DE69025920T2 - Glykosaminoglykan-modifiertes Protein, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, die es enthalten - Google Patents

Glykosaminoglykan-modifiertes Protein, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, die es enthalten

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Description

    Bereich der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Protein, das mit einem Glycosaminoglycan modifiziert ist. Genauer betrifft sie ein Protein, das mit einem Glycosaminoglycan modifiziert und erhalten wird durch Reaktion eines Glycosaminoglycans, das mit einem spezifischen Aktivator aktiviert ist, mit einem Protein.
    • Hintergrund der Erfindung
  • In der letzten Zeit wurden regelmäßig Anstrengungen unternommen, Enzyme und physiologisch aktive Proteine als Medikamente zur Behandlung verschiedener Krankheiten einschließ Krebs, Entzündungen und erblicher Enzymdefizienz zur Anwendung zu bringen.
  • Viele dieser Enzyme und physiologisch aktiven Proteine sind jedoch heterogen zu lebenden Organismen. Daher würde die Verabreichung dieser Verbindungen als solcher in einem Organismus ein Problem bezüglich der Immunisierung hervorrufen oder die in vivo Stabilität herabsetzen. Wenn eine solche Verbindung in ein Medikament formuliert werden soll, ist es daher notwendig, eine anaphylaktische Reaktion abzumildern und den verlängerten medikamentösen Effekt zu verbessern.
  • Ferner wurden Anstrengungen unternommen, diese Proteine in großen Mengen mittels gentechnologischer Verfahren herzustellen. Durch gentechnologische Verfahren hergestellte Proteine sind jedoch mit dem Problem behaftet, daß es ihnen an einer Zuckerkette fehlt, wodurch die Stabilität in vivo ernsthaft beeinträchtigt wird
  • Dementsprechend ist vorgeschlagen worden, ein Enzym oder ein physiologisch aktives Protein mit verschiedenen synthetischen Polymeren oder Polysacchariden zu modifizieren, wodurch deren Stabilität pharmakologisch verbessert wird. Beispiele für die dafür verwendeten synthetischen Polymere schließen Poly-L-asparaginsäure (M. Okada, A. Matsushima, A. Katsuhata, T. Aoyama, T. Ando und Y. Inada: Int. Archs Allergy Appl. Immun. 76, 79 - 81 (1965)) und deren Derivate, Poly-D- oder -L-Lysin, D- Olutaminsäure/D-Lysin-Copolymer (F. T Liu und D. H. Katz: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1430 - 1434 (1979)), Polyvinylalkoholpyran-Copolymer; Polyethylenglykol und dessen Derivate und Styrol/Maleinsäure-Copolymer (H. Maeda, M. Ueda, T. Morinaga und T. Matsumote: J. Med. Phem., 28, 455 - 461 (1985)) ein. Beispiele für die Polysaccharide schließen Agarose, Carboxymethylcellulose, Dextran (T. P. King, L. Kochoumian, K. Ishizaka, L. Kichtenstein, P. S. Norman: Arch. Biochem. Biophys., 169, 464 - 473 (1975)), Pullulan (M. Usui und T. Matsuhashi: J. Immunol., 122, 1266 - 1272 (1979) und N. Matsuhashi: Genkansa no Jikken Dobutsu Moderu (Experimental Animal Model for Hyposensitization), herausgegeben von S. Kobayashi et al., Genkansa Ryoho no Kiso to Rinsho (Bases and Clinical Application of Hyposensitization Therapy), 4 - 11, Chugai Igakusho (1982)) und Lipopolysaccharide ein.
  • Andererseits wird in US 4 485 754 ein stabilisiertes Protein vorgeschlagen, das erhalten wird durch Reaktion eines Proteins wie Superoxiddismutase oder Insulin mit Chondroitinsulfat in Gegenwart von 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Das so erhaltene Protein liegt jedoch in Form eines komplizierten Polymers vor, einschließlich eines Polymers des Proteins an sich, da mehrere Carboxyl-Gruppe in Aspartam- oder Glutaminsäure, die in dem Protein enthalten sind, durch 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid aktiviert werden. Daher sollte dieses Produkt unter dem Gesichtspunkt des pharmakologischen Effekts der unmodifizierten Superoxiddismutase oder des unmodifizierten Insulins als Monomer weiter verbessert werden.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins, das in vivo hochstabil ist und den inhärenten physiologischen Effekt des Start-Proteins für eine verlängerte Zeitdauer ohne Ausbildung eines Polymers oder einer komplizierten Struktur bewirken kann.
  • Der obige erfindungsgemäße Gegenstand kann erreicht werden mit einem Glycosaminoglycan-modifizierten Protein, das erhalten wird durch Reaktion eines Glycosaminoglycans, das durch die reduzierende Endgruppen-Lactonisierungsmethode aktiviert wurde, mit einem Protein.
  • Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführung wird ein Glycosaminoglycanmodifiziertes Protein der folgenden Formel
  • worin P einen Protein-Rest abzüglich n Amino-Gruppen an dem Protein darstellt, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 100 und GAG repräsentiert einen Glycosaminoglycan-Rest abzüglich einer reduzierenden terminalen Zuckergruppe aus dem Glycosaminoglycan.
  • In Figur 1 steht Spur 1 für das elektrophoretische Muster von SOD aus roten Rinderblutzellen, Spur 2 steht für das Muster von SOD aus roten Hundeblutzellen, Spur 3 steht für das Muster aus HA-modifizierten SOD aus roten Hundeblutzellen, und Spur 4 steht für HA-modifiziertes SOD aus roten Rinderblutzellen.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Das erfindungsgemäße Glycosaminoglycan-modifizierte Protein kann beispielsweise hergestellt werden durch Reaktion eines Glycosaminoglycans, das durch die reduzierende Endgruppen-Lactonisierungsmethode aktiviert wurde, mit einem Protein.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins wird im folgenden genauer beschrieben.
    • Reduzierende Endgruppen-Lactonisierungsmethode
  • Diese Methode umfaßt die partielle Oxidation der reduzierenden terminalen Zuckergruppe eines Glycosaminoglycans, wodurch die terminale Zuckergruppe gespalten wird, gefolgt von der Bildung eines Lactons. Anschließend wird ein mit dem Glycosaminoglycan modifiziertes Protein hergestellt durch Reaktion des Lactons mit einer Amino-Gruppe des Protein. Das Reaktionsschema dieses Verfahrens ist wie folgt: Reaktionsschema B Oxidation Säure
  • In dem obigen Reaktionsschema ist R¹ = OH R² CH&sub2;OH, A repräsentiert ein Kalium- oder Natriumatom, und P, n, GAG sind wie oben definiert.
  • In diesem Verfahren wird das Glycosaminoglycan der Formel (II) zuerst oxidiert, wodurch die reduzierende terminale Zuckergruppe gespalten wird. Dadurch wird eine Carboxyl-Verbindung der Formel (III) erhalten. Beispiele für das in diesem Oxidationsschritt zu verwendende Oxidationsmittel schließen Jod und Brom ein. Das Oxidationsmittel kann üblicherweise in einer Menge von 2 bis 20 Äquivalenten, bevorzugterweise von 5 bis 15 Äquivalenten, pro Mol der Verbindung der Formel (II) verwendet werden. Die Oxidationsreaktion kann in einem flüssigen Medium, ausgewählt aus beispielsweise einer Pufferlösung, wie eine Boratpufferlösung (pH 8,3), eine Phosphatpufferlösung (pH 8,6) oder eine Mischung einer solchen Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Acetonitril oder Dioxan, Methanol, bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC, bevorzugterweise von 15 bis 20ºC durchgeführt werden. Nach der Oxidationsreaktion wird Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid zur Zersetzung des restlichen Oxidationsmittels zu der Reaktionsmischung hinzugegeben.
  • Die so erhaltene, die Verbindung der Formel (III) enthaltende Lösung wird auf eine Kolonne aufgebracht, die mit 200 ml stark saurem Kationenaustauscherharz wie beispielsweise Dowex 50 und Amberlite IR120 bepackt ist und wird innerhalb einer Stunde durch die Kolonne hindurchlaufen gelassen, wobei die durch durchgelaufene Fraktion aufgefangen wird. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, die Wasserfraktion mit der oben erhaltenen durchgelaufenen Fraktion vereinigt und anschließend die vereinigte Fraktion über Nacht bei 4ºC unter Bildung der Lacton-Verbindung der Formel (IV) stehen gelassen.
  • Die so erhaltene Lacton-Verbindung der Formel (IV) wird dann mit einem Protein unter Erhalt des Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins der Formel (I) umgesetzt. Die Reaktion zwischen der Lacton-Verbindung der Formel (IV) und dem Protein kann durchgeführt werden durch Reaktion des Lactons in Form eines Trialkylamins oder durch Einstellung des pH-Wertes der Mischung des Lactons und des Proteins auf 4 bis 7 mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid, gefolgt von der Durchführung der Reaktion bei 0 bis 70ºC, bevorzugterweise 15 bis 50ºC.
  • Bezüglich des Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins mit der Formel (I) kann n üblicherweise im Bereich ganzer Zahlen von 1 bis 100, bevorzugterweise von 1 bis 10 im Durchschnitt, liegen.
  • Das Glycosaminoglycan-modifizierte Protein, das nach dem oben genannten Verfahren hergestellt wurde, kann mittels konventioneller Verfabren abgetrennt und gereinigt werden. Beispielsweise wird die Reaktionsmischung mittels einer Dialysemembran oder einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt. Anschließend wird das gewünschte Produkt von dem nichtreagierten Glycosaminoglycan und Protein abgetrennt und unter Verwendung eines Anionenaustauschers oder eines Kationenaustauschers gereinigt. Alternativ dazu kann das Produkt mittels Gelfiltration abgetrennt und gereinigt werden unter Ausnutzung der Molekulargewichtsdifferenz. Im Falle einiger Proteine ist es darüberhinaus möglich, das gewünschte Produkt mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Trägers, auf dem ein Enzyminhibitor, ein Substrat oder ein Antikörper immobilisiert ist, abzutrennen und zu reinigen.
  • Das erfindungsgemäß zur Modifizierung eines Proteins verwendete Glycosaminoglycan kann über einen weiten Bereich ausgewählt werden in Abhängigkeit von den gewünschten Charakteristika des gewünschten Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins und von dem Zweck der Modifizierung, ohne besondere Beschränkung. Im besonderen kann es ausgewählt werden aus Coromsäure (coromic acid), Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat, Teichuronsäure, Dermatansulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratosulfat, Keratopolysulfat und deren Derivaten wie beispielsweise Chondroitinpolysulfat. Wenn das gewünschte Produkt als Antithrombosemittel und Antiarteriosklerosemittel verwendet wird, so sind Chondroitinsulfat, Chondroitinpolysulfat, Heparin, Heparansulfat und Dermatansulfat bevorzugte Glycosaminoglycane. Andererseits sind Hyaluronsäure, Dermatansulfat und Chondroitinsulfat geeignet zur Herstellung eines Antirheumamittels und eines Antientzündungsmittels. Diese Glycosaminoglycane können alleine oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden.
  • Das mit dem Glycosaminoglycan zu modifizierende Protein ist nicht sonderlich eingeschränkt. Als Proteine geeignet sind physiologisch aktive Proteine, die aus verschiedenen Tieren einschließlich Menschen stammen, aus Mikroorganismen und Pflanzen sowie solche, die durch chemische Synthese oder unter Verwendung von gentechnologischen Verfahren hergestellt werden. Spezifische Beispiele für die Proteine schließen Cytokine (beispielsweise verschiedene Interferone wie Interferon-α, Interferon-β und Interferon-γ, Interleukin-2, Interleukin-3), Hormone [beispielsweise Insulin, Wachstumshormon-freisetzender Faktor (GRF), Calcitonin, Calcitoningenverbindendes Peptid (CGRP), atrialnatriuretisches Hormon (ANP), Vasopressin, Corticotropin-freisetzender Faktor (CRF) , vasoaktives Intestinalpeptid (VIP), Secretin, α-Melanocyten-simulierendes Hormon (α- MSH), adrenocortikotropisches Hormon (ACTH), Cholecystokinin (CCK), Glucagon, parathyroides Hormon (PTH), parathyroides Hormon-verbindendes Protein (PTHrP), Somatostatin, Enkephalin], Wachstumsfaktoren [beispielsweise Wachstumshormon (GH), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF-I, IGF-II), β-Nervenwachstumsfaktor (β-NGF), basischer Fibroblasten- Wachstumsfaktor (bFGF), transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Erythropoietin, Granulocytenkolonien simulierender Faktor (G-CSF), Granulocytermacrophagen-Kolonien stimulierender Faktor (GM-CSF), Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), epidermischer Wachstumsfaktor (EGF)], Enzyme [beispielsweise Gewebeplasminogen-Aktivator (TPA), Elastase, Superoxiddismutase (SOD), Bilirubinoxidase, Catalase, Uricase, Urokinase, Thermolysin, Trypsin, Chymotripsin, VS-Protease, Pepsin, Papain, Hyaluronidase, Chondroitin ABC-lyase, Asparaginase] und andere Proteine [beispielsweise Ubiquitin, Insulin-sekretionsaktivierendes Protein (IAP), Serum-Thymusfaktor (STF), Peptid-T, Albumin, Globulin, Transferrin, Lipoprotein, Lipid-A-Derivat, Ornithonyssusprotein, Trypsin- Inhibitor] ein.
  • In dem erfindungsgemäßen Glycosaminoglycan-modifizierten Protein ist ein Glycosaminoglycan-Rest chemisch an ein Protein gebunden. Die Menge an in das Protein einzuführende Glycosaminoglycan kann, abhängig von beispielsweise dem Protein und/oder Glycosaminoglycan, seinem Molekulargewicht und der Endverwendung des gebildeten Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins, variieren.
  • Die geeignete Einführungsmenge jedes Glycosaminoglycans kann jedoch leicht durch einfache Experimente vom Fachmann bestimmt werden. Allgemein kann das Glycosaminoglycan in das Protein in einer Menge von 1 bis 99,9 Gew.-% eingeführt werden, bevorzugterweise von 90 bis 95 Gew.-%, auf Basis des Gewichtes zu modifizierenden Proteins.
  • Ein Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein reagiert kaum mit dem Antikörper, der mit dem unmodifizierten Protein korrespondiert. Darüber hinaus wird durch die Modifikation die Antikörper-Produktivität des Proteins wesentlich herabgesetzt.
  • Ferner wird bei Verabreichung des Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins in einen lebenden Organismus seine Aktivität für eine lange Zeit aufrechterhalten, verglichen mit der Aktivität des entsprechenden unmodifizierten Proteins. Folglich zeigt das Glycosaminoglycan-modifizierte Protein eine verbesserte in vivo Stabilität.
  • Medikamente, die das erfindungsgemäße Glycosaminoglycan-modifizierte Protein enthalten, können in verschiedene Darreichungsformen zur oralen Verabreichung formuliert werden, beispielsweise Körnchen, feine Subtilaes, Pulver, Tabletten, Kapseln, Sirup, Pastillen, Suspensionen oder Lösungen. Alternativ dazu kann das Glycosaminoglycan-modifizierte Protein als solche oral verabreicht werden. Alternativ dazu dann es zu Injektionen für intravenöse, intraarterielle, intraportale, intrapleuroperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder intratumorale Verabreichung formuliert werden. Darüber hinaus kann es in Form eines Pulvers vorliegen und bei Verwendung in eine Injektion formuliert werden. Es kann in Suppositorien zur rektalen oder in Salben zur parenteralen Verabreichung formuliert werden. Diese Zubereitungen können zusammen mit bekannten organischen oder anorganischen flüssigen oder festen pharmazeutischen Trägern, Verdünnern, Bindern, Desintegrationsmitteln und ähnlichem, geeignet zur oralen, parenteralen oder analen Verabreichung, formuliert werden (beispielsweise Lactose, Sucrose, Glucose, Stärke, Gummi arabicum, Tragacanthgummi). Darüber hinaus können Stabilisatoren, Feuchthaltemittel, Emulgatoren, Aromastoffe und Komponenten zur Veränderung des osmotischen Druckes hinzugegeben werden. Die Beispiele dafür schließen Gelatine, Glycerin, Vaseline, Wachs, Kunststoffe und höhere Alkohole ein. Ferner können wahlweise Salze als Hilfsmittel zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Formulierung in einer angemessenen Menge verwendet werden. Für Suppositorien kann eine wasserlösliche oder hydrophile Basis wie Macrogol oder eine ölige Basis wie ein Kakao-Öl verwendet werden.
  • Die Dosis des erfindungsgemäßen Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins kann in Abhängigkeit von der zu behandelnden Krankheit, den Symptomen und dem Alter des Patienten variieren. Es ist bevorzugt, dem Patienten die Verbindung kontinuierlich oder stoßweise in einer Dosis von 1 bis 5000 mg/Tag im Falle der oralen Verabreichung oder von 1 bis 100 mg/Tag im Fall von Injektionen zu verabreichen.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Illustrierung der vorliegenden Erfindung, ohne daß diese darauf limitiert wäre.
  • In den folgenden Beispielen wurden die Aktivität und das Molekulargewicht des GAG-modifizierten Proteins und der Gehalt an Glycosaminoglycanen und Proteinen unter den folgenden Bedingungen bestimmt.
    • Aktivitätsbestimmung Superoxiddismutase:
  • Eine Enzym-Einheit ist definiert als die Menge des Enzyms, die 50 % der Aktivität von Xanthinoxidase bei einem pH-Wert von 7,8 und bei 25ºC inhibiert.
    • Bestimmung des Molekulargewichts
  • Eine Probe wird unter Verwendung einer G6000PWx2 (Tosoh Corporation) Kolonne einer high performance liquid chromatography unterzogen. Die Elution wurde mit 0,2 M wäßriger Natriumchlorid-Lösung durchgeführt. Das Molekulargewicht einer Probe wird anhand einer Eichkurve bestimmt.
    • Bestimmung des Glycosaminoglycan-Gehalts (1) Glycosaminoglycan, das Uronsäure enthält
  • Eine Probe wird einer Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion gemäß des Verfahrens wie in T. Bitter and H. M. Muir, Analytical Biochemistry, 4, 330 - 334 (1962) beschrieben, unterzogen.
    • (2) Glycosaminoglycan, das keine Uronsäure enthält
  • Eine Probe wird einer Phenol-Schwefelsäure-Reaktion unterzogen, gemäß dem Verfahren, wie es in M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers and F. Smith, Anal. Chem., 28, 350 - 356 (1956) beschrieben ist.
    • Bestimmung des Protein-Gehalts
  • Der Protein-Gehalt wird bestimmt nach dem Verfahren von Lowry et al., wie es beschrieben ist in O. H. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr and R. J. Randall, J. Biol. Chem., 193, 265 275 (1951).
    • Beispiel 1 Herstellung eines GAG-modifizierten Proteins nach der reduzierende Endgruppen-Lactonisierungs-Methode: A. Herstellung von reduzierende Endgruppen-lactonisierter Hyaluronsäure:
  • 500 mg Hyaluronsäure (MW 10 000) wurde in 50 ml Wasser aufgelöst. 5 ml einer 0,1 M Jod-Lösung in Methanol wurde hinzugefügt und die Reaktion bei Zimmertemperatur für 6 h ablaufen gelassen. Dann wurden ungefähr 5 ml 0,1 N Natriumhydroxid zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, wodurch die Entfärbung des freigesetzten Jods hervorgerufen wurde. Kaliumacetat- gesättigtes Ethanol wurde zu der Lösung hinzugegeben. Der daraufhin gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und in 50 ml Wasser aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 50 ml eines stark sauren lonenaustauscherharzes [Dowex 50(H&spplus;)] bei 5ºC für 20 h kontaktiert. Das daraus erhaltene Filtrat wurde mit Tri-n-butylamin neutralisiert. Das überschüssige Amin wurde mit Ether entfernt und der Rückstand lyophilisiert. Auf diese Weise wurde das Tri-nbutylamin der reduzierende Endgruppen-lactonisierten Hyaluronsäure als weißes Pulver erhalten.
  • Charge Nr. 310
  • Ausbeute: 410 mg.
  • Reduzierender Zucker, bestimmt nach dem Somogyi-Nelson-Verfahren: keiner.
    • B. Herstellung des mit dem reduzierende Endgruppen-lactonisierten Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins I. Herstellung des Hyaluronsäure-modifizierten Peptids (H-Arg-Gly- Asp-Val-NH&sub2;; RGDV):
  • 60 mg des Produkts der Charge Nr. 310 wurde in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst und 2,5 mg einer Dimethylformamid-Lösung von RGDV hinzugegeben. Die resultierende Mischung ließ man für 2 h bei 60ºC reagieren. Es wurden 10 ml einer 25%igen wäßrigen Natriumacetat-Lösung zu der Reaktionsmischung hinzugegeben und die resultierende Mischung anschließend bei Zimmertemperatur 30 min stehen gelassen. Dann wurde Ethanol dazugegeben und der daraufhin gebildete Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde mit einem Ultrafiltrationsgerät behandelt, das mit einer Membran für ein Fraktionierungsmolekulargewicht von 5 000 ausgestattet war, wodurch das nichtreagierte RGDV entfernt wurde. Anschließend wurde das Filtrat lyophilisiert. Die Charakteristika des Hyaluronsäure-modifizierten RGDV waren wie folgt:
  • Charge Nr. 320
  • Ausbeute: 40,2 mg
  • RGDV-Gehalt: 3,3 %.
  • Hyaluronsäure-Gehalt: 96,7 %. und
  • In den obigen Formeln ist X ein Wasserstoffatom einer nichtreduzierenden Endgruppe von Hyaluronsäure.
    • Beispiel 2
  • Herstellung von Hyaluronsäure-modifizierter Superoxiddismutase 400 mg aus Waben gewonnene (comb-derived) Hyaluronsäure (MW 150 000) wurde in 2 M Phosphatpuffer (pH 11,5) aufgelöst und 1 ml einer Acetonitril- Lösung von Cyanbromid (100 mg/ml) hinzugegeben und die resultierende Mischung für 5 min bei 4ºC miteinander reagiert. Sofort nach Beendigung der Reaktion wurden 150 ml Acetonitril zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Der so erhaltene Niederschlag wurde rasch mit Acetonitril gewaschen und in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat- Lösung aufgelöst. 10 ml einer 1%igen Lösung von Superoxiddismutase (SOD), gewonnen aus roten Hundeblutzellen, wurde zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, und die Reaktion für 20 h bei 4ºC durchgeführt. Ethanol wurde unter Bildung eines Niederschlages zur der Reaktionsmischung hinzugegeben und der resultierende Niederschlag in Wasser aufgelöst. Nach Zugabe von 0,1 ml Ethanolamin zu der Mischung wurde die Reaktion für eine Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Unter Erhalt eines Niederschlages wurde Ethanol zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, und der so erhaltene Niederschlag gut mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch Hyaluronsäure-modifizierte SOD erhalten wurden.
  • Die Charakteristika der so erhaltenen Hyaluronsäure-modifizierten SOD waren wie folgt:
  • Ausbeute: 350 mg
  • SOD-Gehalt: 21,2 %
  • Hyaluronsäure-Gehalt: 78,8 %
  • Molekulargewicht: 172 000
  • Aktivität: 82,1 % der unmodifizierten SOD
  • Elektrophorese: siehe Figur 1

Claims (7)

1. Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein der Formel
worin P einen Protein-Rest abzuglich n Amino-Gruppen des Proteins darstellt; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 100 und GAG repräsentiert einen Glycosaminoglycan-Rest, abzüglich einer reduzierenden terminalen Zuckergruppe aus dem Glycosaminoglycan.
2. Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Glycosaminoglycan-Gehalt im Bereich von 1 bis 99,9 Gew.-% auf Basis des Gewichtes des Proteins liegt.
3. Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Glycosaminoglycan ausgewählt ist aus Colominsäure, Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitinsulfat, Teichuronsäure, Dermatansulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratosulfat, Keratopolysulfat und Derivaten davon.
4. Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist durch Oxidation einer reduzierenden terminalen Zuckergruppe eines Glycosaminoglycans, Behandlung des reduzierende terminale Zuckergruppen-oxidierten Glycosaminoglycans mit einer Säure und Umsetzung des Glycosaminoglycans mit einem Protein.
5. Verfahren zur Herstellung eines Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins gemäß Anspruch 1, das folgendes umfaßt: teilweise Oxidierung der reduzierenden terminalen Zuckergruppe des Glycosaminoglycans, wodurch die terminale Zuckergruppe gespalten wird, gefolgt von der Bildung eines Lactons daraus, und Umsetzung des aktivierten Glycosaminoglycans mit einem Protein.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet daß sie ein Glycosaminoglycan-modifiziertes Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner enthält.
7. Verwendung eines Glycosaminoglycan-modifizierten Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, Entzündungen und hereditärer Enzymdefizienz.
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