JPH069700A - ポリエチレングリコール−ヒルジン結合体、その製造法及び血栓症の治療への使用 - Google Patents
ポリエチレングリコール−ヒルジン結合体、その製造法及び血栓症の治療への使用Info
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Abstract
できるPEG−ペプチド結合体を製造する方法を提供す
ることを目的とする。 【構成】 適当な無水溶媒中ポリエチレングリコール又
はその誘導体(PEG)を活性化し、活性化されたPE
Gを回収し、該活性化されたPEGとペプチドをカップ
リングさせる工程を含むポリエチレングリコール(又は
誘導体)−ペプチド(PEG−ペプチド)結合体(conj
ugate )の製造方法であって、PEGを、カルボニルジ
イミダゾール、N−ヒドロキシスクシンイミド及び2,
3,5−トリクロロホルメート(2,3,5-trichloroforma
te)から選ばれる活性化剤によって活性化させ、活性化
されたPEGの回収を疎水性有機溶媒により活性化混合
物から沈殿させることによって行うことを特徴とする製
造方法。
Description
ル(又は誘導体)−ペプチド結合体(conjugate )、
(以下、「PEG−ペプチド」と略す。)、特に、ポリ
エチレングリコール(又は誘導体)−ヒルジン(hirudi
n )(PEG−ヒルジン)結合体の製造方法に関する。
びその誘導体(以下PEGと略す。)又はデキストラン
は、ヒトにおいて免疫原性がないことが知られており,
薬物学的使用を目的とする蛋白質と合わせて使用するこ
とが、インビボ(in vivo )でこれら蛋白質の半減期を
延長するために提案されている。
〜66アミノ酸を含有するペプチドの混合物の形態で医
用ヒルの唾液腺にその主な供給源があり、非常に特異的
且つ効果的なトロンビン阻害特性が知られているが、血
流から直ぐに除去されてしまう。その半減期は、約1時
間である。それゆえ、ヒルジンのインビボでの半減期を
延ばすことは、特に血栓症の予防に使用するために有効
である。
デキストラン−ヒルジン結合体が、ピー.クローズ(P.
Crause)によって作られた(EP-A-0,345,616)。ラット
において、デキストラン−ヒルジンの半減期は、遊離の
ヒルジンの半減期に比べ、インビボで増加したが、デキ
ストランとヒルジンとを結合する方法の収率が非常に低
く、結合したヒルジンの活性の70%以上が失なわれる
のが観察される。
た共有結合によって一般的に得られる。
PEGの活性化とペプチドと活性化したPEGのペプチ
ドとのカップリングという主たる2つのステップを包含
する。
結合体の最終収率を限定する。
PEGを精製し回収するステップを必要とするPEG活
性化方法が提案されているが、これは、収率が低い。
al.)(アナリティカルバイオケミストリー(Analytica
l Biochemistry) 1983, 131 ,25-33)は、水に対する広
範(extensive )な透析と凍結乾燥によって活性化PE
Gを精製するステップを含む、ジオキサン中でカルボニ
ルジイミダゾールとの反応によってPEGを活性化する
方法を開示している。
適用する場合に問題がある。更に、活性化したPEG
は、水溶液媒体中で不活性化され、それによって透析ス
テップによる活性化反応の収率を下げることになる。
に使用でき工業的スケールに適用できるPEG−ペプチ
ド結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明は、更に、ヒルジンの少なくとも80%がPEG
と結合し、得られる結合体が出発物質のヒルジンに比べ
て100%近く活性を保持しているようなPEG−ヒル
ジン結合体を製造する方法を提供することを目的とす
る。
達成すべく鋭意研究を重ねた結果、以下のような方法を
見出して本発明を完成した。
でPEGを活性化し、PEGを回収する公知のステップ
及びペプチドとの反応を含む。
びその誘導体は、主にポリエチレングリコール及びポリ
エチレングリコールのC1〜C6の低級脂肪族モノエーテ
ル、ポリエチレングリコールの芳香族モノエーテルまた
はモノエステル並びに単量体単位に関して総数のエチレ
ングリコール単位の少なくとも90%を含有するポリグ
リコール化(polyglycolated)された誘導体を意味する
と理解されるものである。
ル、N−ヒドロキシスクシンイミド及び2,3,5−ト
リクロロホルメート(2,3,5-trichloroformate)から選
ばれる試薬で活性化することによって活性化されたPE
Gは、疎水性有機溶媒によって活性混合物から沈殿によ
って簡単に精製され、続くペプチドとの縮合ステップに
おいても活性を維持することが見出された。
エーテル又は炭化水素を含む、非極性または僅かに極性
のある非プロトン性の溶媒から選ばれる。
ル、ペンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選択される
ものが有利であり、特にエチルエーテルが好ましい。
れ凍結乾燥される。
好ましくは極性非プロトン性の溶媒中で行われるのが良
い。
サン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシドまたはテトラヒドロフランから選ばれ
る。
ルボニルジイミダゾールによって活性化される。
対し、活性化剤は5〜50モル、好ましくは10〜20
モル使用される。
量が2,000〜100,000、好ましくは2,00
0〜50,000が良く、ポリエチレングリコール及び
ポリエチレングリコールのC1〜C6の低級脂肪族モノエ
ステルから選ばれる。
応によって得られる活性化されたPEGは、以下の一般
式I:
キル基又はカルボニルイミダゾール基、nは、約45〜
2,400を示す。〕で表される。ペプチドとのカップ
リングは、ペプチドの遊離のアミノ官能基によりイミダ
ゾール環を置換することによって僅かにアルカリ性で行
われる。
一般式II:
される。
PEG−ヒルジン結合体の製造に使用される。
れる天然のヒルジン、その天然変異体(variants、その
いくつかはHV1、HV2及びHV3と称されてい
る)、並びに遺伝子工学によって産生され、抗トロンビ
ン活性を有する変異体及びアナログ(analogs )を意味
すると理解される。
は、特に、特許出願EP-A-0,158,564、EP-A-0,200,655、
EP-A-0,273,800及びEP-A-0,332,529中に記載されてい
る。
ン基を有している。活性化されたPEGは、それゆえ、
ランダムな方法でペプチドのN−末端官能基またはいず
れかの異なるリジン基のアミン官能基に結合し得る。
は、ヒルジンのN−末端アミンに結合しておらず、それ
によってペプチド単独の抗トロンビン活性に近い活性を
有する結合体を得ることができる。
ジン結合体の製造方法にも係り、この方法は: a)適当な無水溶媒中でのカルボニルジイミダゾールと
の反応によるPEGの活性化、 b)疎水性溶媒を用いての沈殿による活性化されたPE
Gの回収、 c)わずかにアルカリ性の媒体中、ヒルジン又はその変
異体と活性化されたPEGとの縮合及び d)得られた結合体の精製 の各工程を包含する。
の縮合の工程a)、b)及びc)は、上記に記載した条
件に従って行われる。
d)は、一般に以下の2ステップのクロマトグラフィー
によって行われる: d1)反応していない過剰のPEGを除去する陰イオン
交換クロマトグラフィー及びそれに続く d2)残留する遊離ヒルジンから結合体を分離する逆相
クロマトグラフィー。
D−セファロース又はQ−セファロースが有利であり、
d2)で行われる逆相(reversed phase)は、RP30
0又はRP8相が有利である。
たヒルジンの収率は、60%以上である。
HV2−Lys47に使用される。
よって得られるPEG−ヒルジン結合体及び血栓症の治
療における治療薬としてのそれらの使用にも係る。
性化されたPEGの製造、PEG−ヒルジン結合体の製
造及び得られた結合体の抗トロンビン活性について、本
発明を例示することを目的としている。
(5,000)(MPEG5,000)の製造 MPEG5,000を活性化する反応は、すべて、無水
媒体中で行う。それゆえ、まず、反応媒体の構成物中に
存在するわずかな水も除去する。MPEG5,000
(メルク(Merck) )及びN,N´−カルボニルジイミダ
ゾール(CDI)(アルドリッチ(Aldrich) )の貯蔵
は、水を捕獲するためにシリカゲルを含むデシケーター
中で行う。5Aのモレキュラーシーブ(プロラボ(Prola
bo) )を、400℃に加熱したオーブン中で乾燥さ
せ、、その後温度を50℃に下げた後、該モレキュラー
シーブを500mlのジオキサン(SDS)に加え、溶
媒中に存在する水を捕獲する。
8.1g(約50mmol)のCDIに加え、混合物を
少なくとも2時間凍結乾燥する。乾燥した粉末を、50
mlのジオキサンに加え、MPEG5,000をCDI
で活性化させる反応を、攪拌しながら37℃で2時間行
う。MPEG5,000分子は、たった1つの遊離のヒ
ドロキシ基を有しているので、可能な活性化部位を1か
所のみ有していることになる。
は、エーテルを用いて沈殿させることによって行う。反
応媒体中の温度が20℃又はそれ以下になった時点で、
2容量のエーテルを攪拌しながら加えると、MPEG
5,000は即座に沈殿するが、過剰のCDI及び反応
中に遊離したイミダゾールは、溶液中に存在する。該溶
液をワットマン(Whatmann)44フィルターで濾過し、
フィルターをエーテルで洗浄した後、凍結乾燥した活性
化されたMPEG5,000の沈殿物を、50mlのジ
オキサン中に入れ、上述したようにエーテルで再沈殿さ
せる。濾過後、活性化されたMPEGを、終夜凍結乾燥
し、水分から防御するために、シリカゲルを含むデシケ
ーター中で保存する。
0の製造 PEG50,000を活性化する反応は、すべて、無水
媒体中で行う。全ての痕跡量の水を除去するために、P
EG50,000、CDI及びジオキサンを、実施例1
に記載したように処理する。
50,000を、1g(約6mmol)のCDIに加
え、混合物を少なくとも2時間凍結乾燥する。乾燥した
粉末を、50mlのジオキサンに加え、PEG50,0
00をCDIで活性化させる反応を、攪拌しながら60
℃で15時間行う。PEG50,000の分子は、2つ
の遊離のヒドロキシ基を有している:それゆえ、PEG
50,000の1分子につき2つの可能な活性化部位が
ある。
例1に記載したようにエーテルで沈殿させることによっ
て回収する。18.6gの活性化されたPEG50,0
00が回収される。
7と活性化されたMPEG(5,000)とのカップリ
ング A.rHV2−Lys47とMPEG5,000との結
合(Conjugation ) 3g(約0.5mmol)の実施例1の活性化されたM
PEG5,000と、15mg(約2μmol)のrH
V2−Lys47を、100mM ホウ酸塩バッファー
(borate buffer )(pH8.4)25ml中で混合す
る。反応媒体を攪拌しながら4℃で12時間放置する。
活性化されたMPEG5,000は、水と接触すると急
速に活性を失うので、3gの活性化したMPEG5,0
00を、12時間毎に順次反応媒体に4回加える。4度
目の活性化されたMPEG5,000の添加の後、反応
媒体を再度4℃で48時間放置する。
s47結合体の精製 MPEG5,000−rHV2−Lys47結合体の精
製を以下の2段階で行なう:即ち、 i) 陰イオン交換クロマトグラフィーによって、MPE
G5,000−rHV2−Lys47及びrHV2−L
ys47をカラムに吸着させ、遊離の保持されていない
過剰のMPEGを除去する。
て、残存するrHV2−Lys47を、MPEG5,0
00−rHV2−Lys47から分離する。
ロマトグラフィー 直径14mmのバイオラッドカラム(Biorad column )
に10mlの相(phase )を注ぎ入れ、50mlの平衡
化バッファー:10mM ホウ酸塩(borate)で、流速
1ml/分で平衡化する。全クロマトグラフィーを流速
1ml/分で行う。Aで得られたMPEG5,000−
rHV2−Lys47を含有する反応媒体を、水で10
倍に希釈し、10mMホウ酸塩を含有する溶液とする。
約250mlの試料を得、これをQ−セファロースカラ
ムにかける。カラムを50mlの平衡化バッファーで洗
浄し、溶出を10mlの10mMホウ酸塩バッファー
(pH8.5)、1M NaClを用いて行い、カラム
を平衡化バッファーで再度平衡化する。遊離のrHV2
−Lys47及びMPEG5,000−rHV2−Ly
s47を含む20mlの試料が回収される。これは、溶
出10mlとカラムの再平衡化の10mlとを合わせた
ものに相当する。
ー 全クロマトグラフィーを流速1ml/分で行う。アクア
ポアー(Aquapore)RP300カラム(直径95mm、
長さ250mm(アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社))及びヒューレットパッカード社(He
wlett Packard)HP1090HPLCを使用する。
5,000−rHV2−Lys47を含む1で得られた
試料のpHを、10mM TFA平衡化バッファー水溶
液でpH2に低下させる。これにより、最終容量が35
mlになる。5mlの試料を、RP300カラムにイン
ジェクトし、カラムを平衡化バッファーで洗浄すること
により、試料中の塩を除去する。次いで、溶出を10m
M TFAを含有する0から100%のアセトニトリル
の40分グラジエントで行い、その後カラムを10〜2
0mlの平衡化バッファーで洗浄する。蛋白質の溶出
は、ODを215nmで測定することによってモニタリ
ングする。操作は、7回行い、こうして35mlの試料
をクロマトグラフィーにかける。クロマトグラムを、図
1に示す。2つの画分が回収される:即ち、 −画分1は、リテンション時間が15分であり、遊離の
rHV2−Lys47を含有するピークに相当する。
2分であり、MPEG5,000−rHV2−Lys4
7を含有するピークに相当する。
EG5,000−rHV2−Lys47の溶出ピークの
比較から、95%以上のrHV2−Lys47がMPE
G5,000と結合していることが判る。
のrHV2−Lys47を含有する7つの画分1を混合
し、終夜凍結乾燥し、PBSバッファー中に入れる(表
参照)。この操作を、MPEG5,000−rHV2−
Lys47を含む7つの画分2についても同様に行う。
法で決定でき、その結果、活性化されたMPEG5,0
00は、rHV2−Lys47の末端のアミン官能基に
結合していないことを確認する。
7と活性化されたPEG50,000とのカップリング A.rHV2−Lys47とPEG50,000との結
合 2g(約40μmol)の実施例2の活性化されたPE
G50,000と、2mg(約280nmol)のrH
V2−Lys47を、100mM ホウ酸塩バッファー
(pH8.4)5ml中で混合する。反応媒体を攪拌し
ながら4℃で24時間放置する。活性化されたPEG5
0,000は、水と接触すると急速に活性を失うので、
100mM ホウ酸塩バッファー5ml中に含まれる2
gの活性化したPEG50,000を、24時間毎に順
次反応媒体に4回加える。36mlのPEG50,00
0−rHV2−Lys47の溶液が回収される。
s47結合体の精製 MPEG5,000−rHV2−Lys47の場合と同
様に、PEG50,000−rHV2−Lys47結合
体の精製を以下の2段階で行う:即ち、 i) 陰イオン交換クロマトグラフィー、及び ii) 逆相カラムクロマトグラフィー。
ロマトグラフィー 直径14mmのバイオラッドカラムに10mlの相を注
ぎ入れ、50mlの平衡化バッファー:10mM ホウ
酸塩(pH8.5)で、流速1ml/分で平衡化する。
全クロマトグラフィーを流速1ml/分で行う。Aで得
られるPEG50,000−rHV2−Lys47を含
有する反応媒体を、水で10倍に希釈し、10mMホウ
酸塩を含有する溶液とする。約360mlの試料を得、
これを3回にわけてQ−セファロースカラムでのクロマ
トグラフィーにかける。120mlの試料をQ−セファ
ロースカラムにかけ、カラムを50mlの平衡化バッフ
ァーで洗浄し、溶出を10mlの10mMホウ酸塩バッ
ファー(pH8.5)、1M NaClで行い、カラム
を平衡化バッファーで再度平衡化する。遊離のrHV2
−Lys47及びPEG50,000−rHV2−Ly
s47を含む40mlの試料が回収される。これは、溶
出10mlとカラムの再平衡化の最初の30mlの和に
相当する。
e)RP8でのクロマトグラフィー 全クロマトグラフィーを流速1ml/分で行う。5μリ
クロスフェアーRP8カラム(直径4mm、長さ125
mm(ヒューレットパッカード社))及びヒューレット
パッカード社HP1090HPLCを使用する。
0,000−rHV2−Lys47を含む1で得られた
試料のpHを、純粋なTFA200μlでpH1.5に
低下させる。カラムを10mM TFA平衡化バッファ
ー水溶液で平衡化する。20mlの試料を、RP8カラ
ムにインジェクトし、カラムを平衡化バッファーで洗浄
することにより、試料中の塩を除去する。溶出は、10
mM TFAを含有する0から100%のアセトニトリ
ルの40分グラジエントで行い、その後カラムを10〜
20mlの平衡化バッファーで洗浄する。蛋白質の溶出
は、ODを215nmで測定することによってモニタリ
ングする。操作は、2回行い、こうして40mlの試料
をクロマトグラフィーにかける。クロマトグラムを、図
2に示す。2つの画分が回収される:即ち、 −画分1は、リテンション時間が15分であり、遊離の
rHV2−Lys47を含有するピークに相当する。
0分であり、PEG50,000−rHV2−Lys4
7を含有するピークに相当する。
G50,000−rHV2−Lys47(画分2)の溶
出ピークの比較から、70%以上のrHV2−Lys4
7がPEG50,000と結合していることが判る。
のrHV2−Lys47を含有する7つの画分1を混合
し、終夜凍結乾燥し、PBSバッファー中に入れる。こ
の操作を、PEG50,000−rHV2−Lys47
を含む2つの画分2についても同様に行う。
方法: −逆相分析クロマトグラフィー(分析HPLC)、 −抗トロンビン活性試験及び −アミノ酸分析 によって行った。
125mm(ヒューレットパッカード社))及びヒュー
レットパッカード社HP1090HPLCを使用する。
流速は、全クロマトグラフィーの間1ml/分である。
バッファー:30%アセトニトリル、10mM TFA
及び70%水で平衡化する。500μlのPBSに含有
されている約25μgのPEG−rHV2−Lys47
をカラムにインジェクトし、平衡化バッファーでカラム
を洗浄後、溶出を10mM TFAを含む30から65
%アセトニトリル/水の40分グラジエントで行い、そ
の後カラムを平衡化バッファーで再度平衡化する。蛋白
質の溶出は、蛋白質に特徴的なOD215nmを測定す
ることによってモニタリングする。クロマトグラムに存
在する溶出ピークの面積は、カラムにインジェクトした
蛋白質の量に比例する。上述の様な条件下でrHV2−
Lys47の既知量をクロマトグラフィーすることによ
り、溶出ピークとインジェクトされたrHV2−Lys
47の量とを相関させることができる。
イする。この試験に使用する基質は、トロンビンによっ
て切断され、410nmで吸光を示す発色基(Chromoph
ore )を遊離するクロモザイムPL(Chromozym PL)
(トシル−グリシル−プロリル−リシン−4−ニトラニ
リドアセテート)である。
る活性トロンビンの量に依存する。ヒルジンの存在下、
トロンビンは抑制され、発色基の形成速度は、遅くな
る。
存 −トロンビン:カイネティックスバッファー中3.3μ
g/ml(IU/ml)、氷上に保存 −クロモザイムPL(ベーリンガー):6.66mg/
ml、室温で保存 −カイネティックスバッファー:50mM トリス−塩
酸 0.1M NaCl 0.1% PEG 6,000 pH 7.9 37℃にサーモスタットで調整する。
タットで調整したスペクトロフォトメーター中410n
mでモニターする。0〜100μlのヒルジンを1ml
のプラスティックスペクトロメーターキュベット中でカ
イネティックスバッファー中50μlトロンビンと混合
し、最終容量980μlとする。キュベットをあらかじ
め37℃で3分間プレインキュベートし、ヒルジンをト
ロンビンに結合させる。20μlのクロモザイムを各キ
ュベットに加え攪拌後、ODを毎分3分間410nmで
測定する。結果はOD/分で得られる。
activity )は公知であり(15,000ATU/m
g)、結合体の活性をアッセイすることにより、結合体
の量が判る。
を6N HCl蒸気で加水分解し、アミノ酸を5%n−
ヘプタン中254nmで吸光するフェニルイソシアネー
ト(PITC)と結合させる。アミノ酸結合体をC18逆
相カラムにインジェクトし、種々の結合体を分離できる
グラジエントを用いて溶出する。PITCとアミノ酸と
の結合及びクロマトグラフィーは、アプライドバイオシ
ステムズ社 130A アミノ酸アナライザーを用い
た。逆相カラムでのリテンション時間は、各アミノ酸結
合体に特異的である。アミノ酸結合体の標準溶液によっ
て、これらのリテンション時間を決定することができ、
またrHV2−Lys47の結合体の加水分解物中に存
在するアミノ酸の量を決定することができる。rHV2
−Lys47のアミノ酸構成は知られているので、この
ように分析したrHV2−Lys47の正確な量を決定
することができる。
結果を以下の表1に示す。
は、分析HPLC又はアミノ酸分析によって得られる定
量結果と同様の結果を与えるという事実により、明らか
に、得られたPEG−ヒルジン結合体のほぼ100%が
活性を有する(実施例3では、85から98%、実施例
4では、63から88%)ことが判る。
7並びにMPEG50,000及びPEG50,000
との結合体2種の阻害定数の測定 阻害定数の分析を、アール.エス.ストーン及びジェ
イ.ホフスティーンジ(R.S.Stone and J.Hofsteenge、
バイオケミストリー(Biochemistry)、1986,25,4628及び
バイオケミストリー(Biochemistry)、1991,4 ,295-300
)に記載の方法に従って行う。
ンを阻害する。阻害定数はそれゆえ以下のようにして計
算できる。
0の結合は、rHV2−Lys47−トロンビン複合体
における阻害定数に影響を及ぼさない。これらの結果に
より、PEG−ヒルジン結合体は、遊離のヒルジンと同
様の効果のあるトロンビン阻害物質であることが判る。
試験 遊離のrHV2−Lys47及びPEG−rHV2−L
ys47のラット血漿における半減期を測定するため
に、以下の2種の実験を行った: −短期間の試験:ラットに麻酔がきいている最大5〜6
時間のみ続ける。
試験の期間中意識がある。
レー種(Spraque Dawley strain )のラットを使用す
る。実験開始前5日間、ラットをそれぞれのケージに分
け、13時間の昼−夜周期に順応させ、水と食物を自由
摂取させる。
なるように3.2%クエン酸ナトリウム溶液をあらかじ
め入れたプラスティックチューブに集める。
分間4,000gで遠心することにより調製する。血漿
試料を−80℃で保存する。使用した結合体は、短期間
の試験においてはMPEG5,000−rHV2−Ly
s47、長期間の試験においてはMPEG5,000−
rHV2−Lys47及びPEG50,000−rHV
2−Lys47を使用する。
トにペントバルビタールナトリウム塩(50mg/k
g)を腹腔内投与して麻酔をする。カテーテルを右の頸
静脈に入れ、遊離形態(コントロール)又は結合した形
態のrHV2−Lys47 500μgを投与する。第
2のカテーテルを、左の頸動脈に入れ、血液試料を集め
る。
EG−rHV2−Lys47注射前(t0)並びに注射
後5分、10分、20分、1時間、2時間、4時間、5
時間及び6時間後に集める。
ットの尾の血管に、遊離形態(コントロール)又は結合
した形態のrHV2−Lys47を500μg投与す
る。血液試料は、rHV2−Lys47又はPEG−r
HV2−Lys47注射前(t0)並びに注射後5分、
8時間及び24時間後に尾の血管からエーテルでの緩や
かな麻酔下で集める。これら期間を除き、ラットは実験
中全て意識がある。
結合した形態のrHV2−Lys47の量を、ELIS
A試験及び活性試験によって決定する。キャリブレーシ
ョン系列は、集められた試料と同じ様な条件にするため
に、t0に集められた血漿で希釈したrHV2−Lys
47又はMPEG5,000−rHV2−Lys47の
適切に定量された溶液で調製する。血漿試料は、カイネ
ティックスバッファーで希釈され、rHV2−Lys4
7の濃度が、キャリブレーションの範囲に入るようにす
る。長期間の試験においては、遊離または(MPEG
5,000及びPEG50,000と)結合したrHV
2−Lys47の量を、抗トロンビン活性試験によって
決定する。これらの分析の結果は、短期間の試験につい
ては図3に、長期間の試験については図4に示す。rH
V2−Lys47のC−末端の脱離(degradation )
が、血漿中で起こり、それにより、ELISA試験及び
活性試験により得られる定量結果の差が説明される。事
実、ELISA試験に用いた2種の抗体の1つは、rH
V2−Lys47のC−末端部分を認識するので、活性
が残っている脱離された分子を認識しなくなる。
離の形態又はMPEG5,000と結合した形態で、同
量をラットに注射した場合、MPEG5,000−rH
V2−Lys47の血漿濃度は、遊離のrHV2−Ly
s47の場合に比べ、7〜8倍高い。従って同一レベル
の阻害を得るには、遊離のrHV2−Lys47よりも
7〜8倍少ない量のMPEG5,000−rHV2−L
ys47を注射すればよい。
PEG5,000−rHV2−Lys47の半減期は、
rHV2−Lys47のそれと比較して増大しているこ
とが判る。一方、PEG50,000−rHV2−Ly
s47の半減期は、上記2種のそれよりも、実質的に大
きい。確かに、注射3時間後、注射前の最初に測定した
活性と比較して、PEG50,000−rHV2−Ly
s47結合体で処置したラットで、50%以上の抗トロ
ンビン活性が、MPEG5,000−rHV2−Lys
47結合体で処置したラットで30%の抗トロンビン活
性が観察される。10%未満の抗トロンビン活性が、遊
離の形態のヒルジンをラットに注射した後8時間で測定
される。
00−rHV2−Lys47の生産コストは、遊離のr
HV2−Lys47の生産コストに比べ、僅かに増加す
るだけなので、薬物学的にMPEG5,000−rHV
2−Lys47を使用することは、rHV2−Lys4
7を使用するよりも、実質的にコストが減少できること
になる。
ル5,000−rHV2−Lys47(MPEG−rH
V2−Lys47)のクロマトグラフィー後に得られる
クロマトグラムを示す。蛋白質の溶出は、光学密度(O
D)を215nmで測定することにより経時的にモニタ
ーする。
ムでのPEG50,000−rHV2−Lys47のク
ロマトグラフィー後に得られるクロマトグラムを示す。
蛋白質の溶出は、光学密度(OD)を280nmで測定
することにより経時的にモニターする。
間を横軸にとり、縦軸に遊離又は結合したrHV2−L
ys47の血漿中の濃度を示すグラフである。
間を横軸にとり、縦軸に遊離又は結合したrHV2−L
ys47のパーセンテージ活性を示すグラフである。
Claims (25)
- 【請求項1】 適当な無水溶媒中ポリエチレングリコー
ル又はその誘導体(PEG)を活性化し、活性化された
PEGを回収し、該活性化されたPEGとペプチドをカ
ップリングさせる工程を含むポリエチレングリコール
(又は誘導体)−ペプチド(PEG−ペプチド)結合体
(conjugate )の製造方法であって、PEGを、カルボ
ニルジイミダゾール、N−ヒドロキシスクシンイミド及
び2,3,5−トリクロロホルメート(2,3,5-trichlor
oformate)から選ばれる活性化剤によって活性化させ、
活性化されたPEGの回収を疎水性有機溶媒により活性
化混合物から沈殿させることによって行うことを特徴と
する製造方法。 - 【請求項2】 該疎水性有機溶媒が、非極性または僅か
に極性のある非プロトン性の溶媒から選ばれることを特
徴とする請求項1に記載の製造方法。 - 【請求項3】 該疎水性有機溶媒が、脂肪族エーテル及
び炭化水素から選ばれることを特徴とする請求項1又は
2に記載の製造方法。 - 【請求項4】 該疎水性有機溶媒が、エチルエーテル、
ペンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選ばれるもの、
特にエチルエーテルであることを特徴とする請求項1か
ら3のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項5】 該沈殿物を、次いで、濾過及び凍結乾燥
することを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載
の製造方法。 - 【請求項6】 該活性化反応が、極性非プロトン性溶媒
から選ばれる適当な無水溶媒中で行われることを特徴と
する請求項1から5のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項7】 該無水溶媒が、ジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドま
たはテトラヒドロフランから選ばれることを特徴とする
請求項1から6のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項8】 PEGが、分子量が2,000〜10
0,000、好ましくは2,000〜50,000であ
って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
ールのC1〜C6の脂肪族モノエステルから選ばれること
を特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の製造方
法。 - 【請求項9】 活性化剤が、カルボニルジイミダゾール
であることを特徴とする請求項1から8のいずれかに記
載の製造方法。 - 【請求項10】 PEG1モルに対し、活性化剤が5〜
50モル、好ましくは10〜20モル使用されることを
特徴とする請求項9に記載の製造方法。 - 【請求項11】 該ペプチドがヒルジン又はその変異体
の1つであることを特徴とする請求項1から10のいず
れかに記載の製造方法。 - 【請求項12】 ポリエチレングリコール(又は誘導
体)−ヒルジン(PEG−ヒルジン)結合体の製造方法
であって: a)適当な無水溶媒中でカルボニルジイミダゾールと反
応させることによりポリエチレングリコール又はその誘
導体(PEG)を活性化させる工程、 b)活性化されたPEGを、疎水性溶媒を用いて沈殿さ
せることにより、回収する工程、 c)わずかにアルカリ性の媒体中、ヒルジン又はその変
異体と活性化されたPEGとを縮合させる工程、及び d)得られた結合体を精製する工程 の各工程を包含する製造方法。 - 【請求項13】 活性化反応が、極性非プロトン性溶媒
から選ばれる適当な無水溶媒中で行われることを特徴と
する請求項12に記載の製造方法。 - 【請求項14】 該適当な無水溶媒が、ジオキサン、ジ
メチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホ
キシドまたはテトラヒドロフランから選ばれることを特
徴とする請求項12又は13に記載の製造方法。 - 【請求項15】 該疎水性有機溶媒が、非極性または僅
かに極性のある非プロトン性の溶媒から選ばれることを
特徴とする請求項12から14のいずれかに記載の製造
方法。 - 【請求項16】 該疎水性有機溶媒が、脂肪族エーテル
及び炭化水素から選ばれることを特徴とする請求項12
から15のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項17】 該疎水性溶媒が、エチルエーテル、ペ
ンタン、ヘキサンまたはヘプタンから選ばれるもの、特
にエチルエーテルであることを特徴とする請求項12か
ら16のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項18】 PEG1モルに対し、カルボニルジイ
ミダゾールが5〜50モル、好ましくは10〜20モル
使用されることを特徴とする請求項12から17のいず
れかに記載の製造方法。 - 【請求項19】 得られた結合体を、以下の2つの連続
する工程:即ち、 −反応していない過剰のPEGを除去する陰イオン交換
クロマトグラフィー及び −残留する遊離ヒルジンから結合体を分離する逆相クロ
マトグラフィー により精製することを特徴とする請求項12から18の
いずれかに記載の製造方法。 - 【請求項20】 PEGが、分子量が2,000〜10
0,000、好ましくは2,000〜50,000であ
って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
ールのC1〜C6の脂肪族モノエステルから選ばれること
を特徴とする請求項12から19のいずれかに記載の製
造方法。 - 【請求項21】 ポリエチレングリコール又はその誘導
体(PEG)が、ヒルジンに対し、そのペプチドの末端
アミン官能基とは異なる、ペプチドの少なくとも1つの
アミン官能基に結合しているポリエチレングリコール
(又は誘導体)−ヒルジン(PEG−ヒルジン)結合
体。 - 【請求項22】 結合体の60重量%以上が、抗トロン
ビン活性を有することを特徴とする請求項21に記載の
結合体。 - 【請求項23】 PEGが、分子量が2,000〜10
0,000、好ましくは2,000〜50,000であ
って、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコ
ールのC1〜C6の脂肪族モノエステルから選ばれること
を特徴とする請求項21又は22に記載の結合体。 - 【請求項24】 請求項12から20のいずれかに記載
の製造方法によって得られる請求項21から23のいず
れかに記載の結合体。 - 【請求項25】 血栓症の治療のための、医薬物質とし
ての請求項21から23のいずれかに記載の結合体。
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