JPH0676439B2 - 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法 - Google Patents
化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法Info
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- JPH0676439B2 JPH0676439B2 JP60027283A JP2728385A JPH0676439B2 JP H0676439 B2 JPH0676439 B2 JP H0676439B2 JP 60027283 A JP60027283 A JP 60027283A JP 2728385 A JP2728385 A JP 2728385A JP H0676439 B2 JPH0676439 B2 JP H0676439B2
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- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法
に関する。
に関する。
従来の技術 近年、遺伝子組み換え技術やペプチドの有機合成法の発
展にともない、ペプチドホルモンを大量に合成すること
が可能になってきた。しかしながら、生体に投与された
ペプチドホルモンの生体内におけるクリアランスは、一
般に非常に早いことが知られている。またペプチドホル
モンが異種動物から得られたもので若干構造の異なるも
のである場合には、場合により、抗体が産生され、重篤
な症状を引き起こす危険が予想される。従って、これら
を医薬として用いるに際しては、その活性を保持したま
ま、クリアランスを遅延させ、さらにその抗原性を減弱
させる技術の開発が望まれている。この目的を達成する
ために、ペプチドホルモンを化学的に修飾する方法はき
わめて有効な手段である。すなわち化学修飾によって、
上記の生体内におけるクリアランスの遅延，抗原性の減
弱，さらには生理活性の増強が期待され、ペプチドホル
モンの化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
展にともない、ペプチドホルモンを大量に合成すること
が可能になってきた。しかしながら、生体に投与された
ペプチドホルモンの生体内におけるクリアランスは、一
般に非常に早いことが知られている。またペプチドホル
モンが異種動物から得られたもので若干構造の異なるも
のである場合には、場合により、抗体が産生され、重篤
な症状を引き起こす危険が予想される。従って、これら
を医薬として用いるに際しては、その活性を保持したま
ま、クリアランスを遅延させ、さらにその抗原性を減弱
させる技術の開発が望まれている。この目的を達成する
ために、ペプチドホルモンを化学的に修飾する方法はき
わめて有効な手段である。すなわち化学修飾によって、
上記の生体内におけるクリアランスの遅延，抗原性の減
弱，さらには生理活性の増強が期待され、ペプチドホル
モンの化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
発明が解決しようとする問題点 一般に生理活性ペプチドの化学修飾を行うにあたって
は、それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行な
い得る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチ
ルエーテルは、このもの自体が抗原性を有しないと考え
られているため、蛋白質やペプチドの化学修飾に用いら
れているが、該物質の蛋白質，ペプチドへの導入は塩化
シアヌルを用いる方法が一般的である。しかしながら、
同時に結合基として導入される塩化シアヌルはそれ自体
安全性に問題があり、かつまたその生体内における分解
物の安全性についても解明されておらず、その使用は慎
重を期す必要がある。また反応に際しても、アルカリ側
のpHを必要とし、アルカリ性で失活しやすい蛋白質やペ
プチドに関しては、本法を適用できない欠点がある。
は、それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行な
い得る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチ
ルエーテルは、このもの自体が抗原性を有しないと考え
られているため、蛋白質やペプチドの化学修飾に用いら
れているが、該物質の蛋白質，ペプチドへの導入は塩化
シアヌルを用いる方法が一般的である。しかしながら、
同時に結合基として導入される塩化シアヌルはそれ自体
安全性に問題があり、かつまたその生体内における分解
物の安全性についても解明されておらず、その使用は慎
重を期す必要がある。また反応に際しても、アルカリ側
のpHを必要とし、アルカリ性で失活しやすい蛋白質やペ
プチドに関しては、本法を適用できない欠点がある。
また米国特許第4,002,531号は酵素のモノアルキルポリ
エチレングリコール誘導体の製造法を開示しているが、
そこに開示されたpH8.5で水素化ホウ素ナトリウムを用
いる方法をペプチドホルモンに適用すると、その生理活
性を失活させるおそれがあり有効な製造法とはなり得
ず、さらに該特許文献は酵素誘導体の生体内におけるク
リアランスの遅延効果に関し示唆すらなく、その効果に
ついては不明である。
エチレングリコール誘導体の製造法を開示しているが、
そこに開示されたpH8.5で水素化ホウ素ナトリウムを用
いる方法をペプチドホルモンに適用すると、その生理活
性を失活させるおそれがあり有効な製造法とはなり得
ず、さらに該特許文献は酵素誘導体の生体内におけるク
リアランスの遅延効果に関し示唆すらなく、その効果に
ついては不明である。
さらに、生理活性蛋白質にホルムアルデヒド，アセトア
ルデヒド，ベンツアルデヒド，ピリドキサールなどの低
分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に導入する
方法〔メソッド イン エンザイモロジー，第47巻,469
−478頁（1977）〕；特開昭58−154596号公報〕が知ら
れている。しかしながら当該方法をペプチドホルモンに
適用しても有効なクリアランスの遅延化は達成されず、
抗原性の低下は期待されないのみならず、導入された低
分子のアルデヒドがハプテンとして作用して該ペプチド
ホルモンに免疫原性を与える可能性がある。
ルデヒド，ベンツアルデヒド，ピリドキサールなどの低
分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に導入する
方法〔メソッド イン エンザイモロジー，第47巻,469
−478頁（1977）〕；特開昭58−154596号公報〕が知ら
れている。しかしながら当該方法をペプチドホルモンに
適用しても有効なクリアランスの遅延化は達成されず、
抗原性の低下は期待されないのみならず、導入された低
分子のアルデヒドがハプテンとして作用して該ペプチド
ホルモンに免疫原性を与える可能性がある。
本発明者らは、これらの欠点を解決すべく、鋭意研究を
行ない、本発明を完成した。
行ない、本発明を完成した。
問題を解決するための手段 本発明は、(1)分子中の少なくとも１個の一級アミノ基
に、ＲＯ−CH2−CH2 ｎ基（I:Rは末端酸素の保護基,
nは任意に変わりうる正の整数）を直接結合してなる化
学修飾ペプチドホルモン、および(2)ペプチドホルモン
とＲOCH2CH2n-1Ｏ−CH2CHO（Ｒは末端酸素の保護
基、ｎは任意に変わりうる正の整数）で示されるアルデ
ヒドとを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下反応
させることを特徴とする、分子中の少なくとも１個の一
級アミノ基に、ＲOCH2CH2 ｎ基（Ｒおよびｎは前記
と同意義）を直接結合してなる化学修飾ペプチドホルモ
ンの製造法を提供するものである。
に、ＲＯ−CH2−CH2 ｎ基（I:Rは末端酸素の保護基,
nは任意に変わりうる正の整数）を直接結合してなる化
学修飾ペプチドホルモン、および(2)ペプチドホルモン
とＲOCH2CH2n-1Ｏ−CH2CHO（Ｒは末端酸素の保護
基、ｎは任意に変わりうる正の整数）で示されるアルデ
ヒドとを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下反応
させることを特徴とする、分子中の少なくとも１個の一
級アミノ基に、ＲOCH2CH2 ｎ基（Ｒおよびｎは前記
と同意義）を直接結合してなる化学修飾ペプチドホルモ
ンの製造法を提供するものである。
本願明細書において、ペプチドホルモンは２個以上のア
ミノ酸がペプチド結合によって結合したもので、アミノ
酸数が100以下で代謝調節（記憶，睡眠，血糖値，血
圧，免疫），抗菌，抗ウイルス，抗腫瘍，抗昆虫，毒，
味，酵素活性阻害，微生物の接合促進などの活性を有す
る物質を総称する。
ミノ酸がペプチド結合によって結合したもので、アミノ
酸数が100以下で代謝調節（記憶，睡眠，血糖値，血
圧，免疫），抗菌，抗ウイルス，抗腫瘍，抗昆虫，毒，
味，酵素活性阻害，微生物の接合促進などの活性を有す
る物質を総称する。
すなわち、ペプチドホルモンは遺伝子工学産物，ヒトを
含む各種動物由来のもの，合成品等いずれでもよく、さ
らにこれらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する
物質をも包含する。
含む各種動物由来のもの，合成品等いずれでもよく、さ
らにこれらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する
物質をも包含する。
なかでもアミノ酸数が２〜50個、とりわけ10〜30個のペ
プチドホルモンが好ましい。
プチドホルモンが好ましい。
具体的には例えば、インスリン,ACTH,ガストリン，カル
シトニン，エンドルフイン，グルカーゴン，ソマトスタ
チン，ウロガストロン，成長ホルモン放出因子（GR
F），コルチコトロピン放出因子（CRF）やこれらの誘導
体などが挙げられる。
シトニン，エンドルフイン，グルカーゴン，ソマトスタ
チン，ウロガストロン，成長ホルモン放出因子（GR
F），コルチコトロピン放出因子（CRF）やこれらの誘導
体などが挙げられる。
本発明におけるペプチドホルモンはその分子量が500〜1
0,000、とりわけ3,000〜8,000であることが好ましい。
0,000、とりわけ3,000〜8,000であることが好ましい。
ペプチドホルモンの一級アミノ基として、Ｎ末端のα−
アミノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられ
る。
アミノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられ
る。
上記（Ｉ）で表わされる基に関し、Ｒで示される末端酸
素の保護基としては、アルキル，アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、C1-18のもの、と
りわけメチル，エチル，プロピル,i−プロピル，ブチ
ル,i−ブチル,sec−ブチル,t−ブチルなど低級（C1-4）
アルキルが好ましい。アルカノイルとして具体的には、
C1-8のもの、とりわけホルミル，アセチル，プロピオニ
ル，ブチリル,i−ブチリル，カプロイルなど低級
（C1-8）アルカノイルが好ましい。ｎで表わされる正の
整数は、500以下、とりわけ７〜120が好ましい。
素の保護基としては、アルキル，アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、C1-18のもの、と
りわけメチル，エチル，プロピル,i−プロピル，ブチ
ル,i−ブチル,sec−ブチル,t−ブチルなど低級（C1-4）
アルキルが好ましい。アルカノイルとして具体的には、
C1-8のもの、とりわけホルミル，アセチル，プロピオニ
ル，ブチリル,i−ブチリル，カプロイルなど低級
（C1-8）アルカノイルが好ましい。ｎで表わされる正の
整数は、500以下、とりわけ７〜120が好ましい。
式（Ｉ）で表わされる基の分子量として2.5万以下、と
りわけ350〜6000のものが好ましい。生理活性の維持お
よびクリアランス遅延化効果の面からペプチドホルモン
の分子量の３〜150％、好ましくは５〜100％、とりわけ
10〜85％の分子量を有する式（Ｉ）で表わされる基が挙
げられる。
りわけ350〜6000のものが好ましい。生理活性の維持お
よびクリアランス遅延化効果の面からペプチドホルモン
の分子量の３〜150％、好ましくは５〜100％、とりわけ
10〜85％の分子量を有する式（Ｉ）で表わされる基が挙
げられる。
本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、ペプチドホルモ
ンの一級アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式
（Ｉ）で表わされる基を有するものである。
ンの一級アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式
（Ｉ）で表わされる基を有するものである。
一級アミノ基としてＮ末端α−アミノ基のみを有する場
合は、そのアミノ基に直接結合した式（Ｉ）で表わされ
る基を有するものである。またペプチドホルモン分子中
に１個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基
の一部に、好ましくはそれらε−アミノ基の15〜80％
（平均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有
するものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直
接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有しても、有しな
くてもよい。
合は、そのアミノ基に直接結合した式（Ｉ）で表わされ
る基を有するものである。またペプチドホルモン分子中
に１個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基
の一部に、好ましくはそれらε−アミノ基の15〜80％
（平均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有
するものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直
接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有しても、有しな
くてもよい。
本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、例えばペプチド
ホルモンとＲＯCH2CH2n-1Ｏ−CH2CHO（II:Rおよび
ｎは前記と同意義）で示されるアルデヒドとを還元剤の
存在下反応させることにより製造することができる。
ホルモンとＲＯCH2CH2n-1Ｏ−CH2CHO（II:Rおよび
ｎは前記と同意義）で示されるアルデヒドとを還元剤の
存在下反応させることにより製造することができる。
本反応に用いるホウ素系還元剤としては、水素化ホウ素
ナトリウム，シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げ
られるが、中でもシアノ水素化ホウ素ナトリウムが反応
の選択性や中性付近で反応が行なえる点でより好まし
い。
ナトリウム，シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げ
られるが、中でもシアノ水素化ホウ素ナトリウムが反応
の選択性や中性付近で反応が行なえる点でより好まし
い。
反応に際しては、アルデヒド（II）をペプチドホルモン
に対して、１〜10,000倍モル程度、ホウ素系還元剤はア
ルデヒド（II）に対して１〜100倍モル程度用いればよ
く、ペプチドホルモンとアルデヒド（II）のモル比を増
減することによって修飾の程度を任意に選択することが
できる。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないもので
あればいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液，ホウ酸
緩衝液などの緩衝液が挙げられる。また、ペプチドホル
モンを失活させず、反応の支障にならない低級アルカノ
ール（例、メタノール，エタノール,i−プロパノー
ル），アセトニトリルなどの有機溶媒を添加してもよ
い。反応のpHは３〜14の広い範囲で可能であるが、中性
付近（pH6.5〜7.5）が望ましい。反応温度は０゜〜80℃
でペプチドホルモンが失活しない温度であれば、いずれ
でもよいが、０゜〜50℃の範囲がより好ましい。反応時
間は0.5〜72時間、通常は３〜30時間程度で十分であ
る。反応液は、透析，塩析，イオン交換クロマトグラフ
イー，ゲルろ過，高速液体クロマトグラフイー，電気泳
動等通常の蛋白質の精製法で精製し、所望の化学修飾ペ
プチドホルモンを得ることができる。またアミノ基の修
飾の程度は、例えば酸分解のあと、アミノ酸分析を行な
って算出することができる。
に対して、１〜10,000倍モル程度、ホウ素系還元剤はア
ルデヒド（II）に対して１〜100倍モル程度用いればよ
く、ペプチドホルモンとアルデヒド（II）のモル比を増
減することによって修飾の程度を任意に選択することが
できる。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないもので
あればいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液，ホウ酸
緩衝液などの緩衝液が挙げられる。また、ペプチドホル
モンを失活させず、反応の支障にならない低級アルカノ
ール（例、メタノール，エタノール,i−プロパノー
ル），アセトニトリルなどの有機溶媒を添加してもよ
い。反応のpHは３〜14の広い範囲で可能であるが、中性
付近（pH6.5〜7.5）が望ましい。反応温度は０゜〜80℃
でペプチドホルモンが失活しない温度であれば、いずれ
でもよいが、０゜〜50℃の範囲がより好ましい。反応時
間は0.5〜72時間、通常は３〜30時間程度で十分であ
る。反応液は、透析，塩析，イオン交換クロマトグラフ
イー，ゲルろ過，高速液体クロマトグラフイー，電気泳
動等通常の蛋白質の精製法で精製し、所望の化学修飾ペ
プチドホルモンを得ることができる。またアミノ基の修
飾の程度は、例えば酸分解のあと、アミノ酸分析を行な
って算出することができる。
前記したアルデヒド（II）は、例えば ＲＯCH2CH2 ｎOH（III:Rおよびｎは前記と同意義）
で示されるエチレングリコール誘導体から製造できる
が、下記の方法は、対応するカルボン酸の副成が少なく
有利な製造法である。
で示されるエチレングリコール誘導体から製造できる
が、下記の方法は、対応するカルボン酸の副成が少なく
有利な製造法である。
すなわち、化合物（III）を塩化メチレン，クロロホル
ムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピリ
ジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリジ
ニウムを化合物（III）に対し１〜３モル量用い、−10
゜〜50℃、好ましくは室温で、１〜30時間反応させる。
ムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピリ
ジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリジ
ニウムを化合物（III）に対し１〜３モル量用い、−10
゜〜50℃、好ましくは室温で、１〜30時間反応させる。
また化合物（III,但しｎ−１）をｔ−ブタノール中でカ
リウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタール
を反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など）ま
たは無機酸（塩酸，硫酸など）などの酸で処理すことに
より化合物（III）より−OCH2CH2−鎖長の長い対応する
アルデヒド（II）を製造することができる。この場合、
まずカリウムｔ−ブトキシドを上記化合物（III）に対
し10〜30モル量を加えて溶解させ、これにブロモアセタ
ールを化合物（III）に対し３〜15モル量加えて、10゜
〜80℃で0.5〜５時間反応させ、常法により後処理後、
上記酸の希薄水溶液に溶かし、５分〜２時間加熱する。
リウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタール
を反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など）ま
たは無機酸（塩酸，硫酸など）などの酸で処理すことに
より化合物（III）より−OCH2CH2−鎖長の長い対応する
アルデヒド（II）を製造することができる。この場合、
まずカリウムｔ−ブトキシドを上記化合物（III）に対
し10〜30モル量を加えて溶解させ、これにブロモアセタ
ールを化合物（III）に対し３〜15モル量加えて、10゜
〜80℃で0.5〜５時間反応させ、常法により後処理後、
上記酸の希薄水溶液に溶かし、５分〜２時間加熱する。
上記いずれの反応液も、抽出，濃縮，再結晶，再沈澱，
クロマトグラフイー，蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
クロマトグラフイー，蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、対応する公知の
非修飾ペプチドホルモンと同様の有用な生理活性を有
し、医薬品などとして有用である。
非修飾ペプチドホルモンと同様の有用な生理活性を有
し、医薬品などとして有用である。
本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、対応する公知の
非修飾ペプチドホルモンに比し、生体内におけるクリア
ランスが遅延され、長時間有効にその活性を示すのみな
らず、毒性，抗原性も低く、公知のペプチドホルモンと
同様の目的に、同様の用法で安全に使用することができ
る。
非修飾ペプチドホルモンに比し、生体内におけるクリア
ランスが遅延され、長時間有効にその活性を示すのみな
らず、毒性，抗原性も低く、公知のペプチドホルモンと
同様の目的に、同様の用法で安全に使用することができ
る。
本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、通常自体公知の
担体，希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的ま
たは非経口的に哺乳動物（サル，イヌ，ブタ，ウサギ，
マウス，ヒト）に投与することができる。
担体，希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的ま
たは非経口的に哺乳動物（サル，イヌ，ブタ，ウサギ，
マウス，ヒト）に投与することができる。
例えば、本発明の化学修飾インスリンを血糖降下薬とし
て使用する場合、成人１日１回10〜100単位を筋注によ
り投与するのがよい。
て使用する場合、成人１日１回10〜100単位を筋注によ
り投与するのがよい。
本明細書中、アミノ酸に関し略号で表示する場合は、IU
PAC−IUB（Commission of Biological Nomenclature）
による略号に基づくものである。
PAC−IUB（Commission of Biological Nomenclature）
による略号に基づくものである。
作用および実施例 以下の実施例および参考例によって本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。
に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。
実施例1. B1−ポリエチレングリコールメチルエーテル
修飾インスリンの製造 （ｉ） ブタインスリン150mgを20mlの水に懸濁し、こ
れに一規定塩酸を一滴づつ加え、インスリンを溶解させ
た。そののち0.4Mリン酸緩衝液（pH7.0）20mlを加え、
最終的に0.2Mリン酸緩衝液とした。これに参考例１(i)
で得たポリエチレングリコールメチルエーテルアルデヒ
ド（平均分子量5000）1.125gを加え、ついでシアノ水素
化ホウ素ナトリウム100mgを加えて、37℃で24時間かき
まぜた。反応液を水に対して12時間透析し、ついで内容
物をカルボキシメチルセルロースのカラム（3.0×23.0c
m）に注いだ。カラムを水で洗ったのち、水（500ml）と
0.2M酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.8）の間で、対数勾
配をかけて溶出した。主溶出画分（320〜400ml）を集め
凍結乾燥した。ついでバイオゲルｐ−30のゲル過に付
し、0.1規定酢酸で展開した。主溶出画分（110〜150m
l）を集めて凍結乾燥した。収量132mg，酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値:Lys, 0.92(1);H
is, 2.12(2),Arg, 1.08(1);Asp, 3.20(3);Thr, 2.11
(2);Ser, 2.86(3);Glu, 7.88(7);Pro, 1.11(1);Gly, 3.
78(4);Ala, 2.16(2);Half Cys, 6.08(6);Val, 3.67(4);
Ile, 1.78(2);Leu, 6.17(6);Tyr, 4.04(4);Phe, 2.09
(2)ブタインスリンのPheは本来３個であるが、Ｂ鎖Ｎ末
端のPhaが、ポリエチレングリコールメチルエーテルで
修飾され１個少なくなっている。またグリコース低下作
用はブタインスリンの約50％であった。
修飾インスリンの製造 （ｉ） ブタインスリン150mgを20mlの水に懸濁し、こ
れに一規定塩酸を一滴づつ加え、インスリンを溶解させ
た。そののち0.4Mリン酸緩衝液（pH7.0）20mlを加え、
最終的に0.2Mリン酸緩衝液とした。これに参考例１(i)
で得たポリエチレングリコールメチルエーテルアルデヒ
ド（平均分子量5000）1.125gを加え、ついでシアノ水素
化ホウ素ナトリウム100mgを加えて、37℃で24時間かき
まぜた。反応液を水に対して12時間透析し、ついで内容
物をカルボキシメチルセルロースのカラム（3.0×23.0c
m）に注いだ。カラムを水で洗ったのち、水（500ml）と
0.2M酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.8）の間で、対数勾
配をかけて溶出した。主溶出画分（320〜400ml）を集め
凍結乾燥した。ついでバイオゲルｐ−30のゲル過に付
し、0.1規定酢酸で展開した。主溶出画分（110〜150m
l）を集めて凍結乾燥した。収量132mg，酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値:Lys, 0.92(1);H
is, 2.12(2),Arg, 1.08(1);Asp, 3.20(3);Thr, 2.11
(2);Ser, 2.86(3);Glu, 7.88(7);Pro, 1.11(1);Gly, 3.
78(4);Ala, 2.16(2);Half Cys, 6.08(6);Val, 3.67(4);
Ile, 1.78(2);Leu, 6.17(6);Tyr, 4.04(4);Phe, 2.09
(2)ブタインスリンのPheは本来３個であるが、Ｂ鎖Ｎ末
端のPhaが、ポリエチレングリコールメチルエーテルで
修飾され１個少なくなっている。またグリコース低下作
用はブタインスリンの約50％であった。
（ii） 参考例１で得た平均分子量1900および750のポ
リエチレングリコールメチルエーテルアルデヒドを用い
てブタインスリンを同様に処理し、上記(i)と同じくＢ
鎖のＮ末端Phaのα−アミノ基が平均分子量1900および7
50のポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾され
たインスリン誘導体が得られた。平均分子量1900のポリ
エチレングリコールメチルエーテル修飾インスリンの酸
分解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値:Ly
s, 0.98(1);His, 2.09(2),Arg, 1.09(1);Asp, 3.17(3);
Thr, 2.04(2);Ser, 2.89(3);Gln, 7.60(7);Pro, 1.09
(1);Gly, 3.76(4);Ala, 2.03(2);Half Cys, 3.93(6);Va
l, 3.27(4);Ile, 1.54(2);Leu, 5.87(6);Tyr, 3.88(4);
Phe, 2.00(2) 平均分子量750のポリエチレングリコールメチルエーテ
ル修飾インスリンの酸分解物（6N塩酸中,110℃,24時
間）中のアミノ酸分析値:Lys, 1.03(1);His, 2.18(2),A
rg, 1.12(1);Asp, 3.30(3);Thr, 2.15(2);Ser, 3.13
(3);Glu, 7.83(7);Pro, 1.17(1);Gly, 4.04(4);Ala, 2.
24(2);Half Cys, 5.48(6);Val, 3.26(4);Ile, 1.58(2);
Leu, 6.30(6);Tyr, 4.03(4);Phe, 2.23(2) （iii） グルコース低下作用は文献記載〔Z.アナルテ
イシエヘミー，第252巻,224頁（1970）〕の方法で測定
すると平均分子量1900のポリエチレングリコールメチル
エーテル修飾インスリンがブタインスリンの85％，平均
分子量750のポリエチレングリコールメチルエーテル修
飾インスリンが100％であった。
リエチレングリコールメチルエーテルアルデヒドを用い
てブタインスリンを同様に処理し、上記(i)と同じくＢ
鎖のＮ末端Phaのα−アミノ基が平均分子量1900および7
50のポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾され
たインスリン誘導体が得られた。平均分子量1900のポリ
エチレングリコールメチルエーテル修飾インスリンの酸
分解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値:Ly
s, 0.98(1);His, 2.09(2),Arg, 1.09(1);Asp, 3.17(3);
Thr, 2.04(2);Ser, 2.89(3);Gln, 7.60(7);Pro, 1.09
(1);Gly, 3.76(4);Ala, 2.03(2);Half Cys, 3.93(6);Va
l, 3.27(4);Ile, 1.54(2);Leu, 5.87(6);Tyr, 3.88(4);
Phe, 2.00(2) 平均分子量750のポリエチレングリコールメチルエーテ
ル修飾インスリンの酸分解物（6N塩酸中,110℃,24時
間）中のアミノ酸分析値:Lys, 1.03(1);His, 2.18(2),A
rg, 1.12(1);Asp, 3.30(3);Thr, 2.15(2);Ser, 3.13
(3);Glu, 7.83(7);Pro, 1.17(1);Gly, 4.04(4);Ala, 2.
24(2);Half Cys, 5.48(6);Val, 3.26(4);Ile, 1.58(2);
Leu, 6.30(6);Tyr, 4.03(4);Phe, 2.23(2) （iii） グルコース低下作用は文献記載〔Z.アナルテ
イシエヘミー，第252巻,224頁（1970）〕の方法で測定
すると平均分子量1900のポリエチレングリコールメチル
エーテル修飾インスリンがブタインスリンの85％，平均
分子量750のポリエチレングリコールメチルエーテル修
飾インスリンが100％であった。
（iv） 血中クリアランスの測定 ストレプトゾトシン（50mg／kg）をSDラット（雄,7週
令）に静脈内注射し、その３日後20時間絶食したラット
の腹腔内にブタインスリン，平均分子量5000および1900
のポリエチレングリコールメチルエーテル修飾インスリ
ン（インスリンとして0.3単位／kg）をそれぞれ投与し
て、尾静脈から採血し、血糖の経時変化を測定した。結
果を第１図に示す。
令）に静脈内注射し、その３日後20時間絶食したラット
の腹腔内にブタインスリン，平均分子量5000および1900
のポリエチレングリコールメチルエーテル修飾インスリ
ン（インスリンとして0.3単位／kg）をそれぞれ投与し
て、尾静脈から採血し、血糖の経時変化を測定した。結
果を第１図に示す。
実施例2. B1−アルカノイルポリエチレングリコール修
飾インスリンの製造 参考例２で得た平均分子量1500のアセチルポリエチレン
グリコールアルデヒドを用いてブタインスリンを実施例
１と同様に反応し、Ｂ鎖のＮ末端Pheのα−アミノ基が
平均分子量1500のアセチルポリエチレングリコールで修
飾されたインスリン誘導体が得られる。
飾インスリンの製造 参考例２で得た平均分子量1500のアセチルポリエチレン
グリコールアルデヒドを用いてブタインスリンを実施例
１と同様に反応し、Ｂ鎖のＮ末端Pheのα−アミノ基が
平均分子量1500のアセチルポリエチレングリコールで修
飾されたインスリン誘導体が得られる。
参考例１ ポリエチレングリコールメチルエーテルアル
デヒドの合成 (i) ポリエチレングリコールメチルエーテル（5g,平均
分子量5,000）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、クロ
ルクロム酸ピリジニウム（330mg）を加え、室温で12時
間かきまぜた。反応液を２倍量の塩化メチレンでうすめ
て、フロリジルのカラム（６×10cm）に注ぎ込み、カラ
ムを塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったのち、
メタノール−クロロホルム（1:9）で溶出した。2,4−ジ
ニトロフエニルヒドラジンテストで陽性の画分を集め
て、溶媒を減圧留去し、結晶性のワックスを得た。収量
1.5g（30％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.08（ク
ロロホルム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲ
ル），13C−NMRで96.2PPMに水和した型 でアルデヒド基の吸収を認めた。
デヒドの合成 (i) ポリエチレングリコールメチルエーテル（5g,平均
分子量5,000）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、クロ
ルクロム酸ピリジニウム（330mg）を加え、室温で12時
間かきまぜた。反応液を２倍量の塩化メチレンでうすめ
て、フロリジルのカラム（６×10cm）に注ぎ込み、カラ
ムを塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったのち、
メタノール−クロロホルム（1:9）で溶出した。2,4−ジ
ニトロフエニルヒドラジンテストで陽性の画分を集め
て、溶媒を減圧留去し、結晶性のワックスを得た。収量
1.5g（30％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.08（ク
ロロホルム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲ
ル），13C−NMRで96.2PPMに水和した型 でアルデヒド基の吸収を認めた。
(ii) ポリエチレングリコールメチルエーテル（10g,平
均分子量5,000）を三級ブタノール（100ml）に溶かし、
カリウム三級ブトキシド（4.17g）を加え、ついでブロ
ムアセタール（2.56ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧下留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。水
で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルム
を減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる
結晶性残渣をろ取し、エーテルで洗浄して対応するポリ
エチレングリコールメチルエーテルジエチルアセタール
9.5g（95％）が得られた。この内5gを取り、0.05Mトリ
フルオロ酢酸50mlに溶かし、沸とう水中で30分間処理し
たあと凍結乾燥し、(i)で得たものよりも−Ｏ−CH2CH2
だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテル
アルデヒドが得られた。
均分子量5,000）を三級ブタノール（100ml）に溶かし、
カリウム三級ブトキシド（4.17g）を加え、ついでブロ
ムアセタール（2.56ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧下留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。水
で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルム
を減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる
結晶性残渣をろ取し、エーテルで洗浄して対応するポリ
エチレングリコールメチルエーテルジエチルアセタール
9.5g（95％）が得られた。この内5gを取り、0.05Mトリ
フルオロ酢酸50mlに溶かし、沸とう水中で30分間処理し
たあと凍結乾燥し、(i)で得たものよりも−Ｏ−CH2CH2
だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテル
アルデヒドが得られた。
(iii) ポリエチレングリコールメチルエーテル（5.7g,
平均分子量1,900）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、
クロルクロム酸ピリジニウム（970mg）を加え、室温で1
2時間かきまぜた。反応液を塩化メチレンで希釈し、フ
ロリジルのカラム（6.0×10.0cm）に注ぎ込み、カラム
を塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったあと、10
％メタノール／クロロホルムで溶出した。2,4−ジニト
ロフエニルヒドラジンテストで陽性の画分を集めて、溶
媒を留去すると結晶性のワックスを得た。収量1.8g（30
％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.10（クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲル）13C−NMR
で96.2PPMに水和した形 でアルデヒド基の吸収を認めた。
平均分子量1,900）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、
クロルクロム酸ピリジニウム（970mg）を加え、室温で1
2時間かきまぜた。反応液を塩化メチレンで希釈し、フ
ロリジルのカラム（6.0×10.0cm）に注ぎ込み、カラム
を塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったあと、10
％メタノール／クロロホルムで溶出した。2,4−ジニト
ロフエニルヒドラジンテストで陽性の画分を集めて、溶
媒を留去すると結晶性のワックスを得た。収量1.8g（30
％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.10（クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲル）13C−NMR
で96.2PPMに水和した形 でアルデヒド基の吸収を認めた。
(iv) ポリエチレングリコールメチルエーテル（19.5g,
平均分子量1900）を三級ブタノール（100ml）に溶か
し、カリウム三級ブトキシド（10.4g）を、ついでブロ
ムアセタール（6.4ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧で留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。反
応液を水洗，ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ク
ロロホルムを減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加
え、生ずる結晶性残留物をろ取し、エーテルで洗浄しア
セタール8.5g（89.5％）を得た。この内3gを0.05Mトリ
フルオロ酢酸に溶かし、沸とう水中で30分間処理したあ
と、凍結乾燥し、(iii)で得たものよりも−Ｏ−CH2CH2
−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒドが得られた。
平均分子量1900）を三級ブタノール（100ml）に溶か
し、カリウム三級ブトキシド（10.4g）を、ついでブロ
ムアセタール（6.4ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧で留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。反
応液を水洗，ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ク
ロロホルムを減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加
え、生ずる結晶性残留物をろ取し、エーテルで洗浄しア
セタール8.5g（89.5％）を得た。この内3gを0.05Mトリ
フルオロ酢酸に溶かし、沸とう水中で30分間処理したあ
と、凍結乾燥し、(iii)で得たものよりも−Ｏ−CH2CH2
−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒドが得られた。
(v) 平均分子量750,550,350のポリエチレングリコール
メチルエーテルを上記と同様の方法で対応するアルデヒ
ドに導いた。
メチルエーテルを上記と同様の方法で対応するアルデヒ
ドに導いた。
参考例２ アルカノイルポリエチレングリコールアルデ
ヒドの合成 (i) 平均分子量1500のポリエチレングリコール1540
（和光純薬製）15gをピリジン50mlに溶かし無水酢酸1.8
5mlを添加し、かきまぜながら40℃で２時間、さらに室
温で16時間反応させ、反応後、溶媒を減圧留去した。ク
ロロホルムに溶解し、水洗後、クロロホルム層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥、クロロホルムを減圧留去した。残
留物を少量のクロロホルムに溶解し、石油ベンジン−エ
ーテル（2:1）混液を加えて放置し、結晶性のワックス1
4g（90％）を得た。この内1.4gをとり50mlの塩化メチレ
ンに溶解、クロルクロム酸ピリジニウム300mgを加えて
室温で18時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリ
カゲルＣ−200（和光純薬製）のカラム（３×50cm）に
通し、５％メタノール−クロロホルム（200ml）で洗っ
たのち、10％メタノール−クロロホルムで溶出した。2,
4−ジニトロフエニルヒドラジンテスト陽性画分を集め
て溶媒を減圧留去して、結晶性のワックスを得た。収量
580mg（41％） (ii) 平均分子量1000のポリエチレングリコール1000
（和光純薬製）20gを塩化メチレン50mlに溶解、無水ｎ
−カプロン酸5.15gを加えて70℃で２時間反応させた。
溶媒を留去し、シリカゲルＣ−200（３×50cm）カラム
を用いて、酢酸エチル−メタノール（4:1）で溶出して
精製し、冷蔵庫中では固化する油状物14.9g（60％）を
得た。(i)と同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸化
してアルデヒド体を得た。
ヒドの合成 (i) 平均分子量1500のポリエチレングリコール1540
（和光純薬製）15gをピリジン50mlに溶かし無水酢酸1.8
5mlを添加し、かきまぜながら40℃で２時間、さらに室
温で16時間反応させ、反応後、溶媒を減圧留去した。ク
ロロホルムに溶解し、水洗後、クロロホルム層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥、クロロホルムを減圧留去した。残
留物を少量のクロロホルムに溶解し、石油ベンジン−エ
ーテル（2:1）混液を加えて放置し、結晶性のワックス1
4g（90％）を得た。この内1.4gをとり50mlの塩化メチレ
ンに溶解、クロルクロム酸ピリジニウム300mgを加えて
室温で18時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリ
カゲルＣ−200（和光純薬製）のカラム（３×50cm）に
通し、５％メタノール−クロロホルム（200ml）で洗っ
たのち、10％メタノール−クロロホルムで溶出した。2,
4−ジニトロフエニルヒドラジンテスト陽性画分を集め
て溶媒を減圧留去して、結晶性のワックスを得た。収量
580mg（41％） (ii) 平均分子量1000のポリエチレングリコール1000
（和光純薬製）20gを塩化メチレン50mlに溶解、無水ｎ
−カプロン酸5.15gを加えて70℃で２時間反応させた。
溶媒を留去し、シリカゲルＣ−200（３×50cm）カラム
を用いて、酢酸エチル−メタノール（4:1）で溶出して
精製し、冷蔵庫中では固化する油状物14.9g（60％）を
得た。(i)と同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸化
してアルデヒド体を得た。
発明の効果 本発明の化学修飾ペプチドホルモンは、ペプチドホルモ
ンとしての生理活性を維持した上で、生体内でのクリア
ランスが遅延化されまた抗原性が低下されている。
ンとしての生理活性を維持した上で、生体内でのクリア
ランスが遅延化されまた抗原性が低下されている。
第１図は実施例１(iv)に開示したラット血漿中のクリア
ランス遅延化効果を示す。およびは実施例１で得た
それぞれ平均分子量1900および5000のポリエチレングリ
コール修飾インスリンの、は対照としたブタインスリ
ンの測定結果を示す。
ランス遅延化効果を示す。およびは実施例１で得た
それぞれ平均分子量1900および5000のポリエチレングリ
コール修飾インスリンの、は対照としたブタインスリ
ンの測定結果を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】分子中の少なくとも１個の一級アミノ基
に、ＲOCH2CH2 ｎ基（Ｒは末端酸素の保護基、ｎは
任意に変わりうる正の整数）を直接結合してなる化学修
飾ペプチドホルモン。 - 【請求項２】ペプチドホルモンとＲOCH2CH2n-1Ｏ−
CH2CHO（Ｒは末端酸素の保護基、ｎは任意に変わりうる
正の整数）で示されるアルデヒドとを、シアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムの存在下反応させることを特徴とする、
分子中の少なくとも１個の一級アミノ基に、ＲOCH2CH
2 ｎ基（Ｒおよびｎは前記と同意義）を直接結合して
なる化学修飾ペプチドホルモンの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1984/000085 WO1985003934A1 (en) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | Chemically modified protein and process for its preparation |
| WO84/00085 | 1984-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61178926A JPS61178926A (ja) | 1986-08-11 |
| JPH0676439B2 true JPH0676439B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=13818260
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60027283A Expired - Lifetime JPH0676439B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-13 | 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法 |
| JP60037936A Expired - Lifetime JPH0696599B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | 化学修飾リンホカインおよびその製造法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60037936A Expired - Lifetime JPH0696599B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | 化学修飾リンホカインおよびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | USH1662H (ja) |
| JP (2) | JPH0676439B2 (ja) |
| KR (1) | KR920007681B1 (ja) |
| AU (1) | AU2867784A (ja) |
| WO (2) | WO1985003934A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0229108B1 (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-27 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US5214131A (en) * | 1988-05-06 | 1993-05-25 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof |
| JP2958019B2 (ja) * | 1988-05-06 | 1999-10-06 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| GB8824591D0 (en) * | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
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