JPS6127924A - 心房ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、有用なナトリウム利尿、利尿および血管拡張
活性を有する、新規な、高分子量の心房ペプチドに関す
る。

哺乳類動物の心房心筋の細胞は多数の膜結合貯蔵顆粒を
有することが知られている。ラット、イヌ、ネコおよび
ヒト心房に認められているこれらの特徴的な分泌顆粒は
、ペプチドホルモン産生細胞のもつ顆粒に類似している
〔デ・ボールドほか（ＤａＢｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　）
　：ジャーナル・オデ・ヒストケミストリー・アンド・
サイトケミストリー（Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）　、　　
２６　：　１０９４〜１１０２（１９７８）参照〕。心
房心筋組織の粗抽出液を非利尿ラットに静脈内投与する
と、急速かつ強力なナトリウム利尿を生じることも報告
されている〔デ・ボールドほか（ＤａＢｏｌｄ、　ａｔ
　ａｌ　）　：ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ　８ｃ
ｉ、　）、　　２８　：　８９〜９４（１９８１）参照
〕。ラットの心房ホモジネートを短時間煮沸し、セファ
デックス（５ｅｐｈａｄｅｘ■）上で分画することによ
る部分精製はトリポードほか（Ｔｒｉｐｐｏｄｏ　ｅｔ
　ａｌ、　）によって行われた〔デロシーデイングズ書
オデΦザ・ソサイアティ・オデ・エクスペリメンタル・
アンド・バイオロジカルφメデイシン（Ｐｒｏｃ、　８
ｏｃ、　Ｆｉｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　）、１７
０：５０２〜５０８（１９８２））。これらの研究者に
より、ナ）　ＩＪウム利尿活性は、分子量３．６００〜
４４，０００ダルトンの全範囲に、また３　６．０００
〜４４，０００ダルトンの高分子量範囲および３．６０
０〜５，０００ダルトンの低分子量範囲の両ペプチド分
画に見出されている。

ラットの心房抽出物も低分子量分画（１０，０００ダル
トン以下）と高分子量分画（２０，０００〜３０．００
０ダルトン）に分画化され、両分面ともに、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏで平滑筋を弛緩させること、ラットに静脈内投与
すると強力なナトリウム利尿作用を示すことが明らかに
されている〔カリ−はが（Ｃｕｒｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ、
　）　：サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　。

２２１ニア１〜７３（１９８３）参照〕。

その後、約１９個から５９個のアミノ酸の範囲のアミノ
酸配列をもつ、様々な低分子量および中間分子量の心房
性、ナトリウム利尿ペプチドが多くの研究者によって開
始されてきた。デ・ボールドほか［ＤｅＢｏｌｄ　ｅｔ
　ａｌ、　：フェデレーション拳デロシーデイングズ（
Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、）、　　４２　（３）　：抄録１
８７０．６１１頁（１９８−３’）　）は分子量５１５
０ダルトン、アミノ酸４７個の配列を有する心房性す）
　ＩＪウム利尿ペプチドを精製し、これをカルジオナト
リンＩ（Ｃａｒｄｉｏｎａｔｒｉｎ　Ｉ　）と命名した
。さらに６個の、ナトリウム利尿活性を有するピークが
、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって得
られている。

最近、グラマーほか（Ｇｒａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　
：バイオケミカルーアンドゆバイオフィジカル・リサー
チ争コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　：５ｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ｒ，ｅｓ。

ｃｏｍｍｕｎ、　）　、　　１１６　（２）　：　６９
３〜７０６゜１９８３年１０月６１日〕は、分子量約３
，８００１、アミノ酸残基６６個のラット心房性ナトリ
ウム利尿因子の部分精製について報告している。

さらに最近になって、２８個のアミノ酸配列な有するラ
ットおよびヒトの心房性ナトリウム利尿ペデチｒが開示
されている〔それぞれ、フリンほか（Ｆｌｙｎｎ　ｅｔ
　ａｌ、）　：バイオケケミカル争アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｄ、　ｃｏｍｍｕｎ、）
　、　１１７仁鴇：８５９〜８６５（１９８３年１２月
２８日）、およびカンザワほか（Ｋａｎｇａｗａ　＆　
Ｍａｔｓｕｏ）：同誌、１１８（１）：１３１〜１３９
　（１９８４年１月１６日〕。

チボーほか（Ｔｈ１ｂａｕｌｔ　ｅｔ　ａｌ、　：　ｘ
フィービーニス・レターズ（ＦＥＥＳ　Ｌｅｔｔ、）、
　　１６７　：　３５２〜３５（５（１９８４））は７
３個のアミノ酸を有する中間分子量の心房性ナトリウム
利尿ペプチドの精−製を、またカンザワほか（Ｋａｎｇ
ａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　：バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチのコミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　ｃｏｍｍｕｎ、）＋　　１１９　（３）　：
　９５５〜９４０（１９８４））は４８個のアミノ酸を
有する中間分子量のβ−ラット心房性す）　ＩＪウム利
尿ペデチＶの精製を報告している。

本出願人による係属中の米国特許出願、第５５１，３７
２号（１９８３年１１月１０日出願）および第’５６９
．６８４号（１９８４年１月１０日出願）にはアミノ酸
約１９個から約２４個を有する低分子量の心房ペプチド
が開示され、請求されている。これらのベデチＶの中の
数種についてはさらに、本出願人の指導する研究グルー
プによって報告されている〔カリ−ほか（Ｃｕｒｒｉｅ
　ｅｔ　ａｌ、）：サイエｙス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　
　２２３　：６７〜６９（１９８４）］。

発明の簡単な記述 本発明は、有用なナトリウム利尿、利尿および血管拡張
活性を示す、新規な高分子量ペプチドを提供するもので
ある。この生物学的に活性なペプチドは、以下のアミノ
酸配列を有する。

Ｇｌｕ−Ｖａ　ｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ｅ　ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ−５ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＧＬｙ
−ＧＬｕ−Ｖａ　Ｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−８ｅＬニーＧｉ
ｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ−Ｇｕｙ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−０
５Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒ　Ｉ　ｌｅ−Ａｓｐ−
Ａｘｇ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ−５ｅｒ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｏｏｌ」 このペデチＶ構造中のアミノ酸成分は、以下の慣用の略
記号によって示した。

Ｌ−アラニン　　　　　　　　　ＡｌａＬ−アルギニン
　　　　　　　　ＡｒｇＬ−アスパラギン酸　　　　　
　ＡｓｐＬ−アスパラギン　　　　　　　ＡｓｎＬ−シ
スティン　　　　　　　　ＣｙｓＬ−グルタミン酸　　
　　　　　　ＧｌｕＬ−グルタミン　　　　　　　　Ｇ
ｌｎグリシン　　　　　　　　　　　Ｇ１７Ｌ−ヒスチ
ジン　　　　　　　　ＨｉｓＬ−イソロイシン　　　　
　　　ｌ１ｅＬ−ロイシン　　　　　　　　　ＬｅｕＬ
−リジン　　　　　　　　　　ＬｙｓＬ−メチオニン　
　　　　　　　ＭｅｔＬ−フェニルアラニン　　　　　
ＰｈｅＬ−プロリン　　　　　　　　　　Ｐｒ。

Ｌ−セリン　　　　　　　　　５ｅｒ Ｌ−ヌレオニン　　　　　　　　ＴｈｒＬ−トリプトフ
ァン　　　　　　　ＴｒｐＬ−チロシン　　　　　　　
　　ＴｙｒＬ−バリン　　　　　　　　　Ｖａ１ 本発明のペプチド物質は、それが最初得られたラット心
筋中には存在しなかった部分精製型で単離されている。

すなわち、低分子量ペプチドを実質的に含まず、他の細
胞成分や組織物質を含まない形に調製されている。この
新規な心房ベデチｒの生理学的特徴は、それが、細胞外
容量、ナ）　ＩＪウムおよび血管抵抗性を改変する体液
性物質に関する心房内分泌系の研究に際してきわめて重
要であることを示唆している。

本発明の新規ペプチドは、とくに、利尿剤、ナトリウム
利尿剤、腎血管拡張剤および平滑筋弛緩剤として治療的
に応用できる。すなわち、このペプチドは、ナトリウム
、尿量、に影響し、腎血管を拡張し、平滑筋の緊張を緩
和する。

要約すれば、この新規ペプチドはラット心房抽出物のｒ
ル濾過クロマトグラフィーによる分画化で得られた。こ
の操作で高分子量および低分子量分画が得られ、いずれ
も有用なす）　ＩＪウム利尿活性を有する。低分子量分
画は本発明者の係属中の上記出願に記載されているよう
に、分離され、数種の低分子量心房性す）　ＩＪウム利
尿ペプチドに精製された。

ラット心房抽出物の上記ゲル濾過クロマトグラフィーに
よって得られた高分子量分画〔ア）　ＩＪオペデチデン
（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｇｅｎ　）　−ＡＰＧ　）は本
発明に従って、等電点電気泳動および逆相Ｉ（ＰＬＯに
より分画され、部分精製ＡＰＧとした。部分精製高分子
量分画の臭化シアン分解物の精製により、上記ＡＰ（）
のアミノ酸１９〜１１１からなる９６個のアミノ酸の、
単一な生物活性臭化シアン分解ペプチドを生じた。これ
らのペプチドの配列分析と、中間分子量心房ペプチドの
配列分析に関する最近の報告〔チボーほか（Ｔｈ１ｂａ
ｕｌｔ、　ａｔ　ａｌ、）　：エフイーピーニス・レタ
ーズ（ＦｇＢｓ　Ｌｅｔ、ｔ、、）　、　　１６７　：
６５２〜．！＋５／）（１９８４）およびカンザワほか
（Ｋａｎｇａｗａ、　ｅｔ　ａｌ、　）　：バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）　、　１１９　：９３６〜９
４０（１９８４））とを組合せて、上記１１１残基のＡ
ＰＧの全−次構造を明らかにした。

発明の詳細な記述 本発明を形成する主題に関しては特許請求の範囲にとく
に指摘され、明確に請求されているが、以下の本発明の
好ましい実施態様についての詳細な記述により、本発明
はよりよく理解できるものと確信する。引用文献は、こ
の詳細な記述の末尾にまとめて示した。

ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、ラット心房抽出物
のナトリウム利尿および利尿活性は、高分子量（２０，
０００〜３０，０００　）および低分子量（１０，００
０以下）の分画に見出され、この両分画は平滑筋鎮痙活
性（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）も示すことが明らかにされた
（１）。トリプシンによる部分蛋白分解の影響から、本
発明者は、高分子量分画は低分子量分画の前駆体である
と結論した。高分子量分画のトリプシン処理により鎮痙
活性は著明に増大したのである。ｒル濾過において低分
子量分画と共移動する活性物質（２）は、逆相ＨＰＬＣ
でアトリオペデチンＩ、ＩＦおよび■に分離される（３
）。したがって、高分子量分画の活性成分は、低分子量
生物活性心房ペプチドであるアトリオペデチン（ＡＰ）
の前駆体、アトリオベデチｒン（ＡＰＧ　）と命名され
た。これらのアトリオペデチンは、アトリオペデチデン
の全１１１個のアミノ酸のうち、上述の本発明者の係属
中の特許出願に記載されているような以下の部分配列を
有するものである。

ＡＰ　ｌ　＝アミノ酸８８〜１０８ ＡＰＩ［＝アミノ酸８８〜１１０ ＡＰＩＩＩ＝アミノ酸８８〜１１１ 高分子量心房ペプチドおよびその誘導体の精製には、各
分画な部分トリプシン分解によって活性化したのち、平
滑筋を用いた生物検定を実施した（１．２）。活性分画
は低分子量ア）　ＩＪオペデチンの配列を含有する６）
。高分子量分画（Ｇ−７５セフアデツクス・クロマトグ
ラフィーにより得る）の精製の第一工程は等電点電気泳
動であって、これにより上記分画が生物活性物質群の混
合物（見かけの等電点：ｐＨ４，９１，５，０１，５，
１７，５，３４および６．０３　）であることが明らか
にされた。生物活性物質群（ｐＨ４，６〜５．４）の混
合物を、両性電解質および蔗糖の除去後、逆相ＨＰＬＣ
に付した。典型的なりロマトグラムでは、生物活性ペデ
チＰの複合混合物が３１および３４％アセトニトリルの
ところに集まった。これらのベデチＶのうち、最も多い
成分はｒル分析により十分純粋であって（見かけの分子
量：　１７．０００　）　、これを本発明の方法に従っ
てさらに精製し、特性づけするアトリオベデチデンとし
て選択した。

アトリオペデチデンから誘導されるアトリオペデチン類
の単純な配列に比べて、アトリオベデチデンの複雑さか
らみて、本発明者は、アトリオ、ペデチｒンも、もつと
大きいあるペプチドの誘導体であろうと結論した。した
がって、化学的分解の影響を検討した。低分子量アトリ
オベデチン配列にはメチオニンがない（５）ことから、
臭化シアン分解が選ばれた。臭化シアン分解はア）　Ｉ
Ｊオペデチｒンの１１１個の全アミン配配列の１８位の
メチオニンの位置で起こり、９６個のアミノ酸からなる
高分子量ペプチド断片が得られる。全高分子量分画の臭
化シアン消化物の分画化における初期工程で生物活性物
質（３０〜３１チアセトニ）　ＩＪシル部見出される）
が得られ、これを逆相ＨＰＬＣで精製すると、電気泳動
による見かけの分子量が９．５００ＸＨＰＬＣで単一の
成分が生成した。

両ペプチドの配列データを以下に示す。

Ｌｙｓ　−Ａｓ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１（ｉ
　ｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ　−Ｍｅ　ｔ
−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−　Ｇｌ　ｕ−Ａｓｐ−へＧｌｙ−
Ａ１ａ’Ａｌａ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　へＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
４Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−ＣＰｒｏ−Ｔｒｐ−’Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ｅｔ
−Ａｓｐ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＣＰｒｏ−５ｅｒ−
Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＤＣ５−Ａ５ｎ−５ｅ
ｒ−Ｐｈｅ−Ａｒ　−Ｔ　ｒ−ＣＯＯＨＤこれらのベデ
チｒの配列とチボーほか（Ｔｈ１ｂａｕｌｔｅｔａ１．
：エフイービーニス・レターズ（ＦＥＢＳｂｅｔｔ、、
）＋　　１６７　：　６５２〜３５６（１９８４））お
よびカンザワほか（Ｋａｎｇａｗａ　ｅｔ、　ａｌ　：
バイオケミカル・アンｒ・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ。

ｃｏｍｍｕｎ、　）　、　　１上９　：　９３３〜９４
０（１９８４））の配列の重複から、１１１個の残基を
有するアトリオペデチｒンの一次構造が明らかである。

Ｃ末端分析の結果もこれと一致する。ＡＰＧのカルボキ
シペプチダーゼ処理では直ちにＰｈｅが除去されたが、
ＴｙｒまたはＡｒｇの放出は検知されなかった。

一方、臭化シアン分解ペプチドを同様に処理した場合は
、Ｔｙｒ　、、ＡｒｇおよびＰｈｅの急速な放出を認め
た（第１表）。これから、このプレバレージョンは、同
じ配列を有し’　ＴＹｒ　％　ＡｒｇおよびＰｈｅで終
わる３種のペプチドを含むことがわかる。

この１１１個のアミノ酸残基配列には、そのＣ末端に最
近報告された低分子量ペプチド第１表 臭化シアン分解ペプチドのＣ末端配列分析Ｔｙｒ　　　
　　　１０　　　１８　　　４５　　　６２Ａｒｇ　　
　　　　２３　　　２６　　　５５　−　７４Ｐｈｅ　
　　　　　２６　　　２７　　　６５　　　８９（配列
にアンダーラインを付した）が導入されていて、一対の
塩基性アミノ酸残基（この場合Ａｒｇ−Ａｒｇ　）と結
合している。これは多（の分泌ペプチドおよび蛋白質の
前駆体にみられる典麗的な切断部位の形である。

上に示した１１１個のアミノ酸からなるアトリオペデチ
ｒンの全−次構造は、アトリオペデチｒンの最初の残基
６４個のＡアミノ酸配列、臭化シアン分解ペプチドの最
初の残基６９個のＢアミノ酸配列、中間Ｍｒ型型心ナナ
トリウム利尿因子Ｃアミノ酸配列（１１Ｌおよびβ−ラ
ット心房ナトリウム利尿ポリペプチドのＤ全アミノ酸配
列（１２）から推断された。

以下の実施例には、高分子量（２０，０００〜３０，０
００　’）分画の上記成分（アミノ酸１１１個）および
この分画から誘導された臭化シアン分解ペデチげ断片（
アミノ酸９６個）について、精製、性質の一部、ならび
にナトリウム利尿、利尿および血管拡張活性を示す。

例１ アトリオペデチデンの調製 １２００匹のラットの心臓から心房抽出物を調製し、す
でに報告されているように（３）、一般操作によってＧ
−７５セフアデツクス上クロマトグラフイーに付した。

高分子量分画を凍結乾燥し、両電解質キャリヤーである
ｐＨ４〜６のアンホリン（エルビーケー〇インストリニ
ーメンツ、ロックヴイル、メリーランド）Ｋ溶解し、１
１０−の蔗糖濃度勾配カラム（エルビーケー）を用いｉ
、ｏｏ。

Ｖで４０時間電気泳動を行った（４）。次にカラムを４
８−７時の速度で溶出し、２ｔｎｔずつの分画な集めた
。−を測定したのち、カラム分画の一部（５０μｔ）を
とって−を８に調整しく　０．Ｉ　Ｍ　）リス緩衝液（
ｐＨ８，４）　４５０ｐＬを添加）、トリプシン（シグ
マ・ケミカル、セントルイス、ミでり−、１−につき１
単位）と２２℃で１時間インキュベートした。これらの
プレバレージョンについて、既報の一般操作（１，２）
により、ヒヨコ直腸弛緩活性を測定した。生物活性を有
するカラム分画（約６０−）を合しくｐＨ４，６〜５．
４）、０．５Ｍ酢酸中Ｇ−５０セファデックス（８０Ｘ
２．７ｃｒｎ）を用いてクロマトグラフィーに付し、両
電解質と蔗糖を除去した。凍結乾燥後、この物質を、ブ
ラウンリー　ＲＰ　−３００アクアボアカラムおよび既
報（６）の溶媒系により逆相ＨＰＬＣに付した。勾配は
（ａ）０〜２４　％に、　８．８分、（ｂ）　２４〜２
８％Ａ１２５分、（ｃ）２８〜６６％Ａ、１００分以上
から構造された。ＨＰＬＣカラム分画（２−）の一部（
５０μｔ）をとり、真空中で乾燥し、０．１　Ｍ　）リ
ス（ｐＨ８）５００μＬにとり、トリプシン処理し、６
００匹のラット心臓からの心房抽出物をＧ−７５セフア
デツクス上クロマトグラフイーに付して得られた高分子
量分画の凍結乾燥物（１，３）を７０チギ酸１０ｆｎｔ
に溶解し、ガラス栓付チューブ中、臭化シアン（イース
トマン・オーがニック・ケミカルズ、ロチニスター、Ｎ
、Ｙ、）　５００　ｉｖに加えた。１６時間（２２°Ｃ
）後、水９０−を加え、この溶液を凍結乾燥した。上述
のシステムを用い、（ａ）０〜２７．２　Ｔｏ　Ａ、　
　１０分、つ℃・で（ｂ）２７．２〜３２％、６０分で
、残留物を逆相ＨＰＬＣＩｃ付した。

生物活性分画（２９，６〜３１．２％Ａで得られた）を
真空中で乾燥し、溶媒Ａ’　（−１０パノール−１中０
．１％トリフルオロ酢酸）およびＢ（水中０．１　％ト
リフルオロ酢酸）の混合物を、０．６７−７分の速度、
（ａ）　ｊ３〜１５　％　Ａ’、５分、ついで（ｂ）１
５〜２４％Ａ’、９０分で用いる第２のプロトコールに
よって精製した。生物活性分画（２２〜２２．５％Ａ／
　）を真空中で乾燥し、溶媒Ａ”（ゾロパノール−１中
０．０８５チリン酸）およびＢ“（水中０．０８５％リ
ン酸）を、０．６７７！／分の速度、０〜５０チＡ“、
５０分で用いる第６のプロトコールに付した。生物活性
生成物（３２，１％Ａで得られた）を上記第２のプロト
コールを用いて２回ＨＰＬＣに付して、２２．１−Ａ′
に単一の生物活性成分（，２１５ｎｍで検出）１１０μ
ｔ（蛋白質）を最終的に得た。

中１１０００で２２時間加水分解して行った。加水分解
物を凍結乾燥し、０−フタルアルデヒＶ・プレカラム・
デリヴイテイゼーション（６）を用い、ついで逆相ＨＰ
ＬＣによるウォーターのアミノ酸分析システムに適用し
た。

ムダ４フ０Ａ型気相シすエンサーを使用して、２〜４　
ｎｍｏｌ　　の配列決定エドマン分解により実施しく７
）、フェニルチオヒダントイン誘導体をＨＰＬＣにより
検出した（８）。平均反応収率は９３％以上であった。

　　　　　　　　　　゛ 漬液（ｐＨ５，５’）　２８０μＬに１〜２ｎｍｏ１の
ペデチドを溶かし、これにカルボキシペプチダーゼＹ（
２μ？、２０μｔ１ヒアス・ケミカル、ロックフォード
、イリノイ）を加えて実施した。間隔をおいて、サンプ
ル５０μｔを採取し、２５μｔの１％トリフルオロ酢酸
に加え（９）、放出されたアミノ酸を上述のアミノ酸分
析によって測定した。

ゲル分析 ペデチげ（１〜２μ？）の電気泳動はレムリ（Ｌａｅｍ
ｍｉｉ、１０）Ｋ従い、１５チポリアクリルアミドｒル
（０，４％ビスアクリルアミｒ）を用いて行った。ゲル
は０．８チ硝酸銀で２０分間染色し、０．００５％クエ
ン酸および０．２チホルムアルデヒドの溶液で展開した
。

例２ 例１に記載したようにして精製した、臭化シアン分解高
分子量ラット心房ペプチドのナトリウム利尿活性をイヌ
で試験した。

高分子量ペデチ−はそのまま、またはトリプシン処理後
に注射した。トリプシン（１単位１−）インキュベーシ
ョンは、精製臭化シアン分解高分子量ペプチド１００μ
ｔを用い、室温で６０分間実施した。アトリオペデチン
エおよび■はペニンスラ・ラボズ（サンカルロス、カリ
フォルニア）から購入した。アトリオペデチン■および
８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−Ａｒｇ−アトリオペデチン
■〔フリンら（ｐｌｙｎｎ　ｅｔ　ａｌ、）のペプチド
（１３））は自動ペプチド合成により合成した。

いずれかの性のモングレルイヌをベントパルビタールナ
トリウム（６０■／に？、静注）により麻酔した。脇腹
を切開して右腎の腹膜を露出させた。

尿管にｐｇ　１６０　（レイ−・アダムス）管を挿管し
、これをフラクションコレクターにつないで尿を採取し
た。電磁流量計（径８１１１Ｉ！、カロリーナ・インス
トリューメント）を右腎動脈の周囲に置いて、腎血流を
測定した。２２’Ｆ’−ジの針（ｐｗ　５０管およびシ
リンジに連結）を流量計上の腎血管に挿入した。イヌに
は食塩水（０，９％ＮａＣ１）を１．３ｍｔ／分の割合
で連続的に注入した。尿サンプルは５分間隔で集め、容
量、ナトリウム、カリウムおよび浸透圧を測定した。ペ
デチｒは３０分間隔で注射した（腎動脈内）。

結果 高分子量（臭化シアン）ペプチドは濃度依存性の利尿を
生じ、これはトリプシン処理によって有意な変化を示さ
なかった。閾値反応（尿量の５０チ増加）はＱ、３ｎｍ
ｏｌで達成されたが、３　ｎｍｏｌでは尿流量は４５０
％増加した。容量の２００チ増加を生じるのに必要なペ
プチドの量を比較したところ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−ＡＰｍ　Ｏ，３ｎｍｏｌ　、高分子量＋トリ
プシン処理、高分子量のまま０．７ｎｍｏｌ、アトリオ
ベデチン■およびｍ　１０　ｎｍｏｌで、アトリオペデ
チンエでは３　Ｑ　ｎｍｏｌ　　でも尿量は５０％しか
増えなかった。腎血流量を２０ｍ／分増加させるのに必
要な用量を比較した血管拡張作用の強さは次の順序であ
った。すなわち、５ｅｒ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ
　−ＡＰ　ｍ　１　ｎｍｏｌ　、臭化シアン処理高分子
ペプチド（トリプシン前処理の有無いずれでも）　！１
　ｎｍｏｌ、アトリオペデチンｍ　８　ｎｍｏｌ、アト
リオペデチンｎ　１７　ｎｍｏｌで、アトリオペデチン
エは３０　ｎｍｏｌでも腎血流量を６−７分しか変化さ
せなかった。各ペデチｙＫつき６〜４匹の別のイヌを用
いて試験した。

要約すると、精製した高分子量アトリオペデチデン臭化
シアン断片は著明な利尿作用を示し、その作用は低分子
量ペデチｒのうち最も強力なものと差がなかった。これ
から、このペプチドは腎臓　　　′で直ちに変換するか
、または腎臓がこのペデチｒのまま直接認識するかのい
ずれかが考えられる。

ペプチドの作用強度の順序が、腎血管拡張作用とナトリ
ウム利尿作用とで一致しないのは、これらの反応が別個
のレセプターを介するためであろう。

アミノ酸１１１個のアトリオペデチｒン（臭化シアン分
解前の）の部分精製物をイヌで試験した場合も、はぼ同
様の利尿作用が認められた。

以上の本発明の詳細な記載において引用された文献は次
のとおりである。

文献 １）カリ−ほか（Ｃｕｒｒｉｅ　ａｔ　ａｌ、　）　：
サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）＋　２２１　：　７４
〜７３（１９８３）２）カリ−はか（Ｃｕｒｒｉｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、）　：デロシーデイングズｅオプ・ず・ナシ
ョナル・アカデミ−・オデ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）。

８１：１２３’Ｄ〜１２３３（１９８４）６）カリ−ほ
か（Ｃｕｒｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　：サイエンス（
５ｃｉｅｎｃｅ　）、　２２３　：　６７〜６９　（１
９８４）４）プラーほか（Ｇｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
　）　：バイオケミカル拳ジャーナＡ／　（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ、　）　、　　１２７　：８６５〜８７４（
１９７２） ５）グロスほか（Ｇｒｏｓｓ　＆　Ｗｉｔｋｏｐ　）　
：ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、　　２３７　：　１　Ｂ
５６〜１８６０６）ヒルほか（Ｈｉｌｌｅｔａｌ、）：
アナリテイカ／ｌ／−ケミストリー（Ａｎａｌ　Ｃｈｅ
ｍ、　）　、　　５１　：１６６８〜１３４１（１９７
９） ７）バンカピラーほか（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、）：メソツズ・イン・エンディモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、）、　　９１　：　６９９
〜４１３　（１９８５）８）バンカピラーほか（Ｈｕｎ
ｋａｐｉｌｌｅｒ　＆　Ｈｏｏｄ　）　：同誌、４８６
〜４９３ ９）ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ　）　：メソツズ・イン・
エンディモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
）　、　　４７　：８４〜９３（１９７７） １０）　　レムリ（ｒ、ａｅｍｍｌｉ　）　：ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ　）　。

２２７　：６８０〜６Ｂ−５（１９７０）１１）チが−
ほか（Ｔｈ１ｂａｕｌｔ　ａｔ　ａｌ、　）　：　ｘ　
７．、イービーニスｅレターズ（ＦＥＢ８　Ｌｅｔｔ−
）　？１６７　：６５２〜３５６（１９８４） １２）カンガワほか（Ｋａｎｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、）
　：バイオケミカル・アンＰ・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　）ｔ　　１１９　：９５６〜９４０（
１９８４）１６）フリンほか（Ｆｌｙｎｎ　ｅｔ　ａｌ
、）　：バイオケミカル・アンド・バイオフィシカル・
リサーチ・コミュニケーショｙ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、）、　　１１７　　：　８５９〜８６５
（１９８３）本明細書の記載から、本技術分野におげろ
熟練者には、本発明の精神および範囲から逸脱しない範
囲で多くの他の例が自明であろう。これらは本発明の範
囲に包含されるものである。

手続補正書（自船 昭和６０年　４月３日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 からなり、強力なナトリウム利尿、利尿および血管拡張
   活性を有するペプチド
2. （２）特許請求の範囲第１項記載のペプチドの治療有効
   量からなる、ナトリウム利尿、利尿または血管拡張用医
   薬組成物
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のペプチドの治療有効
   量を哺乳類動物に投与することを特徴とする、哺乳類動
   物にナトリウム利尿、利尿または血管拡張をもたらす方
   法
4. （４）特許請求の範囲第１項記載のペプチドのアミノ酸
   １９から１１１までの配列からなるペプチド断片
5. （５）特許請求の範囲第４項記載のペプチドの治療有効
   量からなる、ナトリウム利尿、利尿または血管拡張用医
   薬組成物
6. （６）特許請求の範囲第４項記載のペプチドの治療有効
   量を哺乳類動物に投与することを特徴とする、哺乳類動
   物にナトリウム利尿、利尿または血管拡張をもたらす方
   法