CS231169B2 - Processing method of adsorbing agent for affinitive separation of nucleic acids - Google Patents

Processing method of adsorbing agent for affinitive separation of nucleic acids Download PDF

Info

Publication number
CS231169B2
CS231169B2 CS781289A CS188180A CS231169B2 CS 231169 B2 CS231169 B2 CS 231169B2 CS 781289 A CS781289 A CS 781289A CS 188180 A CS188180 A CS 188180A CS 231169 B2 CS231169 B2 CS 231169B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
affinity
nucleic acids
specific
separation
residue
Prior art date
Application number
CS781289A
Other languages
English (en)
Other versions
CS188180A2 (en
Inventor
Werner Mueller
Hans Buenemann
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CS188180A2 publication Critical patent/CS188180A2/cs
Publication of CS231169B2 publication Critical patent/CS231169B2/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3253—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure not containing any of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. aromatic structures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
    • C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
    • C07D219/08—Nitrogen atoms
    • C07D219/10—Nitrogen atoms attached in position 9
    • C07D219/12—Amino-alkylamino radicals attached in position 9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/10—Aza-phenanthrenes
    • C07D221/12—Phenanthridines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F265/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00
    • C08F265/10—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00 on to polymers of amides or imides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
  • Graft Or Block Polymers (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby adsorpčního činidla pro afinitně specifické dělení nukleových kyselin, zejména kyselin desoxyribonukleových (dále označovaných zkratkou DNK).
Izolace jednotlivých genů nebo souboru stejných genů v opakovaném uspořádání z genomu eukaroytních buněk má velký praktický význam nejen z čistě vědeckého zájmu, nýbrž i z hlediska genové technologie· Takové izolace byly možné za předpokladu, že složení bází genu nebo genové skupiny se odlišovalo svými spacery (což jsou nízkomolekulární skupiny s molekulovou hmotností do 4 000, působící prostorový odstup (alespoň o 6 až 7 % od průměrného složení bází celkového genomu·
Jako dělicího způsobu se většinou používá gradientově odstředění podle hustoty cestových iontů s přísadami, specifickými pro DNK-báze, jako iontů stříbra, rtuti nebo platiny nebo aktinomycinu, netropsinu nebo barviva 2-(4-hydroxyfenyl)-5-{5-[l-metylpiperazin-4-yl]-benzimidezol-2-yl}-benzimidazolu· Tyto způsoby mají jenom Omezenou kapacitu, jsou drahé a náročné na čas·
Vývoj materiálů pro afinitní chromatografií biopolymerů v minulých letech silně zjednodušil izolaci nebo umožnil vůbec poprvé přípravu velkého množství biopolymerů v čistém stavu· Při těchto způsobech se vychází zpravidla z nosiče, který se po chemické aktivaci uvádí do reakce s látkou, která váže pokud možno specificky izolovaný biopolymer. Na základě této specifičnosti lze v ideálním případě žádaný biopolymer adsorbovat selektivně ze směsi podobných sloučenin na chromátografický materiál a potom za vhodných podmínek desorbovat v čistém stavu (P. Cuatrecasas а С. B. Anfinsen, Ann· Rev. Biochem.
(1971) 259 až 278 ).
Přes možství příkladů úspěšného pouuití této metody nebyl dosud vyvinut pro možství biopoljraerů iádný chrornatografický mateeiál, který umoonuje podobné selektivní a programoovtelné rozdělení i smasí nukleových kyselin. Vysoce účinné dělení směsí kyselin nukleových v gramovém mnoství je věek předpokladem pro uvedenou izolaci jednotlivých genů nebo souborů stejných genů.
Při způsobech, které jsou k dispozici pro dělení nukleových kyselin o nízké molekulové hmotnost, například přenosových ribonukleových kyselin, se dosahuje dělení na různé druhy na adsorpčních činidlech, která kombinují iontoměrné vlastnosti s lipofilními interakcemi [R. M. Kotheri a V. Sharikar, Journal of Chroιaatogatphy 98 (1974) 499 ai 475] . Přitom se v poddtatě využívá moonnotí interakcí nosiče se vzácnými bázemi nukleových kyselin, které jsou v různých přenosových . ribonukleových kyselinách k dispozici v rozdílném mnoitt^í.
Protoie ribonukleové kyseliny a deso^/ribonukleové kyseliny o vyšší molekulové tanootnoti neobsáhlí zpravidla iádné vzácné báze, lze způsoby jejich rozdělení stavět jenom na následujících rozdílných znacích: '
a) Poměr jednoduchých provazců ke dvojitým
b) rozdíly ve sloSení bází .
c) rozdíly ve sledu bází
d) rozdíly v molekulových hmoOnožtach
e) rozdíly v terciárních strukturách.
Všech těchto znaků se skutečně používá u dnes obvyklých způsobů frakcionace [H. M. Kothaai. Cuчonoaog. Rev. I2 (1970) 127 ai 155j.
U neúčinnějšího způsobu, frakcionace v solném gradientu ne jltatždзtředivca, vedou rozdíly podle b, c a e k rozdílům v hustotě vznosu f jednotlivých DlNKdruhů, které lze ještě zvěěáit přidáním látek specifických k bázím. Dělicí ' ostrosti ubývá s ub^vajcí molekulovou hmotnost, kapacity s přibívseící molekulovou hmotnost. Při adsorpční chromoetžratfi na hydгolχyaptiOu dochází k frakc^na^ v podstatě podle a a jenom v menší míře podle b, přičemi nukleové kyseliny ^1!^δί guaninem a cytozinem jsou dasoabžvány při trochu niiších koncentracích solí nei sloiky ioЪata:¢ aden^m a tyminem [w. Pakroppa a W. Muller, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 7' (3) (1974) 699 ai 703].
Zcela analogicky lze nukleové kyseliny s dvojným provezcem děěit i na specifických ' adsorpčních činidlech protain-k:řaoelioe (například oeeyl-séažat ^^οΙπ-^ιοΙΙο^ podle rozdílů ve sl^oiení bází, přičemi opět mohou být nejdříve eluovány druhy DNK bohatŠÍ ^aninem a cytozinem [j. D. MaafoH a A. D. Her8hey, Annartical ^o^emistry 1 (1960) 66 ai 77, N. Siieoka a Te 'ei^Ying Che^. J. Moo. Biol. 4 (1962) 161 ai 172]. Vlastní mechanismus účinku těchto více méně náhodně objevených adsorpčních'činidel není znám. Malou dělící ostrost těchto oθttriáll se nepodeailo přes všechno lii.lí dodnes zásadně zleppit.
Teprve v posledních letech byly -po systematickém studiu četných látek nalezeny sloučeniny, které tvoří komplexy s kyseliTami nu^^vými a které se zdály vhodnými k cílené s^téze MUriM pro -afinLtní chгomotograafi [w. MuHer - a D M. ^0^10^ Eur. J. Bio^em. 54 (1975) 267 ai 277, W Muller, H. Bunemann a N. Dena^ata, Eur. J. B^chem. 54 (1975) 279 ai 291 a W. Mller a F. Gasuter, Eur. J. Bloch^. 54 (1975) 385 ai 39^4j. Jaké -výhody přináší použití takových dobře prostudovaných látek při - dělení směsí nu^^vých kyselin mc^hlo být jii ukázáno ne příkladech kombinovaného pouuití aydroзχrθpptiOž a atddžoabrooidu jako bázicky specifické - přísady k dělení tjpeгhaaikáloíca a heHká^ích DNK [w. Pakroppa, W. ^iíbI a W. Muller, AAojytictl Biochemietry 67 (1975) 372 ai 383.] a hySrooo/taρtitj * v kžaOinaci s deriváty feoyloežtrdloí červeni jako bázicky specifických kžιnoPexotvoaotca látek při dělení druhů DNK s dvoji^m paoaazceo [w. Prokroppa a W. Muller, Proč. Nat. Acad.
Sei. USA, 71 (3) (1974) 699 ai 703]. ~
Dělicí schopnost těchto posléze uvedených způsobů je srovnatelná s dělicí schopností prepsrsčního gradientu na bázi hustoty chloridu česného, to znamená, že lze vzájemně dělit DNK frakce s rozdílm v obsahu (G+C) (přičemž G značí guanin a C eytozin). Přes vysokou kapaectu, má tento způsob -tu nevýhodu, že se směseml DNK o průměrné molekulové tonotaooU složek vyěěí než 20 x Ю® špatně manipuluje a speciální hydro^s^tl-t používaný jako adsorpční činidlo se musí zvlášť.připravovat.
Již déle je známo, že směsi nukleových kyselin lze v systému polyetyleiglykol-dextrei za určitých podmínek dělit jednak v RNK a jedntprtvtzctvé DNK a jednak ve dvouprovazcové DNK.
Přitom se hromadí dvouprovazcové DNK vždy v (lehčí) polyetylenglykolové fázi, tj. má vyšší rozdělovači koeficient než jednoprovazcové kyseliny nukleové. Abssoutní hodnoty rozdělovačích koeficientů lze sice mmnnt přidáním draselných nebo lithných solí o 3 až 4 řády, frakcionace podle složení bází se však v tomto systému nedaří.
Úkol tohoto vynálezu spočívá nyní v tom, mít k dispozici způsob výroby adso^^ích činidel, kterými lze dosáhnout bázicky s/osSo strukturně specifického dělení biopolymerů a zejména směsí jednoprovazcových e/nebo dvouprovezéových - s/osSo maximálně vinutých a/nebo lineárních nukleových tyselin, zejména směsí DNK, při vysoké kapaeitě.
Pod afinitní tpθcifiCnt8tí je třeba rozumět především strukturní specifičnost e bázickou tpecifiCitst.
Ukázalo se však, že uvedenou úlohu lze řešit pomocí polymerního nosiče, ne který je, zejména ^valentně, vázán přímo nebo přes delší meeiskupiiy (space^ zbytek s afinitou k biopolymerů, případně bázicky a/nebo strukturně specifická skupina.
Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby edsorpčního činidle pro afinitně specifické dělení motromotekkUáгních látek, zejména biopolymerů, jako nukleových kyselin, vyznačující se tím, že se nejprve vytvoří polymeraci nebo polykondenzací alespoň jednoho monomeru, který má kromě toho funkční skupinu, přes kterou lze vázat ztytek s afinitou ke kyseinnám nukleovým přímo nebo přes polymerní spacer, o sobě známým způsobem polymmrní nosič, polymerní nosičový maatriál se případně rozmělní na požadovanou velikost částic a potom se roubuje zbytek s afinitou ke kyselinám nukleovým přímo nebo kopolymmrací v přítomnooti alespoň jednoho dalšího . monomeru jako kopolymeru, nebo se vyrábějí částice požadované velikosti o sobě známým způsobem perlovou polymesaαí.
Jeden ze zvláště - výhodných způsobů provedení tohoto vynálezu se týká způsobu výroby adso^č^ho činidla definovaného druhu, vyznaauuícího se polymerním nosičem s malou póxOovUosItť a tnltCineliottí, na který je naroubován kopolymer nejméně ze dvou směsně ptlymeгovvteliých monornmrů, z nichž jeden nese zbytek s afinitou ke kyselinám nukleovým.
Jako zbytky s afinitou k ' Siopolmerím lze používat komppexotvorné látky bázicky a/nebo strukturně specifické, které jsou popsány v uvedené literatuře. Zejména vhodné jsou zbytky Serviv následujících obecných vzorců I a II
a (D,
23'169 (II)
v uvedených obecných vzorcích značí CH-skupinu nebo atom dusíku, značí atom tyslíku, atom sirý, Ni-skupinu nebo skupinu obecného vzorce
kde r1 značí nezávisle na sobě atomy voráta nebo metylskupiny>
R značí atom vodíku nebo meeylskupinu, r3 značí atom vodíku nebo meeylskupinu,
R4 značí atom vodíku nebo metylskupinu a
A značí anion jako chloridový anion, perchlorátový anion nebo oxalátový anion.
Zejména výhodné komplexotvorné látky podle vynálezu, vázané na polymerní nosič bázicky a/nebo strukturně specifické, jsou zbytky následujících barviv:
1. Щвр^о^птИп^ (DAPI)
2, p-dipttylвminofuchsondipttyliminová sůl (Malachitová zelen) (CH3)2N
N(CH3)2
3. Hexatnetylyp-rosmiliniClortySrát (krystalová violet)
4. Heptrmetylso-rosrniliniClorid ( πletySоeteň)
Auramin (bázické aOrhtnsOmttanové barvivo)
NH
6.
(енз)2п
Менз)2
2-/4-ЬуГгохуУе1пу/-5 1 5- -тееуур1гегаг1п-4-у0] btnzimidaazr-2
-btnzOmiaazoO
(СНз^С h2n
С(СНз)з nh2
8.Di-terc.butylakriflevin
9. 3»7-dismino-10-fenyl-5-oxBBntr6cenová sůl
10. 3,7-tetrBieeyldiaininoo10-fenol-5-ooaanOr8cenová sůl
11. 3,76teyrametyliioeminoo9-fenolakriiioová sůl
12. Sůl eetyeu S-/1 Oo/l^-tetrameeyldiaininoO-^-oxaantrylen/ipropiooové kriteOny (CH3)2N
CH2CH2COOH
N(CH3)2
13. Akrrfeoaén
14. Sůl 10-/propenyl/-proflavinu
CH2CH-CH2
15. 3,7-diamino-5-fenylfenazinová sůl
16. 3,7-tetrametyldiamino-5-fenylfenazinová sůl
17. 2-metyl-3-8mino-7-dinietylaniinofenazinová sůl (£H3)2N
18. 2-metyl-3-emino-6-dimetylaminoakridinová sůl (CH3)2N
19. 2-metyl-3-aniino-7-dinietylaniinofenotiazinová sůl (CH3)2M
20. Proflavin
21. 3,7-diamino-5-oxaantracenová sůl
22. 3,7-diamino-5-tiaantracenová sůl
23. 3,7-diaminofenazinová sůl
24· 3,7-diaminofenoxazinová sůl
25. Tionin
26. 3,6-tetramětyldlaminoakridin (akridinová oranž)
27. Pyronin G
28. Tiopyronin
29. 3,7-tetrametyldiaminofenazinová sůl
30. 3,7-tetrametyldiaminofenoxazinová sůl·
31. Chlorid zinečnatý nebo chlorid dizinečnatý 2,7-bis-/dimety18mino/-fentiazoniumhydrochlorid (Metylenová modř)
32. N-/3-metoxy-7-chlorchinolin-4-yl/-etylendiamin
přičemž
Me ve výáe uvedených vzorcích značí metylenovou skupinu,
33. Etidiumbromid
Podle vynálezu výhodnými komplexotvornými fickými jsou však fenylneutrální červeň vzorce látkami bázicka a/nebo strukturně spéci231169
a malachitová zeleň /p-dimetyleminofuchsondimetyliminová sůl/
Tato barviva jsou o sobě známá a komerčně dostupná nebo je lze připravovat způsoby běžnými odborníkovi a uvedenými například v publikacích W. Mullera a D. M. Crotherse /Eur. J. Biochem. 54 /1975/ 276 až 277, W. Muller, H. Biinemann a N. Dattgupti /Eur.
J. Biochem. 54/1975/ 279 až 29' a W. a F. Geatier Eur. J. .Biochem. 54 (1975)
385 až 394/.
Tyto komplexotvornélátky bázicky a/nebo strukturně specifické, případně zbytky barviv lze vázat kovalentně na nosič způsoby běžnými odborníkovi z oboru, například esterifikicí hydroxylových skupin přítomných na nosiči přes karboxylové skupiny zavedené do molekuly barviva, tvorbou amidů, tvorbou uretinu nebo též i ^polymera^ v ne^Ношпо^! a s výhodou v přítomnooti jiných ktlolyeerovvtelňých monomerů přes kopolymerovetelné dvojné vazby, které jsou zavedeny do mooekuly barviva, například přes akrylamidovou skupinu, jak je tomu podle vynálezu u výhodných látek, bázicky a/nebo strukturně specifických, a to u a^j^r^l-fen^l^-n^i^u^trální červeně a ikrylmmla chitové zeleně následujcích vzorců. Teto uvedená označení jsou triviální názvy, přesný název zní lkryltylleinntennlnnutгální červeň a lkryltyleeiňoeθaθchittvá zeleň.
Akkyoolaminntenňlnnutrální červeň
cr
1
Akryoyleminomalechitová zeleň
Tyto komplexotvorné látky bázicky c/nebo strukturně specifické lze připravovat! způsobem, známým odborníkovi a to o sobě známým zavedením ccylovéio zbytku do molekul uvedených barviv. To platí rovněž pro delěí výše uvedené molekuly barviv.
Označení akrylový zbytek se v těchto případech kryje s názvem akryloylový zbytek.
Výroba se však provádí s výhodou způsoby popsanými v příkladech 3 a 4. Akkryloylová barviva jsou nová.
Podle vynálezu se používá jako polymerního nosiče s výhodou polymerního nosiče s malými póry a málo stlačitelného, jako p^^Ly-bis-^e^ki^y^l^í^midu. Tyto polymerní mat^i^iály pro nosiče s malými póry a málo stlačitelné se ukázaly být velice výhodnými pro afinitní vysoce viskozních roztoků kyselin nukleových. Dále nevykkzují tyto polymerní maaeriály nosičů žádné význačné interakce afinitními zbytky, zejména s kompAexotvornýmilátkami bázicky a/nebo strukturně specifcklými pro nukleové kyseliny, . které jsou vázány buň přímo nebo přes polymerní spacer na polymerní nosič.
Výhodným se ukázalo zavést mezi polymerní nosič a kommlexotvornou látku bázicky a/nebo strukturně specifickou delší space^ tj. molukulu s delším řetěccem bez funkčních skupin, protože tím není nepříznivě ovlivněna tvorba komplexu kommpexotvorné látky bázicky a/nebo strukturně specifické s helikální nukleovou kyselinou, poněvadž není sterická zábrana.
Podle obzvláště výhodného způsobu je tudíž u adsor^^^ Činidla podle vynálezu zbytek s afinitou k nukleovým kyselinám, případně kommlexotvlrná látka· bázicky a/nebo strukturně specifická vázána přes kopolymer, který má s výhodou stupeň polymera^ od 200 do 300, na polymerní nosič. K tvorbě tohoto ^polymeru se používá s výhodou další monommr, který je kopolymerovvtelný se skupinou zavedenou do kompJexotvorné látky bázicky a/nebo strukturně specifické a s kopolymerovвtellými skupinami, které jsou na polymerním nooiči.
Jako tohoto dalšího monommru se používá s výhodou akrylamid a barviva s uvedenými akrylovými skupinami se roubují na poly-bisakrylamid, který má Ještě volné kopolymerovltelné dvojné vazby.
Naroubování lze provádět podle vynálezu libovonrým způsobem, například ^^ri^kací, tvorbou amidu nebo tvorbou ustanu, k čemuž se používá obvyklých ^akčních činidel a obvyklých podmínek způsobu provedením případně se pro tuto reakci vhodné · skupiny zavádějí do polymerního maatriálu nosiče, případně se zavede zbytek s afinitou k biopolymeru.
Lze však rovněž naroubovat takový zbytek s afinitou k biopolymeru, do kterého byla zavedena klpolymeeΌllaelná dvojná vazba, v přítomiooti přebytečného dalšího kopolymerovvtelného monomeru jako kopolymeru, na polybisakrylamid, protože polybisakiylemid má ještě volné kopolyrnerovatelné dvojné vazby· Roulbovecí kopolymeraci lze provádět ve vodě nebo v některém netečném organickém rozpouštědle a v přítomnosti obvyklého polymeračního katalyzátoru.
Jako kopolymerovatrlného zbytku s afinitou k biopolymeru se používá s výhodou akrylfenylneuUrální červeně nebo akryleθlachitoaé zeleně a jako dalšího kopolyeerovatrlného monomeru akrylamidu, přičemž se naroubuje na polybisakrylamid kopolymer z těchto souččstí. Podle výhodného způsobu provedení se roubuje kopolymer z akrylamidu e akrylfenylneutrální červeně nebo akrylm^a-achit^ové zeleně o polymeračním stupni od 200 do 300·
Při této roubovací kopolymerci se pracuje s výhodou v takovém poměru zbytku s afinitou k biopolymeru, obsahujícím polyeerovatelnou dvojnou vazbu, k dalšímu kopolymerovatelnému monoomru, jenž činí 1:100 až asi 1:5 000, přičemž se tato reakce provádí s výhodou v poměru 1:3 000· Přioom se ukázalo, že výchozí mooární poměr dalšího monomeru ku zbytku s afinitou k biopolymeru, obsahujícím kopolyeerovθtrlnož dvojnou vazbu, zůstává zachován i v kopolymeru·
Při průměrném stupni polymera^ kopolymeru od 200 až 300 lze vycházet z toho, že naroubované řetězce kopolymeru mají vždy jenom jeden zbytek s afinitou k biopolymeru· Kopolymery tvoří tedy spacer rozdílné délky mmzi zbytkem s afinitou k biopolymeru a polymerním nosičem, zejména částicemi poly-bisakrylamidu·
Ukázalo se, že adsorpční činidla vyrobená podle vynálezu splňují dané požadavky a že je lze beze všeho získat synteticky jednoduchým způsobem· Polymerní nosič se získá například polymeraci bisakiyrlamidu ve vysoce koncentrovaném roztoku· Produkt polymerace je křehká, bezbarvá pevná látka, kterou lze velmi lehce rozetřít na dobře sedimentjící úlomky, které lze opakovaným sítováním homogerizovat až na požadované velikosti částic, Boo,necí schopnost ve vodném roztoku je i při mLmt^o^iádných koncentracích solí konstantní a prakticky nezávislá na rychlosti průtoku během chromejtprofit, Protože tyto částice obsahují ještě mes0staí nezreagovaných polymercwtelných dvojných vazeb, lze jich, jek již bylo uvedeno vpředu, použít pro další roubovací polyme^cc· .
Takto se získají kopolymeraci akryleelвchitoaé zeleni, specifické k edeninu a tyminu г jkrylfttylteutráltí červeně, specifické ke guaninu a cytosinu, s akrylamidem v přítoensoti těchto polybisakryaeeidoaých částic ve vodném roztoku výhodná adsorpční činidla podle vylezu· Přitom je 40 až 50 vzniklých kopolymerů o půrměrném stupni polymerace asi 200 vázáno za obvyklých reakčních podmínek·ve formě roubovaných kopolymerů na částice nosiče z poly-bisakrylamidu·
Po důkladném promni silné zbarvené částice adsorpčního činidla již žádné barvivo a lze jich použžt přímo pro afinitní nukleových kyselin. Obvykle se adsorbuje na ma<^e^l^i^:l směs nukleových kyselin v 0,01 M fosfá0avée pufru a desorbuje se lineárním solným gradientem· Druh soli závisí na druhu kyselin nukleových· Zatímco pro desorpci kyselin ribonukleových, včetně přenosových ribonukleových kyselin, stačí chlorid sodný, pro bázicky specifickou eluci DNK z adsorpčních činidel obsahujících jkryl-ealjchitovou zeleň je nutný chloгisUjt.
Ukázalo se, že pro výrobu nosiče je též nožné vycházet z nerozpustných maeriálů s hydrojqy-, případně aminaskupinami, které jsou k dispozici ve formě perlí jako například z aeint)orkyl8βfвrózy, mkrokkryselické celulózy, zasítšného hydrouetyleet8krylátž nebo epo:xppopylae:kylátu· U těchto nosičů se zavád^ě^ akrylové skupiny nezbytné k dodatečnému roubování reakcí s jkrylpllchloridee· Lze tak daocíit stejně vysoký obsah barvivá, jako při roubování akoyrlamidoaými úlomky·
Jako převážně strukturně _ specifické komplexotvorné látky přicházejí v úvahu sloučeniny schopné interkalece. Pod pojmem interkalace se rozumí zejména speciální interakce molekul
23'169 barviv s DNK, přičemž molekula barviva se vsouvá mezi dva sousedící páry bází dvojité šroubovice DNK. Které látky z hlediska struktury jsou schopné interkalace je odborníkovi jasné. Jedná se o plenární, elektrony bohaté chromofory· Jsou to především zbytky plenárních polycyklických, například bi-, tri- nebo tetracyklických kondenzovaných kruhových systémů, které mohou obsahovat heteroatomy, .· jako dusík, kyslík a síru·
Tento · efekt lze zýšit, když, jakb například v případě etiduumbromidu a 9-(akryloyleminoetyl-amino)-2-rneeooy-6-chlooakridinu, je na kruhu k dispozici aeinookuupna, která umooňuje vazbu na fosfátové skupiny DNK. Pro odborníka je snadné pouuít přísluSné upoořebitelné sloučeniny, jako například akridiny, benzakridiny, fenentreny, feoεnOridioy, pyridoindoly, naftaleny, naftotiofenyt benzotiofeny, tiantreny, xantiny, fenoxantiny, cHnoliny, chinoxaliny, fenantroliny, fenotiaziny, fenoxaziny, falaziry atd·
A^k^idinoví deriváty, například 9-(arryloylaeino-etylθeino)-2-metooУ“6-chllos8kridin nebo fenatridinové deriváty, například rOidieebromid (5crtdl-3,8-diaeioo-6-frnoaOridiumbromid) odděěují po kopulaci na částice bisakrylaeidu bázicky nespecificky dvouprovazcové DNK od supercoiled DNK (eluční diagram obr· 7)· Toto velice důležité pro jednoduché oddělení plasmidooýhl a virových DNK z rozložených buněk.
Sloupec nahrazuje nákladný rOidiuebromid-crsiuechloridooý gradient. Toto · dělení je téí možné na sloupci aкryloylaeinoOennlnouUгální červeně, protože obě barviva tvoří s DNK komplex podobné struktury (interkalační kommpex)· AккrdoydamiioOθnndnortráloí červeň dělí jak strukturně specificky, tak i bázicky specificky. Vždy podle vzniklého problému dělení je tudíž možná řada obměn včetně složení adsorpčního činidla.
Protože romePexotoorné látky bázicky a/nebo strukturně specifické jsou vázány stabilní kovalentní vazbou uhlík-uhlík, lze adsorpční činidle podle vynálezu používat i při extrémních hodnotách pH, prorvat detergenčními činidly a regenerovat roztoky solí. Dále je možné vestavět četné různé romePexoťoorné látky bázicky a/nebo strukturně specifické, takže lze vytvářet adsorpční činidla,·která lze používat k dělení přenosových ribonukleových kyselin. Délku řetězce naroubovaných kopodymeků·a tím i délku řetězce mezi polymerním nosičem a roeePexotoornou látkou bázicky a/nebo strukturně specifickou lze řídit obvyklým způsobem pomocí eeekkapoetanodu.
V následujícím je vynález blíže vysvětlen pomocí příkladů odvoláním na připojené výkresy.
Na výkresech znázornili: obr. 1 schéma výroby obzvváětě výhodných adsorpčních činidel podle vynálezu pomocí dvoustupňové polymerace, obr. 2 eluční diagram směsi tří rozvětvených bakteriálních desoxyribonukleových kyselin za pouužtí adsorpčního činidla vyrobeného podle vynálezu, obr. 3 eluční diagram sU^í^i tří rozvětvených bakteriálních desoxyribonukleových kyselin, který byl získán za pouužtí dalšího adsorpčního činidle vyrobeného podle vynálezu, obr. 4 eluční diagram EcoRi-Chddooyzátu λ -fágové kyseliny deso^/ribonukleové, který byl získán za pooužtí adsorpčního činidla vyrobeného podle vynálezu, obr. 5 eluční diagram, který byl získán ze pouužtí adsorpčního činidle vyrobeného podle · vynálezu při dělení seěsi DNK-RNK z Moouteus e obr. 6 eluční diagram sUÍí^:L čtyř rozdílných přenosových ribonukleových kyselin z kvasnic, který byl získán z adsorpčního činidla připraveného podle vynálezu, obr. 7 eluční diagram dělení sloučenin se strukturou dvooité šroubovice (supercoiled) a lineárních DN.
Na obr. 1 je znázorněna výroba obzvláště vhodných adsorpčních činidel podle vyinálezu, dvoustupňovou polymeraci. Ze schématu vyplývá, že z roztoku A bisa^kry^l^i^eidu vzniká polyeerací v prvním kroku gel B, který se rozmělňuje na částice £. Ve druhém kroku se kopolymer z akrylemidu a komepexního činidla naroubuje na částice £, číež vznikne kopolymer
D, který se popřípadě převede na částice E požadované oelikooti·
U
Obr. 2 představuje eluční diagram směsi tří rozvětvených bakteriálních deso^yribonukleových tyselin s rozdíným obsahem gueninu a cytozinu. Na tomto disgpramu se na osu x nanáší fretce a ne osu y jednat extinkce a jednat molární toncentrace chloristanu, přičemž třivta představuje fratci desoχyribonukleových tyselin s obsahem 72 % guaninu в cytozinu, třivta jj fratci s 50 % guaninu a cytozinu, třivta 2 fratci se 32 % guaninu a cytozinu, při stále se zvyšující mo^rní trncentraci chloristanu, což vyjadřuje třivta 4· Při eluci bylo pouuito adsorpční činidlo podle vynálezu.
Obr. 3 je ©luční diagram tří rozvětvených betteriálních desoxyribltutlelvých tyselin. Ne osu x byly vynášeny opět fratce tyselin a na osu y jednat extintce a jednat mooární toncentrace chloridu sodného. Křivty 4» g 8 2 -představují fratce dηsoχyгibonutleových tyselin stejného složení jato na obr. 2. Křivta 2 představuje zvyš^ící se toncennraci chloridu sodného. Při eluci bylo použito další adsorpční činidlo podle vynálezu.
Obr. 4 představuje eluční diagram Eco-Ri-lydrolyzátu Λ-fágů dηslxyriblnutleové tyseliny, tde na osu χ jsou opět nanášeny fratce tyselity a na osu y jednat extintce a jednat mo^rní toncentrace chllrLstatj. Křivta 12 představuje fratce hydrolyzátu. Eluční diagram byl zístán při stále se zvyěuuící ^ηοοη^βο! ch^ristanu, což znázorňuje třivta £, o ze pouuití adsorpčního činidla podle vynálezu.
Obr. 5 je eluční diagram, zístaný při dělení směsi PNA /6/ -iNk/7/, za zvyš^ící se trncentrace ch^ristanu, což vyjadřuje třivta 4 o 28 pouužtí adsorpčního činidla podle vynálezu. Směs DNA 76/-RN//7/ byla zístána z M. Na diagramu byly opět na osu x vynášeny fratce směsi a ne osu y jednat extintce a jednat mo^rní toncentrace ch^ristenu. Křivta 2. - představuje ve své horní části Í№/7/ a dolní část této třivty, v děném případě označená jeto třivte 6, představuje DIU/7/.
Obr. 6 Je eluční diegram směěi, sestávajcí ze čtyř rozdíliých přenosových ribo^t^ových tyselin z tvasnic, přičemž ne diagramu je zatreslme fretce t-iN5/Phe/, tterá je znázorněna třivtou 8 e fretce t-iN5/Gly/, znázorněná třivtou 2· ELuce se provádí při zvyyuuící se toncennraci chloridu sodného, což je na diagramu znázorněno třivtou 5 e za poi^žtí edsorpčního činidla podle vynálezu. Ne osu x a y se vynáší stejné veličiry jeto shore.
Obr. 7 je eluční diegrem zístaný při dělení látet DNA se strjktjrlj ve tvaru . dvojtá šroubovice (superccH^), tato látta je znázorněna třivtou 10. a lineární strjktjrlj. DNA s lineární strutturou jsou znázorněny ne diagramu třivtou 11. Eluce probíhá opět při zv^^ící se ch^ristanu, znázorněného třivtou 4·
DbBŠí přítlady slouží pro bližší objasnění ^nálezu.
Přitlačí
A. Výroba poly-bisatryBamidového nosiče g Ν,Ν'-metylenbisetrylamidu se suspenduje ve 100 ml metanolu ve vysoté 1 litoové polyetylenové tádince a přidá se 200 ml vroucí redestilovaté vody. Bisatrylamid přejde během míchání směsi pomocí majglttictého míchadle zcela do rozt^otu. K roztotu ochlazenému na 60 °C a intenzivně míchanému se pipetuje nejprve 1 ml Ν,Ν,Ν ,N'-tetη8mηtyetndjamitu a potom se přidá najednou roztot 0,2 g вmoltumperoxiddisujfátu v 5 ml vody. Ihned po promíchání se míchání zastaví. ioztot se po nětolita setundách zakalí a za zahřátí ztuhne na bezbarvý blot. Polyme^ce se asi po 1 minutě přeruší tím, že se blot polymeru rozdrtí nahrubo veltou špeech!!. Úlomty se suspenduu! do dvoulitrové polyetylenové tádinty v 1 litru metanolu a rozetřou na zrnitou taši. K další hlmoleηtzaci částic se taše protírá postupně síty s ubývající velitostí ot (1 mm χ 1 mm, 0,5 mm x 0,5 mm a 0,25 mm x 0,25 mm). Vzniklé částice se ponechh^ sedimentovat, načež se mléčně talný supernatant Tento po15 stup se několikrát opakuje, a to nejprve metanolem, potom se směsí metanol/voda, nato s 19 roztokem kyseliny octová a potom znovu s destUovanou vodou· Získané částice polybisakry1amidu se skladují* ve vodném roztoku a lze jich kdykoHv použít k roubovací polytneeaci, která je dále popsána. Ze 300 ml polymeračního roztoku se získá asi 300 ml usazených částic polybistkrylaniSu.
B. Naroubování kopolymeru z akrylamidu a aklrylneutrál-čtrvtně na polybisakrylamid získaný ve stupni A ml - ve stupni A získaných, usazených částic polybisakrylamidu se suspenduje v láhvi se Šroubovým uzávěrem ve 20 ml destilované vody. V této suspenzi se rozpuutí 5 g akrylamidu a 10,3 g chloridu akrylfenylneuurální červeně, tím, íe se suspenze v láhvi opatrně prot^pe, aí se barvivo zcela rozpuusí. Kopolymorace se potom iniciuje přidáním 0,050 ml netkeptoetanolu k nastavení stupně polymerace a 1 ml roztoku peroxidu sodného (0,8 g peroxidu sodného ve 100 ml 1 M-pufru z octanu sodného o hodnotě pH 5,5) jako katalyzátoru. Vzniklá suspenze se ihned potom udržuje po 5 minut pod dusíkem a dále při teplotě místnost: za vy loučení vzduchu.
Asi po 30 minutách se r^eakční směs zřetelně ' oteplí a asi po 2 hodinách je polymerace v podstatě skončena. Ponechá se ještě několik hodin.stát, než se viskozní suspenze přenese na nuč. Trnavě zbarvený viskózní roztok se odsaje . a ne nuČi ztylé, silně zbarvené částice se promj důkladně vodou aí promývací roztok.i při pouuití 1% roztoku kyseliny octové zůstává bezbarvý. Po následném kontinuálním prom^ 0,01 M pufrem z forforečnanu sodného o hodnotě pH 6,0 přes noc lze matteiál pouuít pro afinitní chrlmnttlrθtii nukleových kyselin.
Stanovení výtěíku a ato^ami^ se provádí pomocí ^C-značení a u barvi-va pomocí optické hustoty. Výtěžky jsou následuuící;
Barvivo: Vvetavění do kopolymeru (vázaného a nevázaného) 60,5 %
Akrylemid: yveta^vení do kopolymeru (vázaného a nevázaného) .49,2 %
Barvivo: Vvetavění do vázaného kopolymeru (vztaženo na součet) 1 - ,0 %
Akrylamid: Vvetavění do vázaného kopolymeru, (vztaženo na součet) 57^ %
Je zjištěno, že výchozí molám! poměr barviva k akrylamidu (1:3 000) zůstává zachován i v ^polyme^ech. Protože byl zjištěn průměrný stupen polymerace 200 aí 300, lze z - toho že řetězce kopolymeru me^í vždy jenom jednu molekulu barviva v řetězci.
Analogických výsledků se doodí použitím tkryl-naltchitové zeleně nebo 9-(tkrylanino-etylamino)-3-chllr-7-nttlχyakriSinu.
Výše uvedený způsob je objasněn schemmticky na obr. - 1.
23И69
Příklad použití
Dělení nukleových kyselin afinitní chromatografií na adsorpčních činidlech podle vynálezu
Jak ukazují eluční diagramy na obr. 2 až 6, je možnost použití adsorpčních činidel podle vynálezu v oblasti dělení kyselin nukleových velice mnohostranná. Směsi dvouprovazcových nukleových kyselin v závislosti na složení bází lze dělit na základě bázické specifičnosti vázaného barviva.
Tak obr. 2 ukazuje eluční diagram směsi tří rozvětvených bakteriálních kyseliny desoxyribonukleových o průměrné molekulové hmotnosti asi 700 000 D rozdílného složení bází. К tomu byl použit sloupec o rozměrech 16 cm x 1,5 cm, který obsahuje jako adsorpční činidlo kopolymer akrylmalachitové zeleně s akrylamidem, naroubovaný na polyakrylamidových částicích. Množství použité kyseliny desoxyribonukleové činí asi 1 mg.
Obr. 3 ukazuje eluční diagram směsi tří rozvětvených bakteriálních desoxyribonukleových kyselin o průměrné molekulové hmotnosti asi 700 000 D, které mají rozdílné složení bází. К eluci 1 mg směsi nukleových kyselin byl použit sloupec o rozměrech 15,2 cm x 1,5 cm, který obsahuje jako adsorbens bisakrylamidové částice, na které je naroubován kopolymer ekrylfenylneutrální červeně s akrylamidem.
Za použití adsorpčních činidel připravených podle vynálezu lze rozdělit i fragmenty DNK, které byly získány působením restrikčních endonukleáz. To je ukázáno na obr. 4, který znázorňuje eluční diagram Eco-Rl-hydrolyzátu λ-fágové kyseliny desoxyribonukleové, který byl dělen v množství 0,5 mg na sloupci rozměrů 15,8 cm x 1,5 cm, obsahujícím jako adsorbens polybisakrylamidové částice, na které jsou naroubovány kopolymery akrylmalachitové zeleně s akrylamidem.
Označení fragmentů DNK na vsunutém obrázku gelově elektroforetického dělení jednotlivých frakcí ve srovnání s výchozím materiálem odpovídá označení v práci Thomase a Davise v J. Mol. Biol. 91, 315 až 328 (1975).
S adsorpčními činidly podle vynálezu se daří hladce i rozdělení kyselin ribonukleových od kyselin desoxyribonukleových z téhož organismu, jak lze zjistit z obr. 5. Na obr. 5 je ukázán eluční diagram směsi DNK-RNK izolované z M.luteus (72 % G+C), přičemž směs v množství 1 mg byla dělena pomocí sloupce o rozměrech 16,2 cm x 1,5 cm, kterýžto sloupec je naplněn polybisakrylamidovými částicemi, na které jsou naroubovány kopolymery akrylmalachitové zeleně.
Obr. 6 ukazuje eluční diagram pro směs čtyř různých z kvasinek získaných přenosových kyselin ribonukleových. V 1,5 mg dělené směsi se jedná o směs z t-RNAPhe, t-RNAL^s, t-RNA^^a a t-RNA^iy. Pro afinitní chromatografií se používá sloupec rozměrů 16 cm x 1,5 cm který je naplněn polybisakrylamidovými částicemi, na které jsou naroubovány polymery ekrylfenylneutrální červeně s akrylamidem.
Obr. 7< ukazuje eluční diagram dělení supercoiled a lineární DNK. Pro afinitní chromatografií bylo použito polybisekrylamidových částic, přičemž jsou neroubovány částice 9-(Bkryloylamino-etyl-amino)-2-rnetoxy-6-chlorakridinu.
Při použití adsorpčních činidel podle vynálezu к dělení směsí kyselin nukleových afinitních chromatografií, jak bylo popsáno, vpředu, používá se jako elučního činidla vodných solných koncentračních gradientů, к čemuž se jako solí používá s výhodou solí alkalických kovů, jako je chlorid sodný, chloristan sodný, chloristan lithný, atd. V určitých případech lze používat i pufrů, například fosfátového pufru, přičemž pro adsorpční činidla, která obsahují jako bázicky specifickou komplexotvornou látku zbytek malachitové zeleně, se používá slabě kyselý pufr o hodnotě 5,5 až 6, například 0,01 molární fosfátový pufr o hodnotě 5,5 až 6.
Složky, koncentrace, hodnoty pH а к tomu použité pufry nezbytné pro docílení optimálních solných gradientů jsou odborníkovi pracujícímu v oboru běžné.
Souhrnně lze tudíž konstatovat, že adsorpční činidla podle vynálezu se výborně hodí pro afinitní specifické dělení makromolekulám!ch látek a zejména biopolymerů, jako směsí nukleových kyselin. Tato absorpční činidla lze připravit jednoduchým způsobem a cíleně upravit ve smyslu jejich specifičnosti к bázím·
Akrylmelachitová zeleň použitá jako reakční partner ve stupni В byla připravefla následujícím způsobem:
Příprava akryloylmalachitové zeleně la) 15,1 g (0,1 mol) 4-nitrobenzald'ehydu a 36,3 g = 38 ml (0,3 mol) Ν,Ν-dimetylenili nu a 40,5 g chloridu zinečnatého (bezvodého) ee smíchá a zahřeje na Ю0 °C teploty lázně· Zpočátku lehce pohyblivá směs se v průběhu reakční doby změní v pevnou zelenou hmotu, která již není míchatelná. Po pětihodinové reakční době se směs ochladí. Produkt se vyjme do 150 ml acetonu, přičemž po určité době ζβ míchání produkt zgelovatí a zinečnetá sůl se vyloučí. Nerozpustná sůl se odsaje, promyje acetonem а к filtrátu se přidá tolik vody, až nastane krystalizace. Krystaly se odsají, promyjí vodou, isopropylalkoholem a eterem. ·
Výtěžek: 28,7 g (76,6 % teorie), teplota tání 168 °C (látka je citlivá na světlo).
lb) 3,75 g (0,01 mol) nitrosloučeniny získané podle la) se rozpustí ve 200 ml koncentrované kyseliny octové (99%) a 20 ml vody a přidají se 4 g chloridu zinečnatého. Potom se za chlazení a míchání přidá po částech při teplotě místnosti (20 až 30 °C) g zinkového prachu. Směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti, potom se odsaje přebytečný zinek a promyje koncentrovanou kyselinou ‘octovou. Filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 50 °C, zbytek se rozdělí mezi 150 ml chloroformu a 100 ml vody, potom se chloroformová fáze vytřepe 80 ml 2 N roztoku uhličitanu sodného a 100 ml vody. Chloroformová fáze se oddělí, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zfiltruje, potom se zahustí ve vakuu při teplotě 50 °C asi na 100 ml a použije se přímo к další reakci (slabě fialově zbarvený roztok).
lc) Získaných 100 ml chloroformového roztoku aminosloučeniny se zředí 50 ml metanolu. Přidá se 10 g uhličitanu sodného (bezvodého) a špička špachtle 1,3-dinitrobenzenu a potom se přikape za míchání a chlazení ledem (0 °C až 5 °C) 1,81 g = 1,65 ml ekryloylchlorídu (dvojnásobné molární množství). Suspenze se míchá přes noc při teplotě místnosti, potom se odsaje uhličitan sodný a filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 35 až 40 °C. Zbytek se vyjme do Ю0 ml chloroformu a 50 ml vody a protřepe, chloroformová fá2e se oddělí, znovu extrahuje 50 ml vody, vysuší nad síranem sodným a odpaří ve vakuu při teplotě 35 až 40 °C. Olejovitý nazelenalý odparek se rozetře se 20 ml isopropylalkoholiče ostaví se za chladu ke krystalizaci. Krystaly se odsají, promyjí isopropylalkoholem, a eterem a vysuší v eksikátoru. Výtěžek přes stupně 1b a 1c: 2,9 g (72,7 % teorie). Teplota tání: 175 °C.
Analýza:
vypočteno: 78,2 % C, 7,27 % H, 10,52 % N; nalezeno: 75,9 % C, 7,21 % H, 9,99 % N.
NMR-spektrum (hexadeuterodimetyleulfoxid): CHj-(N-metyl) S 2,83 PPM, =CH-(akryl) Q 5,7 PPM, CH2=(akryl) P 6,3 PPM, aromatické protony mezi 6,5 a 7,5 PPM.
1d) 250 mg (0,001 mol) chlorenilu se rozpustí v 15 ml tetrahydrofuranu a přidá se 0,4 g (0,001 mol) akryloylsloučeniny 1c). Roztok okamžitě zmodrá a po dvou hodinách stání přiteplotě místnooti nastoupí krystalizace. Reakční směs se ponechá stát při teplotě místnooti přes ' noc, potom se krystaly odsají, prommjí tetaalyrdrofuaanem a eterem a vysují v ekeikátoru. Pro další čištění se látka opět vyjme do vody, zneuSralizuje se kyselinou chlorovodíkovou a potom vytřepe etylacetátem. Čistý produkt se potom vysráií přidáním chloridu sodného do vodného roztoku.
Výtěžek: 0,335 g (84,2 % teorie).
V NM-ssek kru 1d) lze pozorovat ve srovnání s 1c) posun N^t^eej^l^-pi^o^^c^r^c^v^é^h^o signálu ne ' 3,3 PPM. .
Akrrlfernlneeurální červeň, pouuitá ve stupni B, byla připravena následujícím způsobem:
Příprava tkryloylaminefornrlnetSráleí červeně la) 6,9 g (0,05 mol) 4-eitroaeilies se rozpuutí ve 150 ml směsi tttrahydroOsrae/ /chlorofom 1 ;1 , přidá se na špičku špachtle .1 ,3-dinitrbbenzteu a 8 mL trieSylθmles. Za míchání se při teplotě 10 ai 20 °C přikope pommlu 9 ml (0,1 mol) srгylsylchlsrids. Roztok . se míchá při teplotě míítnosti přes noc, přičemž vyk^st^uje trtetylaminhydrochlorid. Potom se ve vakuu při teplotě 50 °C odpaří směs tttrahydrsOsгJe chlorofom, odparek se rozmíchá s vodou, odsaje e promyje vodou, lsoprspylarkoholem a eterem. Produkt se vysuší ve vakuu při teplotě 50 °C. · lb) 2,5 g akry1oy1slosčeeley 2a) se rozpětí v 60 ml tttrθhsdroOuraeu za míchání při teplotě 50 °C a zředí se 60 ml koncentrované kyseliny octové (99%) a ochladí se na teplotu 30 °C. Potom se přidá po částech 10 g zinkového prachu, přičemž teplota stoupne za chlazení ledem na 35 ai 40 °C. Potom se míchá po dobu delších '0 minut, při teplotě mfi^s^i^ť^oti, nadbytečný zinek se odsaje a promyje koncentrovanou kyselinou octovou. Filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 45 °C. Olejovitý odparek je prakticky chromeaograOicky čistý a pcou^e se k další reakci.
lc) K roztoku 4,2 g (0,02 mol) N,N-dimetyS-p-Oeeylendiamoniumddchlorldu a 2,88 g (0,02 mol) s-to1uidinSumchlsrldu ve 400 ml vody se přidá pomalu a za míchaní při teplotě místeosti roztok 12 g chromenu sodného (0,04 mol) ve 100 ml vody. Vyloučený zelený produkt se po 15 minutách ot^í^i^aje, promyje třikrát vodou, přičemž promývací roztok zůstává zelený, sraženina se potom zpracuje dále tak, že se suspenduje v malém mneSitví vody.a homooekezuSe.
Homogenní suspenze se zředí vodou na objem 1,6 litru. Po přidání 1,15 x 0,02 mol N-akryloyl-p-fenytendiamsnlumecetátu ve 100 ml vody se nastaví hodnota pH reakční směsi 130 ml roztoku3 M octanu sodného na 4,9. Potom se směs za míchání zahřeje k varu, roztok se přioom zbarví nejdříve tmavě modře a potom ze varu tmavě fialově (k dokončení reakce se ponechá 5 minut za . varu). Potom se vroucí horký roztok odsaje přes nuč, filtrát (asi 2 litjy) se upraví přidáním 240 g chloridu sodného na 2 M roztok a směs se ponechá přes noc stát v lednici. Vyloučené krystaly se. odsejí a vysuší v eksikátoru (nesmí být promovány vodou, protože látka je dobře rozpustná ve vodě).
Výtěžek: 2,4 g surového produktu.
Pro delší čištění se i,3 g surového produktu rozpustí ve směsi 25 ml metanolu a 0,1 M chloridu sodného (4:1) a nanese na sloupce silikagelu 60 o rozměrech 4 x 95 cm. Potom se eluuje stejným rozpouštědlem’(objemy frakcí = 20 ml). Frakce 22 ež 55 se spojí a zkoncentrují ve vakuu asi na 15 ml. Krystaly se odsají, promyjí malým množstvím 0,1 M chloridu sodného e vysuší v eksikátoru.
Výtěžek: 0,665 g chromatogreficky čistého barvivé.
9-(akryloylamino-etylamino)-3-chlor-7-metoxyakridin byl připraven následujícím způsobem:
Příprava 9-(aryloylaminoetylamino)-3-chlor-7-metoxyakridinu
854 mg 3,9-dichlor-7-metoxy-akridinu se zahřívá s 1 ml etylendieminu a 7,7 g fenolu po dobu 30 minut v olejové lázni na 60 °C. Tavenina se vyjme do 200 ml chloroformu a 150 ml vody, hodnota pH se nastaví na 4 koncentrovanou kyselinou octovou a ekvilibruje. Organická fáze se znovu 3- až 4krát extrahuje 0,1 M pufrem z octěnu sodného a potom se odstraní.
• Vodné extrakty se nastaví na hodnotu pH roztokem sody, extrahují směsí chloroform-n-butanol (20:1), organická fáze se filtruje přes silikonový papír a odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí v 0,1 M pufru z octěnu sodného, odfiltrují se zbytky dimerního proь duktu a hodnotě pH roztoku se nestaví na 10. Po jedné hodině při teplotě místnosti se sraženina odsaje, promyje malým množstvím zředěného roztoku amoniaku (4 °C) a vysuší.
Výtěžek: 50 až 80 % teorie.
206 mg získané aminosloučeniny se rozpustí ve 25 ml chloroformu za tepla a po chlazení se přidá 0,3 ml akrylchloridu. Roztok okamžitě ztmavne. Po odsátí a promytí malým množstvím chloroformu se získá 122 mg (50 % teorie) 9-(akryloyleminoetylamino)-3-chlor-7-metoxyaktidinu v chromatograficky čisté formě.

Claims (4)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    1. Způsob výroby adsorpčního činidla pro afinitně specifické dělení nukleových kyselin, vyznačující se tím, že se nejdříve polymeraci nebo polykondenzací alespoň jednoho monomeru, který má alespoň jednu funkční skupinu, přes kterou Je popřípadě vázána komplexotvorná látka, která je bázicky nebo strukturně specifická pro nukleové kyseliny, a to bučí přímo nebo přes polymerní nízkomolekulární skupiny s molekulární hmotností do 4 000, působícími prostorový odstup, vytvoří polymerní nosič, který se popřípadě rozmělní na částice a potom se naroubuje buň přímo nebo kopolymerací v přítomnosti akrylamidu, který kopolymeruje se skupinami polymerního nosiče, načež se vyrobí perlovou polymeraci částice požadované velikosti.
  2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se к nukleovým kyselinám roubuje afinní zbytek s kopolymerovatelnou dvojnou vazbou v přítomnosti kopolymегоvatelného monomeru, například kopolymerního pólybisakrylamidu.
  3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že polymerace roubováním provádí ve vodě v přítomnosti roztoku peroxidu vodíku Jako polymeračního katalyzátoru.
  4. 4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že jako zbytku, který Je afinní к nukleo- » vým kyselinám a obsahuje kopolymerovatelnou dvojnou vazbu se používají barviva obecného vzorce I
CS781289A 1977-03-02 1978-03-01 Processing method of adsorbing agent for affinitive separation of nucleic acids CS231169B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2709094A DE2709094C2 (de) 1977-03-02 1977-03-02 Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS188180A2 CS188180A2 (en) 1984-02-13
CS231169B2 true CS231169B2 (en) 1984-10-15

Family

ID=6002605

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS781289A CS231161B2 (en) 1977-03-02 1978-03-01 Method of separating of nucleid acid mixtures
CS781289A CS231169B2 (en) 1977-03-02 1978-03-01 Processing method of adsorbing agent for affinitive separation of nucleic acids

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS781289A CS231161B2 (en) 1977-03-02 1978-03-01 Method of separating of nucleid acid mixtures

Country Status (14)

Country Link
US (2) US4335226A (cs)
JP (1) JPS53131294A (cs)
AT (1) AT364734B (cs)
CA (1) CA1122208A (cs)
CH (1) CH651222A5 (cs)
CS (2) CS231161B2 (cs)
DE (1) DE2709094C2 (cs)
DK (1) DK150536C (cs)
FR (1) FR2416721A1 (cs)
GB (2) GB1597891A (cs)
HU (1) HU182462B (cs)
IT (1) IT1095439B (cs)
NL (1) NL7802022A (cs)
SE (1) SE7802249L (cs)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2534486B1 (fr) * 1982-10-15 1987-11-20 Commissariat Energie Atomique Support particulaire greffe en surface, son procede de preparation et adsorbants pour chromatographie d'affinite incorporant ce support, ainsi que leur utilisation, notamment en biologie
US4665184A (en) * 1983-10-12 1987-05-12 California Institute Of Technology Bifunctional molecules having a DNA intercalator or DNA groove binder linked to ethylene diamine tetraacetic acid
DE3407814A1 (de) * 1984-03-02 1985-09-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5489387A (en) * 1984-03-29 1996-02-06 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide
US5562614A (en) * 1993-11-22 1996-10-08 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Programmable manifold system for automatic fluid delivery
US5229002A (en) * 1984-03-29 1993-07-20 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide
US5368737A (en) * 1984-03-29 1994-11-29 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl-or carbamoyl-substituted polysaccharide
JPS60226829A (ja) * 1984-03-29 1985-11-12 Daicel Chem Ind Ltd 多糖誘導体より成る分離剤
DE3619303A1 (de) * 1986-06-07 1987-12-10 Merck Patent Gmbh Optisch aktive adsorbentien
DE3811042A1 (de) * 1988-03-31 1989-10-19 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
US5342785A (en) * 1988-07-05 1994-08-30 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for determining pyrogen content
US4957620A (en) * 1988-11-15 1990-09-18 Hoechst Celanese Corporation Liquid chromatography using microporous hollow fibers
JP2925753B2 (ja) * 1990-02-23 1999-07-28 ダイセル化学工業株式会社 光学異性体の分離方法
EP0708919B1 (de) * 1993-07-16 1998-09-16 MERCK PATENT GmbH Trennmaterialien für die hydrophobe chromatographie
DE4333674A1 (de) * 1993-10-02 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie
DE4333821A1 (de) * 1993-10-04 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
DE4334353A1 (de) * 1993-10-08 1995-04-13 Merck Patent Gmbh Verfahren und Träger für die Gelpermeationschromatographie
JP3249408B2 (ja) 1996-10-25 2002-01-21 昭和シェル石油株式会社 薄膜太陽電池の薄膜光吸収層の製造方法及び製造装置
US7214410B2 (en) * 2002-10-04 2007-05-08 Shipley Company, L.L.C. Process for selecting solvents for forming films of ferroelectric polymers
RU2257200C1 (ru) * 2004-05-12 2005-07-27 Кутушов Михаил Владимирович Лекарственное средство
JP5253380B2 (ja) * 2006-04-18 2013-07-31 ダウ・コーニング・コーポレイション テルル化カドミウムベース光起電力デバイスおよびその調製方法
ATE441942T1 (de) * 2006-04-18 2009-09-15 Dow Corning Fotovoltaische anordnung auf kupfer-indium- diselenidbasis und herstellungsverfahren dafür
KR20090003334A (ko) * 2006-04-18 2009-01-09 다우 코닝 코포레이션 구리 인듐 디셀레나이드-기재 광전지 장치 및 그의 제조 방법
KR101839380B1 (ko) * 2010-09-22 2018-03-16 가부시키가이샤 가네카 핵산의 검출 방법 및 디바이스, 키트
CA2811369C (en) * 2010-09-29 2019-09-03 Intervet International B.V. N-heteroaryl compounds
TWI538235B (zh) 2011-04-19 2016-06-11 弗里松股份有限公司 薄膜光伏打裝置及製造方法
WO2014113112A1 (en) * 2013-01-15 2014-07-24 Conocophillips Company Fluorescent tags for detection of swellable polymers
CN105593276B (zh) * 2013-10-03 2020-03-27 3M创新有限公司 具有增强的结合容量的配体官能化基材

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3640983A (en) * 1966-11-09 1972-02-08 Shojiro Horiguchi Method of making coupler-bonded-polymers and chromogen-bonded-polymers nd polymers made thereby
US3983001A (en) * 1972-05-10 1976-09-28 Ceskoslovenska Akademie Ved Isolation of biologically active compounds by affinity chromatography
NL7411909A (nl) * 1973-09-10 1975-03-12 Research Corp Werkwijze voor het bereiden van een samenstel- ling op basis van een kleurstof, werkwijze voor het isoleren van albumine.
US4017476A (en) * 1974-03-15 1977-04-12 Mobil Oil Corporation Preparation of finely divided styrene-divinylbenzene organic pigments
FR2268022B1 (cs) * 1974-04-22 1977-06-24 Rhone Poulenc Ind
US4046750A (en) * 1974-09-30 1977-09-06 California Institute Of Technology Ionene modified small polymeric beads
LU73094A1 (cs) * 1975-07-29 1977-03-24
US4035316A (en) * 1975-11-24 1977-07-12 California Institute Of Technology Cell specific, variable density, polymer microspheres
US4213860A (en) * 1976-06-30 1980-07-22 Board of Regents, State of Florida for and on behalf of the University of Florida Affinity chromatography and substrate useful therefor
US4194877A (en) * 1977-11-28 1980-03-25 United States Of America Dye-containing polymer composition

Also Published As

Publication number Publication date
FR2416721B1 (cs) 1983-01-21
CS231161B2 (en) 1984-10-15
IT7820640A0 (it) 1978-02-24
DK150536C (da) 1987-10-19
DK150536B (da) 1987-03-23
ATA146078A (de) 1981-04-15
SE7802249L (sv) 1978-09-03
CA1122208A (en) 1982-04-20
CH651222A5 (de) 1985-09-13
US4335226A (en) 1982-06-15
US4394487A (en) 1983-07-19
DK90878A (da) 1978-09-03
GB1597891A (en) 1981-09-16
JPS53131294A (en) 1978-11-15
HU182462B (en) 1984-01-30
IT1095439B (it) 1985-08-10
FR2416721A1 (fr) 1979-09-07
CS188180A2 (en) 1984-02-13
NL7802022A (nl) 1978-09-05
AT364734B (de) 1981-11-10
CS7801289A2 (en) 1984-02-13
DE2709094A1 (de) 1978-09-07
GB1597892A (en) 1981-09-16
DE2709094C2 (de) 1984-11-22
JPS6219892B2 (cs) 1987-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS231169B2 (en) Processing method of adsorbing agent for affinitive separation of nucleic acids
EP1379698B1 (en) Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same
Hudson et al. Nucleic acid dendrimers: novel biopolymer structures
US6620926B2 (en) Purification of oligomers
FR2687679A1 (fr) Oligothionucleotides.
EP0424819A1 (en) Reversible modification of biological compounds for detection, separation and purification thereof
WO2005014609A2 (en) Method of producing a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analogue
CA2382631A1 (en) Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
US4207200A (en) Soluble complex former for the affinity specific separation of macromolecular substances, its preparation and its use
WO1994000455A1 (en) Enantioselective receptor for amino acid derivatives, and other compounds
KR100647306B1 (ko) 아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법
US20200399683A1 (en) Composition and Methods For Affinity Directed Enrichment of Rare Species
US8835625B2 (en) Propargyl substituted nucleoside compounds and methods
US20030195351A1 (en) Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides
US6342362B1 (en) Methods and compositions for the purification of proteins or other macromolecules
Jäschke et al. Synthesis and analytical characterization of RNA-polyethylene glycol conjugates
JP2000512843A (ja) 安定性が２個のハイブリッドされた核酸分子の塩基組成に僅かしか依存しないハイブリッド複合体の形成方法
CA1131225A (en) Dyestuffs as affine residues
JP7629641B2 (ja) 人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー
Skakuj et al. Automated Synthesis and Purification of Guanidine‐Backbone Oligonucleotides
CS242863B2 (cs) Způsob výroby nových sloučenin typu akryloylaminobarviv
JPS6396553A (ja) 充填剤
JPH10117774A (ja) アクリルアミド系重合体、及びこれを用いた酵素の回収方法
FR2686882A1 (fr) Oligothionucleotides.
JP2527340C (cs)