DE10006591A1

DE10006591A1 - Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10006591A1
Application number: DE10006591A
Authority: DE
Inventors: Thomas Kolzau; Heinz-Gerhard Koehn; Wilhelm Pluester; Mathias Ulbricht
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Qiagen North American Holdings Inc
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2001-08-23
Anticipated expiration: 2020-02-12
Also published as: WO2001059098A2; WO2001059098A3; WO2001059098A9; DE10006591B4; US20030166916A1

Abstract

Ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, bei dem man das ggf. vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der ein Füllungsmittel in einer Konzentration enthält, daß die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt, den das Ausgangsmaterial enthaltenden Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden, die Membran ggf. wäscht und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran eluiert.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäu ren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial unter Verwendung einer porösen Membran.

Es existieren bereits eine ganze Reihe von Verfahren, bei denen nukleinsäurehal tiges Ausgangsmaterial ggf. nach Vorreinigung durch eine poröse Membran ge saugt oder gedrückt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die ent haltenen Nukleinsäuren während des Passierens der Membran selektiv an der Membranoberfläche binden.

Die Affinität von Nukleinsäuren zu den eingesetzten Membranen wird in der Re gel über eine spezielle Ausgestaltung der Membranoberfläche in Verbindung mit bestimmten Bedingungen in dem Puffersystem, in dem das Ausgangsmaterial die Membran passiert, erreicht.

So ist z. B. aus dem US-Patent 5,438,128 ein Verfahren bekannt geworden, bei dem zur Aufreinigung von Nukleinsäuren spezielle Polymermembranen zum Ein satz kommen, die mit Ionenaustauschergruppen funktionalisiert sind. Zur selekti ven Bindung wird das die Nukleinsäuren enthaltene Ausgangsmaterial in einem Puffer mit geringer Ionenkonzentratioin aufgenommen und in diesem Puffer durch die Membran hindurchgesaugt bzw. gedrückt, wobei die selektive Bindung erfolgt.

Ein weiteres bekanntes Verfahren beschreibt die EP 0512767. Bei diesem be kannten Verfahren erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren an hydrophilen Mem branen, wobei dem Bindungspuffersystem ein organisches Lösungsmittel, z. B. Isopropanol, in hoher Konzentration zugesetzt ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren zu schaffen, die gegenüber dem bekannten Verfahren in einfacherer Weise durchzuführen ist.

Gelöst wird diese Aufgabe mit Verfahren, das die Merkmale des Anspruchs 1 und des Anspruchs 5 aufweisen.

Die Erfindung soll zwei Varianten abdecken. Bei der ersten Variante können be liebige Membranen zum Einsatz kommen. Bei der zweiten Variante kommen spezielle Membranen zum Einsatz.

Erfindungsgemäß ist bei der ersten Variante vorgesehen, daß man das gegebenen falls vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der Polyethylenglykol (PEG) und/oder mindestens ein Salz in einer Konzentration ent hält, daß die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangs material und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erfor derlichen Werts liegt, dann das Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuf fer z. B. unter Vakuum oder mittels Zentrifugation durch die Membran permeie ren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren (Tiefenfilterwirkung) der Membran zurückgehalten werden.

In einem weiteren Schritt kann die Membran dann gewaschen werden, um gege benenfalls unspezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen. Falls ge wünscht, kann sich an den Waschschritt dann ein Elutionsschritt anschließen, bei dem die gebundenen Nukleinsäuren wieder von der Membran abgelöst werden.

Besonders bevorzugt wird als Fällungsmittel PEG in einer Endkonzentration von mehr als 6% bezogen auf das Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmateri al eingesetzt.

Die Aufreinigung von Nukleinsäuren in Gegenwart PEG 8000 an Silika-Beads wird von Engelstein et al. in Microbial & Comparative Genomics, Vol. 3, No. 4, 1998 beschrieben. Der in dieser Veröffentlichung verwendete Bindungspuffer enthält 20% PEG 8000. Das PEG 8000 soll bei dieser bekannten Methode die bislang in Verbindung mit Aufreinigungen von Nukleinsäuren an Silkaträgern erforderlichen chaotropen Reagenzien ersetzen. Daß der hier beschriebene Me chanismus in Verbindung mit anderen Trägermaterialien als Silika und auch an ders konfektionierten Trägern als Beads möglich wäre, ist an keiner Stelle ange deutet bzw. beschrieben.

Es kommt hinzu, daß die eingangs erwähnte EP 0512767 in der auf Seite 7 ge zeigten Tabelle feststellt, daß in Gegenwart von PEG (10% oder 20%) keine Bindung von DNA an Membranen erfolgte, was gegen die Ergebnisse der An melderin spricht.

Üblicherweise werden Kunststoffmembranen aus z. B. Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon oder PVDF eingesetzt.

Die Membranen können bevorzugt Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 µm aufweisen, wobei die Ausbeute über die Wahl des Porendurchmessers optimier bar ist. Bei Abnahme des Porendurchmessers steigt die Rückhalterate der Mem bran. Allerdings verstopfen kleinere Poren auch schneller, so daß der Poren durchmesser nicht zu klein gewählt werden sollte.

Die Membranen werden bevorzugt so ausgelegt, daß sowohl Oberflächenfilter wirkung als auch Tiefenfilterwirkung auftritt.

Die gewählten Bindungsbedingungen sollten weiterhin grundsätzlich sicherstel len, daß das Nukleinsäuremolekül in gestauchter Form vorliegt, da so eine opti mierte Rückhaltung an und in der Membran möglich ist.

Gemäß der zweiten Variante der Erfindung ist vorgesehen, daß die in den Auf reinigungsverfahren eingesetzten Membranen mit deprotonierbaren Gruppen, insbesondere mit Sulfonsäure-, Carbonsäure oder Phosphorsäure-Gruppen funk tionalisiert sind.

Auch bei dieser Variante läßt man das nukleinsäurehaltige Ausgangsmaterial in einem Bindungspuffer durch die in diesem Fall funktionalisierte Membran pas sieren, wobei der Bindungspuffer ein Fällungsmittel für Nukleinsäuren enthält. Anschließend kann die Membran ggf. gewaschen werden und die Nukleinsäuren können dann von der Membran eluiert werden.

Es ist vorgesehen, daß das Fällungsmittel in dem Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmaterial in einer Konzentration vorliegt, die oberhalb des zur Fäl lung von Nukleinsäuren erforderlichen Wertes liegt. Bei dieser erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung fallen die Nukleinsäuren in Gegenwart des Bindungs puffers aus. Wird das Bindungspuffer-Ausgangsmaterialgemisch dann durch die Membran gesogen, so bleiben die Nukleinsäuren an der Membran haften.

Als Fällungsmittel können z. B. Salz, PEG oder auch Isopropanol zur Anwendung kommen, um nur eine wenige besonders geeignete, die Erfindung nicht ein schränkende Beispiele zu nennen.

Bei einem weiteren bekannten Verfahren gemäß dem US-Patent 5705628 erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren in Gegenwart von PEG an magnetischen Mikro partikeln, deren Oberfläche funktionalisiert ist. Das hier beschriebene Verfahren ist speziell auf magnetische Beads abgestimmt, die im Vergleich zu den erfin dugsgemäß eingesetzten Membranen ein umständlicheres Handling erfordern. Ein weiterer Nachteil ist, daß Beads höhere Elutionsvolumina als Membranen benötigen.

Es hat sich herausgestellt, daß Verfahren mit erfindungsgemäß funktionalisierten Membranen sehr gute Nukleinsäureausbeuten ermöglichen, insbesondere, wenn, wie in einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung vorgesehen, die funktionali sierten Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Ober fläche der Membran fixiert ist und deren anderes Ende frei beweglich ist. Diese Polymerketten erhöhen die Rückhalteeigenschaften von Membranen für Nuklein säuren erheblich.

Die Polymerketten richten sich in Abhängigkeit von den äußeren Umgebungen unterschiedlich zu der Membran aus. Bei eher alkalischem bzw. neutralem pH- Wert und/oder niedriger Ionenkonzentration stehen die Polymerketten mehr oder weniger gestreckt von der Membran ab. Erniedrigt man den pH-Weit und/oder erhöht man die Ionenkonzentration, so legen sich die Polymerketten an die Mem bran an.

Im vorliegenden Fall hat sich gezeigt, daß die höchste Rückhalterate der Mem bran für Nukleinsäuren dann vorliegt, wenn die Polymerketten zwar von der Membran abstehen, aber nicht vollständig gestreckt sind (Tentakelstruktur). Un ter diesen Bedingungen, die sich einstellen, wenn z. B. höhere Ionenkonzentratio nen oder höhere PEG-Konzentrationen vorliegen, liegt auch das Nukleinsäure molekül in gestauchter Form vor, in der es besonders effektiv in der Tentakel struktur zurückgehalten wird.

Als Polymerketten können z. B. Polyacrylsäure oder dergl. eingesetzt werden.

Auch bei dieser Variante weisen die Membranen bevorzugt Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 µm auf, wobei die Ausbeute über die Wahl des Poren durchmessers optimierbar ist.

In beiden Fällen kann die Elution der an der Membran haftenden Nukleinsäuren mit Puffern niedriger Ionenkonzentration bzw. mit Wasser bei Raumtemperatur erfolgen. Zur Elution wird der eingesetzte Puffer durch die Membran gesaugt oder gedrückt. Ein eventueller zwischen Bindung und Elution vorgesehener Waschschritt kann auf gleiche Weise mit z. B. Ethanol oder dergleichen erfolgen.

Zur Elution werden bevorzugt Bedingungen eingestellt, bei denen die Polymer ketten möglichst vollständig gestreckt von der Membran abstehen und das Nukleinsäuremolekül ebenfalls in gestreckter Form vorliegt. Unter diesen Bedingun gen, die sich z. B. bei Verwendung der oben angegebenen Elutionspuffer einstel len, ist eine besonders gute Ablösung des Nukleinsäuremoleküls von der Mem bran möglich.

Grundsätzlich kann man alle eingesetzten Puffer oder Gemische unter Vakuum durch die Membran saugen oder z. B. mittels Zentrifugation hindurchdrücken.

Bevorzugt wird das Verfahren mit Membranen durchgeführt, die in Mikrotiter filterplatten, Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen angeordnet sind.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden.

A: Herstellung funktionalisierter Membranen Beispiel 1 a) Modifizierung von Polypropylenmembranen

Eine Polypropylen-Mikrofiltrationsmembran (Accurel 2E HF, nominale Poren größe 0,2 µm, Membrandicke 150 µm; Membrana GmbH, Wuppertal oder Ver suchsmuster #1333-12A, nominale Porengröße 0,45 µm, Membrandicke 110 µm, 3M, St. Paul, USA) mit einem Durchmesser von d = 80 mm wird unter Schütteln für 2 h mit einer 100 mM Lösung von Benzophenon in Aceton equilibriert. Nach folgend wird die Membran mit einer 10%igen wässrigen Acrylsäurelösung über schichtet. Anschließend wird für 15 min mit UV-Strahlung (UVA-Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet. Abschließend wird die modifizierte Membran für 24 h bei 60°C mit Wasser extrahiert und getrocknet.

b) Modifizierung von Nylonmembranen

Eine Nylon-Mikrofiltrationsmembran (Schleicher, nominale Porengröße 0,45 µm, Membrandicke 127 µm) wird unter den gleichen Bedingungen wie bei a) modifiziert.

B: Aufreinigung von Nukleinsäuren

Für die nachfolgenden Aufreinigungen wurden die gemäß Beispiel 1a und b her gestellten oberflächenmodifizierten Membranen in eine 96er Mikrofiltrations platte eingespannt.

Beispiel 2

Zur Bestimmung des Rückhaltevermögens der modifizieren Membranen für pDNA wird 1 µg pDNA mit jeweils 200 µl Bindungspuffer (BP) versetzt (BP1: 5 mM Tris, pH = 7,5; BP2: 4 M NaCl, 10% PEG 8000, pH = 4,6). Die Aufreinigung erfolgt mittels Zentrifugationsschritte (3000 rpm) nach dem Prinzip: Bind-Wash- Elute. Als Basismaterial für diesen Versuch wird oberflächenmodifiziertes PP mit einer nominalen Porenweite von 0,45 µm eingesetzt. Nach der Inkubation wird 2 × mit je 200 µl 70% EtOH gewaschen. Die Elution erfolgt mit 30 µl Tris-HCl (5 mM, pH 7,5). Abschließend wird ein zweites Mal mit 100 µl eluiert. Die halb quantitative Auswertung von 4 µl Eluat erfolgt mittels Ethidiumbromid- Gelelektrophorese (nicht dargestellt).

Während bei Einsatz des Bindungspuffers BP1 keine Bindung an der Membran erfolgte, ließ sich die pDNA bei Verwendung von BP2 nahezu quantitativ an die Membran binden und im ersten Elutionsschritt wieder eluieren.

Beispiel 3

Es wird eine pDNA-Aufreinigung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse durch geführt. Hierzu werden 1,5 ml Bakterienkultur mit den Puffern P1-P3 (P1: 100 µl, P2: 300 µl, P3: 300 µl) aus dem Kit "Perfect Prep Plasmid Midi" der Fa. Eppen dorf versetzt. Nach Zentrifugation wird das klare Lysat mit jeweils 700 µl Bin dungspuffer (s. Tabelle 1) versetzt. Die Aufarbeitung der Probe erfolgt unter den im Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen. Zur Kontrolle wird eine Plasmidpräpa ration unter Durchführung der kompletten Aufreinigungsprozedur mit dem Kit "Perfect Prep Plasmid Mini" der Fa. Eppendorf, aus der identischen 1,5 mL Bak terienkultur durchgeführt (Daten nicht dargestellt). Als weitere Kontrolle wird das Gemisch aus geklärtem Lysat und jeweiligem Bindungspuffer (s. Tabelle 1) für 30 Minuten bei 12000 g, Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand ent fernt. Danach erfolgt zweimaliges Waschen mit 200 µl 70% Ethanol, Trocknung unter Vacuum, sowie die Zugabe von 30 µl Tris-HCl, pH 7,5 (Daten nicht darge stellt).

Ausbeute und Reinheit wurden mittels Photometrie und Analyse durch Ethidi umbromid-Gelelektrophorese bestimmt (Tabelle 1, Fig. 1). Die Tabelle gibt die mittels Photometer ("BioPhotometer" der Fa. Eppendorf) bestimmte Konzentrati on der eluierten pDNA in ng/µl an.

Tabelle 1

Die Spuren des in Fig. 1 gezeigten Gels waren wie folgt belegt:

1. Bindungspuffer, pH 7,4, modifizierte Membran
2. Bindungspuffer, pH 4,6 modifizierte Membran
3. Bindungspuffer, pH 3,5 modifizierte Membran
4. Bindungspuffer, pH 7,4 unmodifizierte Membran
5. Bindungspuffer, pH 4,6 unmodifizierte Membran
6. Bindungspuffer, pH 3,5 unmodifizierte Membran

Das Gel und auch die photometrische Auswertung zeigten übereinstimmend, daß sich bei den modifizierten Membranen pDNA sowohl bei pH 4,6 als pH 7,4 in hoher Konzentration aufreinigen läßt, während bei der unmodifizierten Membran lediglich bei pH 7,4 eine schwache Ausbeute an aufgereinigter pDNA zu ver zeichnen ist.

Claims

1. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, bei dem man

- das ggf. vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer ver setzt, der PEG und/oder mindestens ein Salz in einer Konzentration enthält, daß die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt,
- das Ausgangsmaterial enthaltenden Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden
- die Membran ggf. wäscht
- und ggf die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wie der von der Membran eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß PEG in einer Endkonzentration von < 6% vorliegt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.

5. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, die mit deprotonierbaren Gruppen funktionalisiert ist, bei dem man

- das ggf vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer ver setzt, der ein Fällungsmittel für Nukleinsäuren enthält
- das Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden
- die Membran ggf wäscht
- und ggf die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wie der von der Membran eluiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmaterial eine Endkonzentration an Fällungsmittel aufweist, die oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren er forderlichen Werts liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fällungsmittel PEG ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß PEG in einer Endkonzentration von < 6% vorliegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit Sulfonsäure-, Carbonsäure oder Phosphorsäure-Gruppen funktionalisiert ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist, und deren anderes Ende frei beweg lich ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.

14. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, daß die Membran Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 µm aufweist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, daß die Membran eine Dicke < 500 µm aufweist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, daß die Membran zum Einsatz in Mikrotiterplatten Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, daß der Bindungs-, Wasch- und/oder Elutionspuffer mittels Va kuum durch die Membran gesaugt werden.