JPH03284698A - グリコサミノグリカン修飾プロテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はグリコサミノグリカンにより修飾されたプロテ
ィンに関し、さらに詳しくは、特定の活性化剤により活
性化されたグリコサミノグリカンとプロティンとを反応
させることにより得ることができるグリコサミノグリカ
ンにより修飾されたプロティンに関する。

［従来の技術］ 近年、癌をはじめとして各種炎症反応や遺伝的酵素欠損
症など各種の疾患に対して酵素や生理活性蛋白質を医薬
品として用いる試みが盛んに行なわれている。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、これらの酵素や生理活性蛋白質は、生体に対し
て異種蛋白質であることが多く、そのまま生体内に投与
することは免疫原性の問題や生体内での安定性の問題を
生じ、製剤化にあたってアナフイラキ／−反応の軽減や
薬効の持続性の向上等の改善が必要になってくる。

また、これらの蛋白質を遺伝子工学の操作により大量に
生産する試みがなされているが、遺伝子工学により生産
される蛋白質は、糖鎖の欠如の問題があり、これも生体
内での安定性に大きな問題がある。

そのために、酵素や生理活性蛋白質の安定性を薬理学的
に改善するために、種々の合成高分子物質、多糖類等で
修飾する提案がなされている。そのために使用される合
成高分子物質としては、例えば、ポリーＬ−アスパラギ
ン酸１′またはその誘導体、ポリ−Ｄ〜または−Ｌ−リ
ジン、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとの共重合体１、
ポリビニルアルコールビラン重合体、ポリエチレングリ
コールまたはその誘導体、スチレン−マレイン酸共重合
体３′等が挙げられ、多糖体としては、例えば、アガロ
ース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン１　
プルラン４１″　　リポポリサッカライド等が挙げられ
る［”　　Ｍ、０ｋａｄａ、Ａ、Ｍａ　ｔ　ｓｕＳｈｉ
ｍａ、Ａ、Ｋａｔｓｕｈａｔａ、Ｔ。

Ａｏｙａｍａ、Ｔ、Ａｎｃｌｏ　　　ａ、ｎｄ　　　Ｙ
、Ｉｎａｄａ：Ｉｎｔ、Ａｒｃｈｓ　　　Ａｌｌｅｌｒ
ｇｙａｐｐｌ、　　Ｉｍｍｕｎ　、　７６．７９−８１
．（１９５５）；”　　　Ｆ、Ｔ、　　Ｌｉｕ　　　ａ
ｎｄ　　　Ｄ、Ｈ。

Ｋａｔｚ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ
、、　　７６、　１４３０　　１４３４（１９７９）：
”　　　Ｈ，Ｍａｅｃｌａ、　　Ｍ、　　Ｌｌｅｄａ、
　　Ｔ、　　Ｍｏｒｉｎａｇａ　　　ａｎｄ　　　Ｔ、
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ：Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、　　２
８．　４５５−４８１（１９８５）；”　　　Ｍ、Ｕｓ
ｕ　　ｉ　　　ａｎｄ　　　Ｔ、Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ
　　：Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　、　　１２２．１
２６６〜１２７２（１９７９）；５Ｉ　松橋直・減感作
の寅験動物モデル、小林節雄他編、減感作療法の基礎と
臨床、ｐｐ、４〜１１、中外医学書（１９８２）；！″
　Ｔ、Ｐ、Ｋｉｎｇ、Ｌ。

Ｋｏｃｈｏｕｍｉａｎ、に、ｌ５ｈｉｚａｋａ。

Ｌ、Ｋｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｐ、Ｓ、Ｎｏｒｍａｎ
　：Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、１
６９．４６４−４７３（１９７５）蓼照］。

一方、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノブロビル
）−カルボジイミドの存在下にスーパーオキシドシフム
ターゼやインスリン等の蛋白質とフンドロイチンＷｉ酸
等とを反応させることによって安定化された該蛋白質が
提案されている（特開昭６２−２５５４３５号公報参照
）が、この方法によって得られる蛋白質は、これら蛋白
質に存在する複数のアスパラギン酸やグルタミン酸のカ
ルボキシル基が、１−エチル−３（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミドにより夫々活性化される結
果、得られる蛋白質と称される物質は、蛋白質それ自体
の重合体を含む複雑な重合体を形成し、スーパーオキシ
ドジスムターゼやインスリン等の単体としての薬理効果
において今−歩の改善が望まれている。

今回、還元末端限定酸化法、カルボキシル基活性化法ま
たは還元末端ラクトン法により活性化されたグリコサミ
ノグリカンをプロティンと反応させることにより、構造
の複雑な重合体が生ずることなく、生体内での安定性に
優れ、しかも該プロティンが本来もっている生理活性を
持続して発現しうるグリコサミノグリカン修飾プロティ
ンが得られることが見い出され本発明を完成するに至っ
た。

［課題を解決するための手段］ かくして、本発明の一態様によれば、グリコサミノグリ
カンの還元性末端糖部分を還元及び部分酸化することに
より形成されるアルデヒド基にアミン結合を介してプロ
ティンが結合していることを特徴とするグリコサミノグ
リカン修飾プロティンが提供される。

また、本発明のもうひとつの態様によれば、下記式 式中、 男）はプロティンからｎ個のアミ７基を除いたプロティ
ン残基を表わし、 祠７罰はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部分を
除いたグリコサミノグリカン残基を表わす、 で示されるグリコサミノグリカン修飾プロティンか提供
される。

本発明のさらに別の態様によれば、グリコサミノグリカ
ンのウロン酸部分の少なくとも一部のカルボキシル基が
アミド結合を介してプロティンに結合していることを特
徴とするグリコサミノグリカン修飾プロティンが提供さ
れる。

本発明の上記グリコサミノグリカン修飾プロティンは、
例えば、還元末端限定酸化法、還元末端ラクトン法又は
カルボキシル基活性化法により活性化されたグリコサミ
ノグリカンをプロティンと反応させることにより製造す
ることができる。

以下、本発明のグリコサミノグリカン修飾プロティンを
その製造法に関連してさらに詳しく説劫する。

還元末端限定酸化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部分
を還元及び部分酸化することにより、該末端糖部分を開
裂させ且つアルデヒド基を形成せしめ、このアルデヒド
基とプロティンのアミノ基との間の還元アルキル化反応
を利用してグリコサミノグリカンで修飾されたプロティ
ンを製造する方法であり、その方法を反応式で示せば次
のとおりである。

反応式Ａ Ｒ？ Ｊ　←Ｎ＋＋、）ｎ　　　　　４／　ＨＮＨ２）ｎ式（
１）のグリコサミノ　　式（ＩＮ）のグリコサミノグリ
カッ修飾プロティン　グリカッ修飾プロティン上記式中
、 Ｒ１及びＲ２はそれぞれグリコサミノグリカンの還元性
末端糖部分の２位及び５位に通常みられる基を表わし、
Ｒ１としては、例えばＯＨ，ＮＨ，、ＮＨＣＯＣＨ３等
が挙げられ、Ｒ２としては、例えばＣＨ，ＯＨ，Ｃｏ○
■（、ＣＨ，００Ｓ　０３Ｍ等が挙げられ、ここでＭは
一般的に水素原子、アルカリもしくはアルカリ土類金属
、又はトリアルキルアミンやピリジン等のアミンを表わ
す； また、■、ｎ及び同Ｘ覆１は前記のとおりである。

本方法においては、先ず、上記式（ＩＶ）で示されるグ
リコサミノグリカンを還元して還元性末端糖部分を開裂
させて、式（Ｖ）の化合物とする。この還元に使用しう
る還元剤としては、例えは、水素化ホウ素ナトリウム、
シアン水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素アル
カリ塩等が挙げられる。また、上記還元は適当な液体媒
体中、例えばホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，３）、リン酸塩
緩衝液（ｐＨ８，６）等の緩衝液；これら緩衝液とジメ
チルホルムアミド、アセトニトリル、ジオキサンメタノ
ール等の有機溶媒との混合液中で、通常θ〜４０℃、好
ましくは１５〜２０℃の温度で行なうことができる。

上記還元剤の使用量は、その種類等ｌ二よっても異なる
が、一般には式（ＩＶ）の化合物１モルに対して５〜５
０当量、好ましくは１０〜２０当量の範囲内で用いるの
が好都合である。

得られる式（Ｖ）の化合物は次いで部分的に酸化される
。その際、式（Ｖ）の化合物におけるＲ１がＯＨである
場合には式（Ｖｌ）のアルデヒド化合物が生成し、一方
、式（Ｖ）のアルデヒド化合物におけるＲ２がＣＨ，Ｏ
Ｈである場合には式（■）のアルデヒド化合物が生成す
る。この酸化反応に使用しうる酸化剤としては、例えば
、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの過
ヨウ素酸アルカリ塩等が挙げられ、これらは通常、式（
Ｖ）の化合物１モルに対して１〜３０当量、好ましくは
５〜１０当量の範囲内で用いられる。また、該酸化反応
は一般に０〜２０℃、好ましくは０〜５℃の範囲内の温
度で行なうことができる。

生成する式（Ｖｌ）又は（■）のアルデヒド化合物は、
それ自体既知の還元アルキル化法に従い、プロティンの
アミン基と反応させることができ、これによって本発明
が目的とする前記式（Ｉ）又は（ｎ）で示されるグリコ
サミノグリカン修飾プロティンを得ることができる。上
記還元アル弄ル化は、例えば、前述した如き液体媒体中
において式（Ｖｌ）又は（■）のアルデヒド化合物とプ
ロティンとを通常１５〜６０℃程度の温度で反応させ、
それと同時ｊコ又はその後に、例えばンアノ水素化ホウ
素すトリウム等の還元剤を用いて還元することにより行
なうことができる。

プロティンに導入しうるグリコサミノグリカンの量は、
プロティン及び／又はグリコサミノグリカンの種類やそ
れらの分子量、最終のグリコサミノグリカン修飾プロテ
ィンの用途等によって異なり一概に決定することができ
ないが、個々のプロティンに適するグリコサミノグリカ
ンの導入量は当業者であれば簡単な実験により容易に決
定しうるであろう。しかし一応の目安として一般的に言
えば、修飾すべきプロティンの重量を基準にして、グリ
コサミノグリカンは１〜９９．９重量％、好ましくは９
０〜９５重量％の範囲内の割合で導入するのが適当であ
ると考えられる。また、前記式（１）又は（Ｉ［）のグ
リコサミノグリカン修飾プロティンについて言えば、ｎ
は一般に１〜１００、好ましくは１−１０の範囲内（平
均値）にあることができる。

還元末端ラクトン化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部分
を酸化することにより、該末端糖部分を開裂させ、更に
ラクトンを形成せしめ、このラクトンとプロティンのア
ミノ基との反応を利用してグリコサミノグリカンで修飾
されたプロティンを製造する方法であり、その方法を反
応式で示せば次のとおりである。

反応式Ｂ ［１２ ↓（Ｅ）−（Ｎ晒 式（１）のグリコサミノ グリカン修飾プロティン 式中、 Ａはカリウム又はナトリウムを表わし、■、ｎ、罪、Ｒ
１及びＲ２はは前記のとおりである。

本方法において、先ず、式（ｍＶ）で示されるグリコサ
ミノグリカンを酸化して還元性末端糖部分を開裂させて
式（■）のカルボキシル化合物とする。

この酸化に使用しうる酸化剤としては、例えば、ヨウ素
、臭素等が挙げられ、これらは式（■）の化合物１モル
に対して通常２〜２０当量、好ましくは５〜１５当量の
割合で用いるのが適当である。

該酸化反応は通常、前述した如き液体媒体中において、
０〜４０°Ｃ１好ましくは１５〜２０℃の温度で行なう
ことができる。

生成する式（■）の化合物は次いで酸で処理することに
より式（ｆｆ）のラクトン化合物にすることができる。

ここで用いうる酸としては、強酸性陽イオン交換樹脂、
例えばダウエックス５０、アンバーライトｌＲ１２０等
を挙げることができる。

得られる式（Ｖｌｌ）のラクトン化合物は次いでプロテ
ィンと反応させることにより、前記式（ｎ［）で示され
るグリコサミノグリカン修飾プロティンを製造すること
ができる。式（１Ｎ）のラクトン化合物とプロティンと
の反応は、ラクトンをトリアルキルアミン塩として反応
させるか、プロティンとの混合液を水酸化ナトリウム水
溶液でｐＨを４〜７にした後、０〜７０℃、好ましくは
１５〜５０℃で反応させる。プロティンに導入しうるグ
リコサミノグリカンの量は、プロティン及び／又はグリ
コサミノグリカンの種類やそれらの分子量、最終のグリ
コサミノグリカン修飾プロティンの用途等によって異な
り、−概に決定することができないが、個々のプロティ
ンに適するグリコサミノグリカンの導入量は当業者であ
れば簡単な実験により容易に決定しうるであろう。しか
し一応の目安として、一般的に言えば、修飾すべきプロ
ティンの重量を基準にして、グリコサミノグリカンは１
〜９９゜９重量％、好ましくは９０〜９５重量％の範囲
内の割合で導入するのが適当であると考えられる。

また、前記式（Ｉｌｌ）のグリコサミノグリカン修飾プ
ロティンについて言えば、ｎは一般に１−１００、好ま
しくは１〜１０の範囲内（平均値）にあることができる
。

カルボキシル　活性化法 グリコサミノグリカンはごく少数の例外（例えばケラト
硫酸及びケラトポリ硫酸）を除いて下記式 で示されるウロン酸部分を含有している。

本方法は、このウロン酸部分のカルボキシル基を利用し
てこれをプロティンのアミノ基と結合させることにより
、グリコサミノグリカン修飾プロティンを製造する方法
である。

その方法は、先ずグリコサミノグリカンをペプチド化学
の分野でよく知られている方法に従ってグリコサミノグ
リカンのウロン酸部分のカルボキシル基を活性化し、次
いでプロティンと反応させることからなる。

グリコサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシル基
を活性化する方法としては、グリコサミノグリカンをＮ
−ヒドロキンスクシンイミド、ｐニトロフェノール、Ｎ
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ〜ヒドロキシピペ
リジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２．４．５−
トリクロロフェノール等と反応させ、該カルボキシル基
を活性エステル基に変える方法が挙げられる。

より具体的には、例えば、グリコサミノグリカンを適当
なアミン（例えば、トリ（ｎ−ブチル）アミン、トリエ
チルアミン、ピリジン等）との塩に変え、それを適当な
溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジメ
チルスルホキシド等）中において、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドと適当な縮合剤、例えばｌ−エチル−３−（
ジメチルアミノプロピル）−力ルポジイミド、ジシクロ
へキシルカルボジイミド等の存在下に０〜５０℃の温度
において反応させることによって、カルボキシル基が活
性化されたグリコ−サミノグリカンが得られる。

次いで、このカルボキシル基が活性化されたグリコサミ
ノグリカンをプロティンと反応させれば、本発明のグリ
コサミノグリカン修飾プロティンを得ることができる。

カルボキシル基活性化グリコサミノグリカンの水溶液ま
たはｐＨが６〜９の範囲のリン酸塩緩衝液にプロティン
の水溶液を加えて０〜５０℃、好ましくは１５〜２５℃
で３０分〜２０時間反応させる。プロティンに導入しう
るグリコサミノグリカンの量は、プロティン及び／又は
グリコサミノグリカンの種類やそれらの分子量、最終の
グリコサミノグリカン修飾プロティンの用途等によって
異なり、−概に決定することができないが、個々のプロ
ティンに適するグリコサミノグリカンの導入量は当業者
であれば簡単な実験により容易に決定しうるであろう。

しかし一応の目安として、般的に言えば、修飾すべきプ
ロティンの重量を基準にして、グリコサミノグリカンは
１〜９９．９重量％、好ましくは９０〜９５重量％の範
囲内の割合で導入するのが適当であると考えられる。

上記のカルボキシル基活性化法によれば、グリコサミノ
グリカンのウロン酸部分の少なくとも一部のカルボキシ
ル基がアミド結合を介してプロティンに結合しているグ
リコサミノグリカン修飾プロティンが得られる。

以上に述べた各種の方法で製造されるグリコサミノグリ
カン修飾プロティンの分離、精製は、例えば、反応液を
透析膜や限外濾過膜を用いて脱塩後、陰イオン交換体ま
たは陽イオン交換体で未反応のグリコサミノグリカンや
プロティンと分離精製することは容易である。又、分子
量の差を利用してゲル濾過法で分離精製することも容易
である。

更にプロティンによっては酵素阻害剤や基質及び抗体を
固定化した担体を用いて親和性の差で分離精製すること
も可能である。

本発明に従いプロティンを修飾するために使用しうるグ
リコサミノグリカンは特に制限されるものではなく、目
的とするグリコサミノグリカン修飾プロティンに要求さ
れる特性、修飾の目的等に応じて広い範囲から選ぶこと
ができるが、具体的には、例えば、ユロミン酸、ヒアル
ロン酸、コンドロイチン、フンドロイチン硫酸、ティク
ロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケ
ラト硫酸、ケラトポリ硫酸等或いはこれらの誘導体、例
えばフンドロイチンポリｉ［等から適当に選んで使用す
ることができる。しかして、例えば抗血栓剤、抗動脈硬
化剤等の如き目的のためには、コンドロイチン硫酸、コ
ンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デル
マタン硫酸などが適しており、また、抗リウマチ剤、抗
炎症剤等の如き目的に対しては、ヒアルロン酸、デルマ
タン硫酸、コンドロイチン、硫酸などが好適に使用され
る。上記グリコサミノグリカンはそれぞれ単独で使用す
ることができ、或いは２種以上を併用してもよい。

一方、かかるグリコサミノグリカンによって修飾しうる
プロティンもまた、特Ｃ；制限されるものではないが、
一般には、医薬等の分野で有用な、ヒトを含む各種動物
由来、微生物由来、植物由来或いは化学的に又は遺伝子
工学的に製造された生理活性蛋白質が包含される。具体
的には例えば、ザイトカイン［例：各種インターフェロ
ン（インターフェロン−α、インターフェロン−β、イ
ンク−フエロン−γ）、インターロイキン−２、インタ
ーロイキン−３など］、ホルモン［例：インスリン、成
長ホルモン放出因子（Ｇ　ＲＦ　）、カルシトニン、カ
ルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、心房性ナ
トリウム利尿ホルモン（Ａ　Ｎ　Ｐ　）、パップレシン
、フルチコトロビン放出因子（ＣＲＦ　）、ｔ＜ソアク
テイブインステイナルペブチド（ＶＩＰ）、セクレチン
、σ−メラニン細胞刺激ホルモン（σＭＳＨ）、副腎皮
質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシストキニン（ＣＣ
Ｋ）、グカゴン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状
腺ホルモン関連蛋白質（ＰＴＨｒＰ）、ソマトスタチン
、エンケファリンなど］、成長因子［例：成長ホルモン
（ＧＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ
−１１）、β神経成長因子（β−ＮＧＦ）、塩基性繊維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成
長因子−β（ＴＧＦ−β）、ユリスロポイエチン、顆粒
球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）、顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）、血小板由来成
長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）など
］、酵素（例：組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ）、エラスターゼ、スーパーオキンドジスムターゼ（
ＳＯＤ）、ビリルビンオキシダーゼ、カタラーゼ、ウリ
カーゼ、ウロキナーゼ、サーモライシン、トリプシン、
キモトリプシン、Ｖｓプロテアーゼ、ペプシン、パパイ
ン、ヒアルロニダーゼ、フンドロイチンＡＢＣリアーゼ
、アスパラギナーゼなど）、その他の蛋白質［例：ユビ
キチン、インスリン分泌活性化蛋白（ＩＡＰ）、血清胸
腺因子（ＳＴＦ）、ペプチド−Ｔ１アルブミン、グロブ
リン、トランスフェリン、リポ蛋白、リビドＡ誘導体、
家ダニ蛋白、トリブンンインヒビターなど］を挙げるこ
とができる。

本発明のグリコサミノグリカン修飾プロティンは、前記
式（１）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示されるように、
グリコサミノグリカン残基がプロティンに化学的に結合
しており、グリフサミノグリカンの含有量は、修飾され
たプロティンの重量を基準にして一般には１〜９９．９
］［’量％、好ましくは９０〜９５重量％の範囲内にあ
ることができる。

一般的にグリコサミノグリカン修飾プロティンはプロテ
ィンそれ自身の抗体とは反応しにくいばかりでなく、抗
体産生能もかなり低下する（後記実施例参照）。

また、体内に投与されたグリコサミノグリカン修飾プロ
ティンのプロティンのもつ活性が未修飾プロティンの活
性よりも持続性があることがら体内での安定性が増加す
る。

本発明のグリコサミノグリカン修飾プロティンを医薬品
として適用する際には、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、
カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤もしくは液剤等の剤型
に製剤して、または原末のまま経口投与することができ
、或いは注射剤として静脈内投与、動脈内投与、門脈内
投与、胸腹内投与、筋肉内投与、皮下投与または腫瘍的
投与してもよい。また、注射用の粉末にして用時調製し
てもよく、座剤等の剤型にして経腸または非経口投与し
てもよい。経口、経腸もしくは非経口投与に適した医薬
用の有機または無機の固体または液体の担体もしくは希
釈剤を本発明のグリコサミノグリカン修飾プロティンを
含む医薬品の肩製に用いることができる。さらＩこ、安
定財、湿潤剤、乳化剤や浸透圧を変えるための物質を配
合したり、配合剤の適切なＰＨを維持するための塩類を
補助薬剤として適宜用いることができる。本発明のグリ
コサミノグリカン修飾プロティンの臨床投与量は、対象
となる病態、症状、年齢等により異なるが、一般には、
経口投与では１日量１〜５０００＋ｇをそして注射剤と
しては１同量１〜１００ｍｇを連続投与または間欠投与
することが好ましい。

［実施例１ 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明は、かかる実施例に限定されものではない。

以下の実施例において、各酵素活性は以下の条件下によ
り測定した。

［酵素活性の単位測定〕 カタラーゼ活性：ｐＨ７，０及び２５℃の条件下で、過
酸化水素の濃度が１０．３から９．２ｍＭまでの範囲で
、１分間に１．０μＭの過酸化水素を分解する時、１ユ
ニツ）（Ｕ）とする。

リゾチーム活性：ｐＨ６，２及び３５℃の条件下で、１
分間に５４０ｎｍでグラム陽性細菌（ＭＬ−Ｃｅ　ｌ　
Ｉ　）懸濁液の吸光度が０．００１減少する酵素量を、
１ユニツトとする。

ヒアルロニダーゼ：ｐＨ６，２及び３７℃で、１分間に
ヒアルロン酸から１μＭの不飽和二糖を遊離する酵素量
を、１ユニツトとする。

エラスターゼ：ｐＨ８，５及び２５℃で、１分間に１μ
ＭのＮ−アセチル−トリーし一アラニン・メチルエステ
ルを加水分解する酵素量を、ｌユニットとする。

ウリカーゼ：ｐＨ８，５及び２５℃で、１分間に１μＭ
の尿酸を酸化するのに必要な酵素量を、１ユニツトとす
る。

ウロキナーゼ：ｐＨ７，５及び３７°Ｃで、プラスミノ
ーゲンに作用させ、σ−カゼインから生成する過塩素酸
に溶解する物を、△２７．で測定し、１分間に１．０変
化させる酵素量を、１ユニツトとする。

アスパラギナーゼ：ｐＨ８，６及び３７℃で、１分間に
Ｌ−アスパラギンから１．０μＭのアンモニアを生成す
る酵素量を、１ユニツトとする。

スーパーオキシドジスムターゼ：ｐＨ７，８及び２５℃
でキサンチンオキシダーゼの活性を５０％阻害するに必
要なＳＯＤの量を１ユニツトとする。

電気泳動ニアセチルセルロース膜（Ｓｅｐａｒａｘ　　
ＪＯＯＫＯＯＣＯ，、ＬＴＤ、）を使用し、０．１Ｍ−
ピリジン／ギ酸・緩衝液（ｐＨ３，０）、０　、５　ｍ
　Ａ　／　ｃ　ｍの条件で３０分泳動し、Ｃｏｏｍａｓ
ｓｉｅ　　Ｂｌｕｅ　及びＡｌｕｃｉａｎ　　Ｂｌｕｅ
で染色しｔ：。

ＨＰＬＣによる分子量測定：東ソ株式会社製造のカラム
Ｇ６０００ＰＷＸ２を使用し、０゜２Ｍ−食塩水溶液で
溶出し、ＨＡのキャリブレジョン　カーブからＨＡ−Ｃ
ａ　ｔ　ａ　１ａｓｅの分子量を測定する。

免疫学的活性：５ｗ１ｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ系雌のマウ
スを４匹を一群として、腹腔（ｉｌｔ　ｒａｐｅｒ　ｉ
　ｔｏｎｅａ　Ｉ、以下ｉ、ｐ。

と称す）に週に一回１２週間投与する。０゜０５Ｍ−リ
ン酸緩衝液ｐＨ７，０（以下ＰＢＳと称す）に溶解した
Ｃａｔａｌａｓｅ又はＨＡ−Ｃａ　ｔ　ａ　］　ａ　ｓ
ｅの蛋白として０゜ＩＩＴ１ｇ分を投与する。０．３．
６．９及び１２週目に、眼窩後の血管（ｒｅｔｏｒｏ。

ｒｂｉｔａｌ　　ｐｌｅｘｕｓ）から採血して一２０°
Ｃに保存する。それぞれの血清はＶｏｉｄｅｒら８″の
方法に従い、ＨＰＯＥＬＩＳＡ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓ
ｈ　　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いるｅｎｚｙｍｅ！１
ｎｋｅｄ　　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａ
ｙ法）で力価を測定した。

即ち、抗原を炭酸塩緩衝液（０，５Ｍ、ｐＨ９，５）Ｔ
　Ｉ　Ｏμｇ／ｍＱ、ｉ：：希釈し、１００．ｕ１２を
使用する。プレート（Ｎｕｎｃ　　１ｍｍｕｎｏ　　　
ＩＩ　　　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　　　ｐｌａｔｅｓ）
を４℃で一晩インキユベートし、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ
）入り生理食塩（０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗
浄する。

試験に用いられる血清をツイーン入りＰＢＳで希釈し、
１００μＱ加える。三つのコントロール即ち、抗原コン
トロール、抗血清コントロールおよび正常マウス血清フ
ントロールが作られたことになる。室温で１時間装置し
、各々に１００μａのＨＰＯ−結合山羊抗マウスイムノ
グロブリン（ＨＰＯ−ｃｏｎｊｕａｇａｔｅｄ　　ｇｏ
ａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅ　　ｉｍｍｕｎｏｇｌ。

ｂｕ　ｌ　ｉｎｓ、ＩｇＧ＋ＩＧＡ＋ＩｇＭ）を加えて
、室温で１時間３０分インキュベートする。１００μＱ
のオルソ−フェニレンジアミン基質（ｏ−ｐｈｅｎｙ　
＋、ｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　　　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）
を加えて１０分間インキュベートし、０．ＯｌｍＱの４
Ｎ−硫酸を加えて反応を中止する。

力価は光学密度がコントロールの血清を対称にして０．
０１となるところの希釈倍率で表す。

マウス虚血足浮腫に及ぼす影響二８週齢のｄｄｙ系雄の
マウスを保定器にて保定し、縫合糸（プレイン２号）で
右下欄後肢を一周縛り、一方を固定し、もう一方に５０
０ｇのオモリを吊して一定時間虚血を行う。突験は虚血
前及び６０分後の足鷺厚をノギスで測定する。

その後、足踵を切断し足踵重量を測定する。

投与群はコントロール群（生理食塩水を虚血直前に静注
）、Ｃａｔａｌａｓｅ及びＨＡＣａｔａｌａｓｅを虚血
開始前３０分虚血直前にＣａｔａｌａｓｅは１００００
単位／ｋｇそしてＨＡ−Ｃａｔａｌａｓｅは２０００単
位／ｋｇを投与する。−群５匹を用いる。

効果の判定は、コントロールに対する検体の（虚血足の
足踏厚（ｍｍ）一対照足の足社厚（ｍｍ））で表す。又
、コントロールに対する検体の（虚血足の足鷺重量（ｍ
ｍ）一対照足の足鍍重量（ｍｇ））で表す。

寅施例１．還元末端限定酸化法によるＧＡＧ修飾プロテ
ィンの調製 還元末端限定酸化グリコサミノグリカンの調製Ａ、還元
末端残基開環ヒアルロン酸の調製（ＲＨＡ　） ２０００ｍｇのヒアルロン酸（ＭＷｌｏｏＯＯ）を２０
０ｍＱの０．０５Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，３）に溶
解し、１８２ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え、室
温で５時間反応した。反応液を酢酸でｐ　Ｈ４，５にし
て、エタノールを加えて生じた沈殿を濾取した。沈殿を
２００ｍ０．の水に溶解し、１０００ａ１２の陽イオン
交換樹脂（ダウエックス５０（Ｈつ）を通過させた。通
過液と水洗浄液を合わせて酢酸ナトリウム飽和のエタノ
ールを加えて生じた沈殿を濾取した。

ロット番号　　１００ 収量＋１８００＋ｎｇ Ｂ、還元末端限定酸化ヒアルロン酸の調製（ＯＨＡ　’
） 上記Ａ、で調製されたＲ−ＨＡ１７００ｍｇを２５０＋
［ｌ（２の４０ｍＭイミダゾール塩酸塩（ｐＨ６，５）
に溶解し、０℃にして１３９．９６ｍｇの過ヨウ素酸ナ
トリウムを加えて１時間反応した。反応液にエタノール
を加えて生じた沈殿を濾取し、沈殿を水に溶解して再度
エタノールを加えて沈殿物を得た。この沈＆Ｉ（Ｃ）−
ＨＡ）は即座にリン酸塩緩衝液まｔ：は水に溶解して、
プロティンとの反応に用いた。

ロフト番号　　１１０−１ 収量：１６００ｍｇ Ｃ１他のグリコサミノグリカンの還元末端限定酸化物の
調製（０−ＧＡＧ） ヒアルロン酸（ＭＷ　Ｉ　ＯＯ万　ＨＡ　１００）、コ
ンドロイチン硫酸（牛気管軟骨山来Ｃ３（Ｔ）、鮫軟骨
由来Ｃ３（Ｓ）、鯨軟骨由来Ｃ５（Ｗ））、デルマタン
硫酸（豚皮由来ＤＳ）、ヘパリン（豚小腸由来Ｈｅｐ）
、ヘパラン硫酸（豚腎由来Ｈ３）を原料として、上記の
Ａ、に準じて表−１の条件で還元末端残基開環グリコサ
ミノグリカン（Ｒ−ＧＡＧ）を調製した。ひきつづき、
上記のＢ、の方法に準じて表−２の条件で還元末端限定
酸化グリコサミノグリカン（０−ＧＡＧ）を調製した。

表−１ 表−２ ［Ｉ］　　ヒアルロン酸修飾カタラーゼの調製１００ｍ
ｇのロフト番号］、１（１−２をｌｏｍｆｆの０゜００
５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、２．３ｍ
ｇのカタラーゼ（牛肝臓由来）を加えて室温で６時間反
応し、０−４ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加
えて室温で２００時間反応た。反応液を限外濾過装置（
分子量３０万カツトの膜）で定分子量の物を除去した。

その後、ＤＥＡＥイオン交換樹脂クロマトグラフィーで
精製して、透析膜で脱塩後、凍結乾燥した。

ロット番号　　　１２０−１ 収量：３０．１％ｇ カタラーゼ含量＝２，１％ ヒアルロン酸含量、９７．９％ 活性：未修飾カタラーゼの７４．５％ ［σ］。ニー７８゜０（Ｃ＝１、Ｈ，０）電気泳動：第
１図参照 アセチルセルロース膜（ＳＥＰＡＲＡＸＪＯＯＫＯＯＣ
Ｏ，ＬＴＤ） ０、］Ｍ　　ｆｏｒｍｉｃ　　ａｃｉｄ／ｐｙ　ｒ　ｉ
　ｄ　ｉ　ｎ　ｅ（ｐＨ３，０）０．５ｍＡ／ｃｍ、３
０ｍ１ｎ ［１］　　　ヒアルロン酸修飾カタラーゼの調製１００
ｍｇのロフト番号１１０−２とカタラーゼ（アスペルギ
ルスニガー）　ｌ　ｍｇを上記［Ｉ］に準じて調製した
。得られたヒアルロン酸修飾カタラーゼは以下の通りで
あった。

ロフト番号　　　１２（１２ 収量：２９．０ｍｇ カタラーゼ含量：０．９２％ ヒアルロン酸含量：９９．０８％ 活性：未修飾カタラーゼの８５．１％ ［ａ］　Ｄ＋−７８，８（Ｃ−１、Ｈ，Ｏ）電気泳動：
第２図参照 アセチルセルロース膜（ＳＥＰＡＲＡＸＪ　０ＯＫＯＯ
Ｃｏ、、ＬＴＤ） ０、ＩＭ　　ｆｏｒｍｉｃ　　ａｃｉｄ／ｐｙ　ｒ　ｉ
　ｄ　ｉ　ｎ　ｅ（ｐｌ（３，０）０．５ｒｎＡ／ｃｍ
、３（１ｍｉ　ｎ ［Ｉ１１］　　　ヒアルロン酸修飾ウリカーゼの調製１
００＋ｎｇのロット番号１１（１２をＩＯｍｎのリン酸
塩緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、ウリカーゼ（キャン
シダ由来）２．５ｍｇを加えて室温で１０時間反応し、
０．４＋ｎｇの水素化ンアノホウ素すトリウムを加えて
更に、２００時間反応た。反応液にエタノールを加えて
生じた沈殿を濾取し、沈殿を水に溶解して、ＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィで精製した。得られたヒアル
ロン酸修飾ウリカーゼは以下の通りであった。

ロット番号　　　１２０−３ 収量８２３−５ｆｆｉｇ ウリカーゼ含量：１．８％ ヒアルロン酸含量：９８．２％ 活性：未修飾ウリカーゼの７３．４％ ［σ］　ｐニー７７．９（Ｃ−１、Ｈ２Ｏ）電気泳動：
第３図参照 アセチルセルロース膜（ＳＥＰＡＲＡＸＪＯＯＫＯＯＣ
ｏ、、ＬＴＤ） ０、ＩＭ　　ｆｏｒｍｉｃ　　ａｃｉｄ／ｐｙ　ｒ　ｉ
　ｄ　ｉ　ｎ　ｅ（ｐＨ３，０）０．５ｍＡ／ｃｍ、３
０ｍ　ｉ　ｎ ［ＩＶ］　　ヒアルロン酸修飾アスパラギナーゼの調製 １００ｍｇのロフト番号１３０−２を１０ｍＱの０゜０
５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、Ｌアスパ
ラギナーゼ（大腸菌由来）５ｍｇを加えて室温で１．０
時間反応し、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを
加えて２００時間反応た。反応液にエタノールを加えて
生じた沈殿を濾取し、沈殿を水に溶解して、ＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィで精製しＩ；。得られたヒア
ルロン酸修飾アスパラギナーゼは以下の通りであった。

ロット番号　　　１２０−４ アスパラギナーゼ含量＝４．８％ ヒアルロン酸含量：９５．２％ 活性：未修飾アスパラギナーゼの８４．６％ ［α］　ｐニー７６．９（Ｃ−１、Ｈ２Ｏ）電気泳動：
第４図参照 アセチルセルロース膜（ＳＥＰＡＲＡＸＪＯＯＫＯＯＣ
ｏ、、ＬＴＤ） ０．０６９Ｍ　　ベロナール緩衝液（ｐＨ８，６） ０．５ｍＡ／ｃｍ、４０ｍ　ｉ　ｎ ［Ｖ］　　その他のグリコサミノグリカン修飾プロティ
ンの調製 ロフト番号１１１−１１６でカタラーゼ（牛肝臓由来）
、スーパーオキシドジスムターゼ（牛赤血球由来）、ヒ
アルロニダーゼ（牛皐丸由来）、ウロキナーゼ（人腎細
胞由来）及びリゾチーム（卵白由来）を表−３に示した
条件で、上記の［１］の方法に準じて調製した。得られ
た生成物の分析値を表−４に示した。

代表でロット番号１２１−１について電気泳動を示した
（第５図参照）。条件は［Ｉ］　と同じである。

表−３ 表−４ ［ＶＩ］　　免疫学的活性 アスペルギルス・ニガー由来のカタラーゼ及び該カタラ
ーゼのヒアルロン酸で修飾した氷晶（ロット番号１２０
−２）をそれぞれ感作抗原として、抗体を作成し、それ
ぞれを惹起物質として抗原性を調べた。抗体作成は一週
に一度、腹腔内に１２週間に渡り投与して作成した。抗
原性は抗体の希釈倍率で表した。

表−５ ＨＡ−Ｃａｔａｌａｓｅ（Ｏット番’Ｊ１２Ｏ−１）Ｈ
Ａ−Ｃａｔａｌａｓｅは抗原性及び免疫原性の低下がみ
られｔ：。

［■〕　マウス虚血足浮腫に及ぼす影響（後肢虚血再流
による・０２産生試験） ＨＡ−カタラーゼはロット番号１２０−１で製造したＨ
Ａ−カタラーゼ１０ｍｇを５．２ｍ１２の生理食塩水に
溶解し、０．２２μｍの膜（日本ミリボア工業株式会社
製マイレクスＧＶ）で濾過し、１ｍ１２ずつアンプルに
分注して注射用の製剤としたものを使用し　ブニ　。

該製剤は、アンプル当り６００ユニツトでおる。

次の検体について実験を行つｔ；。

Ｃａｔａｌａｓｅ（Ｂｏｖｉｎｅ　　１ｉｖｅｒ）（４
０以上が有効とみられている） （６０以上が有効とみられている） 以上の結果から虚血３０分前投与では未修飾Ｃａｔａｌ
ａｓｅは効果を示さないのに比較して、ＨＡ−Ｃａｔａ
ｌａ　Ｓ　ｅは明らかに効果を示した。このことは、Ｈ
Ａ−Ｃａｔａｌａｓｅが血中で安定であり、持続性を持
−ってし・るためと判断できた。

［■］　コンドロイチン硫酸修飾エルカトニンの調製 ロツ（番号１１１で調製したＯ−０−Ｃ３（Ｔ）１００
をｌＯｍＱの０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ８。

０）に溶解し、ｉｏ＋ｎｇのユルカトニンを加えて２０
時間反応した。反応液を限外濾過袋ｆ（分子量１０００
０カツトのｆｉりで未反応のエルカｌコンを除去し、凍
結乾燥した。得られたフンドロイチン硫厳修飾エルカト
ニン（ロット番号１２７）は以下の通りであった。

収量：９８．２ｍｇ エルカトニン含量＋５．５０％ コンドロイチン’ｆｉｊｔ＠含量：９４．５０％［ａ］
　、ニー２１．９（Ｃ＝　ｌ、Ｈ，Ｏ）［１Ｎ］　　　
コンドロイチンｉｍｐｓエルカトニン（ロフト番号１２
７）の活性及び血中での安定性１）ニルカド・ニン及び
フンドロイチンＶｊ＋酸修飾エルカトニン（ロフト番号
１２７）をユルカトニン相当量で（５μｇ／にｇ）をラ
ントの尾静脈から投与して、この時の血中カル／ラム低
下量の最大値を１００として、血中カルンウム低Ｆｉが
５０となる時間を測定した。この結果を示すと、エルカ
トニン　　　　　　　４８時間 ロット番号　　　　　　　　７２時間 であった。以上からロフト番号１２７はゆっくりと効果
を発現するものと判断できた。

２）　　　１１−”Ｃ］　アラ＝　’−・（５０ｍＣｉ
／ｍｍｏＱ）を原料として調製したユルカ）ニン（２７
，６μＣｉ／ｌＩｇ）とこねをロット番号１１１で調製
した０−Ｃ３（Ｔ）で上記の［Ｖｌ］　に準じて調製し
たコンドロイチン′ｆｋ酸修飾エルカトニン（１，，５
２μＣｉ／ｍｇ）をエルカトニン相当５μｇ／Ｋｇを家
兎に静脈投与して、２分後の血中濃度を１００として半
減期を求めた。その結果は、 ゴルカ］・ニン　　　　　　　　　　１０分：Ｉ７　ト
ｏ　イチン硫酸エルカトニン　５（１ヂ施例２．カルボ
キシル基活性化法によるＧＡＧ修飾プロティンの調製 カルボキシル基活性グリコザミノグリカンの調製 Ａ、カルボキシル基活性化ヒアルロン酸の調製ａ−２８
００ｍｇのヒアルロンｌｌｉ（ＭＷ１００万）のトリー
ｎ−ブチルアミン塩を２８０ｍ１２のジメチルポルムア
ミドに溶解し、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ−エチ
ル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボ）゛イミド
）０　、１．７　ｍ（！及びＮ−ヒドロキシスクシニミ
ド０．２３ｇを加えて室温で２０時間反応した。反応液
に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えて生じた沈殿を
濾取した。

Ｎ　Ｓ−ＨＡ　　ロット番号　２００ 収量：２５００町 ｂ　、　　２８００＋ｇ）ｔ：　フルｏ　ン＃（ＭＷ　
Ｉ　ＯＯ万）のトリーｎ−ブチルアミン塩を２８０ｖａ
Ｑのジメチルフォルムアミドに溶解し２、ＷＳＣＯ，ｌ
’７−及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．２７
ｇを加えて室温で２０時間反応した。反応液を上記ａと
同様にして処理した。

ＮＢ−ＨＡ　　ロット番号　２００１１収量：２６８０
＋ｎｇ ｃ−２８０（Ｉｇのヒアルロン酸のトリーローブチルア
ミン塩を２８０１のジメチルフォルムアミドに溶解し、
ＷＳＣ０，１７ｍ０及びｐ−ニトロフェノール０．２８
ｇを加えて室温で２０時間反応した。

反応液を上記ａと同様に処理した。

ＰＮ−ＨＡ　　ロット番号　２００−２収量：２７７５
ｍｇ Ｂ、カルボキシル基活性化グリコサミノグリカンの調製 コンドロイチン硫酸（牛気管軟骨由米Ｃ３（Ｔ）、鮫軟
骨由米Ｃ５（Ｓ）、鯨軟骨由来Ｃ５（Ｗ）、ヘパリン（
豚小腸由米Ｈｅｐ）、−・バラン硫酸（豚腎由来Ｈ８）
、デルマタン硫酸（豚皮由来ＤＳ））を表−６の条件で
上記Ａに準じて調製した。

表−６ ［１］　　じアルロン酸修飾カタラーゼの調製１１００
ｒｎ／１７）ｏット番号２００を水２０ｖｎ（ｌｉこ溶
解し、カタラーゼ（ノセ肝臓由来）２．５ｍｇを加えて
ｐＨ７，０で室温で２０時間反応しｔユ。反応液を００
０に冷却し、Ｏｉ、Ｎ水酸化ナトリウムでｐ１］１０．
０にしてすぐに酢酸で中和して３０７ｉカツトの限外濾
過の装置で処理し、未反応のカタラーゼを除去した。得
られたカルボキシル基活性化ヒアルロン酸修飾カタラー
ゼは以下の通りであつｔ−１、ロフト番号　　２１０ 収量−４４ｍｇ カタラーゼ含ｊｉ：２．３１！、。

ヒアルロン酸含量：９７．７％ 活性二未修飾力タラ〜ゼの８４．３％ ［σ）。・−７７，９（Ｃ＝Ｉ、Ｈ，Ｏ）［Ｉ［］　　
ロンドロイチン硫酸修飾スーパーオキンドジスムターゼ
の調製 １１００１Ｔ１のロフト番号２０１とスーパーオキント
′ジスムターゼ（牛赤血球由来）２．５Ｂを上記［１］
の方法に準じて反応した。得られたカルボキシル基活性
化コニ・ドロイテン硫酸修飾スーパーオキンドジスムタ
ーゼは以下の通りであった。

ロット番号　　２１１ 収量８４１．２ｍｇ スーパーオキシドジスムターゼ含量：２．０％コンドロ
イチン硫酸含量：９８．０％ 活性：未修飾スーパーオキシドジスムターゼの８１．４
％ ［ｔｒ］　Ｄニー７８．０（ｃ−１，Ｈ，Ｏ）実施例３
．還元末端ラクトン法によるＧＡＧ修飾プロティンの調
製 還元末端ラクトンＧＡＧの調製 Ａ、還元末端ラクトンヒアルロン酸の調製５００ｍｇの
ヒアルロン酸（ＭＷｌｏｏＯＯ）を５０１の水Ｉこ溶解
し、これＩこ５＋ｅＱの０−１Ｍヨウ素のメタノール溶
液を加えて室温で６時間反応した。

その後、反応液に０．１Ｎ水酸化カリウムを約５ｍＱ加
えて遊離のヨウ素の色を消失させ、この溶液に酢酸カリ
ウム飽和エタノールを加えて生じた沈殿を濾取した。沈
殿を５０ｄの水に溶解し、５０ｍＱの強酸性イオン交換
樹脂（ダウエックス５０（Ｈつ）を５℃で２０時間接触
させ、得られた濾液にトリーｎ−ブチルアミンを加えて
中和後、エーテルで過剰のアミンを除去してから凍結乾
燥した。

得られた白色粉末が還元末端ラクトンビアルロン酸のト
リーｎ−ブチルアミンである。

ロフト番号　　３１０ 収量：４１０ｍｇ ソモジー不ルソン法での還元糖の有無：無［Ｉ］　　ヒ
アルロン酸修飾ペプチド（Ｈ−ＡｒｇＧ　ｌ　３’　　
Ａ　Ｓ　ｌ）　　Ｖ　ａ　ｌ　　　ＮＨｘ　　ＲＧＤＶ
）の調製 ６０ｍｇのロット番号３１０を２０ｒｎＱ、のジメチル
フォルムアミドに溶解し、２　、５　ｍｇのＲＧＤＶの
ジメチルフォルムアミド溶液を加えて６０°Ｃで２時間
反応した。反応液に２５％の酢酸ナトリウム水溶液を１
０ｍｆｆ加えて室温で３０分静置し、その後、エタノー
ルを加えて生じた沈殿を濾取した。

沈殿を水に溶解して分子量５０００カツトの膜の限外濾
過装置で未反応のＲＧＤＶを除去した後、凍結乾燥した
。得られたヒアルロン酸修飾ＲＧＤＶは以下の通りであ
った。

ロフト番号＝３２０ 収量：４０．２ｍｇ ＲＧＤＶ含量：３．３％ ヒアルロン際含量：９６．７％ 比較例：特開昭６２−２５５４３５号によるコンドロイ
チン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼと本発明と
の比較例 １）　水溶性カルボジイミドＪこよるコンドロイチン硫
酸のエステルの生成 コンドロイチン１ｔｌｌ（牛気管軟骨由来ｃｓ（Ｔ））
２５＋ａｇを水１０ｍＱに溶解し、Ｏ，ｌＮ−塩酸でｐ
Ｈを５．０とした後、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣｌ
−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩）を各０．０４３６．０．１４５．０．４３
６．１，４５．４．３６、■４．５及び４３゜ＧＩＩＩ
ｇずつ加えて室温で６時間反応した。反応液を０．０１
５Ｍ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析し、
セルロースアセテート膜で（０，１Ｍ−ピリジン／ギ酸
緩衝液ｐＨ３，０，３０分、０，５ｒｎＡ／ｃｍ）の条
件で電気泳動を行った。更に、ＷＳＣを４３．６ｍｇを
加えて反応したものを０．１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶
液を加えて１時間処理したものも電気泳動した。その結
果、明らかにＣ５（Ｔ）自身がエステル化されているの
が判った（第６図参照）。

２）　水溶性カルボジイミドｔこよるスーパーオキシド
ジスムターゼそれ自身の重合とコンドロイチン硫酸修飾
ＳＯＤの重合体の証明 ５ｍｇのＳＯＤを１０ｍ（＋の水に溶解し、Ｏ、１，Ｎ
塩酸でｐＨを５．０とした後、ＷＳＣを２　、５　ｍｇ
加えて室温で６時間反応した。、０．０１５Ｍ−リン酸
塩緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析した。この水溶液
をロフト番号Ｂとする。

また、特開昭６２−２５５４３５に従い、Ｃ５（Ｔ）２
５Ｂを水１０ｍｆｆ＋＝溶解し、ｐＨを５０とした後、
ＳＯＤ　　５ｍｇとＷＳＣ１２，５ｍｇを加えて室温で
６時間反応した。反応液を上記の１）に準じて処理した
。この水溶液をロフト番号Ｃとする。

３）　ゲルクロマトグラフによる溶出バタンの違い セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社　スエデンＸ１
．２Ｘ１００ｃｍ）のカラムで０．０５Ｍ−リン酸塩の
０．３Ｍ−食塩溶液（ｐＨ７，０）を展開溶媒として、
各チューブに３−４５ｒｎＱずつ溶出し、ケルクロマト
を行った。その結果を第７図に示した。第７図のＡは使
用したＣ３（Ｔ）とＳＯＤの混合液を、Ｂはロット番号
Ｂを、Ｃはロット番号ＣをそしてＤは本発明の実施例２
のロフト番号１．２１−２を示した。以上の結果から、
分子の中にカルボキシル基とアミノ甚を同時に所有して
いる蛋白（この場合は５ＯＤ）とカルボキシル基を持つ
フンドロイチン硫酸をＷＳＣで反応すると、複雑な重合
体が生成されることが証明される。

４）　また、ＳＯＤの含量が同じ程度であっても、活性
はＷＳＣで修飾すると本発明より低い数値を示した。

ＷＳＣ法（ロット番号Ｂ）：未修飾ＳＯＤの４４゜４％ 本発明（ロフト番号１２１−２）：未修飾ＳＯＤの６９
゜９％

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は実施例で得られるグリコサミノグリカン修
飾プロティン及びグリコサミノグリカンとプロティンと
の混合物の電気泳動図であり、第６図は比較例における
フンドロイチン硫酸エステルの電気泳動図であり、 第７図はゲルクロマトグラフである。 第１図 第２図 Ａニアリューシアン ブルー染色 Ｂ：クマシー ブルー染色 ］、：０−ＨＡとカタラーゼの混合 ２　ヒアルロン酸修飾カタラーゼ Ａ　アリューシアン′ ブルー染色 Ｂ：クマシー ブルー染色 １　：　０−ＨＡとカタラーゼの混合 ２、ヒアルロン酸蜂飾カタラーゼ 第３図 Ａニアリューシアン ブルー染色 Ｂ：クマシー ブルー染色 １：Ｑ−ＨＡとウリカーゼの混合 ２：ヒアルロン酸修飾ウリカーゼ 第５図 Ａ：トルイジン ブルー染色 Ｂ；クマシー ブルー染色 １　：　０−Ｃ５（Ｔ）とスーパーオキシドジスムター
ゼ混合２：コンドロイチン硫酸修飾スーツ（−オコシド
ジスムターゼ（ロット番号　１２１−２） 第４図 Ａニアリューシアン ブルー染色 Ｂ：ボンソー３Ｒ 染色 １：０−ＨＡとアスパラギナーゼの混合２：ヒアルロン
酸修飾アスパラギナーゼ第６図 ０．０４３６ｍｇ ０、　１４５ｍｇ ｏ。４３６ｍｇ １゜４５ｍｇ ４．３６ｒｎｇ １４．５ｍｇ ４３．６ｍｇ ７を０　、１．　Ｎ Ｃ３（Ｔ） ＳＣ ＳＣ ＳＣ ＳＣ ＳＣ ＳＣ ＳＣ ＳＣ 水酸化処理したもの 手続補正書印発） 平成３年５月

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部分を還元及
   び部分酸化することにより形成されるアルデヒド基にア
   ミノ結合を介してプロテインが結合していることを特徴
   とするグリコサミノグリカン修飾プロテイン。 ２、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、 「Ｐ」はプロテインからｎ個のアミノ基を除いたプロテ
   イン残基を表わし、 「ＧＡＧ」はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部
   分を除いたグリコサミノグリカン残基を表わす、 で示されるグリコサミノグリカン修飾プロテイン。 ３、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、 「Ｐ」はプロテインからｎ個のアミノ基を除いたプロテ
   イン残基を表わし、 「ＧＡＧ」はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部
   分を除いたグリコサミノグリカン残基を表わす、 で示されるグリコサミノグリカン修飾プロテイン。 ４、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、 「Ｐ」はプロテインからｎ個のアミノ基を除いたプロテ
   イン残基を表わし、 「ＧＡＧ」はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部
   分を除いたグリコサミノグリカン残基を表わす、 で示されるグリコサミノグリカン修飾プロテイン。 ５、グリコサミノグリカンのウロン酸部分の少なくとも
   一部のカルボキシル基がアミド結合を介してプロテイン
   に結合していることを特徴とするグリコサミノグリカン
   修飾プロテイン。 ６、還元末端限定酸化法、カルボキシル基活性化法又は
   還元末端ラクトン法により活性化されたグリコサミノグ
   リカンをプロテインと反応せしめることを特徴とするグ
   リコサミノグリカン修飾プロテインの製造方法。