NO179044B - Fremgangsmåte for fremstilling av et glykosaminoglykanmodifisert protein - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et glykosaminoglykanmodifisert protein, representert ved formelen:

hvori P representerer en proteinrest eksklusive n aminogrupper fra proteinet, n er et heltall fra 1 til 100, og GAG representerer en glykosaminoglykanrest eksklusive en reduserende terminal sukkerdel fra glykosaminoglykanet, som er kjenneteg-net ved at den omfatter å aktivere et glykosaminoglykan ved delvis å oksydere den reduserende terminale sukkerdel av nevnte glykosaminoglykan for derved å spalte den terminale sukkerdelen etterfulgt av dannelse av et lakton derfra ved å behandle det reduserende terminale sukkerspaltede glykosaminoglykanet med syre og å reagere det aktiverte glykosaminoglykan med et protein.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Det er i den senere tid gjort hyppige forsøk på å anvende enzymer og fysiologisk aktive proteiner som medikamenter for behandling av forskjellige sykdommer inkluderende cancer, inflammasjon og arvelig enzymmangel.

Mange av disse enzymer og fysiologisk aktive proteiner er imidlertid heterogene for levende organismer. Tilførsel av disse forbindelser som sådanne til en organisme ville således bevirke et problem med immunogenisitet eller ødelegge stabiliteten in vivo. Når en slik forbindelse sammensettes til en medisin er det derfor nødvendig å avhjelpe en anafylaktisk reaksjon og å forbedre den forlengede medikamenteffekt.

Det er videre gjort forsøk på å fremstille disse proteiner i en stor mengde ved hjelp av genteknologi. Proteiner fremstilt ved hjelp av genteknologi lider imidlertid av et problem med manglende sukkerkjede som alvorlig påvirker stabiliteten in vivo.

Det er følgelig foreslått å modifisere et enzym eller et fysiologisk aktivt protein med forskjellige syntetiske polymerer eller polysakkarider slik at deres stabilitet forbedres farmakologisk. Eksempler på de syntetiske polymerer anvendt for dette inkluderer poly-L-asparaginsyre (M. Okada, A. Matsushima, A. Katsuhata, T. Aoyama, T. Ando og Y. Inada: Int. Archs Allergy Appl. Immun. 76, 79-81, (1985) og derivater derav, poly-D- eller -L-lysin, D-glutaminsyre/D-lysinkopolymer (F.T. Liu og D.H. Katz: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 1430-1434, 1979), polyvinylalkoholpyrankopolymer, polyetylenglykol og derivater derav, og styren/maleinsyrekopolymer (H. Maeda, M. Ueda, T. Morinaga og T. Matsumoto: J. Med. Chem., 28, 455-461, 1965). Eksempler på polysakkaridene inkluderer agarose, karboksymetylceliulose, dekstran (T.P. King, L. Kochoumian,

K. Ishizaka, L. Kichtenstein, P.S. Norman: Arch. Biochem.

Biophys., 169, 464-473, 1975), pullulan (M. Usui og

T. Matsuhashi: J. Immunol., 122, 12 66-1272, 1979) og

N. Matsuhashi: Genkansa no Jikken Dobutsu Moderu (Experimental Animal Model for Hyposensitization), utgitt av S. Kobayashi et al., Genkansa Ryoho no Kiso to Rinsho (Bases and Clinical Application of Hyposensitization Therapy), 4-11, Chugai Igakusho, 1982) og lipopolysakkarid.

På den annen side foreslår US-PS 4.585.754 et stabilisert protein oppnådd ved å omsette et protein som f.eks. peroksyddismutase eller insulin med chondroitinsulfat i nærvær av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid. Det således oppnådde protein er imidlertid i form av en komplisert polymer innbefattende en polymer av proteinet i seg selv, ettersom flere karboksylgrupper i asparaginsyre henholdsvis glutaminsyre inneholdt i proteinet aktiveres av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid. Dette produkt bør således ytterligere forbedres fra et synspunkt med den farmakologiske virkning av den umodifiserte peroksyddismutase eller insulin som en monomer.

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et glykosaminoglykanmodifisert protein som er meget stabilt in vivo og kan uttrykke den iboende fysiologiske effekt av utgangsproteinet for en forlenget tidsperiode uten å danne noen som helst polymer med en komplisert struktur.

Et glykosaminoglykanmodifisert protein kan oppnås ved å omsette glykosaminoglykan som er aktivert ved hjelp av en reduserende terminal restbegrensende oksydasjonsmetode, en karboksylgruppeaktiverende metode, reduserende terminal restlaktoniserende metode eller bromcyanaktiveringsmetode med et protein.

Et glykosaminoglykanmodifisert protein hvori en aminogruppe i et protein er bundet til en aldehydgruppe kan oppnås ved å redusere og delvis oksydere den reduserende terminale sukkerdel av et glykosaminoglykan.

Det kan tilveiebringes et glykosaminoglykanmodifisert protein med den følgende formel:

hvori P står for en proteinrest eksklusive n aminogrupper fra proteinet og GAG står for en glykosaminoglykanrest eksklusive den reduserende terminale sukkerrest fra glykosaminoglykanet.

Det kan videre tilveiebringes et glykosaminoglykanmodifisert

protein hvori minst noen av karboksylgruppene i uronsyredelen av et glykosaminoglykan er bundet til et protein via en amidbinding.

Kort beskrivelse av tegningene.

Fig. 1-6 viser hver et elektroforetisk mønster av det glykosaminoglykanmodifiserte protein oppnådd i eksemplene, og en blanding av et glykosaminoglykan og et protein.

I fig. 1 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av en blanding av bovinavledet katalase og hyaluronsyre (HA) hvis reduserende terminale rest var begrenset oksydert (O-HA), og bane 2 står for mønsteret av en HA-modifisert bovinavledet katalase.

I fig. 2 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av en blanding av Aspergillus niger-avledet katalase og O-HA, og bane 2 står for mønsteret av en HA-modif isert Aspergillus niger-avledet katalase.

I fig. 3 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av en blanding av urikase og O-HA, og bane 2 står for mønsteret av HA-modifisert urikase.

I fig. 4 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av en blanding av asparaginase og O-HA, og bane 2 står for mønsteret av HA-modifisert asparaginase.

I fig. 5 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av en blanding av peroksyddismutase (SOD) og chondroitinsulfat avledet fra bovin trachea-brusk hvis reduserende terminale rest var begrenset oksydert (O-CS(T)), og bane 2 står for mønsteret av CS(T)-modifisert SOD (porsjon nr. 121-2).

I fig. 6 står bane 1 for det elektroforetiske mønster av SOD avledet fra bovine røde blodlegemer, bane 2 står for mønsteret av SOD avledet fra røde blodlegemer fra hunder, bane 3 står for mønsteret av HA-modifisert SOD avledet fra røde blodlegemer fra hunder og bane 4 står for HA-modifisert SOD avledet fra bovine røde blodlegemer. Fig. 7 viser et elektroforetisk mønster av chondroitinsulfat beskrevet i referanseeksempel 4. I fig. 7 står bane S for CS(T), baner 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 står hver for CS(T) behandlet med hensholdsvis 0,043 6 mg, 0,145 mg, 0,43 6 mg, 1,45 mg, 4,36 mg, 14,5 mg og 43,6 mg av vannoppløselig karbodiimid (WSC), og bane 8 står for CS(T) behandlet med 43,6 mg WSC og 0,1 N natriumhydroksyd. Fig. 8 er kromatogrammer av gelfiltrering omhandlet i referanseeksempel 4. I fig. 8 er A et kromatogram for en blanding av chondroitinsulfat som stammer fra bovin trachea-brusk og peroksyddismutase, B står for produktet av porsjon B, C for produktet fra porsjon C, D for produktet fra porsjon 121-2 fremstilt i referanseeksempel 2, og E for produktet fra porsjon 211 fremstilt i referanseeksempel 2.

Glykosaminoglykanmodifisert protein kan fremstilles f.eks. ved å omsette et glykosaminoglykan som er aktivert ved hjelp av en reduserende terminal restbegrensende oksydasjonsmetode, en reduserende terminal restlaktoniserende metode, en karboksylgruppeaktiverende metode eller bromcyanaktiveringsmetode, med et protein, og er beskrevet detaljert i det følgende.

Reduserende terminal restbegrensende oksydasjonsmetode.

Denne metode omfatter å redusere og delvis oksydere den reduserende terminale sukkerdel av et glykosaminoglykan for derved å spalte den nevnte terminale sukkerdel og danne en aldehydgruppe og å fremstille et protein modifisert med glykosaminoglykanet ved hjelp av den reduserende alkyleringsreak-sjon mellom aldehydgruppen og en aminogruppe i proteinet. Reaksjonsskjemaet for denne metode er som følger:

I det ovenstående reaksjonsskjema representerer R<1> og R<2> hver grupper som vanlig iakttas ved 2- og 5-stillingene av den reduserende terminale sukkerdel av et glykosaminoglykan og eksempler på R<1> inkluderer OH, NH2 og NHCOCH3, mens eksempler på R2 inkluderer CH2OH, COOH og CH2OS03M, hvor M står for et hydrogenatom, et alkalimetall eller jordalkalimetall eller et amin som f.eks. trialkylamin eller pyridin, og P, n og GAG er som definert i det foregående.

I denne metode blir glykosaminoglykanet med den ovenstående formel (IV) først redusert for derved å spalte den reduserende terminale sukkerdel. På denne måte oppnås forbindelsen med formel (V). Eksempler på reduksjonsmiddel som kan anvendes ved dette reduksjonstrinn inkluderer alkalimetallborhydrider som natriumborhydrid og natriumcyanoborhydrid. Den ovennevnte reduksjon kan gjennomføres i et passende flytende medium, f.eks. en bufferoppløsning som boratbufferoppløsning (pH 8,3), fosfatbufferoppløsning (pH 8,6) eller en blanding av en slik bufferoppløsning med et organisk løsningsmiddel som f.eks. dimetylformamid, acetonitril eller dioksanmetanol vanligvis ved en temperatur fra 0 til 40°C, foretrukket fra 15 til 20°C.

Mengden av det ovennevnte reduksjonsmiddel kan variere i avhengighet av den anvendte type. Det kan anvendes i mengde på fra 5 til 50 ekvivalenter, foretrukket fra 10 til 20 ekvivalenter, pr. mol av forbindelsen med formel (IV).

Deretter blir forbindelsen med formel (V) oppnådd på denne måte delvis oksydert. Når R<1> i formel (V) er en OH-gruppe, dannes en aldehydforbindelse med formel (VI) ved hjelp av denne oksydasjon. Når R<2> i den ovenstående formel (V) er en CH2OH-gruppe dannes på den annen side en aldehydforbindelse med formel (VII). Eksempler på det oksydasjonsmiddel som anvendes ved denne oksydasjon inkluderer alkalimetallper-jodater som f.eks. natriumperjodat eller kaliumperjodat. Det oksyderende middel kan anvendes vanligvis i en mengde på fra 1 til 30 ekvivalenter, foretrukket fra 5 til 10 ekvivalenter, pr. mol forbindelse med formel (V). Den ovennevnte oksydasjon kan gjennomføres generelt ved en temperatur fra 0 til 20°C, foretrukket fra 0 til 5°C.

Aldehydforbindelsen med formel (VI) eller (VII) oppnådd på denne måte kan omsettes med en aminogruppe i et protein ved hjelp av en kjent reduserende alkyleringsmetode. På denne måte kan det glykosaminoglykanmodifiserte protein representert ved formel (I) eller (II) oppnås. Den reduserende alkylering kan gjennomføres ved å omsette aldehydforbindelsen med formel (VI) eller (VII) med proteinet i et flytende medium valgt fra f.eks. dem som er nevnt i det foregående, vanligvis ved en temperatur fra 15 til 60°C. Samtidig med denne reaksjon eller etter fullføringen av reaksjonen underkastes reaksjonsblandingen for reduksjon med et reduksjonsmiddel som f.eks. natriumcyanoborhydrid.

Med hensyn til det glykosaminoglykanmodifiserte protein med formel (I) eller (II) kan n generelt gjennomsnittlig være fra 1 til 100, foretrukket gjennomsnittlig fra 1 til 10.

Reduserende terminal restlaktoniserende metode.

Denne metode omfatter delvis oksydasjon av den reduserende terminale sukkerdel av et glykosaminoglykan for derved å spalte den terminale sukkerdel etterfulgt av å danne et lakton. Deretter fremstilles et protein modifisert med glykosaminoglykanet ved å omsette laktonet med en aminogruppe i proteinet. Reaksjonsskjemaet ved denne metode er som følger: I det ovenstående reaksjonsskjema representerer A et kalium-atom eller natriumatom, og P, n, GAG, R<1> og R<2> er som definert i det foregående.

Ved denne metode blir glykosaminoglykanet med formel (IV) først oksydert for å spalte den reduserende terminale sukkerdel. Således oppnås en karboksylforbindelse med formel (VIII) . Eksempler på det oksydasjonsmiddel som anvendes ved dette oksydasjonstrinn inkluderer jod og brom. Oksydasjons-middelet kan anvendes vanligvis i en mengde fra 2 til 20 ekvivalenter, foretrukket fra 5 til 15 ekvivalenter, pr. mol av forbindelsen med formel (IV). Oksydasjonsreaksjonen kan gjennomføres i et flytende medium valgt blant f.eks. de ovennevnte ved en temperatur fra 0 til 40°C, foretrukket fra 15 til 20°C. Etter oksydasjonsreaksjonen blir kaliumhydroksyd eller natriumhydroksyd tilsatt reaksjonsblandingen for å spalte det resterende oksydasjonsmiddel.

Den således oppnådde oppløsning inneholdende forbindelsen med formel (VIII) tilføres til en kolonne fylt med 200 ml sterkt

sure kationbytterharpikser som f.eks. Dowex 50 eller Amberlite IR120 og får passere gjennom kolonnen i løpet av en time for å oppnå den gjennomgående fraksjon. Kolonnen vaskes med vann og denne vannfraksjon kombineres med den ovenfor oppnådde gjennomgående fraksjon og deretter får den kombinerte fraksjon stå over natten ved 4°C for å danne laktonforbindelsen med formel

(IX) .

Laktonforbindelsen med formel (IX) oppnådd på denne måte blir så omsatt med et protein til å gi det glykosaminoglykanmodifiserte protein representert ved formelen (III) . Reaksjonen mellom laktonforbindelsen med formel (IX) og proteinet kan gjennomføres ved å omsette laktonet i form av et trialkylamin eller innstille pH-verdien av blandingen av laktonet og proteinet til 4 til 7 med en vandig oppløsning av natriumhydroksyd etterfulgt av å gjennomføre reaksjonen ved 0 til 70°C, foretrukket 15 til 50°C.

Med hensyn til det glykosaminoglykanmodifiserte protein med formel (III) kan n generelt være fra et gjennomsnitt på 1 til 100, foretrukket et gjennomsnitt fra 1 til 10.

Karboksylgruppeaktiverende metode.

Med et fåtall unntagelser (f.eks. keratosulfat og keratopolysulfat) bærer glykosaminoglykaner hver en uronsyredel representert ved den følgende formel:

I samsvar med denne metode kan proteinet modifisert med glykosaminoglykanet oppnås ved å binde en karboksylgruppe i uronsyredelen av et glykosaminoglykan til en aminogruppe i proteinet.

Denne metode omfatter aktivering av en karboksylgruppe i en uronsyredel av et glykosaminoglykan ved hjelp av en metode vanlig kjent innenfor peptidkjemien og deretter å omsette karboksylgruppen aktivert på denne måte med et protein.

Karboksylgruppen i uronsyredelen i glykosaminoglykanet kan aktiveres ved f.eks. å omsette glykosaminoglykanet med en forbindelse valgt fra N-hydroksysuccinimid, p-nitrofenol, N-hydroksybenzotriazol, N-hydroksypiperidin, N-hydroksy-succinamid og 2,4,5-triklorfenol for å omdanne karboksylgruppen til en aktiv estergruppe.

Mer spesielt omdannes glykosaminoglykanet til et salt med et passende amin som f.eks. tri(n-butyl)amin, trietylamin eller pyridin. Deretter blir det resulterende salt omsatt med N-hydroksysuccinimid i et passende løsningsmiddel som dimetylformamid, pyridin eller dimetylsulfoksyd i nærvær av et kondensasjonsmiddel som f.eks. l-etyl-3-(dimetylaminopropyl)-karbodiimid, dicykloheksylkarbodiimid ved en temperatur fra 0 til 50°C. På denne måte oppnås et glykosaminoglykan med en aktivert karboksylgruppe.

Deretter blir glykosaminoglykanet med en aktivert karboksylgruppe omsatt med et protein til å gi det glykosaminoglykan-modif iserte protein.

En vandig oppløsning av proteinet blir for dette tilsatt til en vandig oppløsning av glykosaminoglykanet med en aktivert karboksylgruppe eller en fosfatbufferoppløsning (pH 6 til 9) inneholdende glykosaminoglykanet med en aktivert karboksylgruppe og blandingen får reagere ved 0 til 50°C, foretrukket 15 til 25°C i 30 minutter til 20.timer.

Den ovennevnte karboksylgruppeaktiverende metode gjør det mulig å oppnå et glykosaminoglykanmodifisert protein hvor minst noen av karboksylgruppene i uronsyredelen av glykosaminoglykanet er bundet til proteinet via en amidbinding.

Bromcyanaktiveringsmetode.

Denne metode omfatter aktivering av en aminogruppe eller en karboksylgruppe i et protein, eller en karboksylgruppe, en hydroksylgruppe eller en funksjonell gruppe i den reduserende terminale rest av et glykosaminoglykan og deretter la blandingen reagere for å binde glykosaminoglykanet til proteinet.

Mer spesifikt kan det glykosaminoglykanmodifiserte protein oppnås ved denne metode som følger.

Glykosaminoglykanet oppløses i 2 M fosfatbuffer (pH 11,5) og en acetonitriloppløsning av bromcyan tilsettes dertil. Etter omsetning av blandingen ved 4°C i fem minutter tilsettes acetonitril til reaksjonsblandingen for å gi et bunnfall. Etter fjernelse av overskudd av bromcyan oppløses bunnfallet i 0,1 M natriumhydrogenkarbonatoppløsning. Et protein ble tilsatt dertil og en reaksjon gjennomføres ved 4°C i 20 timer for oppnåelse av et ønsket produkt.

Det glykosaminoglykanmodifiserte protein som fremstilles ved hjelp av en av de ovennevnte metoder kan separeres og renses ved hjelp av en konvensjonell metode. F.eks. blir reaksjonsblandingen avsaltet med bruk av en dialysemembran eller en ultrafiltreringsmembran. Deretter blir det ønskede produkt separert fra det uomsatte glykosaminoglykan og protein og renset med bruk av en anionbytter eller en kationbytter. Alternativt kan produktet separeres og renses ved hjelp av gelfiltrering ved å utnytte forskjellen i molekylvekt. For noen proteiner er det videre mulig å separere og rense det ønskede produkt ved hjelp av affinitetskromatografi under anvendelse av en bærer hvorpå en enzyminhibitor, et substrat eller et antistoff er immobilisert.

Det glykosaminoglykan som anvendes for modifisering av et protein kan velges innen vide grenser avhengig av de ønskede egenskaper av det ønskede glykosaminoglykanmodifiserte protein og formålet for modifiseringen uten spesiell begrensning. Mer spesielt kan det velges blant kolominsyre, hyaluronsyre, chondroitin, chondroitinsulfat, teichuronsyre, dermatansulfat, heparin, heparansulfat, keratosulfat, keratopolysulfat og derivater derav som f.eks. chondroitinpolysulfat. Når det ønskede produkt anvendes som et antitrombotisk middel og et antiarteriosklerotisk middel er foretrukne glykosaminoglykaner chondroitinsulfat, chondroitinpolysulfat, heparin, heparansulfat og dermatansulfat. På den annen side er hyaluronsyre,

dermatansulfat og chondroitinsulfat egnet for fremstilling av et antireumatisk middel og et antiinflammatorisk middel. Disse

glykosaminoglykaner kan anvendes alene eller i en kombinasjon av to eller flere.

Det protein som modifiseres med glykosaminoglykanet er ikke særlig begrenset. Anvendelig som proteiner er fysiologisk aktive proteiner som skriver seg fra forskjellige dyr inkluderende mennesker, mikroorganismer og planter så vel som proteiner fremstilt ved kjemisk syntese eller under anvendelse av genteknologi. Spesifikke eksempler på proteiner inkluderer cytokiner (f.eks. forskjellige interferoner som interferon-cc, interf eron-|3 og interf eron-y, interleukin-2 , interleukin-3) , hormoner (f.eks. insulin, veksthormonfrigivende faktor (GRF), kalsitonin, kalsitoningenrelaterende peptid (CGRP), atrial-natriuretisk hormon (ANP), vasopressin, kortikotropin-frigivende faktor (CRF), vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) , sekretin, oc-melanocyttstimulerende hormon (oc-MSH) , adreno-korikotropt hormon (ACTH), cholecystokinin (CCK), glukagon, paratyroid hormon (PTH), paratyroid hormonrelaterende protein (PTHrP), somatostatin, enkefalin), vekstfaktorer (f.eks. veksthormon (GH), insulinlignende vekstfaktor (IGF-I, IGF-II), P-nervevekstfaktor ((5-NGF) , basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), transformerende vekstfaktor-p(TGF-P), erytropoietin, granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), epidermal vekstfaktor (EGF)), enzymer (f.eks. vevplasminogenaktivator (TPA), elastase, peroksyddismutase (SOD), bilirubinoksydase, katalase, urikase, urokinase, termolysin, trypsin, chymotrypsin, Vs-protease, pepsin, papain, hyaluronidase, chondroitin ABC lyase, asparaginase) og andre proteiner (f.eks. ubiquitin, insulinsekresjonsaktiverende protein (IAP), serum tymusfaktor (STF), peptid-T, albumin, globulin, transferrin, lipoprotein, lipid A derivat, Ornithonyssus protein, trypsininhibitor).

I det i samsvar med oppfinnelsen fremstillbare glykosamino-glykanmodif iserte protein er en glykosaminoglykanrest kjemisk bundet til et protein. Mengden av glykosaminoglykanet som innføres i proteinet kan variere i avhengighet av f.eks. proteinet og/eller glykosaminoglykanet, dets molekylvekt og den endelige bruk av det dannede glykosaminoglykanmodifiserte protein. Den passende innføringsmengde av hvert glykosaminoglykan kan imidlertid lett bestemmes av den fagkyndige på området ved enkle forsøk. Generelt kan glykosaminoglykanet innføres i proteinet i mengder fra 1 til 99,9 vekt%, foretrukket fra 90 til 95 vekt%, basert på vekten av det protein som skal modifiseres.

Et glykosaminoglykanmodifisert protein reagerer neppe med antistoffet tilsvarende det umodifiserte protein. Videre blir antistoffproduktiviteten av proteinet vesentlig nedsatt ved modifiseringen som beskrevet i det etterfølgende eksempel og referanseeksempler.

Videre, når det glykosaminoglykanmodifiserte protein tilføres en levende organisme, opprettholdes dets aktivitet i en lang tid, sammenlignet med aktiviteten av det tilsvarende umodifiserte protein. Det glykosaminoglykanmodifiserte protein viser således en forbedret stabilitet in vivo.

Medisiner inneholdende glykosaminoglykanmodifisert protein fremstilt ifølge oppfinnelsen kan sammensettes i forskjellige former for oral tilførsel, f.eks. granuler, fine subtilater, pulvere, tabletter, kapsler, siruper, pastiller, suspensjoner eller oppløsninger. Alternativt kan det glykosaminoglykan-modif iserte protein tilføres oralt som sådant. Alternativt kan det sammensettes til injeksjonspreparater for intravenøs, intraarteriell, intraportal, intrapleuroperitoneal, intramus-kulær, subkutan eller intratumor tilførsel. Videre kan det være i form av et pulver og sammensettes til et injeksjonspre-parat ved bruk. Det kan sammensettes til stikkpiller for per rectum eller salver for parenteral tilførsel. Disse prepara-ter kan sammensettes sammen med kjente organiske eller uorga-niske flytende eller faste farmasøytiske bærere, fortynnings-midler, bindemidler, desintegrasjonsmidler og lignende egnet for oral, parenteral eller per rectum tilførsel (f.eks. laktose, sukrose, glukose, stivelse, gummi arabicum, tragant-gummi). Videre kan preparatene tilsettes stabiliserings-midler, fuktighetsbevarende midler, emulgeringsmidler, aroma-stoffer og komponenter for å variere det osmotiske trykk. Eksempler inkluderer gelatin, glyserol, vaselin, voks, plastmaterialer og høyere alkoholer. Videre kan salter eventuelt anvendes som en hjelpebestanddel for å opprettholde pH-verdien i preparatet ved et passende nivå. For stikkpiller kan det anvendes en vannoppløselig eller hydrofil base som f.eks. makrogol eller en oljeaktig base som f.eks. kakaoolje.

Dosen av det i samsvar med oppfinnelsen fremstillbare glykosaminoglykanmodifiserte protein kan variere i avhengighet av den sykdom som skal behandles og symptomer og alder på pasienten. Det er foretrukket kontinuerlig eller intermitte-rende å tilføre forbindelsen til en pasient i en dose fra 1 til 5000 mg/døgn i tilfellet av oral tilførsel, eller fra 1 til 100 mg/døgn i tilfelle av injeksjonspreparater.

For ytterligere å illustrere oppfinnelsen gis det etterføl-gende eksempel, samt referanseeksempler.

I disse ble aktivitet og molekylvekt av de GAG-modifiserte proteiner og innholdet av glykosaminoglykaner og proteiner bestemt under følgende betingelser.

Bestemmelse av aktivitet.

Katalase:

En enhet (U) enzym defineres som den mengde enzym som spalter 1,0 {IM hydrogenperoksyd i en hydrogenperoksydopp-løsning med en hydrogenperoksydkonsentrasjon fra 9,2 til

10,3 mM pr. minutt ved pH 7,0 og 25°C.

Lysozym:

En enhet enzym defineres som mengden av enzymet som frembringer en nedsettelse i absorbans på 0,001 av en suspensjon av en grampositiv bakterie (ML-celle) ved 540 nm pr. minutt ved pH 6,2 og 35°C.

Hyaluronidase:

En enhet enzym defineres som den mengde enzym som frigir 1 HM av et umettet disakkarid fra hyaluronsyre pr. minutt

ved pH 6,2 og 37°C.

Elastase:

En enhet enzym defineres som den mengde enzym som hydrolyserer 1 [IM N-acetyl-tri-L-alaninmetylester pr.

minutt ved pH 8,5 og 2 5°C.

Urikase:

En enhet enzym defineres som den mengde enzym som oksyde-rer 1 |XM urinsyre pr. minutt ved pH 8,5 og 2 5°C. Urokinase: En enhet enzym defineres som den mengde enzym som frembringer et plasminogen, når plasminogen behandles med urokinase ved pH 7,5 og 37°C, som gir en endring på 1,0 av en absorbans av en substans oppløselig i perklorsyre

dannet fra cc-kasein pr. minutt ved A275 .

Asparaginase:

En enhet enzym defineres som den mengde enzym som frembringer 1,0 JIM ammoniakk fra L-asparagin pr. minutt ved

pH 8,6 og 37°C.

Peroksyddismutase:

En enhet enzym defineres som den mengde enzym som inhiberer 50 % av aktiviteten av xantin-oksydase ved pH 7,8 og 25°C.

Bestemmelse av molekylvekt.

En prøve underkastes HPLC væskekromatografi under anvendelse av en G6000PWx2 (Tosoh Corporation) kolonne. Eluering ble gjennomført med en vandig 0,2 M natriumkloridoppløsning. Molekylvekten av en prøve bestemmes basert på en kalibrerings-kurve.

Bestemmelse av innhold av glykosaminoglykan.

(1) Glykosaminoglykan inneholdende uronsyre.

En prøve underkastes karbazol-svovelsyrereaksjon i samsvar med metoden beskrevet i T. Bitter og H.M. Muir, Analytical Biochemistry, 4, 330-334, 1962.

(2) Glykosaminoglykan som ikke inneholder uronsyre.

En prøve underkastes feno1-svovelsyrereaksjon i samsvar med metoden beskrevet i M. Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers og F. Smith, Anal. Chem., 28, 350-356 (1956).

Bestemmelse av innhold av protein.

Innholdet av protein bestemmes ved metoden til Lowry et al. som beskrevet i O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr og R.J. Randall, J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951.

REFERANSEEKSEMPEL 1

Fremstilling av GAG-modifisert protein ved hjelp av reduserende terminal restbegrensende oksydasjonsmetoden.

A. Fremstilling av reduserende terminal restbegrensende

oksydert glykosaminglykan:

I. Fremstilling av reduserende terminal restspaltet

hyaluronsyre ( R- HA).

2000 mg hyaluronsyre (MV 10000) ble oppløst i 200 ml av en 0,05 M boratbufferløsning (pH 8,3) og 182 mg natriumborhydrid ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i fem timer. pH-verdien av reaksjonsblandingen ble innstilt til 4,5 med eddiksyre og etanol ble tilsatt. Det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering og oppløst i 200 ml vann. Deretter ble den resulterende oppløsning ført gjennom en kolonne fylt med 1000 ml av en kationbytterharpiks (Dowex 50 (H+) ) . Eluatet og vannet anvendt for å vaske kolonnen ble kombinert og etanol mettet med natriumacetat ble tilsatt. Det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering.

Porsjon nr. 100.

Utbytte: 1800 mg.

II. Fremstilling av reduserende terminal restbegrensende

oksydert hyaluronsyre ( O- HA).

17 00 mg av R-HA fremstilt i det foregående trinn A ble oppløst i 250 ml 40 mM imidazolhydroklorid (pH 6,5) og 139,96 mg natriumperjodat ble tilsatt dertil ved 0°C etterfulgt av en times reaksjon. Etanol ble tilsatt reaksjonsblandingen og det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering. Bunnfallet ble oppløst i vann og etanol ble tilsatt på nytt til å gi et bunnfall. Umiddelbart deretter ble bunnfallet (O-HA) oppløst i en fosfatbufferoppløsning eller vann og anvendt i reaksjonen med et protein.

Porsjon nr. 110-1.

Utbytte: 1600 mg.

III. Fremstilling av andre reduserende terminale restbegren sende oksyderte glykosaminoglykaner ( O- GAG). Hyaluronsyre (som stammet fra kam: HalOO (MV 1.000.000)), chondroitinsulfat (som stammet fra bovin trachea-brusk: CS(T), haibrusk: CS(S), hvalbrusk: CS(W)), dermatansulfat (som stammet fra svinehud: DS), heparin (som stammet fra svineintestinalt vev: Hep), og heparansulfat (som stammet fra svinenyre: HS) ble behandlet på samme måte som i det foregående trinn A under betingelsene som angitt i tabell 1. På denne måte ble det oppnådd reduserende terminale reståpnede glykosaminoglykaner (R-GAGer). Deretter ble reduserende terminale restbegrensende oksyderte glykosaminoglykaner (O-GAGer) fremstilt på samme måte som i det etterfølgende trinn B under betingelsene som indikert i tabell 2. Tabellene 1 og 2 viser også de således oppnådde produkter og utbyttet av disse.

B. Fremstilling av protein modifisert med reduserende terminal restbegrensende oksydert glykosaminoglykan.

I. Fremstilling av hyaluronsvremodifisert katalase.

100 mg av produktet i porsjon nr. 110-2 ble oppløst i 10 ml av en 0,005 M fosfatbufferoppløsning (pH 8,0) og 2,3 mg katalase som stammet fra bovin lever (Seikagaku Corporation) ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i seks timer. Deretter ble 0,4 mg natriumcyanoborhydrid tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i 2 0 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert med en ultrafiltreringsinnretning forsynt med en membran med en fraksjonerende molekylvekt på 300.000 for å fjerne substan-ser med lav molekylvekt. Deretter ble filtratet renset ved hjelp av DEAE ionebytterharpikskromatografi og avsaltet med en dialysemembran etterfulgt av frysetørking.

Porsjon nr. 120-1.

Utbytte: 30,1 mg.

Katalaseinnhold: 2,1 %.

Hyaluronsyreinnhold: 97,9 %.

Aktivitet: 74,5 % av aktiviteten av umodifisert katalase.

[<X]D: -78,0 (C = 1, H20) .

Elektroforese: jfr. fig. 1.

Acetylcellulosemembran (SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.) 0,1 M maursyre/pyridin (pH 3,0)

0,5 mA/cm, 30 minutter.

I de foregående formler er Px en katalaserest eksklusive gjennomsnittlig elleve aminosyrer fra katalase og X er et hydrogenatom av ikke-reduserende terminal rest av hyaluronsyre.

II. Fremstilling av hyaluronsvremodifisert katalase.

100 mg av produktet i porsjon nr. 110-2 og 1 mg katalase avledet fra Aspergillus niger (Seikagaku Corporation) ble fremstilt på samme måte som i det foregående avsnitt I. Egenskapene av den således oppnådde hyaluronsyremodifiserte katalase var som følger:

Porsjon nr. 120-2.

Utbytte: 29,0 mg.

Katalaseinnhold: 0,92 %.

Hyaluronsyreinnhold: 99,08 %.

Aktivitet: 85,1 % av aktiviteten av umodifisert katalase.

[a]D: -78,8 (C = 1, H20) .

Elektroforese: jfr. fig. 2.

Acetylcellulosemembran (SEPARAX, JOOKOOCo., Ltd.) 0,1 M maursyre/pyridin (pH 3,0)

0,5 mA/cm, 30 minutter.

I de foregående formler er P2 en katalaserest eksklusive gjennomsnittlig .26 aminogrupper fra katalase og X er som definert i det foregående.

III. Fremstilling av hvaluronsyremodifisert urikase.

100 mg av produktet fra porsjon nr. 110-2 ble oppløst i 10 ml av en fosfatbufferoppløsning (pH 8,0) og 2,5 mg urikase som stammet fra Candida (Seikagaku Corporation) ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i ti timer. Deretter ble 0,4 mg natriumcyanoborhydrid tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i 20 timer. Etanol ble tilsatt reaksjonsblandingen og det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering. Deretter ble bunnfallet oppløst i vann og renset med DEAE ionebytterharpikskromatografi. Egenskapene av den hyaluronsyremodifiserte urikase oppnådd på denne måte var som følger:

Porsjon nr. 120-3.

Utbytte: 23,5 mg.

Urikaseinnhold: 1,8 %.

Hyaluronsyreinnhold: 98,2 %.

Aktivitet: 73,4 % av aktiviteten av umodifisert urikase.

[a]D: -77,9 (C = 1, H20) .

Elektroforese: jfr. fig. 3.

Acetylcellulosemembran (SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.)

I disse formler er P3 en urikaserest eksklusive gjennomsnittlig 5,5 aminogrupper fra urikase og X har den ovennevnte betydning.

IV. Fremstilling av hyaluronsyremodifisert asparaginase.

100 mg av produktet fra porsjon nr. 110-2 ble oppløst i 10 ml av en 0,05 M fosfatbufferoppløsning (pH 8,0 ) og 5 mg asparaginase som stammet fra Escherichia coli (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i ti timer. Deretter ble 1 mg natriumcyanoborhydrid tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere i 2 0 timer. Etanol ble tilsatt til reaksjonsblandingen og det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering. Deretter ble bunnfallet oppløst i vann og renset med DEAE ionebytterharpikskromatografi. Den hyaluronsyre-modif iserte asparaginase oppnådd på denne måte var som følger:

Porsjon nr. 120-4.

Asparaginaseinnhold: 4,8 %.

Hyaluronsyreinnhold: 95,2 %.

Aktivitet: 84,6 % av aktiviteten av umodifisert asparaginase.

[a]D: -76,9 % (C = 1, H20).

Elektroforese: jfr. fig. 4.

Acetylcellulosemembran (SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.) 0,069 M veronalbufferoppløsning (pH 8,6)

0,5 mA/cm, 40 minutter.

I de foregående formler er P4 en asparaginaserest eksklusive gjennomsnittlig 2,7 aminogrupper fra asparaginase og X er som definert i det foregående.

V. Fremstilling av hyaluronsyremodifisert peroks<y>ddismutase. 100 mg av produktet i porsjon nr. 117 ble oppløst i 10 ml 0,05 M fosfatbufferoppløsning (pH 8,0) og 2,3 mg peroksyddismutase (Sigma) som stammet fra bovine røde blodlegemer ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i 20 timer. Deretter ble 0,4 mg natriumcyanoborhydrid tilsatt reaksjonsblandingen og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i to timer. Etanol ble tilsatt reaksjonsblandingen for å danne et bunnfall. Bunnfallet ble vasket godt med etanol og tørket til å gi en hyaluronsyremodifisert peroksyddismutase. Egenskapene av dette produkt er som følger.

Utbytte: 89,7 mg.

Peroksyddismutaseinnhold: 2,0 %.

Hyaluronsyreinnhold: 98,0 %.

Molekylvekt: 1.000.000.

Aktivitet: 89,8 % av aktiviteten av umodifisert peroksyd dismutase.

[CC]D: -78, 0 (C = 1, H20) .

Elektroforese: jfr. fig. 6.

VI. Fremstilling av andre glykosaminoglykanmodifiserte

proteiner.

Katalase som stammet fra bovin lever, peroksyddismutase som stammet fra bovine erytrocytter, hyaluronidase som stammet fra bovine testikler, lysozym som stammet fra albumen (de ovennevnte enzymer fremstilles samtlige av Seikagaku Corporation) og urokinase som stammet fra humane renale celler (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) ble modifisert med produktene i porsjoner nr. 111 til 116 på samme måte som i det foregående trinn I under betingelsene anført i tabell 3. Tabell 4 viser de analytiske data for de således oppnådde produkter.

Fig. 5 viser det elektroforetiske mønster av produktet i porsjon nr. 121-1 som et representativt produkt. Elektro-foresen ble gjennomført under de samme betingelser som beskrevet under I.

VII. Immunologisk aktivitet.

Antigenisiteten av katalase som stammet fra Aspergillus niger (Seikagaku Corporation) og katalasen modifisert med hyaluronsyre (porsjon nr. 12 0-2) ble undersøkt på følgende måte.

Katalase eller HA-katalase oppløst i en 0,05 M fosfatbuffer-oppløsning med pH 7,0 (i det følgende forkortet som PBS) ble intraperitonealt (i det følgende forkortet som i.p.) tilført en gang i uken i tolv uker til Swiss-Webster hunnmus (hver gruppe på fire dyr) i en dose på 0,1 mg regnet som protein. Ved nullte, tredje, sjette, niende og tolvte uke ble blodet fra hvert dyr samlet fra retoroorbital plexus og lagret ved

-2 0°C. Innholdet av hvert serum ble bestemt ved HPO-ELISA (enzymforbundet immunosorbentassay med bruk av pepperrot-peroksidase) i samsvar med metoden til Voller et al. 100 ul av en antigenoppløsning fortynnet med en karbonatbuffer-oppløsning (0,5 M, pH 9,5) til 10 ug/ml ble anvendt for inokulering av brønnene i Nunc Immuno II mikrotiterplater. Platene ble inkubert ved 4°C over natten og deretter vasket med en fysiologisk saltoppløsriing inneholdende 0,05 % Tween 20 tre ganger. 100 ul av et testserum fortynnet med den Tween 20-holdige PBS ble tilsatt hver brønn. Tre kontroller, d.v.s. en antigenkontroll, en antiserumkontroll og en normal muse-serumkontroll ble også fremstilt. Etter å ha fått stå i romtemperatur i en time ble 100 ul porsjoner av HPO-konjugert geite-antimuseimmunoglobuliner (IgG + IgA + IgM) tilsatt til

hver brønn og inkubert ved romtemperatur i en time og 30 minutter. 100 |il av o-fenylendiaminsubstratet ble tilsatt hver brønn og inkubert i ti minutter. Deretter ble 0,01 ml 4 N svovelsyre tilsatt for å bringe reaksjonen til opphør. Innholdet bestemmes som antistoff-fortynningsforhold som gir en optisk densitet på 0,01 basert på kontrollserumet.

Resultatene er vist i tabell 5.

Som vist i tabell 5 er antigensiteten eller immunogenisiteten av HA-katalase lavere enn for umodifisert katalase. VIII. Effekt på ischemisk musefotødem (- 0,- produktivitet

ved blodresirkulasjon ved bakfotischemi).

En ddy-hannmus med alder åtte uker holdes i en holder-innretning og høyre bakben ombindes med en sutur (Brain nr. 2). En ende av suturen er fiksert mens en vekt på 500 g henges ned fra en annen suturende. Således etableres ischemi for en begrenset tidsperiode. Før ischemien og 60 minutter deretter ble tykkelsen av bakfoten av dyret målt med skyvelæ-re. Deretter kuttes fotpoten av og veies. En fysiologisk saltløsning tilføres intravenøst umiddelbart før initieringen av ischemien til en kontrollgruppe. Til testgruppene ble prøven vist i tabell 6 tilført 30 minutter før initiering av ischemien og umiddelbart før denne. Hver gruppe hadde fem dyr. Katalasen anvendt som en prøve stammet fra bovin lever. HA-katalasen som ble anvendt ble fremstilt på følgende måte.

10 mg HA-katalase fra porsjon nr. 120-1 ble oppløst i 5,2 ml av en fysiologisk saltløsning og filtrert gjennom en membran på 0,22 um (Milex GV, fremstilt av Nippon Millipore Kogyo

Kogyo K.K.). 1 ml porsjoner av filtratet ble fordelt til ampuller til å gi et preparat for injeksjon. Preparatet inneholdt 600 U av enzymet pr. ampulle.

Virkningene ble beregnet i samsvar med følgende ligninger.

Virkning A:

Det antas at en prøve X som viser A på 40 eller mer er effektiv.

Virkning B:

Det antas at en prøve X som viser B på 60 eller mer er effektiv.

Resultatene er vist i tabell 6.

Disse resultater indikerer at den umodifiserte katalase ikke viste noen virkning mens HA-katalasen var klart effektiv når den ble tilført 30 minutter før ischemien. Fra disse resultater forutsettes det at HA-katalasen er stabil i blodet og utøver en vedvarende aktivitet.

IX. Fremstilling av chondroitinsulfatmodifisert elkatonin. 100 mg av produktet av O-CS(T) i porsjon nr. 111 ble oppløst i 10 ml av en 0,05 M fosfatbufferoppløsning (pH 8,0) og 10 mg elkatonin (Seikagaku Corporation) ble tilsatt dertil. Blandingen fikk reagere i 2 0 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert med en ultrafiltreringsinnretning forsynt med en membran med en fraksjonerende molekylvekt på 10.000 for å fjerne ureagert elkatonin etterfulgt av frysetørking. Egenskapene av det chondroitinsulfatmodifiserte elkatonin oppnådd på denne måte (porsjon nr. 127) var som følger:

Utbytte: 98,2 mg.

Elkatonininnhold: 5,50 %.

Chondroitinsulfatinnhold: 94,50 %.

[Ct]D: -21,9 (C = 1, H20) .

I de foregående formler er P5 en elkatoninrest eksklusive gjennomsnittlig to aminogrupper fra elkatonin, X' er et hydrogenatom av den ikke-reduserende terminale rest av chondroitinsulfat, R3 og R4 er ulike og representerer hver -H eller -S03H.

X. Aktivitet og stabilitet av blod av chondroitinsulfatmodifisert elkatonin ( porsjon nr. 127).

a) 5 |lg/kg elkatonin og 5 ug/kg, regnet som elkatonin, av chondroitinsulfatmodifisert elkatonin (porsjon nr. 127) ble

tilført rotter fra halevenen. Den maksimale nedsettelse i blodkalsiuminnholdet bevirket derved ble referert som 100. Deretter ble tid medgått for å oppnå en nedsettelse i blodkalsiuminnholdet på 50 målt. Resultatene er som følger:

Elkatonin: 48 timer, og

Porsjon nr. 127: 72 timer.

Det ble således funnet at produktet fra porsjon nr. 127 ville utøve sin virkning mer sakte.

b) 5 Jig/kg elkatonin (27,6 uCi/mg) fremstilt fra [1-<14>C] alanin (50 mCi/mmol) og 5 ug/kg, regnet som elkatonin, av

chondroitinsulfatmodifisert elkatonin (1,52 |lCi/kg) fremstilt ved å modifisere elkatoninet med O-CS(T) fra porsjon nr. 111

ble intravenøst injisert i kaniner. Konsentrasjonen av hver forbindelse i blodet bestemt to minutter etter injeksjonen ble referert som 100 og halveringstiden ble målt. Resultatene er som følger: Elkatonin: 10 minutter, og

Chondroitinsulfatmodifisert elkatonin: 50 minutter.

REFERANSEEKSEMPEL 2

Fremstilling av GAG-modifisert protein ved hjelp av karboksylgruppeaktiveringsmetoden.

A. Fremstilling av karboksylgruppeaktivert

glykosaminoglykan:

I. Fremstilling av karboksylgruppeaktivert hyaluronsyre.

a) 2 800 mg tri-n-butylaminsalt av hyaluronsyre (MV 1.000.000) ble oppløst i 280 ml dimetylformamid. 0,17 ml

vannoppløselig karbodiimid (WSC; l-etyl-3-(dimetylamino-propyl)-karbodiimid)) og 0,23 g N-hydroksysuccinimid ble tilsatt dertil og blandingen fikk reagere ved romtemperatur i 20 timer. Etanol mettet med natriumacetat ble tilsatt til reaksjonsblandingen og det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering.

NS-HA porsjon nr. 2 00.

Utbytte: 2 500 mg.

b) 2800 mg tri-n-butylaminsalt av hyaluronsyre (MV 1.000.000) ble oppløst i 280 ml dimetylformamid. 0,17 ml WSC

og 0,27 g N-hydroksybenzotriazol ble tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i 20 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som beskrevet i det foregående.

NB-HA porsjon nr. 2001-1.

Ubytte: 2 680 mg.

c) 2800 mg tri-n-butylaminsalt av hyaluronsyre ble oppløst i 280 ml dimetylformamid. 0,17 ml WSC og 0,28 g p-nitrofenol ble tilsatt dertil og den oppnådde blanding fikk reagere ved romtemperatur i 20 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som i det foregående trinn a.

PN-HA porsjon nr. 200-2.

Utbytte: 2775 mg.

II. Fremstilling av karboksylgruppeaktivert glykosaminoglykan. Chondroitinsulfat (som stammet fra bovin trachea-brusk: CS(T), haibrusk: CS(S), hvalbrusk: CS(W)), heparin (som stammet fra svineintestinalt vev: Hep), heparansulfat (som stammet fra svinenyre: HS) og dermatansulfat (som stammet fra svinehud DS) ble behandlet på samme måte som i det foregående trinn I under betingelsene som angitt i tabell 7. De således oppnådde produkter er vist i tabell 7.

B. Fremstilling av protein modifisert med karboksygruppe-aktivert glykosaminoglykan.

I. Fremstilling av hyaluronsyremodifisert katalase.

100 mg av produktet fra porsjon nr. 200 ble oppløst i 20 ml vann og 2,5 mg katalase som stammet fra bovin lever (Seikagaku Corporation) ble tilsatt dertil. Den oppnådde blanding fikk reagere ved romtemperatur ved pH 7,0 i 20 timer. Deretter ble

reaksjonsblandingen avkjølt til 0°C og pH-verdien av blandingen ble innstilt til 10,0 med 0,1 N natriumhydroksyd. Umiddelbart deretter ble blandingen nøytralisert med eddiksyre og filtrert ved hjelp av en ultrafiltreringsinnretning forsynt med en membran med en fraksjonerende molekylvekt på 300.000 for å fjerne ureagert katalase. Egenskapene av den karboksylgruppeaktiverte hyaluronsyremodifiserte katalase oppnådd på denne måte var som følger:

Porsjon nr. 210.

Utbytte: 44 mg.

Katalaseinnhold: 2,3 %.

Hyaluronsyreinnhold: 97,7 %.

Aktivitet: 84,3 % av aktiviteten av umodifisert katalase.

[CC]D: -77, 9 (C = 1, H20) .

hvori P6 er en katalaserest eksklusive gjennomsnittlig ti aminogrupper fra katalase, Y er et hydrogenatom av den reduserende terminale rest av hyaluronsyre, X er som angitt i det foregående og summen av n, m og i er 2.500. II. Fremstilling av chondroitinsulfatmodifisert peroksyddismutase .

100 mg av produktet i porsjon nr. 201 og 2,5 mg peroksyddismutase som stammet fra bovine erytrocytter (Seikagaku Corporation) ble omsatt på samme måte som i det foregående trinn I. Egenskapene av den karboksylgruppeaktiverte chondroitinsulfatmodifiserte peroksyddismutase oppnådd på denne måte var som følger:

Porsjon nr. 211.

Utbytte: 41,2 mg.

Peroksyddismutaseinnhold: 2,0 %.

Chondroitinsulfatinnhold: 98,0 %.

Aktivitet: 81,4 % av aktiviteten av umodifisert peroksyd dismutase.

[<X]D: -78,0 (C = 1, H20) .

hvori P7 er en peroksyddismutaserest eksklusive gjennomsnittlig 80 aminogrupper fra peroksyddismutase, Y' er et hydrogenatom av den reduserende terminale rest av chondroitinsulfat, summen av n, m og { er 40, og X', R3 og R4 er som definert i det foregående.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av GAG-modifisert protein ved hjelp av den reduserende terminale restlaktoniseringsmetode.

A. Fremstilling av reduserende terminal restlaktonisert

hyaluronsyre:

500 mg hyaluronsyre (MV 10.000) ble oppløst i 50 ml vann.

5 ml av en 0,1 M jodoppløsning i metanol ble tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i seks timer. Deretter ble omtrent 5 ml 0,1 N kaliumhydroksyd tilsatt til reaksjonsblandingen for å bevirke avfarging av det frigitte jod. Etanol mettet med kaliumacetat ble tilsatt til oppløsningen. Det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering og oppløst i 50 ml vann. Den resulterende oppløs-ning ble bragt i kontakt med 50 ml av en sterkt sur ione-bytterharpiks (Dowex 50 (H+)) ved 5°C i 20 timer. Det således oppnådde filtrat ble nøytralisert med tri-n-butylamin.

Overskudd av amin ble fjernet med eter og resten ble frysetørket. Det ble således oppnådd tri-n-butylamin av reduserende terminal restlaktonisert hyaluronsyre som hvitt pulver.

Porsjon nr. 310,

Utbytte: 410 mg.

Reduserende sukkerinnhold bestemt ved hjelp av Somogyi-Nelsons metode: Intet.

B. Fremstilling av protein modifisert med reduserende terminal restlaktonisert glykokaminoglykan. I. Fremstilling av hyaluronsyremodifisert peptid ( H- Arg- Gly-Asp- Val- NH,, RGDV) : 60 mg av produktet fra porsjon nr. 310 ble oppløst i 20 ml dimetylformamid og 2,5 mg av en dimetylformamidoppløsning av RGDV ble tilsatt dertil. Den resulterende blanding fikk reagere ved 60°C i to timer. 10 ml av en 25 % vandig oppløs-ning av natriumacetat ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble etanol tilsatt dertil og det således dannede bunnfall ble samlet ved filtrering. Filtratet ble behandlet ved hjelp av en ultrafiltreringsinnretning forsynt med en membran med en fraksjonerende molekylvekt på 5000 for å fjerne ureagert RGDV. Deretter ble filtratet frysetørket. Egenskapene av det hyaluronsyremodifiserte RGDV var som følger:

Porsjon nr. 320.

Utbytte: 40,2 mg.

RGDV-innhold: 3,3 %.

Hyaluronsyreinnhold: 96,7 %.

I de ovennevnte formler er X som definert i det foregående.

REFERANSEEKSEMPEL 3

Fremstilling av hyaluronsyremodifisert peroksyddismutase.

400 mg kamavledet hyaluronsyre (MV 150.000) ble oppløst i 2 M fosfatbuffer (pH 11,5) og 1 ml av en acetonitriioppløsning av bromcyan (100 mg/ml) ble tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved 4°C i fem minutter. Umiddelbart etter avsluttet reaksjon ble 150 ml acetonitril tilsatt til reaksjonsblandingen for å danne et bunnfall. Det således oppnådde bunnfall ble vasket hurtig med acetonitril og ble oppløst i 0,1 M natriumhydrogenkarbonatoppløsning. 10 ml av en 1 % oppløsning av peroksyddismutase (SOD) avledet fra røde blodlegemer fra hunder ble tilsatt til reaksjonsblandingen og reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 20 timer. Etanol ble tilsatt til reaksjonsblandingen for å danne et bunnfall og det resulterende bunnfall ble oppløst i vann. Etter tilsetning av 0,1 ml etanolamin til blandingen ble reaksjonen gjennomført ved romtemperatur i en time. Etanol ble tilsatt til reaksjonsblandingen for oppnåelse av et bunnfall og det således oppnådde bunnfall ble vasket godt med etanol og tørket til å gi hyaluronsyremodifisert SOD.

Egenskapene av det hyaluronsyremodifiserte SOD oppnådd på denne måte var som følger:

Utbytte: 350 mg

SOD-innhold: 21,2 %.

Hyaluronsyreinnhold: 7 8,8 %.

Molekylvekt: 172.000.

Aktivitet: 82,1 % av aktiviteten av umodifisert SOD. Elektroforese: jfr. fig. 6.

REFERANSEEKSEMPEL 4

Sammenligning med chondroitinsulfatmodifisert peroksyddismutase i US-PS 4.585.754: A. Dannelse av chondroitinsulfat med bruk av vannoppløselig

karbodiimid.

25 mg chondroitinsulfat som stammet fra bovin trachea-brusk (CS(T)) ble oppløst i 10 ml vann og pH-verdien av den resulterende oppløsning ble innstilt til 5,0 med 0,1 N saltsyre. Deretter ble 0,0436, 0,145, 0,436, 1,45, 4,36, 14,5 og 43,6 mg vannoppløselig karbodiimid (WSC; l-etyl-3-(dimetylamino-propyl)karbodiimidhydroklorid) tilsatt dertil. Hver blanding oppnådd på denne måte fikk reagere ved romtemperatur i seks timer. Deretter ble reaksjonsblandingen dialysert mot en 0,015 M fosfatbufferoppløsning (pH 7,0) og underkastet elektroforese med bruk av en celluloseacetatmembran (0,1 M pyridin/maursyrebufferoppløsning (pH 3,0), 30 minutter,

0,5 mA/cm). Videre ble reaksjonsproduktet, hvortil 43,6 mg WSC var blitt tilsatt, blandet med 0,1 N vandig oppløsning av natriumhydroksyd, behandlet i en time og deretter underkastet elektroforese. Som et resultat ble det funnet at CS(T) i seg selv tydelig var forestret (jfr. fig. 7).

B. Identifisering av polymerisasjon av SOD i seg selv med vannoppløselig karbodiimid og chondroitinsulfatmodifisert

SOD-polymer:

5 mg SOD ble oppløst i 10 ml vann og pH-verdien av den resulterende oppløsning ble innstilt til 5,0 med 0,1 N saltsyre. Deretter ble 2,5 mg WSC tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk reagere ved romtemperatur i seks timer. Den ble deretter dialysert mot en 0,015 M fosfatbufferoppløsning (pH 7,0). Den således oppnådde vandige oppløsning ble referert til som porsjon nr. B.

I samsvar med US-PS 4.585.754 ble separat 25 mg CS(T) oppløst i 10 ml vann og pH-verdien av den resulterende oppløsning ble innstilt til 5,0. Deretter ble 5 mg SOD og 12,5 mg WSC tilsatt dertil og blandingen fikk reagere ved romtemperatur i seks timer. Denne reaksjonsblanding ble behandlet på samme måte som i det foregående trinn A. Den således oppnådde vandige oppløsning ble referert til som porsjon nr. C.

C. Forskjell i gelkromatografisk elueringsmønster.

Hvert produkt oppnådd i det foregående ble underkastet gelfiltrering under anvendelse av en Sepharose CL4B (Pharmacia, Sverige, 1,2x100 cm) kolonne med bruk av en 0,05 M fosfatbufferoppløsning (pH 7,0) inneholdende 0,3 M natriumklorid som et fremkallingsløsningsmiddel. Eluatet ble samlet i 3,45 ml porsjoner i rør. Fig. 8 viser resultatene av gelfiltreringen. Som vist i fig. 8 ble det funnet at en reaksjon mellom et protein som bærer både en karboksylgruppe og en aminogruppe (SOD i dette tilfelle) med chondroitinsulfat i nærvær av WSC vil gi en polymer med en komplisert struktur som et reaksjonsprodukt.

Videre er aktiviteten av WSC-modifisert SOD lavere enn for glykosaminoglykanmodifisert SOD, selv om innholdet av SOD er de samme i begge tilfeller.

WSC-metode (porsjon nr. C): 44,4 % av aktiviteten av

umodifisert SOD.

Fremgangsmåte i samsvar med referanseeksempel 1

(porsjon nr. 121-2): 69,9 % av aktiviteten av umodifisert SOD.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et glykosaminoglykanmodifisert protein, representert ved formelen: hvori P representerer en proteinrest eksklusive n aminogrupper fra proteinet, n er et heltall fra 1 til 100, og GAG representerer en glykosaminoglykanrest eksklusive en reduserende terminal sukkerdel fra glykosaminoglykanet, karakterisert ved at den omfatter å aktivere et glykosaminoglykan ved delvis å oksydere den reduserende terminale sukkerdel av nevnte glykosaminoglykan for derved å spalte den terminale sukkerdelen etterfulgt av dannelse av et lakton derfra ved å behandle det reduserende terminale sukkerspaltede glykosaminoglykanet med syre og å reagere det aktiverte glykosaminoglykan med et protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at glykosaminoglykan-innholdet i det glykosaminoglykanmodifiserte protein som fremstilles er i området fra 78 til 99 vekt% basert på vekten av proteinet.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at glykosaminoglykanet som anvendes er valgt fra hyaluronsyre, chondroitin, chondroitin-sulf at, dermatansulfat, heparin, heparansulfat, og derivater derav.