DE3014632A1

DE3014632A1 - Sorbenten fuer saccharide, glykoproteine und saccharide enthaltende polymerisate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3014632A1
Application number: DE19803014632
Authority: DE
Inventors: Jiri Dipl Ing Coupek; Karel Dr Filka; Jan Dr Kocourek
Original assignee: PRIRODOVEDECKA FAKULTA UNIVERS; Prirodovedecka fakulta Univezita Karlova Albertov 6
Current assignee: PRIRODOVEDECKA FAKULTA UNIVERS; Prirodovedecka fakulta Univezita Karlova Albertov 6
Priority date: 1979-04-28
Filing date: 1980-04-16
Publication date: 1980-11-06
Also published as: FR2455061A3; CH653348A5; FR2455061B3; CS206823B1; GB2048896A; GB2048896B; DE3014632C2

Description

Die Erfindung betrifft Sorbenten für Saccharide, Glykoproteine und Saccharide enthaltende Polymerisate sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Eiweißstoffe, die fähig sind, Komplexe mit Zuckerstoffen, Polysacchariden und Glykoproteinen auf selektive Art zu bilden, und welche den allgemeinen Namen "Lektine" tragen, wurden aus einer ganzen Reihe von pflanzlichen und tierischen Quellen isoliert. Sie zeichnen sich nicht nur durch ihren Ursprung, sondern vor allem durch ihre spezifische Affinität gegenüber den Zuckerstoffen und deren Derivaten aus.

Durch Binden der Lektine an eine geeignete Trägersubstanz entstehen spezifische Adsorbentien für Saccharide; Bedingung einer solchen Bindungsreaktion besteht im Aufrechterhalten des aktiven Sorptionszentrums im Lektinmolekül, das während der Reaktion nicht blockiert werden darf. Die Lektine enthaltenden Sorbentien finden in analytischer sowie präparativer Affinitäts-Chromatographie und bei selektiven, zum Isolieren von biologisch aktiven Fraktionen angewandten Präzipitations-Techniken Verwendung.

Lektine wurden an Polysaccharide von Dextran- bzw. Agarose-Typ unter Verwendung von Cyanbromid-Methode gebunden und für eine ganze Reihe von Isoliertechniken bei Abtrennung von Glykoproteinen (K. Aspberg, J. Porath, Acta Chem.Scand. 24 - 1970 1839), Dextranen (K.0. Lloyd, Arch.Biochem.Biophys. 137 - 1970 460) oder Zellen (G.H. Edelman, U. Rutishauser, CF. Millete, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 68 -1971- 2153) angewandt. Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Selektivität und Geschwindigkeit. Trägerstoffe vom Dextran- oder Polysaccharid-Typ weisen jedoch auch gewisse nachteilige Eigenschaften auf; zu diesen gehören vor allem große Quellungsdifferenzen in Lösungen mit variablen Ionenstärken und pH-Wert, niedrige mechanische

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Festigkeit der Teilchen und daraus folgende Schwierigkeiten mit Verstopfung der mit solchen Materialien zu füllenden Kolonnen bei erhöhten Druckwerten und Durchflußgeschwindigkeiten der mobilen Phase. Nicht zuletzt kann auch die relativ niedrige Beständigkeit gegen Hydrolyse und Wirkung von Mikroorganismen im Wege stehen. Die Bindungsart der Lektinmolekeln durch die Cyanbromid-Methode macht es notwendig, mit einem hoch toxischen Aktivierungsmittel von verhältnismäßig niedriger Wirksamkeit zu arbeiten. Die beim Cyanbromid-Vorgang entstehende Bindung ist für bestimmte Zwecke nicht stabil genug; es wurde deren sukzessive hydrolytische Spaltung mit gleichzeitiger Herabsetzung der Sorbentkapazität festgestellt.

Die erfindungsgemäßen Substanzen schalten die vorerwähnten Nachteile der bisher bekannten Sorptionsmaterialien aus. Eine kovalente Bindung von Zuckermolekeln kann vorzugsweise durch den Vorgang gemäß dem tschechoslowakischen Urheberschein Nr.

(Anm. PV 2891-77) erzielt werden? dieser besteht auf einer sauer katalysierten Reaktion der Saccharide mit Hydroxylgruppen enthaltenden Polymerisaten in Dioxan oder Tetrahydrofuran. Außer hydrophilen synthetischen Polymerisaten (makroporösen Hydroxyalkylacrylaten und Hydroxyalkylmethacrylaten, teilweise hydrolysiertem vernetzten Polyvinylacetat u.a.) kann man auch mehrere natürliche oder halbsynthetische hydrophile Polymerisate (Polydextrane, Agarose-Polymeren, Cellulose o.dgl.) verwenden, da die eigentliche Reaktion in einem wasserfreien, eventuelle Hydrolyse von glykosidisehen oder peptidischen Bindungen ausschließenden Medium durchgeführt werden muß.

Die erhaltenen Glykosylderivate von Polymeren werden mit Perjodat oxydiert; durch die Wirkung des Letztgenannten erfolgt die Spaltung der C-C-Bindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen mit vicinal gebundenen Hydroxylgruppen in Molekülen der kovalent gebundenen Saccharide unter Entstehung zweier Aldehydgruppen, die erheblich reaktiv sind. Das durch Oxydation aktivierte Polymere reagiert in der nächsten Stufe mit Lektinen unter Entstehung der Schiff'sehen Base. Die Schnelligkeit die-

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- ' '. -. . ■'■ \ - ; '-■ . ■ ■ 3014ß3t; ^: ser Reaktion hängt von der Konzentration der Komponenten und von der Temperatur ab und wird durch den pH-Wert des Reaktiorismediums stark beeinflußt. Die nicht reagierten aktiven Aldehydgruppen werden durch Natriumborhydrid reduziert. Die so ent- ' standenen Sorptions- bzw* Präzipitatlonssubstanzen zeichnen sich durch eine hohe Kapazität aus.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind selektiv wirkende polymere Sorbenten für Saccharide, Glykoproteine und Saccharide enthaltende Polymerisate. - ■/..

Das Wesen solcher Substanzen besteht darin, daß an die aus der Gruppe von oxydierten Polysacchariden, oxydierten glykosylierten Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, oxydiertem Polyacrylamid, und Polyvinylalkohol gewählten Trägerstoffe Lektine kovalent gebunden sind.

Das Verfahren zur Herstellung dieser Sorbenten ist dadurch gekennzeichnet, daß die kovalent gebundene Saccharide enthalten-. den Polymerisate mit Natrium- oder Kaliumperjodat oxydiert werden, worauf die derart aktivierten Polymerisate mit Lektinen bei Temperaturen von bis zu 40⁰C in Pufferlösungen von pH 7 bis 12 reagieren gelassen werden, wobei die nach der Reaktion übrigbleibenden aktiven Aldehydgruppen durch Einwirkung von Reduktionsmitteln, vorzugsweise Natriumborhydrid, eliminiert werden. In ihrer Wirkung sind die erfindungsgemäßen Substanzen mit bekannten und zur Verfügung stehenden Materialien auf Grund von mit Lektinen durch Cyanbromid-Methode gebundenen Sacchariden vergleichbar, wobei für den Prüfstein der Wirksamkeit die Ad--Sorptionskapazität des Sorbenten genommen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist vom technologischen Gesichtspunkt im wesentlichen leichter, erfordert keine besonderen Maßnahmen für die Arbeit mit hoch toxischen Aktiviermitteln und ermöglichi? einfache Steuerung des Konversionsgrades der Bindungsreaktion bei hoher Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus verleihen die ^ nicht oxydierten, an den Trägerstoff gebundenen Sacchari4mol;9- küle diesem Trägerstoff einen hydrophilen Charakter oder

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steigern seine ursprüngliche Hydrophilie. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit gewisser unspezifischer Interaktionen von geschiedenen Systemen bei der Verwendung der Sorbenten in Affinitäts-Chromatographie herabgesetzt.

Der Erfindungsgegenstand soll durch die nachfolgenden, auf diese keineswegs beschränkten Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

15 g Mischpolymerisat von 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylenmethacrylat mit Molekulargewicht-Ausscheidungslimit von 1 000 000, enthaltend auch 16 % von kovalent gebundener Galaktose (Separon HEMA-1000-Gal), wurde in 150 ml Wasser 20 Stunden gequollen. Die Flüssigkeit wurde dann abgesaugt und 346 ml 0,1 M NaJO» zugegeben. Die Oxydation wurde 100 Minuten bei 25⁰C vorgenommen. Das Produkt wurde mit Wasser bis zur negativen Reaktion auf Oxydationsmittel (Mn⁺⁺) durchgewaschen, mit Puffer, in welchem die Bindung des Lektins (Acetatpuffer mit verschiedenem pH) durchgeführt wurde, in Gleichgewicht gebracht und in die nachfolgende Bindungsreaktion eingesetzt.

140 ml Acetatpuffer (pH 7,8) wurde zum Lösen von 2,4 g Lektin aus Canavalia ensiformis DC (Konkanavalin) verwendet und der Lösung der ins Gleichgewicht gebrachte oxydierte Trägerstoff von der vorherigen Stufe in Form eines dicken Breis zusammen mit 250 mg D-Glucose zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 4⁰C in einem Kühlschrank gerührt. Darauf wurde 25 mg NaBHr und nach 20 Minuten eine weitere Dosis von 25 mg NaHB/ zugegeben. Das Gemisch wurde im Kontakt mit Natriumborhydrid insgesamt 40 Minuten gelassen. Nachher wurde das Sorbens mit Acetatpuffer (pH 7,3) durchgewaschen und ferner dreimal mit 200 ml Tris HCl-Puffer in 1 Mol NaCl (pH 8) und mit Acetatpuffer 1 1 Mol NaCl (pH 4) durchgewaschen. Das derart behandelte Sorbens wurde in eine Kolonne übertragen und mit einem Puffer durchgewaschen, in welchen eine Sorptionswirkung gegenüber Saccharidderivaten nachgewiesen wurde. Die Menge an gebundenem

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Konkanavalin betrug 15 mg pro Gramm des trockenen Trägerstoffes.

Die Wirkung des gebundenen Lektins wurde durch Sorption eines synthetischen, kovalent gebundene Saccharide (Glucose, Glactose) enthaltenden Polymerisaten (Acrylamid) durch den nachfolgenden Vorgang bewiesen:

An eine Kolonne von 1 g Trägerstoff mit gebundenem Lektin nach Äquilibrierung mit Acetatpuffer (pH 7,3) wurde 0,3427 g löslichen Polyacrylamidpolymeren mit 0,4 gewichtsprozentigem Inhalt von Glucose im Anfahrpuffer angesetzt. Bei Elution von 102 ml Puffer wurde der Zuckergehalt bis zum Nullwert überwacht. An die Kolonne wurde dann eine Lösung von 0,5 Mol Methyl~alpha-D-glucopyranosid (30 ml) gebracht, worauf die Kolonne mit dem Anfahrpuffer (pH 7,3) durchgewaschen wurde. Das Eluat wurde aufgefangen, dialysiert und lyophilisiert. Durch gravimetrische Methode wurde 0,016 g Polymer festgestellt. Auf Grund der Stoffbilanz wurde bei Chromatographie 3,1 %iger Verlust an glykosyliertem Polyacrylamid-Standard gefunden»

Beispiel 2

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet und behandelt. Seine Wirkung wurde durch selektive Sorption von Ovalbumin nachgewiesen; darüber hinaus wurde wiederholte Verwendung untersucht. 1 g Sorbens gemäß Beispiel 1 mit gebundenem Konkanavalin wurde durch Acetatpuffer (pH 7,3) und nachher durch Tris HCl-Puffer pH 7,8 + 0,15 M NaCl äquilibriert. An die Kolonne wurde 49 mg Ovalbumin in 5 ml Anfahrpuffer angesetzt und das System mit Puffer bis zur negativen Reaktion auf Eiweißstoffe (UV Absorption 280 nm) unter gleichzeitigem Auffangen von Eluat durchgewaschen. Darauf wurde 0,1 M Lösung von Me-alpha-D-Glucopyranosid (50 ml) angesetzt. Das Eluat wurde aufgefangen, dialysiert und lyophilisiert. Die Ausbeute im Eluat betrug 7,8 mg, der Gehalt von ungebundenem Eiweißstoff auf 40 mg bestimmt; 2,44 % Verlust.

Die Kolonne wurde dann mit 20 ml Tris HCl-Puffer pH 7,8 + 1 M

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NaCl und mit 20 ml Acetatpuffer + 1 M NaCl pH 4 durchgewaschen, mit Tris HCl-Puffer ü 15 M NaCl pH 7,8 eingestellt und der gesamte Prozeß wiederholt.

Beim zweiten Zyklus wurde der Eiweißstoffgehalt im Elutionsmittel nach dem Durchwaschen mit Me-alpha-D-glucopyranosid auf 7,6 mg, beim dritten auf 7,8 mg und beim vierten auf 7,6 mg festgestellt.

Beispiel..3,

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß an Stelle des Mischpolymerisaten mit dem Molekulargewicht-Ausscheidungslimit von 1 Mill, dalton, Mischpolymerisat von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Äthylendimethacrylat von 300 000 Molekulargewicht als Trägerstoff verwendet wurde. Beim Testen der Wirkung durch glykosyliertes Polyacrylamid wurde 4,6 %iger Verlust (Ansatzmenge 0,3470 g, im Elutionsmittel 0,0154 g) gefunden. Das Ausgangssorbens enthielt 18 Gew.-% von kovalent gebundener Glucose.

Beispiel 4

Zur 'Bindung des Lektins aus Ricinus communis wurde der oxydierte, in Beispiel 3 beschriebene Trägerstoff angewandt. 1,9 g Lektin wurde in 70 ml Acetatpuffer (pH 7,3), enthaltend 220 mg Galactose, gelöst und 10g des oxydierten Trägerstoffes zugesetzt. Die Eliminierung der nicht reagierten aktiven Aldehydgruppen wurde mit 25 mg NaBH^ vorgenommen; Reaktionszeit wie in Beispiel 1.

Die Wirkung wurde durch Polyacrylamid mit 9,4 gewichtsprozentigem Zuckergehalt geprüft. Ansatzmenge 0,3412 g, Ausbeute im Elutionsmittel 0,0154 g, Verluste 3,8 %.

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Beispiel 5

Die Bindung des Lektine aus Ricinus communis wurde analog wie in Beispiel 4 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß der oxydierte Trägerstoff das Molekulargewicht-Ausscheidungslimit von 300 000 dalton aufwies.

Beim Prüfen der Wirkung durch Polyacrylamid mit gebundener Glucose wurde pro 1 g der Kolonne 0,3400 g Polymer angesetzt; Ausbeute im Elutionsmittel 0,0171 g, Verluste 4,75 %.

Beispiel 6

4,2 g sphärischer Cellulose wurde binnen 20 Stunden in 50 ml Dioxan, gesättigt mit gasförmigem Chlorwasserstoff, bis zum 16-gewichtsprozentigen Gehalt quellen gelassen. Nach dieser Zeitspanne wurde der Reaktionsmischung 2,0 g D-Galactose zugegeben und sie wurde dann 24 Stunden bei Laboratoriumstemperatur geschüttelt. Darauf wurde der Inhalt des Gefäßes in 5 1 Wasservolumen eingegossen und das Produkt nach Absaugen über einen Filter mit Wasser bis zum neutralen pH-Wert und zur negativen Reaktion auf Zucker wiederholt durchgewaschen.

4,0 g spärische Cellulose mit gebundener D-Glactose (11,7 gewichtsprozentiger Gehalt von gebundener D-Glactose analytisch bestimmt) wurde 20 Stunden in destilliertem Wasser quellen gelassen. Das Wasser wurde dann abfiltriert und dem nassen Gel 100 ml 0,1 M NaJO^ zugesetzt. Die Oxydation verlief eine Stunde bei Laboratoriumstemperatur unter Rühren. Darauf wurde die Natriumperjodatlösung abfiltriert und das Gel an der Kolonne mit destilliertem Wasser durchgewaschen, bis die Leitfähigkeit des Eluats der des angewandten destillierten Wassers entsprach. Dem Cellulosegel wurde dann Boratpuffer von pH 8,5 und nach einer Stunde 500 mg Konkanavalin A (dh Lektin aus Canavalia ensiformis) zugegeben. Das Lektin wurde mit Methyl-alpha~D-glucopyranosid inhibiert. Nach 70-stündiger Verweilperiode bei 4°C wurden die nichtreagierten aktiven Gruppen bei 4°C mit 20 mg NaBH- unter 20 Minuten dauerndem Rühren reduziert. Das Gel wurde nachher abwechselnd mit Acetatpuffer bei pH 4,1

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(1 M NaCl) und Tris HCl-Puffer pH 9 (1 M NaCl) durchgewaschen. In der finalen Phase vor der Applizlerung wurde das Gel im Acetatpuffer pH 6 (1 M NaCl), enthaltend 1O"⁵ M MnCl₂ und 1(T³ M CaCIpf aufbewahrt. Der Gehalt an gebundenem Eiweißstoff betrug 9,0 mg pro Milliliter des nassen Gels.

Beispiel 7

Aminoglykosyl-Derivat von Cellulose wurde analog wie in Beispiel 6 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß in die Reaktion 0,8 g N-Acetyl-D-glukosamin eingesetzt und daß das Produkt nicht oxydiert wurde; es wurde nur die Menge des an den Celluloseträger angebundenen Aminozuckers bestimmt.

Beispiel 8

Ein ähnliches Experiment wie in Beispiel 7 wurde mit dem aus Hydroxyäthylmethacrylat-Mischpolymerisat von 1 Mill. Molekulargewicht-Ausscheidungslimit (s. Beispiel 1) bestehenden Trägerstoff durchgeführt. Der Gehalt des gebundenen Aminozuckers betrug 8,9 Gew.-%, was Doppelnenge gegenüber dem Beispiel 7 war.

Beispiel 9

4,0 g von löslichem Polyacrylamid-Gel mit einpolymerisiertern Allylglucosid (vorbereitet nach V. Horejsi, P. Smolek und J. Koccurek: Biochim. Biophys. Acta, 538 -1978- 293-298) wurde in 100 ml 0,1 M NaJO^ binnen einer Stunde bei Laboratoriumstemperatur oxydiert. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch auf 250 ml verdünnt und gegen destilliertes Wasser dialysieren gelassen. Nach der Beseitigung des Perjodats aus dem Reaktionsgemisch durch Dialyse wurde das Gel lyophylisiert. Das Lyophylisat wurde in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Der Lösung wurde 500 mg Lektin aus Canavalia ensiformis, inhibiert mit Methyl-alpha-D-glucopyranosid, zugegeben. Das Gemisch reagierte binnen 70 Stunden bei 4⁰C, worauf die übrig bleibenden alde-

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hydisehen Gruppen durch Reaktion mit NaBH^ - ähnlich wie in Beispiel 6 - reduziert wurden. Die erhaltene Reaktionsmischung - nach Verdickung durch Lyophilisation - wurde durch präparative Gel-Chromatographie am Dextran-Gel auf eine Lektin-Fraktion und eine an glykosyliertes polymeres Acrylamid gebundenes Lektin enthaltende Fraktion getrennt.

Beispiel 10

4,0 g Polyvinylalkohol (125 000 Molekulargewicht und 87 - 89 % Hydrolyse-Grad), welcher durch D-Glucose gemäß dem tschechoslowakischen Urheberschein Nr. 195 044 substituiert wurde, wurde analog wie nach Beispiel 9 oxydiert.

Beispiel 11

Das Sorbens wurde analog wie in Beispiel 1 vorbereitet, mit der Ausnahme, daß an Stelle des Mischpolymerisaten von Äthylendimethacrylat und Hydroxyäthylmethacrylat ein Mischpolymerisat von Hydroxyäthylacrylat mit Äthylendiacrylat von 500 000 dalton Molekulargewicht-Ausscheidungslimit angewandt wurde. Durch Prüfung der Wirkung des glykosylierten Polyacrylamide bei Sorption wurde 5,3 %iger Verlust festgestellt.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Sorbenten für Saccharide, Glykoproteine und Saccharide enthaltende Polymerisate, dadurch gekennzeichnet, daß an die aus der Gruppe von oxydierten Polysacchariden, oxydierten glykosylierten Hydroxyalkylacrylaten oder Hydroxyalkylmethacrylaten, oxydiertem Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gewählten Trägerstoffe Lektine kovalent gebunden sind.

2. Verfahren zur Herstellung von Sorbenten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die kovalent gebundene Saccharide enthaltenden Polymerisate mit Natriumoder Kaliumperjodat oxydiert, worauf die derart aktivierten Polymerisate mit Lektinen bei einer Temperatur von Null bis

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4O⁰C in Pufferlösungen von pH 7 bis 12 reagieren lassen "werden, wobei die nach der Reaktion übrig bleibenden aktiven Aldehydgruppen aus dem Polymerisat durch Einwirkung von Reduktionsmitteln, vorzugsweise Natriumborhydrid, eliminiert werden»

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