標準試料の夫々相
当図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ケラチン組成物を可溶化処理した可溶化
   ケラチンを、無機担体上に表面修飾した無機担体のケラ
   チン修飾物を主成分として、カラム用の充填剤を構成す
   ることを特徴とする光学分割用充填剤。
2. 【請求項２】 請求項１の充填剤を固定相に用いて、液
   体クロマトグラフィーにより光学活性体を分割すること
   を特徴とする液体クロマトグラフィーによる光学異性体
   の分離法。