EP1948795A1 - Verfahren zur selektiven, reversiblen adsorption von nukleinsäuren an ein trägermaterial - Google Patents

Verfahren zur selektiven, reversiblen adsorption von nukleinsäuren an ein trägermaterial

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Publication number
EP1948795A1
EP1948795A1 EP06819298A EP06819298A EP1948795A1 EP 1948795 A1 EP1948795 A1 EP 1948795A1 EP 06819298 A EP06819298 A EP 06819298A EP 06819298 A EP06819298 A EP 06819298A EP 1948795 A1 EP1948795 A1 EP 1948795A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
nucleic acids
carrier material
cosmotropic
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06819298A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Frerix
Jürgen HUBBUCH
Markus Müller
Michael SCHÖNEWALD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH, Qiagen GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority to EP06819298A priority Critical patent/EP1948795A1/de
Publication of EP1948795A1 publication Critical patent/EP1948795A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the selective, reversible adsorption of a nucleic acid or a plurality of nucleic acids to a carrier material.
  • nucleic acids are, for example, phosphates, sulfates and citrates
  • cosmotropic salts are, for example, phosphates, sulfates and citrates
  • polymer-salt systems polymer-salt systems
  • RNA binds more strongly to the adsorbent than DNA in all known cases, simultaneous desalting and separation of RNA / DNA is not possible.
  • the ultra- or Dia-Filtration has a high time requirement, low productivity and only a low selectivity for the different nucleic acid populations such as plasmid DNA, mareerte genomic DNA and long-chain RNA molecules.
  • nucleic acid populations such as plasmid DNA, mareerte genomic DNA and long-chain RNA molecules.
  • gel filtration it is disadvantageous that because of the small quantities to be applied, high product dilution and low productivity must be accepted.
  • the present invention thus describes a process for the selective, reversible adsorption of nucleic acids to a carrier material which is characterized in that (a) a nucleic acid-containing mixture having a cosmotropic salt content of at least 1 mol is brought into contact with the carrier material, whereupon the nucleic acid or the nucleic acids from the nucleic acid-containing mixture is or are adsorbed on the carrier material, and (b) detaching the nucleic acid or nucleic acids bound to the carrier by means of an aqueous solution which has a salt content of not more than 1 mol, in particular less than 1 mol , having.
  • a solution which has a salt concentration of 500 mM or less, eg 100 mM or less, 50 mM or less, 20 mM or less or 10 mM or less having. It is further preferred that the solution for detaching a nucleic acid from the carrier material has a salt concentration of at least 1 mM.
  • the content of the solution of cosmotropic salts in step (a), in which nucleic acid (s) is bound to the carrier material is preferably at least 1.5 moles, more preferably at least 2.0 moles, and most preferably at least 2.5 moles.
  • Cosmotropic salt levels of greater than 5 moles, and more preferably greater than 10 moles, are less preferred.
  • Cosmotropic (or lyotropic) salts are arranged in the so-called Hofmeister series according to their property to increase the structure of the water.
  • chaotropic salts which cause a reduction (disturbance) of the water structure.
  • the known cosmotropic salts include e.g. Phosphates, sulfates and citrates.
  • the type of adsorption described here uses hydrophobic or mixed hydrophobic-electrostatic interactions (so-called "mixed-mode”) .
  • the strength of this bond - ie the synergistic interplay between surface properties of the adsorber, the adsorbent and the liquid phase conditions - determines the reversibility desired in the process It thus differs from the binding of nucleic acids described in the so-called boom patent (US Patent No. 5,234,809, European Patent No. 0 389 063) under chaotropic conditions on silica surfaces.
  • the mode of attachment differs significantly from common exclusive hydrophobic binding modes described in the literature, since in the present case the order of adsorption of DNA and RNA is reversed, i. that DNA (as target nucleic acid) binds more strongly than RNA.
  • DNA as target nucleic acid
  • RNA binds more strongly than RNA.
  • This allows a better utilization of the adsorbents with DNA, an initial elution of RNA and a final elution of DNA under desired buffer conditions with low salt concentrations. Therefore, a simultaneous cleaning and desalination of the sample is possible.
  • organic solvents such as ethanol or isopropanol
  • target nucleic acid or “target nucleic acid” is understood as meaning a nucleic acid or a plurality of nucleic acids consisting of a mixture of different substances, e.g. the components of a cell, to be separated.
  • the present invention thus relates to a process for the selective, reversible adsorption of nucleic acid (s) from solutions having a high concentration of preferably cosmotropic salts ("high concentration” here in particular means> 20% w / w, for example of phosphate citrate and sulfate salts) to a suitable carrier material (adsorbents, membranes, filters or monoliths), for example under hydrophobic or mixed-mode conditions and subsequent desorption of the nucleic acid (s) from the carrier material and elution by formulation solutions with a low salt concentration of 100 mM or less, preferably 50 mM or less and in particular 20 mM or less (eg conventional aqueous buffer systems known to the person skilled in the art such as 10 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, etc.)
  • the nucleic acids fixed according to the invention can be selected from desired aqueous or non-cosmotropic and / or or low salt conditions are e
  • the adsorption of the nucleic acid target molecule according to the invention takes place from high molar solutions of cosmotropic salts to suitable adsorbents, membranes, filters or monoliths, such as e.g. Nitrocellulose and hydrophilized nylon filters, nylon wadding and polyvinylidene fluoride (PVDF) as well as silica-based adsorbents.
  • suitable adsorbents membranes, filters or monoliths
  • Nitrocellulose and hydrophilized nylon filters, nylon wadding and polyvinylidene fluoride (PVDF) as well as silica-based adsorbents.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Particularly suitable is the inventive use of this technology for capturing nucleic acids from product-containing phases of phase systems in which the target nucleic acid has been distributed in the phase with a high concentration of cosmotropic salts, as in WO2004 / 106516 Al described.
  • the process according to the invention overcomes the disadvantages of the prior art (such as a time-intensive concentration and rebuffering of the nucleic acid phase by, for example, ultrafiltration or gel filtration, and precipitation is generally not possible from solutions with high concentrations of cosmotropic salts) and purification of nucleic acid (s) considerably facilitated.
  • precipitation is generally not possible from solutions with high concentrations of cosmotropic salts.
  • the approach according to the invention makes possible an additional solution Purification effect on residual contaminants in the nucleic acid phase or DNA phase (eg proteins, RNA).
  • the method according to the invention opens up applications both on a research scale and in automated high-throughput analyzes (eg in diagnostics) and in preparative applications on a production scale. Furthermore, the use of suitable support materials (eg adsorbents, membranes, filters or monoliths) allows the use of high flow rates and low residence times, since the majority of the adsorption is not diffusion-limited.
  • suitable support materials eg adsorbents, membranes, filters or monoliths
  • nucleic acid-containing solutions are preferably used having a phosphate concentration of at least 20% (w / w) or nucleic acid-containing, cosmotropic, high-molar sulfate or citrate solutions.
  • a phosphate concentration of at least 20% (w / w) or nucleic acid-containing, cosmotropic, high-molar sulfate or citrate solutions At lower concentrations of these cosmotropic salts, the binding of the nucleic acids to the support material ( Adsorbent) incomplete.
  • the necessary final concentration of the binding-inducing, cosmotropic salt component can be modeled or optimized for the respective target nucleic acid.
  • nucleic acid (s) from aqueous two-phase systems
  • the subphase as described, for example, in WO2004 / 106516A1
  • the present invention is also suitable for the isolation of nucleic acids from other described PEG / salt-phase systems in combination with cosmotropic salts such as phosphate, sulfate and citrate salts, whereby also in these the results of a prior art insulation (eg by ultrafiltration or gel filtration) can be significantly improved.
  • Binding under the cosmotropic conditions described above is particularly efficient and with the highest capacities (up to 0.1 mg / cm filter area and higher) possible on suitable supports such as nitrocellulose filters and hydrophilized nylon filter membranes (membrane discs, filter plates, filter capsules, filter cartridges).
  • PVDF can also be adsorbed after rinsing with isopropanol, but with lower dynamic capacity.
  • hydrophobic membranes such as GHP or unmodified nylon, bind nucleic acids, bound DNA can not be completely redissolved or eluted, as in nitrocellulose, PVDF, or hydrophilized nylon with aqueous buffers.
  • nucleic acid-binding adsorbents are suitable for binding, ie monoliths, resins ("adsorbent resins"), nitrocellulose wadding, granules and other formats with adsorbing properties in addition to membranes and filter materials, but especially materials (membranes, filters, monoliths) that are highly absorbent Productivity (high throughput speeds, low diffusion limitation).
  • the carrier material / adsorbent can be washed with an alcohol, in particular isopropanol or ethanol, preferably 50 to 100% (v / v) alcohol or isopropanol or ethanol, particularly preferably 60 to 90% (v / v) alcohol or isopropanol or ethanol, very particularly preferably 65 to 85% (v / v) of alcohol or isopropanol or ethanol.
  • an alcohol in particular isopropanol or ethanol, preferably 50 to 100% (v / v) alcohol or isopropanol or ethanol, particularly preferably 60 to 90% (v / v) alcohol or isopropanol or ethanol, very particularly preferably 65 to 85% (v / v) of alcohol or isopropanol or ethanol.
  • the washed, desalted nucleic acid (eg DNA) present on the membrane can be dissolved in aqueous, eg buffered, solutions such as Tris / HCl-EDTA (TE), which do not lead to the precipitation of DNA and also not very high concentrations (not more than 1 M) ) on cosmotropic salts, such as sulfates, citrates and phosphates, Pl buffer (QIAGEN GmbH, Hilden Germany) or P3 buffer (QIAGEN GmbH, Hilden Germany), are detached from the support material and eluted.
  • aqueous eg buffered
  • solutions such as Tris / HCl-EDTA (TE), which do not lead to the precipitation of DNA and also not very high concentrations (not more than 1 M)
  • cosmotropic salts such as sulfates, citrates and phosphates, Pl buffer (QIAGEN GmbH, Hilden Germany) or P3 buffer (QIAGEN GmbH, Hilden Germany
  • the advantage of the method according to the invention lies in a considerably faster, cost-effective, scalable and automatable desalination, purification, concentration and / or rebuffering of nucleic acid-containing solutions, without complicated and limited techniques such as ultrafiltration, gel filtration etc. having to be used.
  • a clear reduction of RNA as well as of proteins can be achieved.
  • the previously known methods according to the prior art are thus significantly improved.
  • a nucleic acid-containing solution in a first step, a nucleic acid-containing solution must be provided.
  • This solution can be prepared, for example, by shaking out nucleic acid-containing (eg DNA-containing or plasmid-containing) process fluids, such as bacterial lysates, or by purification techniques, such as chromatography, precipitation, filtration, etc., pre-purified process intermediates) in a suitable phase system with a suitable cosmotropic Phase with high Salt concentration, as described for example in WO2004 / 106516 Al, are obtained.
  • the nucleic acid-containing (DNA-containing or plasmid-containing phase) is then immobilized by adsorption on a suitable support material.
  • the support material may be treated with organic solvents, e.g. Alcohols such as isopropanol or ethanol, to be washed.
  • organic solvents e.g. Alcohols such as isopropanol or ethanol
  • the washed, desalted nucleic acid (e.g., DNA or plasmid) present on the membrane can then be washed in a further step in aqueous, e.g. buffered solutions, such as TE, which do not lead to the precipitation of DNA and also do not contain very high concentrations (not more than 1 M) cosmoter salts such as sulfates, citrates and phosphates, in Pl buffer (QIAGEN GmbH) or in P3 buffer (QIAGEN GmbH) are removed from the support material and eluted.
  • aqueous e.g. buffered solutions, such as TE, which do not lead to the precipitation of DNA and also do not contain very high concentrations (not more than 1 M) cosmoter salts such as sulfates, citrates and phosphates, in Pl buffer (QIAGEN GmbH) or in P3 buffer (QIAGEN GmbH) are removed from the support material and eluted.
  • the eluted, purified nucleic acid (s) stand for analyzes such as. in diagnostics, for further processing steps or for therapeutic applications, e.g. gene therapy or genetic vaccines available.
  • the present invention is concerned with the selective, reversible adsorption of nucleic acids under cosmotropic binding conditions to suitable adsorbents, e.g. on hydrophobic surfaces.
  • suitable adsorbents e.g. on hydrophobic surfaces.
  • nitrocellulose and Nylonf ⁇ lter and PVDF as support materials or adsorbents.
  • Particularly preferred is the selective, reversible adsorption of nucleic acids under cosmotropic binding conditions after separation and extraction in phase systems of nucleic acid-containing phases of phase systems, in particular aqueous two-phase systems, as described in WO2004 / 106516 Al and Trinidade, LP. et al. (see above) are known.
  • the process according to the invention is particularly suitable for the isolation of double-stranded nucleic acids from aqueous two-phase systems or organic / aqueous two-phase systems under cosmotropic bonding conditions after separation and extraction in Phase systems of product-containing phases of phase systems on hydrophobic adsorbents, such as nitrocellulose and nylon filters and PVDF.
  • Another aspect of the invention relates to the isolation of double-stranded nucleic acids, e.g. Plasmid DNA from the lower phase of a PEG / potassium phosphate system on hydrophobic adsorbents, e.g. Nitrocellulose and nylon filters and PVDF.
  • hydrophobic adsorbents e.g. Nitrocellulose and nylon filters and PVDF.
  • Figures 1 to 3 show elution profiles of three HPLC runs. On the ordinate the optical density of the respective sample is plotted at 260 nm, and on the abscissa the time in minutes.
  • Fig. 1 is an HPLC chart (column: Source 15 PHE (GE Healthcare), elution with 1.5 M ammonium sulfate, 10 mM Tris / Cl, pH 8.0, 0.8 ml / min after 2.5 min gradient to 10 mM Tris / Cl, pH 8.0 until elution of RNA) of a sample representing the lower phase as the total fraction as obtained after aqueous two-phase separation.
  • the sample contained 26.5 ⁇ g / ml pDNA and 57.5 ⁇ g / ml RNA.
  • Fig. 2 shows the HPLC elution profile of the lower phase after 20 ml of the lower phase having a diameter of 47 mm and a pore size of 0.2 microns
  • Nitrocellulose membrane were filtered (30% w / w potassium phosphate buffer).
  • the sample contained 0.5 ⁇ g / ml pDNA and 50 ⁇ g / ml RNA.
  • the sample is free of pDNA (no corresponding peak at about 1 min), which is virtually quantitatively bound to the nitrocellulose membrane.
  • the other peaks from FIG. 1 salts, proteins, oligonucleotide RNA, RNA
  • FIG. 2 shows that pDNA was selectively and quantitatively removed from the sample.
  • Fig. 3 shows a sample obtained after elution of the nitrocellulose filter with 10 ml of TE buffer (10 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).
  • the yield of pDNA was 50 ⁇ g / ml (corresponding to about 95% yield, 501 ⁇ g of 530 ⁇ g of inserted pDNA could be recovered) and the amount of RNA in the sample was 16.4 ⁇ g / ml of RNA (indicating a depletion of about 86%, 1150 ⁇ g RNA were used, 164 ⁇ g were found in the eluate).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren an ein Trägermaterial, das dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) ein einen kosmotropen Salzgehalt von mindestens 1 Mol aufweisendes, nukleinsäurehaltiges Gemisch mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, woraufhin die Nukleinsäure bzw. die Nukleinsäuren aus dem nukleinsäurehaltigen Gemisch an dem Trägermaterial adsorbiert wird bzw. werden, und (b) die am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren mittels einer wäßrigen Lösung, welche einen Salzgehalt von nicht mehr als 1 Mol aufweist, von dem Trägermaterial wieder abgelöst wird.

Description

Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren an ein
Trägermaterial
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von einer Nukleinsäure oder mehreren Nukleinsäuren an ein Trägermaterial.
Die effiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus kosmotropen Lösungen mit hoher Salzkonzentration (kosmotrope Salze sind z.B. Phosphate, Sulfate und Citrate) und insbesondere aus der Unterphase von wäßrigen Zwei-Phasensystemen (Polymer-Salz Systeme) stellt ein bisher praktisch nicht gelöstes Problem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren dar. Angewandt wurden bisher einige zeit-intensive Methoden (z.B. Ultrafiltration, Gelfiltration etc.), die allerdings nur in wenigen Anwendungen zu rechtfertigen sind. Bisher ist eine schnelle, effiziente und kostengünstige Präzipitation von Nukleinsäuren unter derartigen Lösungsbedingungen nicht möglich (z.B. durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie Isopropanol), da aufgrund der Nichtmischbarkeit erneut ein Phasensystem ausgebildet wird und Teile der Nukleinsäuren anschließend unvollständig als Präzipitat in der Phasengrenzfläche vorliegen. Darüber hinaus sind Fällungen im allgemeinen kompliziert skalierbare Aufarbeitungstechniken. Nach dem Stand der Technik erfolgt aus diesem Grund eine Umpufferung bzw. Formulierung von nukleinsäurehaltigen Phasen durch Ultrafiltration, Gelfiltration oder anderen geeigneten Methoden basierend auf säulenchromatographischen Verfahren.
Es sind auch Verfahren zur Reinigung von doppelsträngiger DNA (vornehmlich Plasmid- DNA) nach dem so genannten wäßrigen Zweiphasensystem („aqueous two-phase System", „ATPS") bekannt, das z.B. in WO2004/106516 Al und Trinidade, I.P., Diogo M.M., Prazeres D. M. F. und Marcos J.C., Purification of plasmid DNA vectors by aqueous two-phase extraction and Hydrophobie interaction chromatography, Journal of Chromatography A, 1082 (2005), 176-184, beschrieben ist. Bei letzterem ATPS Verfahren wird die produkthaltige Unterphase mittels konventioneller hydrophober Interaktionschromatographie weiter gereinigt, wobei die Reinigung durch eine selektive Adsorption einer nicht erwünschten Nukleinsäure erreicht wird. Die Produkt-Nukleinsäure wird hierbei nicht gebunden und somit auch keine Konzentrierung oder Isolierung aus der hoch-salzhaltigen Phase erreicht. Die Nachteile der oben genannten säulenchromatographischen Methoden nach dem Stand der Technik (insbesondere hydrophobe Verfahren) liegen vorwiegend darin, daß sie hohe Kosten verursachen, niedrigere Flußraten und somit eine niedrige Produktivität aufweisen, hohe Druckverluste zeigen, nur geringe Kapazitäten aufweisen sowie Elutionsbedingungen mit hohen Salzkonzentrationen benötigen, die ihrerseits zu Entsorgungsproblemen führen. Da in allen bekannten Fällen RNA stärker an das Adsorbens bindet als DNA, ist eine gleichzeitige Entsalzung und eine Trennung von RNA/DNA nicht möglich. Die Ultra- bzw. Dia-Filtration hat einen hohen Zeitbedarf, eine geringe Produktivität und nur eine geringe Selektivität für die unterschiedlichen Nukleinsäurepopulationen wie Plasmid-DNA, gescheerte genomische DNA und langkettige RNA-Moleküle. Bei der Gelfiltration schließlich ist nachteilig, daß wegen der geringen zu applizierenden Mengen eine hohe Produktverdünnung und eine niedrige Produktivität in Kauf genommen werden müssen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur selektiven Abtrennung von Nukleinsäuren aus wäßrigen, kosmotrope Salze enthaltenden Systemen, wie z.B. Zwei-Phasen-Systemen, zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe löst die Erfindung durch das Verfahren gemäß des unabhängigen Anspruchs 1. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, dem Beispiel und der Zeichnung.
Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren an ein Trägermaterial, das dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) ein einen kosmotropen Salzgehalt von mindestens 1 Mol aufweisendes, nukleinsäurehaltiges Gemisch mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, woraufhin die Nukleinsäure bzw. die Nukleinsäuren aus dem nukleinsäurehaltigen Gemisch an dem Trägermaterial adsorbiert wird bzw. werden, und (b) Ablösen der am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren mittels einer wäßrigen Lösung, welche einen Salzgehalt von nicht mehr als 1 mol, insbesondere weniger als 1 mol, aufweist. Bevorzugt wird zum Ablösen der Nukleinsäure von dem Trägermaterial (oben Schritt (b)) eine Lösung eingesetzt, die eine Salzkonzentration von 500 mM oder weniger, z.B. 100 mM oder weniger, 50 mM oder weniger, 20 mM oder weniger bzw. 10 mM oder weniger aufweist. Es ist des weiteren bevorzugt, daß die Lösung zum Ablösen einer Nukleinsäure von dem Trägermaterial eine Salzkonzentration von mindestens 1 mM aufweist. Der Gehalt der Lösung an kosmotropen Salzen in Schritt (a), in dem Nukleinsäure(n) an das Trägermaterial gebunden wird/werden, beträgt vorzugsweise mindestens 1,5 Mol, mehr bevorzugt mindestens 2,0 Mol, und insbesondere mindestens 2,5 Mol. Kosmotrope Salzgehalte von mehr als 5 Mol und insbesondere von mehr als 10 Mol sind weniger bevorzugt.
Kosmotrope (bzw. lyotrope) Salze sind in der sogenannten Hofmeister-Serie nach ihrer Eigenschaft geordnet, die Struktur des Wassers zu erhöhen. Demgegenüber stehen chaotrope Salze, die eine Verringerung (Störung) der Wasserstruktur bewirken. Zu den bekannten kosmotropen Salzen gehören z.B. Phosphate, Sulfate und Citrate.
Die hier beschriebene Art der Adsorption nutzt hydrophobe oder gemischt hydrophobe- elektrostatische Wechselwirkungen (sog. „mixed-mode"). Die Stärke dieser Bindung - d.h. das synergistische Wechselspiel zwischen Oberflächeneigenschaften des Adsorbers, des Adsorbens und der Flüssigphasenbedingungen - bestimmt die im Verfahren gewünschte Reversibilität der Bindung. Sie unterscheidet sich somit von der im sogenannten Boom-Patent (U.S. Patent Nr. 5,234,809, Europäisches Patent Nr. 0 389 063) beschriebenen Bindung von Nukleinsäuren unter chaotropen Bedingungen an Silika-Oberflächen.
Weiterhin unterscheidet sich die Bindungsart deutlich von gängigen exklusiv hydrophoben Bindungsarten, die in der Literatur beschrieben sind, da sich im vorliegenden Fall die Adsorptionsreihenfolge von DNA und RNA umkehrt, d.h. daß DNA (als Zielnukleinsäure) stärker bindet als RNA. Dies ermöglicht eine bessere Auslastung der Adsorbentien mit DNA, eine initiale Elution von RNA und eine finale Elution von DNA unter gewünschten Pufferbedingungen mit geringen Salzkonzentrationen. Daher ist eine gleichzeitige Reinigung und Entsalzung der Probe möglich. Durch Kombination bzw. Zugabe von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol oder Isopropanol können Bindungs-Selektivitäten weiterhin moduliert werden.
Unter „Zielnukleinsäure" bzw. „Zielnukleinsäuren" werden in Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung eine Nukleinsäure bzw. mehrere Nukleinsäuren verstanden, die aus einem Gemisch verschiedener Substanzen, z.B. den Komponenten einer Zelle, abgetrennt werden sollen.
Besonders günstig ist der erfindungsgemäße Einsatz dieser Technologie zum Abfangen („capturing") von Ziel-Nukleinsäuren aus vorher gewonnenen, produkthaltigen Phasen von Polymer/Salz-Phasensystemen geeignet. In der Regel ist eine schnelle, effiziente und kostengünstige Präzipitation der Nukleinsäure(n) aus diesen Lösungsbedingungen nicht möglich (z.B. durch Zugabe von Isopropanol), da sich dann zwei Phasen, bestehend aus der organischen und der nukleinsäurehaltigen Hochsalzphase, ausbilden oder Nukleinsäuren an der Phasengrenzfläche präzipitieren, siehe oben.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäure(n) aus Lösungen mit einer hohen Konzentration an vorzugsweise kosmotropen Salzen („hohe Konzentration" bedeutet hier insbesondere > 20% w/w z.B. an Phosphat- Citrat- und Sulfatsalzen) an ein geeignetes Trägermaterial (Adsorbentien, Membranen, Filter oder Monolithe) z.B. unter hydrophoben oder „mixed-mode" (hydrophobelektrostatischen Bedingungen und nachfolgende Desorption der Nukleinsäure(n) von dem Trägermaterial und Elution durch Formulierungslösungen mit niedriger Salzkonzentration von 100 mM oder geringer, vorzugsweise 50 mM oder geringer und insbesondere 20 mM oder geringer (z.B. dem Fachmann bekannte konventionelle wäßrige Puffersysteme wie 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 etc.). Die erfindungsgemäß fixierten Nukleinsäuren können unter gewünschten wäßrigen bzw. nicht-kosmotropen und/oder Niedrigsalz- Bedingungen von der Adsorber-Matrix eluiert werden und in nachfolgenden Applikationen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Adsorption des Nukleinsäure-Zielmoleküls erfolgt aus hochmolaren Lösungen kosmotroper Salze an geeignete Adsorbentien, Membranen, Filter oder Monolithe, wie z.B. Nitrocellulose- und hydrophilisierte Nylonfilter, Nylonwatte und Polyvinylidenfluorid (PVDF) sowie auch Adsorbentien auf Silika-Basis. Besonders geeignet ist der erfindungsgemäße Einsatz dieser Technologie zum Abfangen („capturing") von Nukleinsäuren aus produkthaltigen Phasen von Phasensystemen, in welchen sich die Ziel- Nukleinsäure in der Phase mit hoher Konzentration an kosmotropen Salzen verteilt hat, wie z.B. in der WO2004/106516 Al beschrieben.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Nachteile des Standes der Technik (wie eine zeitintensive Konzentrierung und Umpufferung der Nukleinsäure-Phase durch z.B. Ultrafiltration oder Gelfiltration; außerdem ist eine Fällung in der Regel aus Lösungen mit hohen Konzentrationen an kosmotropen Salzen nicht möglich) überwunden und die Reinigung von Nukleinsäure(n) erheblich erleichtert. Außerdem ist eine Fällung in der Regel aus Lösungen mit hohen Konzentrationen an kosmotropen Salzen ansonsten i.d. Regel nicht möglich Neben der Umpufferung ermöglicht der erfindungsgemäße Ansatz einen zusätzlichen Aufreinigungseffekt gegenüber Restkontaminanten in der Nukleinsäure-Phase bzw. DNA- Phase (z.B. Proteine, RNA). Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet Anwendungen sowohl im Forschungsmaßstab als auch bei automatisierten Hochdurchsatz- Analysen (z.B. in der Diagnostik) und bei präparativen Anwendungen im Produktionsmaßstab. Weiterhin ermöglicht die Verwendung geeigneter Trägermaterialien (z.B. Adsorbentien, Membranen, Filtern oder Monolithen) den Einsatz hoher Durchflußraten und geringe Verweilzeiten, da der Hauptanteil der Adsorption nicht diffusionslimitiert ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden nukleinsäurehaltige Lösungen bevorzugt mit Phosphatkonzentration von mindestens 20 % (w/w) oder nukleinsäurehaltige, kosmotrope, hoch-molare Sulfat- oder Citrat-Lösungen eingesetzt .Bei niedrigeren Konzentrationen dieser kosmotropen Salze ist die Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial (Adsorbens) unvollständig. Weiterhin kann man durch Zugabe von nicht-kosmotropen Salzen die notwendige Endkonzentration der bindungsinduzierenden, kosmotropen Salzkomponente modellieren bzw. für die jeweilige Ziel-Nukleinsäure optimieren.
Bei dem Einsatz der vorliegenden Erfindung zur Isolierung von Nukleinsäure(n) aus wäßrigen Zwei-Phasensystemen wird die Unterphase (wie z.B. in WO2004/106516 Al beschrieben) eingesetzt. Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zur Isolierung von Nukleinsäuren aus anderen beschriebenen PEG/Salz-Phasensystemen in Kombination mit kosmotropen Salzen wie Phosphat-, Sulfat- und Citratsalzen, wodurch auch bei diesen die Ergebnisse einer Isolierung nach dem bisherigen Stand der Technik (z.B. durch Ultrafiltration oder Gelfiltration) deutlich verbessert werden.
Die Bindung unter den oben beschriebenen kosmotropen Bedingungen ist besonders effizient und mit höchsten Kapazitäten (bis zu 0,1 mg/cm Filterfläche und höher) möglich an geeignete Träger wie z.B. Nitrocellulosefilter und hydrophilisierte Nylonfiltermembranen (Membranscheiben, Filterplatten, Filterkapsulen, Filterkartuschen). An PVDF kann ebenfalls nach Spülen mit Isopropanol adsorbiert werden, jedoch mit geringerer dynamischer Kapazität. Andere hydrophobe Membranen wie GHP oder nicht-modifiziertes Nylon führen zwar zur Bindung von Nukleinsäuren, jedoch kann gebundene DNA nicht wie bei Nitrocellulose, PVDF oder hydrophilisiertem Nylon mit wäßrigen Puffern wieder vollständig abgelöst bzw. eluiert werden. Für die Bindung eignen sich alle nukleinsäurebindenden Adsorbentien, d.h. neben Membranen und Filtermaterialien auch Monolithe, Harze („Adsorberresins"), Nitrocellulosewatte, Granulate und andere Formate mit adsorbierenden Eigenschaften. Besonders eignen sich jedoch Materialien (Membran, Filter, Monolithe), die eine hohe Produktivität (hohe Durchlaufgeschwindigkeiten, geringe Diffusionslimitierung) aufweisen.
Zur Entfernung von Salzresten kann das Trägermaterial/Adsorbens mit einem Alkohol, insbesondere Isopropanol oder Ethanol, gewaschen werden, vorzugsweise 50 bis 100 % (v/v) Alkohol bzw. Isopropanol oder Ethanol, besonders bevorzugt 60 bis 90 % (v/v) Alkohol bzw. Isopropanol oder Ethanol, ganz besonders bevorzugt 65 bis 85 % (v/v) Alkohol bzw. Isopropanol oder Ethanol. Die Nukleinsäuren liegen dann gefällt auf dem Adsorbens vor.
Die gewaschene, entsalzte, auf der Membran befindliche Nukleinsäure (z.B. DNA) kann in wäßrigen, z.B gepufferten, Lösungen wie Tris/HCl-EDTA (TE), die nicht zur Fällung von DNA führen und zudem keine sehr hohen Konzentrationen (nicht über 1 M) an kosmotropen Salzen, wie Sulfate, Citrate und Phosphate, enthalten, Pl Puffer (QIAGEN GmbH, Hilden Deutschland) oder P3 Puffer (QIAGEN GmbH, Hilden Deutschland), von dem Trägermaterial abgelöst und eluiert werden.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in einer zeitlich deutlich beschleunigten, kostengünstigen, skalierbaren und automatisierbaren Entsalzung, Reinigung, Konzentrierung und/oder Umpufferung von nukleinsäurehaltigen Lösungen, ohne daß aufwendige und limitierte Techniken wie Ultrafiltration, Gelfiltration etc. eingesetzt werden müssen. Dabei kann je nach Zielsetzung und Optimierung der Bedingungen in Abhängigkeit von der jeweiligen Ziel-Nukleinsäure (z.B. Plasmid-DNA, genomische DNA etc.) auch eine deutliche Reduktion von RNA sowie von Proteinen erreicht werden. Die bisher bekannten Verfahren nach dem Stand der Technik werden somit deutlich verbessert.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich wie folgt durchführen. Zunächst muß in einem ersten Schritt eine nukleinsäurehaltige Lösung bereitgestellt werden. Diese Lösung kann z.B. durch Ausschütteln von nukleinsäurehaltigen (z.B. DNA-haltigen bzw. plasmidhaltigen) Prozess-Flüssigkeiten, wie Bakterienlysaten, oder durch Aufreinigungstechniken, wie Chromatographie, Präzipitation, Filtration etc., vorgereinigte Prozeß-Zwischenstufen) in einem geeigneten Phasensystem mit einer geeigneten kosmotropen Phase mit hoher Salzkonzentration, wie z.B. in der WO2004/106516 Al beschrieben, gewonnen werden. Die nukleinsäurehaltige (DNA-haltige bzw. plasmidhaltige Phase) wird dann mittels Adsorption an einem geeigneten Trägermaterial immobilisiert.
Zur Entfernung von Salzresten kann in einem optionalen Schritt das Trägermaterial mit organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Alkoholen wie Isopropanol oder Ethanol, gewaschen werden. Alternativ können die Nukleinsäuren auf dem Trägermaterial selektiv auch mit anderen Lösungen fixiert werden, die zur Fällung von Nukleinsäuren führen (z.B. PEG, Spermidin, Spermin, CTAB= Cetyltrimetylammoniumbromid).
Die gewaschene, entsalzte, auf der Membran befindliche Nukleinsäure (z.B. DNA bzw. Plasmid) kann dann in einem weiteren Schritt in wäßrigen, z.B. gepufferten Lösungen, wie TE, die nicht zur Fällung von DNA führen und zudem keine sehr hohen Konzentrationen (nicht mehr als 1 M) kosmo troper Salze wie Sulfate, Citrate und Phosphate enthalten, in Pl Puffer (QIAGEN GmbH) oder in P3 Puffer (QIAGEN GmbH) von dem Trägermaterial abgelöst und eluiert werden.
Die so eluierte(n), gereinigte(n) Nukleinsäure(n) steht/stehen für Analysen, wie z.B. in der Diagnostik, für weitere Aufarbeitungsschritte oder für therapeutische Anwendungen, z.B. gentherapeutische oder genetische Impfungen, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren unter kosmo tropen Bindungsbedingungen an geeignete Adsorbentien, z.B. an hydrophobe Oberflächen. Besonders bevorzugt sind Nitrocellulose- und Nylonfϊlter sowie PVDF als Trägermaterialien bzw. Adsorbentien. Besonders bevorzugt ist die selektive, reversible Adsorption von Nukleinsäuren unter kosmotropen Bindungsbedingungen nach Trennung und Extraktion in Phasensystemen aus nukleinsäurehaltigen Phasen von Phasensystemen, insbesondere wäßrigen Zweiphasensystemen, wie sie aus der WO2004/106516 Al und Trinidade, LP. et al. (siehe oben) bekannt sind.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von doppelsträngigen Nukleinsäuren aus wäßrigen Zwei-Phasensystemen oder organisch/wäßrigen Zwei- Phasensystemen unter kosmotropen Bindungsbedingungen nach Trennung und Extraktion in Phasensystemen aus produkthaltigen Phasen von Phasensystemen an hydrophoben Adsorbentien, wie z.B. Nitrocellulose- und Nylonfiltern und PVDF.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Isolierung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, aus der Unterphase eines PEG/Kaliumphosphat- Systems an hydrophoben Adsorbentien, wie z.B. Nitrocellulose- und Nylonfiltern und PVDF.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels näher erläutert.
Beispiel
300 g eines wäßrigen Zweiphasensystems enthaltend 6 g Biomasse wurden wie in der WO 2004/106516 Al beschrieben behandelt. Dem Ansatz wurden 15 % Polyethylenglycol (PEG) 800 sowie 20 % Phosphat zugesetzt und die sich einstellende wäßrige Unterphase isoliert. Die Unterphase wurde über eine Nitrocellulosemembran geschickt, und verschiedene Chargen anschließend durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mittels Hydrophober Interaktions-Chromatographie (HIC) analysiert.
Die Fig. 1 bis 3 zeigen Elutionsprofile von drei HPLC-Läufen. Auf der Ordinate ist die optische Dichte der jeweiligen Probe bei 260 nm aufgetragen, und auf der Abszisse die Zeit in Minuten.
In Fig. 1 ist ein HPLC-Diagramm (Säule: Source 15 PHE (GE Healthcare), Elution mit 1.5 M Ammoniumsulfat, 10 mM Tris/Cl, pH 8.0; 0,8 ml/min nach 2,5 min Gradient zu 10 mM Tris/Cl, pH 8.0 bis zur Elution von RNA) einer Probe gezeigt, welche die Unterphase als Gesamtfraktion, wie nach der wäßrigen Zweiphasentrennung erhalten, darstellt. Die Probe enthielt 26,5 μg/ml pDNA und 57,5 μg/ml RNA. Der erste Peak des in Fig. 1 gezeigten Elutionsprofils bei etwa 1 min geht auf die in der Probe enthaltene pDNA zurück, die nächsten Peaks nach einer Retentionszeit zwischen 1,5 und 2,5 Minuten zeigen Salze, Proteine und Oligonukleotid-RNA, und unter dem letzten Peak, der zwischen 6 und 7 Minuten von der HPLC-Säule eluiert wurde, verbirgt sich RNA.
Fig. 2 zeigt das HPLC-Elutionsprofil der Unterphase, nachdem 20 ml der Unterphase durch eine einen Durchmesser von 47 mm und eine Porengröße von 0,2 μm aufweisende Nitrocellulosemembran filtriert worden waren (30 % w/w Kaliumphosphatpuffer). Die Probe enthielt 0,5 μg/ml pDNA und 50 μg/ml RNA. Wie man leicht erkennen kann, ist die Probe frei von pDNA (kein entsprechender Peak bei etwa 1 min), die praktisch quantitativ an der Nitrocellulosemembran gebunden ist. Die anderen Peaks aus Fig. 1 (Salze, Proteine, Ologonukleotid-RNA, RNA) sind auch in Fig. 2 unverändert vorhanden. Dies zeigt, daß pDNA selektiv und quantitativ aus der Probe entfernt wurde.
Fig. 3 schließlich zeigt eine Probe, die nach Elution des Nitrocellulosefilters mit 10 ml TE- Puffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) erhalten wurde. Die Ausbeute an pDNA betrug 50 μg/ml (entsprechend ca. 95 % Ausbeute; von 530 μg eingesetzter pDNA konnten 501 μg wiedergewonnen werden) und die Menge an RNA in der Probe lag bei 16,4 μg/ml RNA (was einer Abreicherung von ca. 86 % entspricht; 1150 μg RNA wurden eingesetzt, 164 μg fanden sich im Eluat wieder). Damit ist gezeigt, daß pDNA nach einer entsprechenden Behandlung (Bindung an ein Trägermaterial, im vorliegenden Fall ein Nitrocellulosefilter) fast vollständig in hochgereinigter Form wiedergewonnen werden kann.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren an ein Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) ein einen kosmotropen Salzgehalt von mindestens 1 Mol aufweisendes, nukleinsäurehaltiges Gemisch mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, woraufhin die Nukleinsäure bzw. die Nukleinsäuren aus dem nukleinsäurehaltigen Gemisch an dem Trägermaterial adsorbiert wird bzw. werden, und
(b) Ablösen der am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren mittels einer wäßrigen Lösung, welche einen Salzgehalt von nicht mehr als 1 mol aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial eine Membran, ein Filter, Nylonwatte oder Polyvinylidenfiuorid (PVDF) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter ein Nitrocellulosefϊlter oder ein hydrophilisierter Nylonfϊlter ist.
4. Verfahren nach Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens aus Silika-Oberfiächen besteht.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) eine mehr als 1 molare Lösung eines kosmotropen Salzes eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das kosmotrope Salz ein Sulfat, Citrat oder Phosphat ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die wäßrigen Lösung, welche einen Salzgehalt von nicht mehr als 1 mol aufweist, ein TE-Puffer (Tris/HCl-EDTA-Puffer) oder Wasser ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der TE-Puffer 10 mM Tris/HCl und 1 mM EDTA enthält und einen pH- Wert zwischen 7 und 8 aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Schritt (a) und vor Schritt (b) noch ein Reinigungsschritt mit einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Fällungsmittel für Nukleinsäuren, insbesondere
Spermidin, Spermin, CTAB, PEG, zwischengeschaltet ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ein Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder Isopropanol, ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einer wäßrigen Zweiphasentrennung von Nukleinsäuren durchgeführt wird.
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