JPS5810380B2 - ペプチドノ セイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は視床下部ホルモンの一種である黄体形成ホルモ
ン分泌刺戟ホルモン（ＬＨＲＨ）機作用を有する新規な
ペプチドおよびその製法に関し、更に詳しくは一般式 を有するペプチドおよびその塩ならびにそれらの製造に
関する。

上記一般式に於いて、アルカノイルとは炭素数２〜５の
直鎖状若しくは有枝鎖状の低級アルカノイル基例えばア
セチル、グロピオニル、ブチリル、インブチリル、バレ
リル等を示し、アルキルとはメチルまたはエチルを示す
。

Ｙは（式中、ｎはＯ乃至３を示す。

）を有するＤ−α−アルキルグリシン残基を示し、２は
エチルアミノ基又は２位に１乃至３個弗素置換したエチ
ルアミノ基を示すが、Ｙに於いてｎ−００場合は弗素置
換エチルアミノ基類のみを示す。

黄体形成ホルモン分泌刺戟ホルモンのアミノ酸配列がＬ
−ピログルタミル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−トリプトフィ
ル−Ｌ−セリル−Ｌ −Ｆ−ロシルークリシルーＬ−ロ
イシル−Ｌ−フルギニルーＬ −プロリル−グリシンア
ミドであることが確認されて以来〔サイエンス１７３巻
１０３６頁（１９７１年）〕多くの類似化合物が合成さ
れて来たが、本発明者等も先にＮ末端Ｌ−ピログルタミ
ン酸残基、６位のグリシン残基およびＣ末端グリシンア
ミド残基を変換した化合物に強い生理活性を見出した（
特願昭４９−４８１７４号〔特開昭５０−１４２５６３
号〕）。

今回これらの位置のアミノ酸残基を更に別な残基に発展
させることにより、更に強力な生理活性を有する化合物
を得て本発明を完成した。

本発明の方法によって得られる前記一般式（Ｉ）を有す
る化合物は、ヒトに投与する場合には、年令、体重、症
状等によっても異なるが、通常成人１回当り数μｇ乃至
１００μｇ程度であり、投与方法は非経口的投与、特に
皮下、皮肉また筋肉内等の注射が好適である。

本発明の方法によれば、前記一般式（Ｉ）を有する化合
物は一般式 〔式中、Ｙおよび２は前述したものと同意義を有する。

〕を有するペプチドをＮ−アルキル−Ｎ−アルカノイル
グリシン〔ここにアルキルおよびアルカノイルとは前述
したものと同意義を有する。

〕の反応性誘導体（■〕と反応させ、常法によって精製
し、必要ならば常法によって酸付加塩に変換することに
より得ることが出来る。

酸付加塩を形成し得る酸として好適なものとしては、通
常酸付加塩の形態の医薬に使用される酸例えば塩酸、硫
酸のような鉱酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロ
ン酸、コノ・り酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、
乳酸、安息香酸、酒石酸のような有機酸があげられる。

本発明の方法によって得られる化合物のうち、特に優れ
た活性を示す化合物は、Ｎ末端のアルカノイル基がアセ
チル、Ｃ末端が２−フルオロエチルアミノ基のものであ
る。

本発明の方法に使用されるＮ−アルカノイルＮ−アルキ
ルグリシンの反応性誘導体としては、通常のペプチド合
成化学において使用される反応性誘導体を特に限定な（
使用することが出来る。

例えば活性エステル、酸アジド、酸ハライド、混合酸無
水物、酸無水物等があげられ、更に反応系中において反
応性誘導体が形成される場合例えばＮ−アルカノイル−
Ｎ−アルキルグリシンとＮ−Ｎ’−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド、またはカルボニルジイミダゾール等の活
性化剤とを同時に化合物（ＩＩ）と反応させるか或いは
段階的に即ち予め前記の王者を反応させた後に反応生成
物を取り出したまたは取り出すことなく化合物（ＩＩ）
と反応させる場合も含まれる。

本発明の方法に使用される最も好適な反応性誘導体は活
性エステルである。

使用される活性エステルとしては、通常のペプチド合成
化学において使用されるものを特に限定なく使用するこ
とが出来る。

そのような活性エステルの例としてはベンゼン環に電子
吸引性の置換分を有するフェノールとのエステル例えば
ｐ −ニトロフェニルエステル、ホリハロケノフェニル
エステル例えば２・３・５−トＩＪクロロフェニルエス
テル、ペンタクロロフェニルエステル、ヒドロキシキノ
リンまたはヒドロキシピリジンとのエステル例えば８−
キノリルエステル、２−ピリジルエステル、チオフェノ
ールとのエステル、Ｎ−ヒドロキシイミドとのエステル
例えばサクシンイミドエステル、フタールイミドエステ
ル等があげられる。

本発明の方法は、適当な溶剤中で前記化合物（■）と前
記化合物（ＩＩＩ）とを接触させることによって容易に
実施される。

反応に使用される溶剤としては種々の不活性有機溶剤が
あげられるが原料化合物の溶解度の高い溶剤が好ましく
例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、
アセトニトリル等が好適である。

反応温度に特に限定はないが、副反応を抑え目的化合物
を収率よく得るためには比較的低い温度で反応を行なう
のが好ましく通常反応は−り０℃〜４０℃程度で行なわ
れる。

反応に要する時間は、主として原料化合物の種類、反応
温度、溶剤の種類等によっても異なるが、通常数時間乃
至数十時間である。

反応終了後、目的化合物は常法によって反応混合物から
採取される。

例えば反応混合物に目的化合物不溶性の溶剤を加えて沈
澱させることによって得ることができる。

これは更にゲル沢過法、カラムクロマトグラフィー、再
沈澱法のような常法によって精製することが出来る。

本発明の方法によって得られる化合物の例としでは例え
ば次のような化合物があげられる。

１、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−ヒスチジ
ル−Ｌ −） ！Ｊ ７’ トフイルーし一セリルーＬ
−ｆロンルーＤ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギ
ニル−Ｌ−プロリン−２・２・２−トリフルオロエチル
アミド ２、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−し−ヒスチジ
ル−Ｌ−ドリフトフィル−し−セリル−Ｌ−チロシル−
Ｄ−ノルロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ −フルギニルー
Ｌ−７’ロリンエチルアミド ３、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−ヒスチジ
ル−Ｌ−ドリフトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−ｆロンルー
Ｄ−ノルロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ −フルギニルー
Ｉ、−７’ロリン−β−フルオロエチルアミド ４、 Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−トリ
プトフィル−Ｌ−セリル−し−チロシル−Ｄ−ノルロイ
シル−Ｌ−ロイシル−Ｌ −フルギニルーＬ−プロリン
−２・２・２− トリフルオロエチルアミド 次に実施例をあげて本発明の方法を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものではない。

実施例の記載において、薄層クロロマドグラフィーはメ
ルク社製Ｄ Ｃ−ＦｅｒｔｉｐｌａｔｔｅｎＫｉｅｓｅ
ｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ （厚さ０．２５ｍｍ）
を使用し、展開溶剤は次の如くである。

Ｉｎ−ブタノール−酢酸−水（６０：１５：２５） ■ ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（１５：１０
：３：１２） ■ クロロホルム−メタノール−３２％酢酸（６０：４
５：２０） 目的化合物の検出は紫外線照射、エールリッヒ呈色反応
、パクリ呈色反応、板目呈色反応によって行なった。

標準物質としてのＬＨ−ＲＨのＲｆｌｌｉｔは上記溶剤
系について各々次の値である。

■、０．３３；［Ｉ、０．５２；ｍ、０．６３アミノ酸
分析は、定沸点塩酸（４％チオグリコール酸含有）によ
り真空封管中１１０℃、２４時間加水分解し自動分析機
により行なった。

実施例 Ｉ Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−ヒスチジル−
Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−セリル−し−チロシル−Ｄ−
アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−７”ロ
リン−２・２・２−トリフルオロエチルアミド Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ
−４リプトフイルーＬ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ア
ラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フルギニルーＩ、−７’ロ
リン−２・２・２−トリフルオロエチルアミド〔薄層ク
ロマトグラフィーＲｆ 値；■、０．４８；ｎ、０．７
３；ＩＩＩ、０．８２、旋光度：〔α〕■−２２° （
Ｃ−０，３、氷酢酸）、１１００ηをメルカプトエタノ
ール０．１５ｍ、７ニソール０．１１１１１存在下、弗
化水素５ｍ１ｍ氷中氷冷下分攪拌する。

弗化水素を減圧で溜去し残渣に水１０ｄを加えトリエチ
ルアミンでｐＨを９となす。

酢酸エチル１０ｒｕｌで３回振った後不溶物を沢去し、
得られた水溶液を減圧上濃縮乾固する。

残渣をジメチルホルムアミド１１１Ｌｌにとかし、Ｎ−
アセチル−Ｎ−メチルクリシン−２・３・５− ） ’
Ｊジクロロェニルエステル（融点７０〜７３°Ｃ１針状
晶）２０〜を加える。

室温に６時間放置後酢酸エチル１０ｍ１を加え生じた沈
澱を遠心分離（２ｏｏｏｒ、ｐＪｒＬ）５分）で集め、
セファデックスＧ−２５（商品名）を担体とする分配ク
ロマトグラフィーによって精製する。

〔カラムサイズ２．７Ｘ９０ｃｍ、分配系ｎ−ブタノー
ル：酢酸：水（４：１：５））。

１０ａづつの分画に分堆し２８０ｍμの紫外部吸収およ
び薄層クロマトグラフィーによって目的化合物の溶離す
る部分を確認し、５５番目から５９番目の分画を集めて
減圧にて濃縮し真空にて乾固する。

残渣を少量の水にとかし更にＳＰ−セファデックスＣ−
２５（ＮＨ４＋型）カラム（１ｘ１ｏｃｍ）にかけ、０
．０２モル重炭酸アンモニウム溶液５０ｍ１を通す。

重炭酸アンモニウム溶液の濃度を更に０．０４モル（３
０ｍｌ）を経て０．０６モルとすると求める分画が溶出
する。

これを集め吸引濾過した後凍結乾燥する。

得られた粉末を０．５Ｎ酢酸５ＩｒＬｌにとかし再び凍
結乾燥すると目的化合物の酢酸塩の純品が得られる。

収量４３ｍｇ旋光度：〔α〕−４０．６° （Ｃ−０，
３，０，ＩＮ酢酸） 薄層クロマトグラフィーＲｆ値 ■、０．３６；ＩＩ、０．５６；ＩＩＩ、０．６９アミ
ノ酸分析（ロイシンを１とした相対値）実施例 ２ Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−し−ヒスチジル−
Ｌ−）リプトフイルーＬ−セリル−し一チロシルーＤ−
ノルロイシルーし一アルギニルーＬ−７’ロリンエチル
アミド Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ
−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ノ
ルロイシル−Ｌ−ロインルーＬ −アルギニル−Ｌ−プ
ロリンエチルアミド〔薄層クロマトグラフィーＲｆ値：
■、０．５６ ； ｎ、０．７５ ；０．３、氷酢酸）
〕８０Ｉｒ１ｇをメルカプトエタノール０．１５ｍ１、
アニソ−／Ｌ／ ０．１ ｍｌ存在下、弗化水素５ｄ中
氷冷下３０分間攪拌する。

弗化水素を減圧で溜去し、残渣に水１０１１Ｌｌを加え
、トリエチルアミンにてｐＨ９とする。

酢酸エチルで３回洗った後不溶物を遠心分離で除去し、
得られた水溶液を減圧上濃縮乾固する。

残渣をジメチルホルムアミド１ｒｒＬｌにとかし、Ｎ−
アセチル−Ｎ−メチルグリシン−２・３・５−トリクロ
ロフェニルエステル１５智を加える。

１晩室温に放置後酢酸エチル１０ｒＩＬｌを加え、生じ
た沈澱を遠心分離（２００Ｏｒ、 ｐｏｍ、 ５分）で
集め、実施例１と同様にセファデックスＧ２５を担体と
する分配クロマトグラフィーにかけ、２９番目から３４
番目の分画を集める。

更に実施例１と同様にＳＰ−セファデックスにかけ、２
回の凍結乾燥を行なう。

収量 ３１ｍｇ 酢酸） 薄層クロマトグラフィーＲｆ値 ■、０．４０；ＩＩ、０．６９；ＩＩＩ、０．８３アミ
ノ酸分析値（ロイシンを１とした相対値）実施例 ３ Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−ヒスチジル−
Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−
ノルロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−７
”ロリン−２−フルオロエチルアミド Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ
−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ノ
ルロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ −アルギニル−Ｌ−プ
ロリン−β−フルオロエチルアミド〔薄層クロマトグラ
フィーＲｆ値；Ｉ、−２３，０°（Ｃ＝０．３、氷酢酸
）〕５０／ｒＬｌより、実施例１及２と同様にして目的
物を得た。

収量 １７ダ 酢酸） 薄層クロマトグラフィーＲｆ値 Ｉ、０．４３；ＩＩ、０．６８；■、０．８３アミノ酸
分析値（ロイシンを１とした相対値）実施例 ４ Ｎ−７セチルーＮ−メチルグリシル−Ｌ−ヒスチジル−
Ｌ −） ＩＪブトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル
−Ｄ−ノルロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−
Ｌ−プロリン−２・２・２−トリフルオロエチルアミド Ｎａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ
−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ −−チロシル−Ｄ
−ノルロイシル−し−ロイシル−Ｌ −アルギニル−Ｌ
−７”ロリン−２・２・２−トリフルオロエチルアミド
〔薄層クロマトグラフィーＲｆ値、Ｉ、０．５２；ｎ、
０．７５；ｍ、０．８５゜５０／ｎ９より実施例１．２
．３と同様にして目的物を得た。

収量 １１．１ｒｖ 酢酸） 薄層クロマトグラフィーＲｆ値 Ｉ、０．３９；ＩＩ、０．６１；ＩＩＩ、０．７６アミ
ノ酸分析値（ロイシンを１とした相対値）試験例 排卵誘導起作用の測定 ウィスター今道系雌ラット（体重２５０１前後）を室温
２３±１℃、人工照明下（午前５時点灯、午後７時消灯
）で飼育し、その間４日性周期を３回以上繰り返した個
体を選んで使用した。

発情前期の午後１時にベンドパルビタールＮａ塩（３０
■／ｖ）を腹腔内投与し、同日午後４時に０．１ ｒｎ
ｌの生理食塩水に溶解した検体を皮下に投与する。

翌日正午から午後１時の間に層殺し直ちに輸卵管を別出
し、２枚のスライドガラスにはさんで顕微鏡下で卵の検
束を行なった。

各検体冬用量について５匹のラットを使用した。

実験結果のＥＤ５ｏは次の通りである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式Ｌ〜ヒスチジル−Ｌ−）リプトフイルーＬ−セリ
   ルーＬ−チロシル−Ｙ−Ｌ−ロイシル−Ｌアルギニル−
   Ｌ−プロリル−ＺＣ式中、Ｙは式（式中ｎは０乃至３を
   示す。 ）を有するＤ−α−アルキルグリシン残基を示し、２は
   エチルアミノ基又は２位に１乃至３個弗素置換したエチ
   ルアミノ基を示すが、Ｙに於いてｎ＝０の場合は前記弗
   素置換エチルアミノ基類のみを示す。 〕を有するペプチド誘導体をＮ−アルキル−Ｎ−アルカ
   ノイルグリシン〔ここにアルカノイルとは炭素数２〜５
   の直鎖状若しくは有枝鎖状のアルカノイル基を示し、ア
   ルキルとはメチルまたはエチル基である〕の反応性誘導
   体と反応させることを特徴とする式％式％ −Ｌ−チロシルーＹ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−
   Ｌ−プロリル−２〔式中、Ｙおよび２は前述したものと
   同意義を有する。 〕を有するペプチド誘導体及びその塩の製法。