KR100188382B1 - 글리코사미노글리칸 변형된 단백질 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 _ - Google Patents
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Abstract
글리코사미노글리칸-변형된 단백질은 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기를 환원시키고 부분적으로 산화시켜 형성된 알데하이드 그룹에 단백질의 아미노 그룹을 결합시켜 생성되며, 이는 생체내에서 안정성이 높고, 지연된 기간 동안 단백질의 생리학적 활성을 보유할 수 있다.
Description
제1도 내지 제6도는 실시예에서 수득된 글리코사미노글리칸-변형된 단백질 및 글리코사미노글리칸과 단백질의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타낸다.
제7도는 비교실시예에 기술된 콘드로이틴설페이트의 전기영동 패턴을 나타낸다.
제8도는 비교실시예에 기술된 겔 여과의 크로마토 그램을 나타낸다.
본 발명은 글리코사미노글리칸으로 변형된 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특이적 활성화제에 의해 활성화된 글리코사미노글리칸을 단백질과 반응시켜 수득된 글리코사미노글리칸-변형된 단백질에 관한 것이다.
최근, 암, 염증 및 선천적 효소 결핍증을 포함한 여러 가지의 질병을 치료하기 위한 약제로서 효소 및 생리학적 활성 단백질을 적용시키려는 시도들이 빈번히 이루어져 왔다.
그러나, 이들 효소 및 생리학적 활성 단백질중 많은 것은 살아있는 유기체에 이질성이다. 따라서, 유기체에 이러한 화합물을 그대로 투여하면 면역원성의 문제점을 야기시키거나 생체내 안정성을 악화시키게 된다. 그러므로, 이러한 화합물을 약제로 제형화하는 경우에는 아나필라시 반응(anaphylatic reaction)을 완화시키고 지연된 약물 효과를 개선시킬 필요가 있다.
또한, 유전 공학 기술을 이용하여 위에서 기술한 단백질을 다량으로 생산하려는 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 유전공학에 의해 생산된 단백질은 생체내에서 안정성에 상당한 영향 미치는 당 쇄(sugar chain)가 결핍되어 있는 문제점을 안고 있다.
따라서, 효소 또는 생리학적 활성 단백질의 안정성을 약리학적으로 개선시키기 위하여 이들을 다양한 합성 중합체 또는 다당류로 변형시키고자 하는 방법이 제시되어 왔다. 이에 사용된 합성 중합체를 예로 들면 폴리-L-아스파트산[M. Okada, A. Matsushima, A. Katsuhata, T. Aoyama, T. Ando and Y. Inada: Int. Archs Allerlrgy Appl. Immun., 79-81 (1985)] 및 이의 유도체, 폴리-D-또는-L-라이신, D-글루탐산/D-라이신 공중합체[F. T. Liu and D.H. Katz: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 1430-1434 (1979)], 폴리비닐알코올 피란 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 유도체 및 스티렌/말레산 공중합체 [H. Maeda, M. Ueda, T. Morinaga and T. Matsumoto: J. Med. Chem.,, 455-461(1985)]이 있다. 다당류로서는 아가로즈, 카복시메틸 셀룰로즈, 덱스트란{T.P. King, L. Kochoumian, K. Ishizaka, L. Kichtenstein, P.S. Norman: Arch. Biochem. Biophys.,, 464-473(1975)], 풀루란[M. Usui and T. Matsuhashi: J. Immunol.,, 1266-1272 (1979) and N. Matsuhashi: Genkansa no Jikken Dobutsu Moderu(Experimental Animal Model for Hyposensitization), ed. by S. Kobayashi et al., Genkansa Ryoho no Kiso to Rinsho(Bases and Clinical Application of Hyposensitization Therapy), 4-11, Chugai Igakusho (1982)] 및 지다당류를 예로 들 수 있다.
한편, 미합중국 특허 제4,585,754호에는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드의 존재하에 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 인슐린과 같은 단백질을 콘드로이틴설페이트와 반응시켜 수득된 안정화 단백질을 제시하고 있다. 그러나, 이에 따라 수득된 단백질은 이 단백질내에 함유된 아스파르트산 또는 글루탐산내의 다수의 카복실 그룹이 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드에 의해 각각 활성화되기 때문에, 단백질 자체의 중합체를 수반한 복잡한 중합체의 형태로 존재한다. 따라서, 이들 생성물은 단량체로서의 변형되지 않은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 인슐린이 갖는 약리학적 효과의 관점에서 추가로 개선되어야 한다.
본 발명의 목적은 생체내에서 매우 안정하며 복잡한 구조의 어떠한 중합체도 형성하지 않으면서 출발 단백질의 고유한 생리학적 효과를 연장된 기간 동안 발현할 수 있는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 이러한 목적은 환원성 말단 잔기-한정 산화 방법, 카복실 그룹 활성화 방법, 환원성 말단 잔기 락톤화 방법 또는 시아노겐 브로마이드 활성화 방법에 의해 활성화된 글리코사미노글리칸을 단백질과 반응시킴으로써 수득된 글리코사미노글리칸-변형된 단백질에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라, 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당잔기를 환원시키고 부분 산화시킴으로써 형성된 알데하이드 그룹에 단백질의 아미노 그룹이 결합된 글리코사미노글리칸 변형된 단백질이 제공된다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 다음 일반식의 글리코사미노글리칸 변형된 단백질이 제공된다:
상기식에서, P는 단백질로부터 n개의 아미노 그룹이 제외된 단백질 잔기를 나타내고, GAG는 글리코사미노글리칸으로부터 환원성 말단 당 잔기가 제외된 글리코사미노글리칸 잔기를 나타낸다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 글리코사미노글리칸의 우론산 잔기내에 존재하는 적어도 일부의 카복실 그룹이 아미드 결합을 통하여 단백질에 결합되는 글리코사미노글리칸 변형된 단백질이 제공된다.
제1도에서, 레인 1은 소-유도된 카탈라제와 히알우론산(HA)[이의 환원성 말단 잔기는 제한적으로 산화되어 있다(O-HA)]의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타내며 레인 2는 HA-변형된 소-유도된 카탈라제의 패턴을 나타낸다.
제2도에서, 레인 1은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)-유도된 카탈라제와 O-HA의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타내며 레인 2는 HA-변형된 아스퍼질러스니거 유도된 카탈라제의 패턴을 나타낸다.
제3도에서, 레인 1은 우리카제와 O-HA의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타내며 레인 2는 HA-변형된 우리카제의 패턴을 나타낸다.
제4도에서, 레인 1은 아스파라기나제와 O-HA의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타내며 레인 2는 HA-변형된 아스파라기나제의 패턴을 나타낸다.
제5도에서, 레인 1은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 소의 기관 연골로부터 유도된 콘드로이틴 설페이트[이의 환원성 말단 잔기는 제한적으로 산화되어 있다(O-CS(T))]의 혼합물의 전기영동 패턴을 나타내며 레인 2는 CS(T) 변형된 SOD(로트번호 121-2)의 패턴을 나타낸다.
제6도에서, 레인 1은 소의 적혈구 세포로부터 유도된 SOD의 전기영동 패턴을 나타내며, 레인 2는 개의 적혈구 세포로부터 유도된 SOD의 패턴을 나타내고, 레인 3은 개의 적혈구 세포로부터 유도된 SOD의 HA-변형된 SOD의 패턴을 나타내며 레인 2는 소의 적혈구 세포로부터 유도된 SOD의 HA-변형된 SOD를 나타낸다.
제7도에서, 레인 S는 CS(T)를 나타내고, 레인 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7은 각각 0.0436mg, 0.145mg, 0.436mg, 1.45mg, 4.36mg, 14.5mg 및 43.6mg의 수용성 카보디이미드(WSC)로 처리된 CS(T)를 나타내며, 레인 8은 WSC 43.6mg 및 0.1N 수산화나트륨으로 처리된 CS(T)를 나타낸다.
제8도에서, A는 소의 기간 연골로부터 유도된 콘드로이틴 설페이트와 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 혼합물에 대한 크로마토그램이며, B는 로트 번호 B의 생성물에 대한 크로마토그램이고, C는 로트 번호 C의 생성물에 대한 크로마토그램이며, D는 실시예1에서 제조된 로트 번호 121-2의 생성물에 대한 크로마토그램이고, E는 실시예2에서 제조한 로트 번호211의 생성물에 대한 크로마토그램이다.
본 발명의 글리코사미노글리칸 변형된 단백질은, 예를 들면, 환원성 말단 잔기-한정 산화방법, 환원성 말단 잔기 락톤화 방법, 카복실 그룹 활성화 방법 또는 시아노겐 브로마이드 활성화 방법에 의해 활성화된 글리코사미노 글리칸을 단백질과 반응시켜 생성할 수 있다.
본 발명에 따르는 글리코사미노글리칸 변형된 단백질의 제조방법은 다음에 상세히 나타낸다.
[환원성 말단 잔기-한정 산화방법]
이 방법은 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기를 환원시키고 부분 산화시킴으로써 언급된 말단 당 잔기를 분해시키고 알데하이드 그룹을 형성시킨 다음 이 알데하이드 그룹과 단백질의 아미노 그룹 사이의 환원성 알킬화 반응에 의해 글리코사미노글리칸 변형된 단백질을 생성하는 공정을 포함한다. 이 방법의 반응 도식은 다음과 같다:
[반응도식 A]
상기 반응도식에서, R1및 R2는 각각 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기의 2-위치 및 5-위치에서 통상 관찰되는 그룹을 나타내며, R1의 예로는 OH, NH2및 NHCOCH3가 포함되고 R2의 예로는 CH2OH, COOH 및 CH2OSO3M(여기서, M은 수소원자, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 또는 트리알킬아민 또는 피리딘과 같은 아민을 나타낸다)이 포함되며, P, n 및 GAG는 위에서 정의한 바와 같다.
이 방법에서는, 먼저 위에서 언급한 일반식(Ⅳ)의 글리코사미노글리칸을 환원시킴으로써 이의 환원성 말단 당 잔기를 분해시킨다. 이에 따라 일반식(Ⅴ)의 화합물을 수득한다. 이 환원 단계에서 사용되는 환원제의 예로는 수소화붕소나트륨 및 시아노수소화붕소나트륨과 같은 알칼리 붕소 하이드라이드가 포함된다. 이 환원반응은 적합한 액체 매질[예 : 붕산염 완충 용액(pH 8.3) 또는 인산염 완충 용액(pH 8.6)과 같은 완충 용액 또는 이러한 완충 용액과 유기 용매(예 : 디메틸포름 아미드, 아세토니트릴 또는 디옥산 메탄올)와의 혼합물]중에서 0 내지 40℃, 바람직하게는 15내지 20℃의 온도에서 수행할 수 있다.
위에서 언급한 환원제의 양은 각 종류에 따라 다양할 수 있다. 이들은 일반식(Ⅳ)의 화합물의 몰당 5내지 50당량, 바람직하게는 10내지 20당량의 양으로 사용될 수 있다.
이어서, 이와 같이 수득된 일반식(Ⅴ)의 화합물을 부분적으로 산화시킨다. 일반식(Ⅴ)에서 R1이 OH 그룹인 경우, 이러한 산화반응에 의해 일반식(Ⅵ)의 알데하이드 화합물이 형성된다. 일반식(Ⅴ)에서 R2가 CH2OH 그룹인 경우, 일반식(Ⅶ)의 알데하이드 화합물이 형성된다. 이 산화반응에서 사용되는 산화제의 예로는 과요오드산나트륨 또는 과요오드산 칼륨과 같은 알칼리 과요오드산염을 들 수 있다. 이러한 산화제는 일반식(Ⅴ) 화합물의 몰당 보통 1내지 30당량, 바람직하게는 5 내지 10당량의 양으로 사용할 수 있다. 위에서 언급한 산화 반응은 0 내지 20℃, 바람직하게는 0 내지 5℃ 의 온도에서 일반적으로 수행할 수 있다.
이에 따라 수득된 일반식 (Ⅵ) 또는 (Ⅶ)의 알데하이드 화합물은 공지된 환원성 알킬화 방법에 따라 단백질의 아미노 그룹과 반응시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 일반식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 목적하는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 수득할 수 있다. 환원성 알킬화 반응은 일반식(Ⅵ) 또는 (Ⅶ)의 알데하이드 화합물을 위에서 언급한 것들중에서 선택된 액체 매질중에서 일반적으로 15 내지 60℃의 온도에서 단백질과 반응시켜 수행할 수 있다. 이 반응과 동시에 또는 이 반응의 완결후, 반응 혼합물을 시아노수소화붕소나트륨과 같은 환원제로 환원시킨다.
일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질에 있어서, n은 일반적으로 1 내지 100의 정수, 바람직하게는 평균 1 내지 10일 수 있다.
[환원성 말단 잔기 락톤화 방법]
이 방법은 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기를 부분 산화시킴으로써 말단 당 잔기를 분해시킨 후 락톤을 형성시키는 공정을 포함한다. 그런 다음, 락톤을 단백질의 아미노 그룹과 반응시켜 글리코사미노글리칸으로 변형시킨 단백질을 제조한다. 이 방법의 반응도식은 하기와 같다:
[반응도식 B]
상기 반응도식에서, A는 칼륨 원자 또는 나트륨 원자를 나타내고, P, n, GAG, R1및 R2는 위에서 정의한 바와 같다.
이 방법에서는, 먼저 일반식(Ⅵ)의 글리코사미노글리칸을 산화시켜 환원성 말단 당 잔기를 분해시킨다. 이에 따라, 일반식(Ⅷ)의 카복실 화합물을 수득한다. 이 산화 단계에서 사용되는 산화제의 예로는 요오드 및 브롬을 들 수 있다. 산화제는 일반식(Ⅵ)의 화합물 1몰당 일반적으로 2 내지 20당량, 바람직하게는 5 내지 15당량의 양으로 사용할 수 있다. 산화반응은 위에서 언급한 것들 중에서 선택된 액체 매질중에서 0 내지 40℃, 바람직하게는 15 내지 20℃의 온도에서 수행한다. 산화반응후, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨을 반응 혼합물에 잔여 산화제를 분해시킨다.
이에 따라 수득된 일반식(Ⅷ)의 화합물 함유 용액을 다우웩스(Dowex)50 및 앰버라이트(Amberlite) IR120과 같은 강산성 양이온 교환 수지 200ml로 채운 컬럼에 가하고 이 컬럼에 1시간에 걸쳐 통과시켜 분획을 수득한다. 컬럼을 물로 세척하고, 세척 분획을 위에서 수득된 통과 분획과 합한 다음 합한 분획을 4℃에서 밤새 정치시켜 일반식(Ⅸ)의 락톤 화합물을 형성한다.
이에 따라 수득된 일반식(Ⅸ)의 락톤 화합물을 단백질과 반응시켜 일반식(Ⅲ)의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 생성한다. 일반식(Ⅸ)의 락톤 화합물과 단백질 사이의 반응은 락톤을 트리알킬아민의 형태로 반응시키거나 락톤과 단백질의 혼합물의 pH 값을 수산화나트륨 수용액을 사용하여 4 내지 7로 조정한 후 0 내지 70℃, 바람직하게는 15 내지 50℃에서 반응시켜 수행할 수 있다.
일반식(Ⅲ)의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질에 있어서, n은 일반적으로 1 내지 100의 정수, 바람직하게는 평균 1내지 10의 정수이다.
[카복실 그룹 활성화 방법]
몇몇의 예외(예 : 케라토설페이트 및 케라토폴리설페이트)를 제외하고는 글리코사미노글리칸은 각각 다음 일반식의 우론산 잔기를 함유한다:
이 방법에 따라, 글리코사미노글리칸의 우론산 잔기내의 카복실 그룹을 단백질의 아미노 그룹에 결합시켜 글리코사미노글리칸으로 변형된 단백질을 수득할 수 있다.
이 방법은 펩타이드 화학분야에서 널리 공지된 방법으로 글리코사미노글리칸의 우론산 잔기내의 카복실 그룹을 활성화시킨 다음, 활성화된 카복실 그룹을 단백질과 반응시키는 공정을 포함한다.
글리코사미노글리칸의 우론산 잔기내의 카복실 그룹은, 예를 들면, 글리코사미노글리칸을 N-하이드록시석신이미드, p-니트로페놀, N-하이드록시벤조트리아졸, N-하이드록시피페리딘, 및 2,4,5-트리클로로페놀 중에서 선택된 화합물과 반응시켜 카복실 그룹을 활성 에스테르 그룹으로 전환시킴으로써 활성화 시킬 수 있다.
구체적으로, 트리(n-부틸)-아민, 트리에틸아민, 피리딘과 같은 적합한 아민을 이용하여 글리코사미노글리칸을 염으로 전환시킨다. 그런 다음, 생성된 염을, 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드, 디사이클로헥실카보디이미드와 같은 축합제의 존재하에 0 내지 50℃의 온도에서 디메틸포름아미드, 피리딘 및 디메틸설폭사이드와 같은 적합한 용매중에서, N-하이드록시석신이미드와 반응시킨다. 이에 따라, 활성화된 카복실 그룹을 갖는 글리코사미노글리칸을 수득한다.
그런 다음, 활성화 카복실 그룹을 갖는 글리코사미노글리칸을 단백질과 반응시켜 본 발명의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 수득한다.
즉, 단백질의 수용액을 활성화된 카복실 그룹을 갖는 글리코사미노글리칸의 수용액 또는 이러한 글리코사미노글리칸이 함유된 인산염 완충액(pH 6 내지 9)에 가하고 혼합물을 0 내지 50℃, 바람직하게는 15 내지 25℃에서 30분 내지 20시간동안 반응시킨다.
위에서 언급한 카복실 그룹 활성화 방법을 이용하면 글리코사미노글리칸의 우론산 잔기내의 적어도 일부의 카복실 그룹이 아미드 결합을 통해 단백질에 결합된 글리코사미노글리칸 변형된 단백질을 수득할 수 있다.
[시아노겐 브로마이드 활성화 방법]
이 방법은 단백질의 아미노 그룹 또는 카복실 그룹, 또는 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 잔기 내의 카복실 그룹, 하이드록실 그룹 또는 작용성 그룹을 활성화시킨 다음 이 혼합물을 반응시켜 단백질에 글리코사미노글리칸이 결합되도록하는 공정을 포함한다.
구체적으로, 글리코사미노글리칸 변형된 단백질은 다음 방법에 따라 수득할 수 있다.
글리코사미노글리칸을 2M 인산염 완충액(pH 11.5)에 용해시키고 시아노겐 브로마이드의 아세토니트릴 용액을 이에 가한다. 혼합물을 4℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 이 반응 혼합물에 아세토니트릴을 가하여 침전물을 생성한다. 과량의 시아노겐 브로마이드를 제거한 후, 침전물을 0.1M 탄산수소나트륨 용액에 용해시킨다. 이에 단백질을 가하고 4℃에서 20시간 동안 반응시켜 목적하는 생성물을 수득한다.
통상의 방법에 따라 위에서 언급한 방법 중의 하나에 의해 수득된 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 분리하고 정제할 수 있다. 예를 들면, 투석막 또는 한외 여과 막을 이용하여 반응 혼합물을 탈염시킨다. 그런 다음, 반응되지 않은 글리코사미노글리칸 및 단백질로부터 목적하는 생성물을 분리하고 음이온 교환기 또는 양이온 교환기를 이용하여 정제한다. 또한, 분자량의 차이를 이용한 겔 여과에 의해 생성물을 분리하고 정제할 수 있다. 또한, 몇몇 단백질의 경우, 효소 억제제, 기질 또는 항체가 고정된 담체를 이용한 친화성 크로마토그래피로 목적하는 생성물을 분리하고 정제할 수도 있다.
단백질을 변형시키기 위해 본 발명에서 사용되는 글리코사미노글리칸은, 특별한 제한없이, 목적하는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질의 필요한 특성 및 변형 목적에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 특히, 콜로민산, 히알우론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이추론산, 데르마탄 설페이트, 헤파린 헤파란 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이들의 유도체(예 : 콘드로이틴 폴리설페이트)중에서 선택될 수 있다. 목적 생성물이 혈전증 치료제 및 동맥경화증 치료제로서 사용되는 경우, 바람직한 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴 폴리설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트 및 데르마탄 설페이트이다. 한편, 류마티스 치료제 및 소염제의 제조를 위해서는 히알루론산, 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트가 적합하다. 이들 글리코사미노글리칸은 단독으로 또는 둘 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
글리코사미노글리칸으로 변형시키는 단백질은 특정하게 제한되지 않는다. 단백질로서 이용가능한 것은 사람을 포함한 다양한 동물, 미생물 및 식물로부터 유래된 약리학적 활성 단백질 및 또한 화학적 합성 또는 유전 공학으로 생성한 것이다. 단백질의 구체적인 예는 사이토킨(예 : 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ와 같은 다양한 인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-3); 호르몬[예 : 인슐린, 성장호르몬 방출 인자(GRF), 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), 심방성 나트륨이뇨 호르몬(ANP), 바소프레신, 코르티코트로핀 방출인자(CRF), 혈관 활성 장펩티드(VIP), 세크레틴, α-멜라닌 세포-자극 호르몬(α-MSH), 향부신피질 호르몬(ACTH), 콜레시스토키닌(CCK), 글루카곤, 부갑상선 호르몬(PTH), 부갑상선 호르몬-방출 단백질(PTHrP), 소마토스타틴, 엔케팔린]; 성장 인자[예 : 성장호르몬(GH), 인슐린형 성장 인자)(IGH-I, IGH-II), β-신경 성장 인자(β-NGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(BFGF), 변형 성장 인자-β(TGF-β), 에리트로포이에틴, 과립구 콜로리 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 상피 성장 인자(EGF)]; 효소[예 : 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA), 엘라스타제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 빌리루빈 옥시다제, 카탈라제, 우리카제, 우로키나제, 테르몰리신, 트립신, 키모트립신, Vs 프로테아제, 펩신, 파파인, 히알우로니다제, 콘드로이틴 ABC 리아제, 아스파라기나제]; 및 기타 단백질 [예 : 우비퀴틴, 인슐린 분비-활성화 단백질(IAP), 혈청 흉선 인자(STF), 펩티드-T, 알부민, 글로불린, 트랜스페린, 지단백질, 지질 A 유도체, 오르니토니서스 단백질, 트립신 억제인자]을 포함한다.
본 발명의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질에 있어서, 글리코사미노글리칸 잔기는 단백질에 화학적으로 결합된다. 단백질로 도입되는 글리코사미노글리칸의 양은, 예를 들면, 단백질 및/또는 글리코사미노글리칸, 이의 분자량 및 형성된 글리코사미노글리칸 변형된 단백질의 최종 투여량에 따라 변할 수 있다. 그러나, 각각의 글리코사미노글리칸의 적합한 도입량은 간단한 실험에 의해 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 구할 수 있다. 일반적으로, 글리코사미노글리칸은 변형되는 단백질의 중량을 기준으로 하여 1내지 99,9중량％, 바람직하게는 90 내지 95중량％의 양으로 단백질로 도입시킬 수 있다.
글리코사미노글리칸 변형된 단백질은 변형되지 않은 단백질에 상응하는 항체와는 거의 반응하지 않는다. 또한, 이러한 단백질에 대한 항체 생산이 변형에 의해 다음 실시예에 기술된 바와 같이 실질적으로 강하된다.
또한, 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 생존 유기체에 투여하는 경우, 이의 활성은 상응하는 변형되지 않은 단백질의 활성과 비교하여 오랫 동안 지속된다. 따라서, 글리코사미노글리칸 변형된 단백질은 생체내에서 증진된 안정성을 나타낸다.
본 발명의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 함유하는 약물은, 예를 들면, 과립제, 미세 섭틸라제, 산제, 정제, 캅셀제, 시럽제, 트로키제, 현탁제 또는 액제 등의 다양한 경구 투여 형태로 제형화 시킬 수 있다. 한편, 글리코사미노글리칸-변형된 단백질 자체를 경구 투여할 수도 있다. 또한, 정맥내, 동맥내, 문맥내, 흉복강내, 근육내, 피하투여 또는 종양내 투여 등의 주사 형태로 제형화시킬 수 있다. 또한, 산제 형태여서 사용전에 주사 형태로 제형화시켜서 사용할 수 있다. 직장 투여를 위한 좌제 또는 비경구 투여를 위한 연고로 제형화 시킬 수 있다. 이러한 제제는 경구, 비경구 또는 직장 투여에 적합한 공지된 유기 또는 무기 액형 또는 고형 약제학적 담체, 희석제, 결합제 및 붕해제[예 : 락토스, 슈크로스, 글루코스, 전분, 아라비아 고무 및 트라카칸드 고무] 등과 함께 제형화 시킬 수 있다. 또한, 안정화제, 보습제, 유화제, 방향제 및 삼투압을 변화시키는 성분을 여기에 가할 수 있다. 이러한 예는 젤라틴, 글리세롤, 와셀린, 왁스, 플라스틱 및 고급 알콜을 포함한다. 또한, 염은 제제의 pH 값을 적합한 수준으로 유지시키기 위한 보조 성분으로서 임의로 사용할 수 있다. 좌제에 있어서는, 수용성 또는 친수성 기재[예 : 매크로골] 또는 오일성 기재[예 : 카카오 오일]을 사용할 수 있다.
본 발명의 글리코사미노글리칸 변형된 단백질의 투여량은 치료할 질병 및 환자의 증후와 연령에 따라 변할 수 있다. 화합물을 환자에게 경구 투여의 경우에는 1내지 500mg/일 또는 주사 투여의 경우에는 1 내지 100mg/일의 분량으로 연속 또는 간헐 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명을 추가로 설명하기 위한 목적이지만, 한정하려는 의도는 아닌 것으로써 다음에 실시예를 기술한다.
다음 실시예에서, GAG-변형된 단백질의 활성과 분자량 및 글리코사미노글리칸과 단백질의 함량은 다음의 조건하에서 측정한다.
[활성 측정]
카탈라제 : 효소 1 유니트(U)는 과산화수소의 농도 범위가 분당 9.2 내지 10.3mM의 과산화수소 용액 중에서 pH 7.0 및 25℃에서 분당 1.0μM의 과산화수소를 분해하는 효소의 양으로 정의한다.
리소자임 : 효소 1 유니트는 그램 양성 세균(ML-세포)의 현탁액의 540nm에서의 흡광도를 pH 6.2 및 35℃에서 분당 0.001 감소시키는 효소의 양으로서 정의한다.
히알우로니다제 : 효소 1 유니트는 히알우론산으로부터 pH 6.2 및 37℃에서 분당 불포화 디삭카라이드 1μM을 유리시키는 효소의 양으로서 정의한다.
엘라스타제 : 효소 1 유니트는 pH 8.5 및 25℃에서 분단 N-아세틸-트리-L-알라닌 메틸 에스테르 1μM을 가수분해시키는 효소의 양으로서의 정의한다.
우리카제 : 효소 1 유니트는 pH 8.5 및 25℃에서 분당 요산 1μM을 산화시키는 효소의 양으로서 정의한다.
우로키나제 : 효소 1 유니트는 플라즈미노겐을 pH 7.5 및 37℃에서 우로키나제로 처리하는 경우 α-카제인으로부터 형성된 과염소산에 가용성인 물질의 흡광도를 △275에서 분단 1.0 변화시키는, 플라즈미노겐을 생성하는 효소의 양으로서 정의한다.
아스파라기나제 : 효소 1 유니트는 L-아스파라긴으로부터 pH 8.6 및 37℃에서 분단 암모니아 1.0μM를 생성시키는 효소의 양으로서 정의한다.
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 : 효소 1 유니트는 pH 7.8 및 25℃에서 크산틴 옥시다제의 활성을 50％ 억제하는 효소의 양으로서 정의한다.
[분자량 측정]
샘플은 G 6000 PWx2(Tosoh Corporation)를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피시킨다. 0,2M 염화나트륨 수용액을 사용하여 용출시킨다. 샘플의 분자량은 보정 곡선을 기준으로 하여 구한다.
[글리코사미노글리칸의 함량 측정]
(1) 우론산을 함유하는 글리코사미노글리칸
샘플을 문헌에 기술된 방법에 따라 카바졸-황산 반응시킨다[참조 : T. Bitter 및 H.M. Muir, Analytical Bilchemistry, 4, 330-334 (1962)].
(2) 우론산을 함유하지 않는 글리코사미노글리칸
샘플을 문헌에 기술된 방법에 따라 페놀-황산 반응시킨다[참조 : Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers 및 F. Smith, Anal, Chem., 28, 350, 356 (1956)].
[단백질 함량 측정]
단백질 함량은 문헌에 기술된 방법에 따라 로우리 등의 방법으로 구한다[참조 : O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr 및 R.J. Randall, J. Biol. Chem.,, 265-275 (1951)].
[실시예 1]
환원성 말단 잔기-한정 산화방법에 의한 GAG 변형된 단백질의 제조
A. 환원성 말단 잔기-한정 산화된 글리코사미노글리칸의 제조
I. 환원성 말단 잔기 분해된 히알우론산(R-HA)의 제조
히알우론산(MW 10000) 2000mg을 0.05M 붕산염 완충 용액(pH 8.3) 200ml에 용해시키고, 수소화붕소나트륨 182mg을 가한다. 혼합물을 5시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응 혼합물의 pH를 아세트산을 사용하여 4.5로 조절하고, 에탄올을 가한다. 이렇게 형성된 침전물을 여과시켜 수집하고 물 200ml에 용해시킨다. 이어서, 생성된 용액을 양이온 교환 수지[Dowex50(H+)] 1000ml로 충전된 컬럼에 통과시킨다. 용출물 및 컬럼을 세척하기 위해 사용한 물을 혼합하고, 아세트산나트륨을 사용하여 포화시킨 에탄올을 가한다. 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다.
로트 번호 100
수율 : 180mg
II. 환원성 말단 잔기-한정 산화된 히알우론산(O-HA)의 제조
위에서 기술한 단계 I에서 제조된 R-HA 1700mg을 40mM 이미다졸 염산염(pH 6.5) 250ml에 용해시키고, 과요오드산나트륨 139.96mg을 0℃에서 가한 후 1시간 동안 반응시킨다. 에탄올을 반응 혼합물에 가하고, 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다. 침전물을 물에 용해시키고, 에탄올을 다시 가하여 침전물을 수득한다. 곧 이어서, 침전물(O-HA)을 인산염 완충 용액 또는 물에 용해시키고, 단백질과의 반응에 사용한다.
로트 번호 110-1
수율 : 1600mg
Ⅲ. 기타의 환원성 말단 잔기-한정 산화된 글리코사미노글리칸 (O-GAG)의 제조
히알우론산[comb : HA 100(MW 1,000,000)으로부터 수득], 콘드로이틴 설페이트 [소의 기관 연골 : CS(T), 상어 연골 : CS(S), 고래 연골 : CS(W)로부터 수득], 데르마탄 설페이트(돼지의 피부 : DS로부터 수득), 헤파린(돼지의 소장 : Hep로부터 수득) 및 헤파란 설페이트(돼지의 신장 : HS로부터 수득)를 표 1에 명시된 바와 같은 조건하에서 위에서 기술한 단계 I에서와 동일한 방법으로 처리한다. 따라서, 환원성 말단 잔기-개방된 글리코사미노글리칸(R-GAG)을 수득한다. 이어서, 환원성 말단 잔기-한정 산화된 글리코사미노글리칸(O-GAG)을 표 2에 나타낸 바와 같은 조건하에서 위에서 기술한 단계 II에서와 동일한 방법으로 제조한다. 표 1 및 2는 또한 이와 같이 수득된 생성물 이의 수율을 나타낸다.
B. 환원성 말단 잔기-한정 산화된 글리코사미노글리칸을 사용하여 변형시킨 단백질의 제조
I. 히알우론산 변형된 카탈라제의 제조
로트 번호 110-2의 생성물 100mg을 인산염 완충 용액(pH 8.0) 10ml에 용해시키고, 소의 간으로부터 수득한 카탈라제(Seikagaku Corporation) 2.3mg을 가한다. 혼합물을 6시간 동안 실온에서 반응시킨다. 이어서, 시아노수소화붕소나트륨 0.4mg을 가하고, 생성된 혼합물을 20시간 동안 실온에서 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 분별 분자량 300,000의 막이 제공된 한외 여과 장치를 사용하여 여과시켜 저분자량 물질을 제거시킨다. 이어서, 여액을 DEAE 이온 교환 수지 크로마토그래피하여 정제하고, 투석막을 사용하여 탈염시킨후, 동결건조시킨다.
로트 번호 120-1
수율 : 30mg
카탈라제 함량 : 2.1％
히알우론산 함량 : 97.9％
활성 : 변형되지 않은 카탈라제 활성의 74.5％
[α]: -78.O (C=1, HO).
전기영동 : [참조 : 제1도].
아세틸셀룰로즈 막(SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.).
0.1M 포름산/피리딘(pH 3.0).
0.5mA/cm, 30분.
및
상기식에서, P1은 카탈라제로부터, 평균 11개의 아미노 그룹이 제외된 카탈라제 잔기이고, X는 히알우론산의 비환원성 말단 잔기의 수소원자이다.
II. 히알우론산 변형된 카탈라제의 제조
로트 번호 110-2의 생성물 100mg 및 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger)로부터 유도된 카탈라제(Seikagaku Corporation) 1mg을 위에서 기술한 I에서와 동일한 방법으로 반응시킨다. 이렇게 수득된 히알우론산 변형된 카탈라제의 특성은 다음과 같다:
로트 번호 120-2.
수율 : 29.0mg.
카탈라제 함량 : 0.92%.
히알우론산 함량 : 99.08%.
활성 : 변형되지 않은 카탈라제 활성의 85.1%.
[α]D: -78.8(C=1, H2O).
전기영동 : [참조 : 제2도].
아세틸셀룰로즈 막(SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.).
0.1M포름산/피리딘(pH 3.0)
0.5mA/cm, 30분.
및
상기식에서, P2는 카탈라제로부터, 평균 26개의 아미노 그룹이 제외된 카탈라제 잔기이고, X는 위에서 정의한 바와 같다.
Ⅲ. 히알우론산 변형된 우리카제의 제조
로트 번호 110-2의 생성물 100mg을 인산염 완충 용액(pH 8.0) 10ml에 용해시키고, 칸디다(Candida)로부터 수득한 우리카제(Seikagaku Corporation) 2.5mg을 가한다. 혼합물을 10시간 동안 실온에서 반응시킨다. 이어서, 시아노수소화붕소나트륨 0.4mg을 가하고, 생성된 혼합물을 20시간 동안 실온에서 반응시킨다. 에탄올을 반응 혼합물에 가하고, 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다. 이어서, 침전물을 물에 용해시키고, DATE 이온 교환 수지 크로마토그래피시킴으로써 정제한다. 히알우론산 변형된 우리카제의 특성은 다음과 같다:
로트 번호 120-3.
수율 :23.5mg.
우리카제 함량 : 1.8%.
히알우론산 함량 : 98.2%.
활성 : 변형되지 않은 우리카제 활성의 73.4%.
[α]D: -77.9 (C=1, H2O).
전기영동 : [참조 제3도]
아세틸셀룰로즈 막(SEPARAX. JOOKOO Co., Ltd.).
0.1M 포름산/피리딘(pH 3.0).
0.5mA/cm, 30분.
및
상기식에서, P3는 우리카제로부터 평균 5.5개의 아미노 그룹이 제외된 우리카제 잔기이고, X는 위에서 정의한 바와 같다.
Ⅳ. 히알우론산 변형된 아스파라기나제의 제조
로트 번호 110-2의 생성물 100mg을 0.05M 인산염 완충 용액(pH 8.0) 10ml에 용해시키고, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터 수득된 아스파라기나제(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) 5mg을 가한다. 혼합물을 10시간 동안 실온에서 반응 시킨다. 이어서, 시아노수소화붕소나트륨 1mg을 가하고, 생성된 혼합물을 20시간 동안 반응시킨다. 에탄올을 반응 혼합물에 가하고, 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다. 이어서, 침전물을 물에 용해시키고, DEAE 이온 교환 수지 크로마코그래피시킴으로써 정제한다. 이렇게 수득된 히알우론산 변형된 아스파라기나제의 특성은 다음과 같다:
로트 번호 120-4.
아스파라기나제 함량 : 4.8%.
히알우론산 함량 : 95.2%.
활성 : 변형되지 않은 아스파라기나제 활성의 84.6%.
[α]D: -76.9 (C=1, H2O).
전기영동 : [참조 제4도].
아세틸셀룰로즈 막(SEPARAX, JOOKOO Co., Ltd.).
0.069M 베로날 완충 용액(pH 8.6).
0.5MA/CM, 40분.
및
상기식에서, P4는 아스파라기나제로부터, 평균 2.7개의 아미노 그룹이 제외된 아스파라기나제 잔기이고, X는 위에서 정의한 바와 같다.
Ⅴ. 히알우론산 변형된 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 제조
로트 번호 117의 생성물100mg을 0.05M 인산염 완충 용액(pH 8.0) 10ml에 용해시키고, 소의 적혈구로부터 수득한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Sigma) 2.3mg을 가한다. 이 혼합물을 20시간 동안 실온에서 반응시킨다. 이어서, 시아노수소화붕소나트륨 0.4mg을 반응 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 실온에서 반응시킨다. 에탄올을 반응 혼합물에 가하여 침전물을 형성한다. 침전물을 에탄올을 사용하여 잘 세척하고 건조시켜 히알우론산 변형된 슈퍼옥사이드 다슈뮤타제를 수득한다. 이 생성물의 특성은 다음과 같다:
수율 : 89.7mg.
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 함량 : 2.0%.
히알우론산 함량 : 98.0%
분자량 : 1,000,000.
활성 : 변형되지 않은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성의 89.8%.
[α]D: -78.0(C=1, H2O).
전기영동 : [참조 제6도].
Ⅵ. 기타 글루코사미노글리칸-변형된 단백질의 제조
소의 간으로부터 수득한 카탈라제, 소의 적혈구로부터 수득한 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 소의 고환으로부터 수득한 히알우로니다제, 알부민으로부터 수득한 리소자임(위에서 기술한 효소는 모두 Seikagaku Corporation에 의해 제조된다) 및 사람 신장 세포로부터 수득한 우로키나제(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)를 표 3에 명시된 조건하에서 위에서 기술한 단계 1에서와 동일한 방법으로로트 번호 111 내지 116의 생성물로 변형시킨다. 표 4는 이렇게 수득된 생성물의 분석 데이터를 나타낸다.
제5도는 대표적인 로프 번호 121-1의 생성물의 전기영동 양상을 나타낸다. 전기영동은 I에 기술된 바와 같은 조건하에서 수행한다.
Ⅶ. 면역학적 활성
아스퍼길러스 니거(Asperguillus niger)로부터 수득한 카탈라제(Seikagaku Corporation)의 항원성 및 히알우론산(로트 번호 120-2)을 사용하여 변형시킨 카탈라제를 다음 방법으로 실험한다.
0.05M 인산염 완충 용액(이후, PBS로 약칭)(pH 7.0)에 용해된 카탈라제 또는 HA-카탈라제를 단백질로 환산하여 0.1mg의 용량으로 암컷 스위스-웹스터 마우스(Swiss-Webster mouse)(각각의 그룹은 4마리로 구성된다)에게 12주 동안 일주일에 1회 복장내(이후, i.p.로 약칭) 투여한다. 0, 3, 6, 9 및 12주에, 각각의 동물의 혈액을 레토로오리비탈 총(retorooribital plexus)으로부터 수집하고 -20℃에서 저장한다. 각각의 혈청의 역가를 볼러(Voller) 등의 방법에 따라 HPO-ELISA[양고추냉이 퍼옥시다제를 사용한 효소 결합된 면역흡착 검정법]에 의해 측정한다. 탄산염 완충 용액(0.5M, pH 9.5)으로 10㎕/ml로 희석된 항원 용액 100㎕를 Nunc Immuno II 미세역가 판의 접종 웰에 접종한다. 판을 4℃에서 밤새 항온처리한 후 트윈 20 트라이스(Tween 20 trice) 0.05%를 함유하는 생리 식염수를 사용하여 3회 세척한다. 트윈(Tween) 20 함유 PBS를 사용하여 희석시킨 시험 혈청 100㎕를 각각웰에 가한다. 또한, 3개의 대조군, 즉 항원 대조군, 항혈청 대조군 및 정상 마우스의 혈청 대조군을 준비한다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후, HPO 결합된 염소 항-마우스 면역 글로블린(IgG+IgA+IgM) 100㎕를 각각의 웰에 가하고, 1.5시간동안 실온에서 항온처리한다.-페닐렌디아민 기질 100㎕를 각각의 웰에 가하고, 10분 동안 항온처리한다. 이어서, 4N 황산 0.01ml을 가하여 반응을 정지시킨다. 역가는 대조군 혈청을 기준으로 하여 0.01의 흡광도를 나타내는 항체 희석비로 나타낸다.
그 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5에 나타난 바와 같이, HA-카탈라제의 항원성 또는 면역원성은 변형되지 않은 카탈라제 보다 낮다.
Ⅷ. 마우스의 허혈성 족 부종상에 대한 효과(뒷다리 허혈에서 혈액 순환에 의한 ㆍO 생산성
8주된 ddy 숫컷 마우스를 사육장치에 가두고 오른쪽 뒷다리를 봉합선으로 묶는다(브뢰인 번호 2). 봉합선의 한쪽 말단은 고정시키고, 500g 중량을 봉합선의 다른쪽 말단에 매단다. 따라서, 제한된 기간 동안 허혈을 발생시킨다. 허혈전 및 60분 후에, 동물의 발-패드의 두께를 슬라이드 캘러퍼스를 사용하여 측정한다. 이어서, 발-패드를 자르고 중량을 측정한다. 대조군에게는 허혈이 시작되기 직전에 생리 식염수를 정맥내 투여한다. 시험군에게는, 표 6에 나타낸 시료를 허혈이 시작되기 30분 전 및 직전에 투여한다. 각각의 그룹은 5마리의 동물로 구성된다. 시료로서 사용되는 카탈라제는 소의 간으로부터 유도된다. 사용된 HA-카탈라제는 다음과 같이 제조한다. 로트 번호 120-1의 HA카탈라제 10mg을 생리 식염수 5.2ml에 용해시키고, 0.22㎛의 막(Milex GV; mfd. Nippon Millipore Kogyo K.K.에 의해 생산)을 통해 여과 시킨다. 여액 1ml를 앰플에 분배시켜 주사용 제제를 수득한다. 제제는 앰플당 효소 600U를 함유한다.
그 효과는 다음식에 따라 계산한다.
효과 A :
40이상의 억제률(A)를 나타내는 샘플이 효과적인 것으로 밝혀졌다.
효과 B :
60 이상의 억제률(B)를 나타내는 샘플이 효과적인 것으로 밝혀졌다.
그 결과를 표 6에 나타내었다.
이들 결과는, 허혈 30분 전에 투여하는 경우 변형되지 않은 카탈라제는 효과적이지 않은 반면, HA-카탈라제는 확실히 효과적임을 나타낸다. 이들 결과로부터, HA-카탈라제가 혈액중에서 안정하며, 지속적인 활성을 발휘하는 것으로 추정된다.
[Ⅸ. 콘드로이틴 설페이트-변형된 엘카토닌의 제조]
로트 번호 111의 O-CS(T)의 생성물 100mg을 0.05M 인산염 완충 용액(pH 8.0) 10ml에 용해시키고, 엘카토닌(Seikagaku Corporation) 10mg을 가한다. 혼합물을 20시간 동안 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 분별 분자량 10,000의 막이 제공된 한외 여과 장치를 사용하여 여과시켜 반응되지 않은 엘카토닌을 제거시킨후, 동결건조시킨다. 이렇게 수득된 콘드로이틴 설페이트 변형된 엘카토닌(로트 번호 127)의 특성은 다음과 같다:
수율 : 98.2mg.
엘카토닌 함량 : 5.50%.
콘드로이틴 설페이트 함량 : 94.50%.
[α]: -21.9(C=1, HO).
상기식에서, P5는 엘카토닌으로부터, 평균 2개의 아미노 그룹이 제외된 엘카토닌 잔기이고, X'는 콘드로이틴 설페이트의 비환원성 말단 잔기의 수소 원자이며, R3및 R4는 상이하며 각각 -H 또는 -SO3H이다.
Ⅹ. 콘드로이틴 설페이트-변형된 엘카토닌(로트 번호 127)의 혈중 활성 및 안정성
a) 엘카토닌 5㎕/kg 및 엘카토닌으로 환산한 콘드로이틴설페이트-변형된 엘카토닌(로트 번호 127) 5㎕/kg을 꼬리 정맥으로부터 래트에게 투여한다. 그 결과 발생된 혈중 칼슘의 양의 최대 감소를 100으로 나타낸다. 이어서, 혈중 칼슘의 양이 50으로 감소되는데 필요한 시간을 측정한다. 그 결과는 다음과 같다:
엘카토닌 : 48시간.
로트 번호 127 : 72시간.
따라서, 로트 번호 127의 생성물은 그 효과를 서서히 발휘하는 것으로 밝혀졌다.
b) [1-14C] 알라닌(50mCi/mmol)으로부터 제조된 엘카토닌(27.6μCi/mg) 5㎍/kg 및 엘카토닌으로 환산해서, 로트 번호 111의 O-CS(T)를 사용하여 엘카토닌을 변형시킴으로써 제조된 콘드로이틴 설페이트 변형된 엘카토닌(1.52μCi/mg) 5㎍/kg을 래빗에게 정맥내 주사한다. 주사한지 2분 후 측정된 혈중의 각각의 화합물의 각도를 100으로 나타내고, 반감기를 측정한다. 그 결과는 다음과 같다:
엘카토닌 : 10분
콘드로이틴 설페이트 변형된 엘카토닌 : 50분
[실시예 2]
카복실 그룹 활성화 방법에 의한 GAG-변형된 단백질의 제조
A. 카복실 그룹 활성화된 글루코사미노글리칸의 제조
I. 카복실 그룹 활성화된 히알우론산의 제조
a) 히알우론산(MW 1,000,000)의 트리-n-부틸아민염 2800mg을 디메틸포름아미드 280ml에 용해시킨다. 수용성 카보디이미드[WSC 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)-카보디이미드)] 0.17ml 및 N-하이드록시숙신이미드 0.23g을 가하고 혼합물을 실온에서 20시간 동안 반응시킨다. 아세트산나트륨을 사용하여 포화시킨 에탄올을 반응 혼합물에 가하고, 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다.
NS-HA 로트 번호 200.
수율 : 2500mg.
b) 히알우론산(MW 1,000,000)의 트리-n-부틸아민염 2800mg을 디메틸포름아미드 280ml에 용해시킨다. WSC 0.17ml 및 N-하이드록시벤조트리아졸 0,27g을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 위에서 기술한 바와 동일한 방법으로 처리한다.
NB-HA 로트 번호 200-1.
수율 : 2680mg.
c) 히알우론산의 트리-n-부틸아민 2800mg을 디메틸 포름아미드 280mL에 용해시킨다. WSC 0.17ml 및 p-니트로페놀 0.28g을 가하고, 수득된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 위에서 기술한 단계 a)에서와 방법으로 처리한다.
PN-HA 로트 번호 200-2.
수율 : 2775mg.
II. 카복실 그룹 활성화된 글리코사미노글리칸의 제조
콘드로이틴 설페이트[소의 기관 연골 : CS(T), 상어연골 : CS(S), 고래연골 : CS(W)로부터 수득], 헤파린 [돼지의 소장 : Hep로부터 수득], 헤파란 설페이트[돼지의 신장 : HS로부터 수득) 및 데르마탄 설페이트(돼지의 피부 : DS로부터 수득)를 표 7에 명시된 조건하에서 위에서 기술한 단계 I에서와 동일한 방법으로 처리한다. 이렇게 수득된 생성물을 표 7에 나타내었다.
B. 카복시 그룹 활성화된 글리코사미노글리칸을 사용하여 변형시킨 단백질의 제조
I. 히알우론산 변형된 카탈라제의 제조
로트 번호 200의 생성물 100mg을 물 20ml에 용해시키고, 소의 간으로부터 수득한 카탈라제(Seikagaku Corporation) 2.5mg을 가한다. 수득된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 pH 7.0에서 반응시킨다. 이어서 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 혼합물으리 pH 값을 0.1N 수산화나트륨을 사용하여 10.0으로 조절한다. 곧이어, 혼합물을 아세트산을 사용하여 중화시키고, 분별 분자량 300,000의 막이 제공된 한외 여과 장치를 사용하여 여과시켜 반응되지 않은 카탈라제를 제거시킨다. 이렇게 수득된 카복실 그룹 활성화된 히알우론산 변형된 카탈라제의 특성은 다음과 같다:
로트 번화 210.
수율 : 44mg.
카탈라제 함량 : 2.3%.
히알우론산 함량 : 97.7%.
활성 : 변형되지 않은 카탈라제 활성의 84.3%.
[α]: -77.9 (C=1, HO).
상기식에서, P6은 카탈라제로부터, 평균 10개의 아미노 그룹이 제외된 카탈라제 잔기이고, Y는 히알우론산의 환원성 말단 잔기의 수소 원자이며, X는 위에서 정의한 바와 같고, n, m 및 ℓ의 합은 2,500이다.
II. 콘드로이틴 설페이트 변형된 슈퍼옥사이드 다스뮤타제의 제조
로트 번호 201의 생성물 100mg 및 소의 적혈구로부터 수득한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Seikagaku Corporation) 2.5mg을 위에서 기술한 I에서와 동일한 방법으로 반응시킨다. 이렇게 수득된 카복실 그룹 활성화된 콘드로이틴 설페이트 변형된 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 특성은 다음과 같다:
로트 번호 211.
수율 : 41.2mg.
슈퍼옥사이드 디수뮤타제 함량 : 2.0%.
콘드로이틴 설페이트 함량 : 98.0%.
활성 : 변형되지 않은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성의 81.4%.
[α]D: -78.0 (C=1, H2O).
상기식에서, P7은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제로부터, 평균 80개의 아미노 그룹이 제외된 슈퍼옥사이드 디스뮤타제이고, Y'는 콘드로이틴 설페이트의 환원성 말단 잔기의 수소원자이며, n, m 및 ℓ의 합은 40이고, X', R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
[실시예 3]
환원성 말단 잔기 락톤화 방법에 의한 GAG-변형된 단백질의 제조
A. 환원성 말단 잔기 락톤화된 히알우론산의 제조
히알우론산(MW10,000) 500mg을 물 50ml에 용해시킨다. 메탄올중의 0.1M 요오드 용액 5ml을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 6시간 동안 반응시킨다. 이어서, 0.1N 수산화칼륨 약 5ml를 반응 혼합물에 가하여 유리된 요오드를 변색시킨다. 아세트산칼륨을 사용하여 포화시킨 에탄올을 이 용액에 가한다. 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집하고, 물 50ml에 용해시킨다. 생성된 용액을 5℃에서 20시간 동안 강산성 이온 교환 수지[Dowex 50(H+)] 50ml와 접촉시킨다. 이렇게 수득된 여액을 트리-n-부틸아민을 백색 분말로서 수득한다.
로트 번호 310.
수율 : 410mg.
소모기-넬슨 방법(Somogyi-Nelson's method)으로 측정한 환원 당: 없음.
B. 환원성 말단 잔기 락톤화된 글루코사미노글리칸을 사용하여 변형시킨 단백질의 제조
I. 히알우론산 변형된 펩티드(H-Arg-Gly-Asp-Val-NH2; RGDV)의 제조
로트 번호 310의 생성물 60mg을 디메틸포름아미드 20ml에 용해시키고, RGDV의 디메틸포름아미드 용액 2.5mg을 가한다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 60oC에서 반응시킨다. 아세트산나트륨 25% 수용액 10ml를 반응 혼합물에 가하고, 수득한 혼합물을 실온에서 30분 동안 정치시킨다. 이어서, 에탄올을 가하고, 이렇게 형성된 침전물을 여과시킴으로써 수집한다. 여과물을 분별 분자량 5000의 막이 제공된 한외 여과 장치로 처리하여 반응되지 않은 RGDV를 제거시킨다. 이어서, 여액을 동결건조시킨다. 히알우론산 변형된 RGDV의 특성은 다음과 같다:
로트 번호 320.
수율 : 40.2mg.
RGDV 함량 : 3.3%.
히알우론산 함량 : 96.7%.
상기식에서, X는 위에서 정의한 바와 같다.
[실시예 4]
히알우론산 변형된 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 제조
comb-유도된 히알우론산(MW 150,000) 400mg을 2M 인산염 완충액(pH 11.5)에 용해시키고, 시아노겐 브로마이드의 아세토니트릴 용액(100mg/ml) 1ml를 가하고 생성된 혼합물을 4℃에서 5분 동안 반응시킨다. 반응이 종결된 직후, 아세토니트릴 150ml를 반응 혼합물에 가하여 침전물을 형성시킨다. 이렇게 수득된 침전물을 아세토니트릴을 사용하여 즉시 세척하고, 0.1M 탄산수소나트륨 용액에 용해시킨다. 개의 적혈구로부터 유도된 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 1% 용액 10ml를 반응 혼합물에 가하고, 4℃에서 20시간 동안 반응시킨다. 에탄올을 반응 혼합물에 가하여 침전물을 형성시키고, 생성된 침전물을 물에 용해시킨다. 에탄올 아민 01ml를 혼합물에 가한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응 혼합물에 에탄올을 가하여 침전물을 수득하고, 이렇게 수득된 침전물을 에탄올로 잘 세척하고 건조시켜 히알우론산 변형된 SOD를 수득한다.
이렇게 수득된 히알우론산 변형된 SOD의 특성은 다음과 같다:
수율 : 350mg.
SOD 함량 : 21.2%.
히알우론산 함량 : 78.8%.
분자량 : 172,000.
활성 : 변형되지 않은 SOD 활성의 82.1%.
전기영동 : [참조 : 제6도].
[비교실시예]
미합중국 특허 제4,585,754호의 콘드로이틴 설페이트 변형된 슈퍼옥사이드 디스뮤타제와 본 발명과의 비교
A. 수용성 카보디이미드를 사용한 콘드로이틴 설페이트의 형성
소의 기관 연골[CS(T)]로부터 수득한 콘드로이틴 설페이트 25mg을 물 10ml에 용해시키고, 생성된 용액의 pH 값을 01N 염산을 사용하여 5.0으로 조절한다. 이어서, 수용성 카보디이미드[WSC; 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 염산염] 0.0436, 0.145, 0.436, 1.45, 4.36, 14.5 및 43.6mg을 가한다. 이렇게 수득된 각각의 혼합물을 실온에서 6시간 동안 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 0.015M 인산염 완충 용액(pH 7.0)에 대해 투석시키고, 셀룰로즈 아세테이트 막[0.1M 피리딘/포름산 완충 용액(pH 3.0), 30분, 0.5mA/cm]을 사용하여 전기영동시킨다. 또한, WSC 43.6mg이 가해진 반응 생성물을 수산화나트륨 0.1N 수용액과 혼합하고, 1시간 동안 처리한후, 전기영동시킨다. 그 결과, CS(T) 자체는 확실히 에스테르화된 것으로 밝혀졌다(참조 : 제7도).
B. 수용성 카보디이미드를 사용한 SOD 자체의 중합화 및 콘드로이틴 설페이트 변형된 SOD 중합체의 확인
SOD 5mg을 물 10ml에 용해시키고, 생성된 용액의 pH 값을 01N 염산을 사용하여 5.0으로 조절한다. 이어서, WSC 2.5mg을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 6시간 동안 반응시킨다. 이어서, 0.015M 인산염 완충 용액(pH7.0)에 대해 투석시킨다. 이렇게 수득된 수용액을 로트 번호 B로 언급한다.
별도로, 미합중국 특허 제4,585,754호에 따라, CS(T) 25mg을 물 10ml에 용해시키고, 생성된 용액의 pH 값을 5.0으로 조절한다. 이어서, SOD 5mg 및 WSC 12.5mg을 가하고 혼합물을 실온에서 6시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 위에서 기술한 단계 A)에서와 동일한 방법으로 처리한다. 이렇게 수득된 수용액을 로트 번호 C로 언급한다.
C) 겔 크로마토그래피 용출 양상의 차이
위에서 수득된 각각의 생성물을 전개 용매로서 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.05M 인산염 완충 용액(pH 7.0)을 사용하여 세파로즈 CL4B(Pharmacia, Sweden; 1.2x100cm) 컬럼으로 겔 여과시킨다. 용출물을 시험관에 3.45ml 분획으로 수집한다. 제8도는 겔 여과의 결과를 나타낸다.
제8도에 나타낸 바와 같이, WSC의 존재하에서 카복실 그룹과 아미노 그룹을 둘 다 갖는 단백질과 콘드로이틴 설페이트 사이의 반응은 반응 생성물로서 복합 구조를 갖는 중합체를 생성한다.
또한, SOD의 함량은 각각 동일하지만, WSC-변형된 SOD의 활성은 본 발명의 글루코사미노글리칸 변형된 SOD보다 낮다:
WSC 방법(로트 번호 C): 변형되지 않은 SOD활성의 44.4%.
본 발명의 방법(로트 번호 121-2:D): 변형되지 않는 SOD 활성의 69.9%.
본 발명을 이의 특정한 실시 양태를 언급하면서 상세히 기술하였으나, 당해분야의 전문가들은 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 다양한 변화와 변형을 가할 수 있음이 분명하다.
Claims (6)
- 일반식(Ⅲ)의 글리코사미노글리칸-변형된 단백질.상기식에서, P는 단백질로부터 n개의 아미노 그룹이 제외된 단백질 잔기이고, n은 1 내지 100의 정수이며, GAG는 글리코사미노글리칸으로부터 환원성 말단 당 잔기가 제외된 글리코사미노글리칸 잔기이다.
- 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기를 부분 산화시켜 말단 당 잔기를 분해시킨 후 락톤을 형성하고 활성화된 글리코사미노글리칸을 단백질과 반응시킴을 포함하여, 제1항에 따르는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸 함량이, 단백질의 중량을 기준으로 하여, 1 내지 99.9중량%의 범위인 글리코사미노글리칸-변형된 단백질.
- 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 콜로민산, 히알우론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이추론산, 데르마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질.
- 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸의 환원성 말단 당 잔기를 산화시키고, 환원성 말단 당 잔기-산화된 글리코사미노글리칸을 산을 사용하여 처리한후 글리코사미노글리칸을 단백질과 반응시킴으로써 수득할 수 있는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질.
- 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르는 글리코사미노글리칸-변형된 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는, 암, 염증, 유전성 효소 결핍증, 혈전증, 동맥 경화증 및 류머티즘 치료용의 약제학적 조성물.
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