DK150536B - Adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nucleinsyrer - Google Patents
Adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nucleinsyrer Download PDFInfo
- Publication number
- DK150536B DK150536B DK090878AA DK90878A DK150536B DK 150536 B DK150536 B DK 150536B DK 090878A A DK090878A A DK 090878AA DK 90878 A DK90878 A DK 90878A DK 150536 B DK150536 B DK 150536B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- residue
- specific
- polymeric
- nucleic acids
- acrylic
- Prior art date
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 39
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 18
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- -1 acryloylamino-ethylamino Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 23
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 17
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 16
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 12
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 claims description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 10
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 8
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 5
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N acryloyl chloride Chemical compound ClC(=O)C=C HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000002685 polymerization catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims 2
- RYRNQWYNHLLOGX-UHFFFAOYSA-N 6,9-dichloro-2-methoxyacridine Chemical compound C1=C(Cl)C=CC2=C(Cl)C3=CC(OC)=CC=C3N=C21 RYRNQWYNHLLOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MVWDJLOUEUAWIE-UHFFFAOYSA-N O=C=O.O=C=O Chemical compound O=C=O.O=C=O MVWDJLOUEUAWIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims 1
- OAABHEHWRQAHEJ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl.CCCCO OAABHEHWRQAHEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims 1
- 125000004427 diamine group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 claims 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 claims 1
- BYFCOQOPKIANTH-UHFFFAOYSA-N n'-(6-chloro-2-methoxyacridin-9-yl)-n'-ethylprop-2-enehydrazide Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(N(NC(=O)C=C)CC)=C(C=CC(Cl)=C3)C3=NC2=C1 BYFCOQOPKIANTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920006322 acrylamide copolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 1,3-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- SMNPLAKEGAEPJD-UHFFFAOYSA-N chembl34922 Chemical compound Cl.Cl.Cl.C1CN(C)CCN1C1=CC=C(NC(=N2)C=3C=C4N=C(NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 SMNPLAKEGAEPJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- IDBIFFKSXLYUOT-UHFFFAOYSA-N netropsin Chemical compound C1=C(C(=O)NCCC(N)=N)N(C)C=C1NC(=O)C1=CC(NC(=O)CN=C(N)N)=CN1C IDBIFFKSXLYUOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- PFUVRDFDKPNGAV-UHFFFAOYSA-N sodium peroxide Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][O-] PFUVRDFDKPNGAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OLSYXIFZNDLKIF-UHFFFAOYSA-N (4-azaniumylphenyl)-prop-2-enoylazanium;diacetate Chemical compound CC([O-])=O.CC([O-])=O.[NH3+]C1=CC=C([NH2+]C(=O)C=C)C=C1 OLSYXIFZNDLKIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- IVCGJOSPVGENCT-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrolo[2,3-f]quinoline Chemical class N1=CC=CC2=C(NC=C3)C3=CC=C21 IVCGJOSPVGENCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzaldehyde Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- JEGZRTMZYUDVBF-UHFFFAOYSA-N Benz[a]acridine Chemical class C1=CC=C2C3=CC4=CC=CC=C4N=C3C=CC2=C1 JEGZRTMZYUDVBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010042309 Netropsin Proteins 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N auramine O Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=N)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLNKWZNWHZDGRT-UHFFFAOYSA-N azane;dihydrochloride Chemical compound [NH4+].[NH4+].[Cl-].[Cl-] FLNKWZNWHZDGRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- LYQFWZFBNBDLEO-UHFFFAOYSA-M caesium bromide Chemical compound [Br-].[Cs+] LYQFWZFBNBDLEO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NCMHKCKGHRPLCM-UHFFFAOYSA-N caesium(1+) Chemical compound [Cs+] NCMHKCKGHRPLCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical group 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- NWSBNVVOFKKFNV-UHFFFAOYSA-N chloroform;oxolane Chemical compound ClC(Cl)Cl.C1CCOC1 NWSBNVVOFKKFNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L disulfate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OS([O-])(=O)=O VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010559 graft polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- OGVXWEOZQMAAIM-UHFFFAOYSA-N hydron;2-methylaniline;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC=C1N OGVXWEOZQMAAIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- YKPCRMJOHYLINR-UHFFFAOYSA-N n-[2-[(6-chloro-2-methoxyacridin-9-yl)amino]ethyl]prop-2-enamide Chemical compound C1=C(Cl)C=CC2=C(NCCNC(=O)C=C)C3=CC(OC)=CC=C3N=C21 YKPCRMJOHYLINR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002828 nitro derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 229960000286 proflavine Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N triethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CC ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAAQKTZKLRYKHR-UHFFFAOYSA-N triphenylmethane Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AAAQKTZKLRYKHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000007966 viscous suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
- B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
- B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
- B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
- B01J20/3253—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure not containing any of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. aromatic structures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
- C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
- C07D219/08—Nitrogen atoms
- C07D219/10—Nitrogen atoms attached in position 9
- C07D219/12—Amino-alkylamino radicals attached in position 9
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
- C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
- C07D221/06—Ring systems of three rings
- C07D221/10—Aza-phenanthrenes
- C07D221/12—Phenanthridines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F265/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00
- C08F265/10—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00 on to polymers of amides or imides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
150536 j»- *1.
Den foreliggende opfindelse angår et adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nucleinsyrer, en fremgangsmåde til fremstilling af dette adsorbens samt dets anvendelse.
5
Isolering af enkelte gener eller af sæt af samme gener i repetitiv anordning fra eukaryotiske cellers genom er ikke kun af ren videnskabelig interesse, men også af stor praktisk betydning med henblik på i 10 2 150536 genteknologien. Sådanne isoleringer var kun mulige, hvis basesammensætningen af genet eller gengruppen med dens "spacere" adskilte sig mindst 6 til 7% fra den gennemsnitlige basesammensætning af det samlede genom. Som adskillelsesmetoder blev mest anvendt cæsiumion= 5 tæthedsgradientcentrifugeringer med DNA-basespecifikke tilsætninger, såsom sølvioner, kviksølvioner eller platinioner eller actinomycin, netropsin eller farvestoffet "Hoechst 33258". Disse fremgangsmåder har kun begrænset kapacitet og er dyre og tidsrøvende.
10 Udviklingen af materialer til affinitetskromatografi af biopolymere har i de forløbne år forenklet isoleringen af mange biopolymere meget eller overhovedet først muliggjort deres renfremstilling. Ved disse fremgangsmåder går man i reglen ud fra et bæremateriale, som efter kemisk aktivering omsættes med et stof, som binder den biopolymere, 15 der skal isoleres,mest muligt specifikt. På grund af denne specifi-tet kan den søgte biopolymere i idealtilfældet adsorberes selektivt fra en blanding af lignende forbindelser på kromatografimaterialet og derefter under egnede betingelser desorberes i ren tilstand (P. Cuatrecasas og C.B.Anfinsen, Ann.Rev.Biochem. 40 (1971) 259 til 278).
20
Trods de mange eksempler på vellykket anvendelse af denne metode, kunne der for mange biopolymere hidtil ikke udvikles noget kromato-grafimateriale, som muliggør en lignende selektiv og programerbar opdeling også for nucleinsyreblandinger. En højtopløsende fraktio-25 nering af nucleinsyreblandinger i grammålestok er imidlertid en forudsætning for den fordrede isolering af enkelte gener eller af sæt af samme gener.
Ved den foreliggende fremgangsmåde til opdeling af nucleinsyrer med 30 lav molekylvægt, f.eks. transfer-ribonucleinsyrer, opnås opdeling i de forskellige arter på adsorbentier, som kombinerer ionbytteregen-skaber med lipofile vekselvirkninger (R.M.Kothari og V.Shankar, Journal of Chromatography 98 (1974) 449 til 475). Derved udnyttes i det væsentlige bærerens vekselvirkningsmuligheder med nucleinsyrernes 35 sjældne baser, som findes i forskellig mængde i forskellige transfer-ribonucleinsyrer .
Da de mere højmolekulære ribonucleinsyrer og desoxyribonucleinsyrer i reglen ikke indeholder nogen sjældne baser, kan metoder til deres opdeling kun opbygges på følgende forskelle i karaktertræk: 3 150536 a) Forhold mellem enkeltstreng og dobbeltstreng b) Forskelle i basesammensætningen c) Forskelle i baserækkefølge d) Forskelle i molekylvægte 5 e) Forskelle i tertiærstruktur.
Alle disse karaktertræk udnyttes faktisk ved de i dag sædvanlige fraktioneringsmetoder (R.M.Kothari, Chromatog.Rev.12 (1970) 127 til 155) .
10
Ved den mest virksomme metode, fraktionering i saltgradienter i ultra-centrifuge fører forskelle ifølge b, c og e til forskelle i svævetæt-hed for enkelte DNA-arter, som kan forøges yderligere ved tilsætning af basespecifikke stoffer. Adskillelsesskarpheden aftager med aftagende 15 molekylvægt og kapaciteten med tiltagende molekylvægt. Ved adsorptionskromatografi på hydroxyapatit sker fraktioneringen i det væsentlige ifølge a og kun i ringere omfang ifølge b, idet guanin-cytosin-rigere nucleinsyrer desorberes allerede ved noget ringere saltkoncentrationer end de adenin-thymin-rigere komponenter (W.Pakroppa og W. 20 Muller, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 71 (3) (1974) 699 til 703).
Ganske analogt kan dobbeltstrengede nucleinsyrer også fraktioneres på specifikke protein-kiselgur-adsorbenter (f.eks. methyl-serum-al= bumin-kiselgur) ifølge forskelle i basesammensætningen, idet de gua= 25 nin-cytosin-rigere DNA-arter igen elueres først (J.D.Mandell og A.D. Hershey, Analytical Biochemistry 1 (1960) 66 til 77, N.Sueoka og Ts'ai-Ying Cheing, J.Mol.Biol. 4 (1962) 161 til 172). Den egentlige virkemåde af disse mere tilfældigt opdagede adsorbenter er ikke kendt.
; Derfor kunne den ringe adskillelsesskarphed af disse materialer trods 30 alle anstrengelser ikke hidtil forbedres afgørende.
Først i de sidste år blev der ved systematisk undersøgelse af talrige stoffer, som danner komplekser med nucleinsyre, fundet forbindelser, som syntes egnede til en målbevidst syntese af materialer til affini-35 tetskromatografi (W.Muller og D.M.Crothers, Eur.J.Biochem. 54 (1975) 267 til 277, W.Muller, H.Bunemann og N.Dattagupta, Eur.J.Biochem.
54 (1975) 279 til 291 og W.Muller og F.Gautier, Eur.J.Biochem. 54 (1975) 385 til 394) . Hvilke fordele anvendelsen af sådanne godt undersøgte stoffer giver ved adskillelsen af nucleinsyreblandinger, kunne demonstreres allerede med eksemplerne på den kombinerede anvendelse 4 150536 af hydroxyapatit og ethidiumbromid som basespecifik tilsætning til adskillelse af superhelical og helical DNA (W.Pakroppa, W.Goebel og W.Muller, Analytical Biochemistry 67 (1975) 372 til 383) og af hydroxyapatit i kombination med phenylneutralrødtderivater som 5 basespecifikke kompleksdannere ved adskillelse af dobbeltstrengede DNA-arter (W.Pakroppa og W.Muller, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 71 (3) (1974) 699 til 703) .
Opløsningsevnen af disse sidstnævnte metoder er sammenlignelige med 10 opløsningsevnen af en præparativ cæsiumchlorid-tæthedsgradient, dvs., at DNA-fraktioner med forskelle i (G+C)-indhold (hvor G står for guanin og C for cytosin) kan skilles fra hinanden. Trods høj kapacitet har fremgangsmåden den ulempe, at DNA-blandinger med en gennemsnitlig molekylvægt af komponenterne på mere end 20 x 10® ikke 15 mere kan styres godt, og at det som adsorbens anvendte specielle hydroxyapatit selv må fremstilles.
Det har været kendt i længere tid, at nucleinsyreblandinger i systemet polyethylenglycol-dextran under bestemte betingelser kan opdeles i 20 på den ene side RNA og enstrenget DNA og på den anden side dobbeltstrenget DNA.
Derved koncentrerer dobbeltstrenget DNA sig altid i den (lettere) polyethylenglycolfase, dvs., at det har en højere fordelingskoeffi-25 cient end enstrengede nucleinsyrer. De absolutte værdier af fordelingskoefficienterne kan ganske vist ved tilsætning af kaliumsalte og lithiumsalte varieres over ca. 3-4 potenser af ti, men en fraktionering efter basesammensætning kan ikke lade sig gøre i disse ; systemer.
30
Den foreliggende opfindelses opgave består nu i at fremstille adsor-benter, hvormed der kan opnås en basespecifik og/eller strukturspecifik adskillelse af nucleinsyrer og især blandinger af enstrengede og/eller tostrengede og/eller supersnoede og/eller lineære nuclein-^5 syrer, især af DNA-blandinger med høj kapacitet.
Ved affinitetsspecifitet skal først og fremmest forstås struktur-specifitet og basespecifitet.
Det har nu vist sig, at nævnte opgave kan løses med et adsorbens, 5 150536 der er ejendommeligt ved et polymert bæremateriale, hvortil en for nucleinsyrer affin rest er kovalent bundet direkte eller over en polymer "spacer".
5 En særlig foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen angår et ad-sorbens af den definerede art, som er ejendommeligt ved et småporet, lidet komprimerbart polymert bæremateriale, hvorpå der er podet en copolymer af mindst to blandingspolymeriserbare monomere, som polymere "spacere", hvoraf én bærer den for den biopolymere affine rest.
10
Som affin rest for den biopolymere kan anvendes basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere, der er beskrevet i de nævnte litteratursteder. Egnede er især rester af farvestoffer med følgende almene formler I og II
15 20 R3 A0 rV ® 1 25 2Yl fYNR2 25 p (id Φ 30 k3 hvori X er en CH-gruppe eller et nitrogenatom, Y er et oxygenatom, et svovlatom, en NH-gruppe eller en gruppe med formlen 35 ^ ^-N(RL)2, 6 150536
1 2 R uafhængigt af hinanden er hydrogenatomer eller methylgrupper, R
er et hydrogenatom eller en methylgruppe, er et hydrogenatom eller en methylgruppe, R4 er et hydrogenatom eller en methylgruppe, og A® er en anion, såsom en chloranion, en perchloratanion eller en oxalat= 5 anion.
Ifølge opfindelsen særligt foretrukne,til det polymere bæremateriale bundne basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere er resterne af følgende farvestoffer: 10
1. Diamidinophenyl- i/ ^ ^NH
indol i || (DAPI) L JL / \ / \ NH2 ..
15 2. Malakitgrønt f L1^C2°42" (ch3)2n^^ v^s'n(ch3)2 20 3. Krystalviolet N(ch3)2 1+ C1~ 25 Cf il (CH3)2N/^ ^>i(CH3)2 4. Methylgrønt N(CH-i) o ’ · Λ 2 cio." (ΎΥχ (ch3)2n·^^ \^-n(ch3)2 5. Auramin
35 NH
i i i 7 150536 6. Farvestof Hoechst 33258 ="•3 tXhooo-
H H
7. Di-tert.-butyl-proflavin (CH3) 3C (CH3) ^ ; h2nXAnaAh2 Λ- ! 8. Di-tert.-butyl-akriflavin (ch3) 3c (ch3) 3 H2N C104 ch3 h2n Æh2 4 a; 10.
i r (CH 3) N (CH 3) 2 11.
(ch3)2n H 1 i 8 150536
12 CH2CH2COOR
(CH3) 2N'^DCo^^Xn(CH3) 2 13· H2N \A NH2 ch3
14 ’ YiYY
-· ch2ch=ch2 15 ’ h2n aJLn AAnh, ό 16.
<ch3)2n-OCnX^I$(Ch3)2 : 0 17.
(ch3)2n\AnAAh, H 1 18. ι^Υτγ^γ'^Π2 (CH3)2n^^N>^nh2 ri \ • \ \ 9
150S3S
19 . CH3 (CH3)2N^^^^-N+H2 20. Proflavln Λ ^
H N^^'N'>5%=%^VlH2 H
21 · ;.' H2N^^^0 ^!vAnh2 22.
23' ΓΥΝΥ^1 Θ h2n ΑΛν KXm2 : 24. rrNT^i © ;; i^N x^a/ko^vA»NH2 25. Thionin „jCDSa, 10 150536 26. Akridinorange
Me 2N NMe 2
H
27. Pyronin G
Me 2N NMe 2 28. Thiopyronin ' Me2N XXsXXfe2 29.
NMe2 30.
Me2N NMe2 ·. J 31. Me thy lenblåt
Me2N jOC^^X N§e2 32’ nh-ch2-ch2-nh2 ’i 11 150536 idet Me i ovennævnte formler står for methylgruppen.
33. Ethidiumbromid _/ \:H2-CH3
De ifølge opfindelsen foretrukne basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere er imidlertid phenylneutralrødt med formlen ' 15
Q
(CH3} 2N NH2 20 C1 og malakitgrønt med formlen .
_^N(CH3)2C1
O
C^c\^
’ 30 Q
N(CH,) 3 2
Disse farvestoffer er i og for sig kendt og kan fås i handelen eller kan fremstilles ved fremgangsmåder, som er velkendt for fagmanden og beskrevet f.eks. i ovennævnte publikation af W.Muller og D.M.Crothers 35 (Eur.J.Biochem. 54 (1975) 267 til 277) , W.Muller, H.Biinemann og N.
Dattagupta (Eur.J.Biochem. 54 (1975) 279 til 291) og W.Muller og F. Gautier (Eur.J.Biochem. 54 (1975) 385 til 394).
Disse basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere eller farvestofrester kan på måder, som uden videre kan anvendes af fag- 12 150536 manden, bindes kovalent til bærematerialet, f.eks. ved forestring med hydroxylgrupper, der findes på bærematerialet, via carboxylgrup-per indført i farvestofmolekylet, ved amiddannelse,ved urethandannel-se eller ved copolymerisation i fravær af og fortrinsvis i nærværel-5 se af andre copolymeriserbare monomere via copolymeriserbare dobbeltbindinger, som er indført i farvestofmolekylet, f.eks. via en acryl= amidgruppe, således som det er tilfældet med de ifølge opfindelsen foretrukne basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere, acrylphenylneutralrødt og acrylmalakitgrønt med følgende formler.
10 Disse nævnte betegnelser er trivialnavne, og den eksakte betegnelse er acryloylaminophenylneutralrødt og acryloylaminomalakitgrønt.
ch=ch2
CO
15 <
NH
V=r 20 ^2%^^ NH, + |T 1 25 +n(ch3)2ci~ 30 CH=CH2 <Cj 35 \) N(CH3)2 13 150536
Disse basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere kan fremstilles af fagmanden på i og for sig kendt måde ved indføring af acrylresten i det nævnte farvestofmolekyle. Dette gælder også for de andre ovennævnte farvestofmolekyler.
5
Betegnelsen acrylrest er i de foreliggende tilfælde ensbetydende med acryloylrest.
Fortrinsvis sker fremstillingen dog på de i eksemplerne 3 og 4 be-10 skrevne måder. Acryloylfarvestofferne er hidtil ukendte.
Ifølge opfindelsen anvender som man polymert bæremateriale fortrinsvis et småporet/lidet komprimerbart polymert bæremateriale, såsom poly-bisacrylamid. Disse småporede og lidet komprimerbare polymere 15 bærematerialer har vist sig meget fordelagtige til affinitetskromatografi af højviskose nucleinsyreopløsninger. Endvidere udviser disse polymere bærematerialer ingen stærke vekselvirkninger med de affine rester, især med de basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere for nucleinsyrer, som bindes enten direkte eller over 20 polymere spacere til de polymere bærermaterialer.
Det har vist sig fordelagtigt mellem det polymere bæremateriale og den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner at indføre en længere spacer, dvs. en længere molekylkæde uden funktionelle 25 grupper, da kompleksdannelsen af den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner med den helikale nucleinsyre derved ikke skades af sterisk hindring.
I en særlig fordelagtig udførelsesform for adsorbenset ifølge opfindel-30 sen er den for den biopolymere affine rest eller den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner derfor bundet til det poly= mere bæremateriale over en copolymer, som fortrinsvis har en polymerisationsgrad på 200 til 300. Til dannelse af denne copolymer anvender man fortrinsvis en yderligere monomer, som er copolymeriserbar med 35 den til polymerisationen i den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner indførte gruppe, og de på det polymere bæremateriale værende copolymeriserbare grupper.
Fortrinsvis anvender man som denne yderligere monomere acrylamid og poder de nævnte acrylgruppeholdige farvestoffer på et poly-bisacryl= \ i 150536 14 amid, som endnu har frie copolymeriserbare dobbeltbindinger.
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af de nævnte adsorbenter, som er ejendommelig ved, at man først ved polymerisation eller polykondensation af mindst én monomer, som yderligere har en funktionel gruppe, hvorunder den for nucleinsyrer affine 5 rest kan bindes direkte eller over en polymer "spacer" på i og for sig kendt måde danner det polymere bæremateriale, eventuelt sønderdeler det polymere bæremateriale til den ønskede partikelstørrelse, og så påpoder den for nucleinsyrer affine rest, enten direkte eller ved copolymerisation i nærværelse af mindst én yderligere monomer som copolymer, eller at man på i og for sig kendt måde ved perlepolymerisation fremstiller partikler af den ønskede størrelse.
Podningen kan ske på vilkårlig ønsket måde, f.eks. ved forestring, 15 ved amiddannelse eller ved urethandannelse, hvortil man anvender sædvanlige reagenser og sædvanlige fremgangsmådebetingelser eller indfører de til disse reaktioner egnede grupper i det polymere bæremateriale eller den for den biopolymere affine rest.
20 Den for den biopolymere affine rest, hvori man har indført en copoly= meriserbar dobbeltbinding, kan man dog også pode på i nærværelse af et overskud af en yderligere copolymeriserbar monomer, som copolymer på polybisacrylamid, da polybisacrylamid endnu har frie copolymeriserbare dobbeltbindinger. Podecopolymerisationen kan udføres i vand el-25 ler i et indifferent organisk opløsningsmiddel og i nærværelse af en sædvanlig polymerisationskatalysator.
Fortrinsvis anvender man som copolymeriserbar for den biopolymere affine rest, acrylphenylneutralrødt eller acrylmalakitgrønt, og som 30 yderligere copolymeriserbar monomer acrylamid, idet man poder en co= polymer af disse bestanddele på polybisacrylamid. Ifølge en foretruk-ken arbejdsmåde poder man en copolymer af acrylamid og acrylphenyl= neutralrødt eller acrylmalakitgrønt med en polymerisationsgrad på 200 til 300.
35
Ved denne podecopolymerisation arbejder man fortrinsvis med et forhold mellem den for den biopolymere affine rest, som har en copoly= meriserbar dobbeltbinding, og den yderligere copolymeriserbare mono= mer på 1:100 til ca. 1:5000, idet man fortrinsvis udfører denne reak- 15 150536 tion ved et forhold på 1:3000. Herved har det vist sig, at det molære udgangsforhold mellem den yderligere monomere og den for den biopoly= mere affine rest, som har en copolymeriserbar dobbeltbinding, også bevares i den copolymere. Med en gennemsnitlig polymerisationsgrad 5 af den copolymere på 200 til 300 kan man gå ud fra, at de påpodede copolymerkæder kun bærer én for den biopolymere affinvest. De copoly= mere danner derved spacere af forskellig længde mellem den for den biopolymere affine rest og det polymere bæremateriale, især polybis-acrylamidpartiklen.
10
Det har vist sig, at adsorbenterne ifølge opfindelsen tilfredsstiller de stillede krav og uden videre kan fås på simpel måde syntetisk.
F.eks. får man det polymere bæremateriale ved polymerisation af bis-acrylamid i højkoncentreret opløsning. Polymerisationsproduktet er 15 et sprødt farveløst fast stof, som meget let kan udrives til godt sedimenterende skår, der ved sigtning flere gange kan homogeniseres til den ønskede partikelstørrelse. Kvældningen i vandig opløsning er konstant, selv ved ekstreme saltkoncentrationer og praktisk taget uafhængig af gennemstrømningshastigheden ved kromatografi. Da disse par-20 tikler endnu indeholder mange ikke omsatte polymeriserbare dobbeltbindinger, kan de som allerede nævnt ovenfor anvendes til yderligere podepolymerisation.
Således får man med det adenin-thymin-specifikke acrylmalakitgrønt 25 og med det guanin-cytosin-specifikke acrylphenylneutralrødt med acryl= amid i nærværelse af disse poly-bisacrylamidpartikler ved copolymeri-sation i vandig opløsning de ifølge opfindelsen foretrukne adsorbenter. Derved bliver 40 til 50% af de dannede copolymere med en gennemsnitlig polymerisationsgrad på ca. 200 under sædvanlige reaktionsbetingelser 30 bundet i form af podecopolymere til bærerpartiklen af poly-bisacryl= amid. Efter grundig skylning afgiver de stærkt farvede adsorbenspar-tikler ingen farvestof mere og kan direkte anvendes til affinitetskromatografi af nucleinsyre. Sædvanligvis adsorberes nucleinsyreblan-dingen i 0,01m phosphatstødpude til materialet og desorberes med en 35 lineær saltgradient. Saltets art afhænger af nucleinsyrens art. Medens natriumchlorid er tilstrækkelig til desorption af ribonucleinsyrer, herunder transfer-ribonucleinsyrer, kræves der perchlorat til basespecifik eluering af DNA af acryl-malakitgrøntholdige adsorbenter.
Det har vist sig, at det til fremstilling af bærematerialet også er 16 150536 muligt at gå ud fra uopløselige materialer med hydroxygrupper eller aminogrupper, som foreligger i perleform, som f.eks. aminoalkylsepha= rose, mikrokrystallinsk cellulose, tværbundet hydroxyethylmethacrylat eller epoxypropylacrylat. Hos disse bærere indføres de til påfølgende 5 podning nødvendige acrylgrupper ved omsætning med acryloylchlorid.
Der kan derved opnås en lignende høj ladning med farvestof, som ved podning på acrylamidskår.
Adsorbenterne ifølge opfindelsen kan anvendes til adskillelse af nu-10 cleinsyrer ved tofaseaffinitetsfordeling, ved tofasefordelingskromato-grafi, ved gelelektroforese og især ved affinitetskromatografi. Med særlig fordel kan disse adsorbenter anvendes til adskillelse af blandinger af enstrengede og/eller tostrengede nucleinsyrer, især af DNA-blandinger.
15
Da adsorbenterne ifølge opfindelsen, som bærer basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere på grundlag af 5-phenylphenazonium= salte, virker specifikt for guanin-cytosin-rig DNA, og adsorbenterne ifølge opfindelsen, som bærer basespecifikke og/eller strukturspeci-2 0 fikke kompleksdannere på grundlag af triphenylmethanfarvestoffer, virker specifikt for adenin-thymin-rig DNA, kan de ønskede basespecifikke og/eller strukturspecifikke eller sekvensspecifikke adskillelser af nucleinsyreblandinger foretages.
25 Som overvejende strukturspecifikke kompleksdannere kan der være tale om de til interkalation egnede forbindelser. Ved interkalation forstår man især en speciel vekselvirkning af farvestofmolekyler med DNA, ved hvilken farvestofmolekylet skyder sig ind mellem to nabo-basepar i DNA-dobbeltspiralen. Hvilke stoffer, der ifølge strukturen 30 er interkaleringsdygtige,er velkendt for fagmanden. Det drejer sig om planare, elektronrige chromofore. Der skal først og fremmest forstås resterne af planare polycykliske, såsom bi-, tri- eller tetra= cykliske kondenserede ringsystemer, som kan indeholde heteroatomer, såsom nitrogen, oxygen og svovl.
35
Virkningen kan være forhøjet, når der f.eks. som i tilfældet med ethidiumbrornid og 9-(acryloylaminoethyl-amino)-2-methoxy-6-chlorakri= din, findes en aminogruppe i ringsystemet, som muliggør en binding til phosphatgrupperne i DNA. Det er let for fagmanden at anvende tilsvarende brugbare forbindelser, f.eks. akridiner, benzakridiner, phen= anthrener, phenantridiner, pyridoindoler, naphthaliner, naphthothio= ø 17 150536 phener, benzothiophener, thianthrener, xanthiner, phenoxanthiner, chinoliner, chinoxaliner, phenanthroliner, phenothiaziner, phen= oxaziner, phthalaziner osv..
5 Akridinderivater, f.eks. 9-(acryloylamino-ethyl-amino)-2-methoxy-6-chlorakridin eller phenanthridinderivater, f.eks. ethidiumbromid (5-ethyl-3,8-diamino-6-phenyl-phenanthridiumbromid) adskiller efter deres kobling til bisacrylamidpartiklerne baseuspecifik dobbeltstrenget DNA fra supersnoet DNA (elutionsdiagram fig. 7). Dette er meget vig-10 tig for en simpel udskillelse af plasmid-DNA og virus-DNA af celle-oplukninger. Søjlen erstatter de komplicerede ethidiumbromid-cæsium= chlorid-gradienter. Denne adskillelse er også mulig med acryloylamino= phenylneutralrødtsøjlen, da begge farvestoffer med DNA danner et kompleks af lignende struktur (interkalationskompleks). Acryloylamino= 15 phenylneutralrødt adskiller både strukturspecifikt og basespecifikt.
Alt efter det foreliggende adskillelsesproblem er en række variationer med hensyn til sammensætningen af adsorbenset derfor mulige.
Da de basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere er 20 bundet over en stabil kovalent kulstof-kulstofbinding, kan adsorben-terne ifølge opfindelsen også anvendes ved ekstreme pH-værdier, vaskes med detergenter og regenereres med saltopløsninger. Endvidere er indbygning af flere forskellige basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdannere eller monomere mulig, således at der kan 25 dannes adsorbenter, der kan udnyttes til adskillelse af transfer-ribonucleinsyrer. Kædelængden af de påpodede copolymere og dermed længden af kæderne mellem det polymere bæremateriale og den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner kan på sædvanlig måde styres ved hjælp af mercaptoethanol.
30 I det følgende beskrives opfindelsen nærmere ved hjælp af eksempler og under henvisning til tegningerne.
På tegningerne viser 35 fig. 1 et skema for fremstillingen ifølge opfindelsen af særligt foretrukne adsorbenter ved hjælp af totrinspolymerisationen ifølge opfindelsen, fig. 2 elutionsdiagrammet for en blanding af tre fraktioner af bak- 18 150536 terielle desoxyribonucleinsyrer under anvendelse af et adsorbens ifølge opfindelsen, fig. 3 elutionsdiagrammet for en blanding af tre fraktioner af bak-5 terielle desoxyribonucleinsyrer, som blev fremstillet under anvendelse af et andet adsorbens ifølge opfindelsen, fig. 4 elutionsdiagrammet for et EcoRI-hydrolysat af X-phag-desoxy= ribonucleinsyre, som blev fremstillet under anvendelse af et adsor-10 bens ifølge opfindelsen, fig. 5 elutionsdiagrammet, der fremkom under anvendelse af et adsorbens ifølge opfindelsen til adskillelse af en DNA-RNA-blanding fra en oplukning af M.luteus, og 15 fig. 6 elutionsdiagrammet for en blanding af fire forskellige transfer-ribonucleinsyrer fra gær, der fremkom med et adsorbens ifølge opfindelsen, og 20 fig. 7 elutionsdiagrammet for adskillelsen af supersnoet og lineær DNA.
De følgende eksempler tjener til at belyse opfindelsen nærmere.
25 Eksempel 1.
A) Fremstilling af poly-bisacrylamid-bærermaterialet.
Man suspenderer 50 g N,Ν'-methylenbisacrylamid i 100 ml methanol i 30 et højt 1 liter polyethylenbægerglas og tilsætter 200 ml kogende redestilleret vand. Under omrøring af blandingen med magnetomrører, går bisacrylamidet fuldstændig i opløsning. Til den til 60°C afkølede og intensivt omrørte opløsning pipetterer man først 1 ml Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiamin og tilsætter så på en gang en opløsning af 35 0,2 g ammoniumperoxidisulfat i 5 ml vand. Straks efter gennemblan- dingen standser man omrøreren. Opløsningen bliver uklar efter nogle sekunder og størkner under opvarmning til en farveløs blok. Polymerisationen afbrydes efter ca. 1 minut, idet den polymere blok hurtigt sønderdeles groft med en stor spatel. Brudstykkerne suspenderes i 1 liter methanol i et 2 liter polyethylenbægerglas og udrives til en 19 150536 kornet grød. For yderligere at homogenisere partiklerne river man grøden igennem sigter med aftagende maskestørrelse (1 mm x 1 mm, 0,5 mm x 0,5 mm og 0,25 mm x 0,25 mm). De opståede skår lader man sedimentere, hvorpå man afdekanterer den mælkeagtigt uklare overstående væske. Denne procedure gentages flere gange, først med methanol, 5 derpå med en blanding af methanol og vand og til slut med en 1%'ig eddikesyreopløsning og til slut igen med destilleret vand. De fremkomne partikler af polybisacrylamid lagres i vandig opløsning og kan til enhver tid anvendes til den i det følgende beskrevne podede co= polymerisation.
10
Af 300 ml af polymerisationsopløsningen får man ca. 300 ml udfældede polybisacrylamidpartikler.
B) Podning af en copolymer af acrylamid og acrylphenylneutralrødt 15 på det i trin A fremstillede polybisacrylamid.
Man suspenderer 60 ml af de i trin A fremkomne udfældede polybisacryl= amidpartikler i en flaske med skruelåg i 20 ml destilleret vand. I denne suspension opløser man 5 g acrylamid og 10,3 mg acrylphenylneu= 20 tralrødtchlorid, idet man forsigtigt ryster suspensionen i flasken, indtil farvestoffet er blevet fuldstændigt opløst. Copolymerisationen begyndes så ved tilsætning af 0,050 ml mercaptoethanol til indstilling af polymerisationsgraden og 1 ml af en natriumperoxidopløsning (0,8 g natriumperoxid i 100 ml lm natriumacetatstødpude med en pH-25 værdi på 5,5) som katalysator. Den dannede suspension luftes straks i 5 minutter med nitrogen og holdes så under udelukkelse af luft ved stuetemperatur. Efter ca. 30 minutter har reaktionsblandingen tydeligt opvarmet sig, og efter ca. 2 timer er polymerisationen i det væsentlige slut. Man lader henstå endnu nogle timer, før man overfører 30 den viskose suspension til et porcelænsfilter. Man frasuger den vis-. kose dybt farvede opløsning og vasker de på filteret tilbageblivende stærkt farvede partikler grundigt med vand, indtil vaskeopløsningen forbliver farveløs ved anvendelse af en 1%'ig eddikesyreopløsning.
Efter en afsluttende kontinuerlig skylning med en 0,01m natriumphos= 35 phatstødpude med en pH-værdi på 6,0 natten over, kan man anvende materialet til affinitetskromatografi af nucleinsyrer.
14
Bestemmelsen af udbyttet sker for acrylamid ved en C-markering og for farvestoffet via den optiske tæthed. Udbytterne er følgende: .4 20 150536
Farvestof: Indbygning i den copolymere (bundet og ikke bundet) 60,5%
Acrylamid: Indbygning i den copolymere (bundet og ikke bundet 49,2%
Farvestof: Indbygning i den bundne copolymere, be- 5 regnet på summen 51,0%
Acrylamid: Indbygning i den bundne copolymere, beregnet på summen 57,0%.
Det kan konstateres, at det molære udgangsforhold mellem farvestof ^0 og acrylamid (1:3000) også bevares i de copolymere. Da den gennemsnitlige polymerisationsgrad af den copolymere blev konstateret til 200 til 300, kan man gå ud fra, at copolymerkæderne i hvert enkelt tilfælde kun bærer et farvestofmolekyle pr. kæde.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde belyses skematisk af fig. 1.
Eksempel 2.
Adskillelse af nucleinsyreblandinger ved affinitetskromatografi på 2Q adsorbenter ifølge opfindelsen.
Som de på fig. 2 til 6 viste elutionsdiagrammer viser, er anvendelsesmuligheden for adsorbenterne ifølge opfindelsen inden for nuclein= syrefraktionering meget alsidig. Alt efter basespecifiteten af det 25 bundne farvestof, opdeles blandinger af dobbeltstrengede nucleinsyrer ifølge deres basesammensætning.
Således viser fig. 2 elutionsdiagrammet for en blanding af tre fraktioner af bakterielle desoxyribonucleinsyrer med en gennemsnitlig 3Q molekylvægt på ca. 700.000 D med forskellig basesammensætning. Til dette formål blev anvendt en søjle med dimensionerne 16 cm x 1,5 cm, der som adsorbens indeholder acrylmalakitgrønt acrylamid-copolymere podet på polybisacrylamidpartikler. Den anvendte desoxyribonuclein= syremængde er ca. 1 mg.
35
Fig. 3 viser elutionsdiagrammet for en blanding af tre fraktioner af bakterielle desoxyribonucleinsyrer med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 700.000 D, der har forskellig basesammensætning. Til elution af 1 mg af nucleinsyreblandingen blev anvendt en søjle med dimensionerne 15,2 cm x 1,5 cm, der som adsorbens indeholder bisacrylamid= i 21 150536 partikler, hvorpå der er podet acrylphenylneutralrødt-acrylamid-copolymere.
Under anvendelse af adsorbenterne ifølge opfindelsen kan der også 5 fraktioneres DNA-fragmenter, som er udvundet ved indvirkning af restriktionsendonucleaser. Dette er vist på fig. 4, som gengiver elutionsdiagrammet for et Eco-RI-hydrolysat af X-phag-desoxyribo= nucleinsyre, som i en mængde på 0,5 mg blev adskilt under anvendelse af en søjle med dimensionerne 15,8 cm x 1,5 cm, der som adsorbens 10 indeholder polybisacrylamidpartikler, hvorpå der er podet acrylmala= kitgrønt-acrylamid-copolymere. Betegnelsen for DNA-fragtten terne i det indskudte billede af en gelelektroforetisk adskillelse for de enkelte fraktioner sammenlignet med udgangsmaterialet svarer til betegnelsen i artiklen af Urenes og Davis i J. Mol. Biol. 91, 315-328 (1975).
15
Også adskillelse af ribonucleinsyrer fra desoxyribonucleinsyrer fra samme organisme kan lade sig gøre med adsorbenterne ifølge opfindelsen, således som det vil ses af fig. 5. På denne fig. 5 er vist elu= tionsdiagrammet for en DNA-RNA-blanding fra en oplukning af M.luteus (72% G+C), hvor blandingen i en mængde på 1 mg blev adskilt ved hjælp af en søjle med dimensionerne 16,2 cm x 1,5 cm, hvilken søjle er fyldt med polybisacrylamidpartikler, hvorpå der er podet acrylmalakitgrønt-copolymere.
Fig. 6 viser elutionsdiagrammet for en blanding af fire forskellige af gær udvundne transfer-ribonucleinsyrer. For den i en mængde på
Phe 1,5 mg adskilte blanding, drejer det sig om en blanding af t-RNA , t-RNA^3, t-RNAG‘'"u og t-RNAG^. Til affinitetskromatografien blev anvendt en søjle med dimensionerne 16 cm x 1,5 cm, der var fyldt med polybisacrylamidpartikler, hvorpå der er podet acrylphenylneutralrødt-acrylamid-copolymere.
Fig. 7 viser elutionsdiagrammet for adskillelsen af supersnoet og lineær DNA. Til affinitetskromatografien blev anvendt polybisacryl= 32 amidpartikler, hvorpå der er podet 9-(aeryloylamino-ethyl-amino)-2-methoxy-6-chlorakridinpartikler.
Ved anvendelsen af adsorbenterne ifølge opfindelsen til adskillelse af nucleinsyreblandinger ved affinitetskromatografi, som ovenfor beskrevet, anvender man som elutionsmiddel vandige saltkoncentrationsgradienter, hvortil man som salte fortrinsvis anvender alkalimetalsalte, såsom natriumchlorid, natriumperchlorat, lithiumperchlorat osv.. I visse tilfælde kan der også anvendes stødpuder, f.eks. phosphatstød- 22 150536 puder, idet man til adsorptionsmidler, der som basespecifik kompleksdanner indeholder resten af malakitgrønt, anvender en svagt sur stødpude med en pH-værdi på 5,5 til 6, f.eks. en 0,01 molær phosphatstød-pude med en pH-værdi på 5,5 til 5.
5
De til opnåelse af optimale saltgradienter, deres bestanddele, koncentrationer, pH-værdier og de dertil anvendte stødpuder kan dog let bestemmes af en fagmand uden videre. Sammenfattende kan altså konstateres, at adsorbenterne ifølge opfindelsen er fremragende eg- 10 nede til affinitetsspecifik adskillelse af makromolekulære stoffer og især biopolymere, såsom nucleinsyreblandinger. Disse adsorbenter kan fremstilles på simpel måde og indstilles med et specielt formål med henblik på deres basespecifitet.
15 Eksempel 3.
Fremstilling af acryloylaminomalakitgrønt.
la) 15,1 g (0,1 mol) 4-nitrobenzaldehyd og 36,3 g = 38 ml (0,3 mol) 20 Ν,Ν-dimethylanilin og 40,5 g zinkchlorid (vandfrit) blandes ocj opvarmes til en badtemperatur på 100°C. Den til at begynde med let bevægelige blanding bliver i løbet af reaktionstiden til en fast grøn masse, der ikke mere kan omrøres. Efter 5 timers reaktionstid lader man afkøle. Produktet optages i 150 ml acetone, hvorved produktet 25 efter nogen tids omrøring opløses,og zinksaltet udskilles. Det uop- løste salt frasuges, vaskes med acetone, og til filtratet sættes vand, indtil der sker krystallisation. Krystallisatet frasuges, vaskes med vand, isopropanol og ether. Udbytte 28,7 g (76,6% af det teoretiske), smeltepunkt 168°C (stoffet er lysfølsomt).
30 lb) 3,75 g (0,01 mol) af den ifølge la) fremkomne nitroforbindelse opløses i 200 ml iseddike (99%) og 20 ml vand, og der tilsættes 4 g zinkchlorid. Derefter tilsættes portionsvis 20 g zinkstøv under omrøring og afkøling til stuetemperatur (20-30°C). Der omrøres i 30 25 minutter ved stuetemperatur, derpå frasuges overskydende zink, og vaskes med iseddike. Filtratet inddampes i vakuum ved 50°C, remanensen opløses i 150 ml chloroform og 100 ml vand og fraskilles, og derefter rystes chloroformfasen med 80 ml 2n-natriumcarbonatopløsning og 100 ml vand. Chloroformfasen fraskilles, tørres med natriumsulfat og filtreres og inddampes så til ca. 100 ml i vakuum ved 50°C og omsæt- 23 150536 tes direkte videre (svag violet opløsning).
lc) Til den fremkomne 100 ml chloroformopløsning af aminoforbindel-sen sættes 50 ml methanol. Der tilsættes 10 g natriumcarbonat (vand-5 frit) og en spatelspids 1,3-dinitrobenzol, og derefter tilsættes dråbevis under omrøring og isafkøling (0-5°C) 1,81 g = 1,65 ml acrylo= ylchlorid (dobbelt molmængde). Suspensionen omrøres natten over ved stuetemperatur, derefter frasuges natriumcarbonatet, og filtratet inddampes i vakuum ved 35-40°C. Remanensen optages i 100 ml chloro= 10 form og 50 ml vand og rystes, chloroformfasen fraskilles, efterekstra-heres med 50 ml vand, tørres med natriumsulfat og inddampes i vakuum ved 35 til 40°C. Den olieagtige, grønlige remanens udrives med 20 ml isopropanol og henstilles koldt til krystallisation. Krystallisatet frasuges, vaskes med isopropanol og ether og tørres i exikkator. Ud-15 byttet efter trinnene Ib og lc er 2,9 g (72,7% af det teoretiske), smeltepunkt 175°C.
Analyse: beregnet C 78,2 H 7,27 N 10,52 fundet C 75,9 H 7,21 N 9,999.
20 NMR-spektrum (hexadeuteriumdimethylsulfoxid):
CH3-(N-methyl) S 2,83 PPM, =CH-(acryl) Q 5,7 PPM, CH2= (acryl) P
6,3 PPM, aromatiske protoner mellem 6,5 og 7,5 PPM.
25 id) 250 mg (0,001 mol) chloranil opløses i 15 ml tetrahydrofuran, og der tilsættes 0,4 g (0,001 mol) acryloylforbindelse (lc). Opløsningen bliver straks blå, og efter ca. 2 timers henstand ved stuetemperatur sker der krystallisation. Man lader henstå natten over ved stuetemperatur,og derefter frasuges krystallisatet, vaskes med 30 tetrahydrofuran og ether og tørres i exikkator. Med henblik på yderligere rensning optages igen i vand, neutraliseres med HCL og udrys-tes så med eddikeester. Det renere produkt udfældes af den vandige opløsning ved tilsætning af natriumchlorid. Udbytte 0,335 g (84,2% af det teoretiske). I NMR-spektret af ld) kan sammenlignet med lc) 35 iagttages en forskydning af N-methyl-protonsignalet til 3,3 PPM.
Eksempel 4.
Fremstilling af acryloylaminophenylneutralrødt.
24 150536 la) 6,9 g (0,05 mol) 4-nitroanilin opløses i 150 ml tetrahydrofuran/ chloroform 1:1, og der tilsættes en spatelspids 1,3-dinitrobenzol og 8 ml triethylamin. Under omrøring ved 10-20°C tildryppes langsomt 9 ml (0,1 mol) acryloylchlorid. Opløsningen omrøres natten over ved 5 stuetemperatur, hvorved der udkrystalliserer triethylammoniumchlorid. Derefter afdampes tetrahydrofuran-chloroform-blandingen i vakuum ved 50°C, remanensen udrives med vand, frasuges og vaskes med vand, iso= propanol og ether. Produktet tørres i vakuum ved 50°C.
•*-0 lb) 2,5 g acryloylforbindelse 2 a opløses i 60 ml tetrahydrofuran under omrøring ved 50°C og fortyndes med 60 ml iseddike (99%) og afkøles til 30°C. Derefter tilsættes portionsvis 10 g zinkstøv, hvorved temperaturen under isafkøling stiger til 35-40°C. Derpå efter-røres i 10 minutter ved stuetemperatur, overskydende zink frasuges og vaskes med iseddike. Filtratet inddampes i vakuum ved 45°C. Den olieagtige inddampningsremanens er kromatografisk praktisk taget ren og anvendes som sådan til næste reaktion.
lc) Til en opløsning af 4,2 g (0,02 mol) N,N-dimethyl-p-phenylendi= 20 ammoniumdichlorid og 2,38 g (0,02 mol) o-toluidiniumchlorid i 400 ml H2O sættes langsomt under omrøring ved stuetemperatur en opløsning af 12 g natriumchromat (0,04 mol) i 100 ml vand. Det udskilte grønne produkt frasuges efter 15 minutter, vaskes tre gange med vand, hvorved vaskeopløsningen forbliver grøn, og bundfaldet forarbejdes straks 25 videre, idet det suspenderes i en mindre mængde vand og homogeniseres. Den homogene suspension fortyndes med vand til 1,6 liter. Efter tilsætning af 1,15 x 0,02 mol N-acryloyl-p-phenylen-diammoniumacetat i 100 ml vand, bliver reaktionsblandingen indstillet til pH 4,9 med 130 ml 3 M natriumacetatopløsning. Derefter opvarmes blandingen under 30 omrøring til kogning. Opløsningen farves derved først dybblå og derefter ved kogning mørkviolet (for at fuldstændiggøre reaktionen lader man koge i 5 minutter). Derefter bliver den kogende varme opløsning frasuget over et porcelænsfilter, og filtratet (ca. 2 liter) bliver med 240 g natriumchlorid indstillet til 2 m opløsning, og man lader 35 den henstå natten over i kølerum. Det udfældede krystallisat frasuges og tørres i exikkator. Det må ikke vaskes med vand, da stoffet er let opløseligt i vand). Udbytte 2,4 g råt produkt.
Med henblik på yderligere rensning bliver 1,3 g af det rå produkt opløst i 25 ml methanol og 0,1 M natriumchlorid (4:1) og ført på en
Claims (16)
1. Adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nuclein-syrer, kendetegnet ved et polymert bæremateriale, hvortil en for nucleinsyrer affin rest er kovalent bundet direkte eller over en polymer "spacer". . < Λ : i 150536
2. Adsorbens ifølge krav 1, kendetegnet ved et småporet, lidet komprimerbart polymert bæremateriale, hvorpå der er podet en copolymer af mindst to blandingspolymeriserbare monomere, som polymere "spacere", hvoraf én bærer den for 5 den biopolymere affine rest.
3. Adsorbens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleks-'/<!j danner har følgende formel _V 30 ,_^+N(CH3)2cr -oc Q N(CH3)2 - f .1 % i ! 150536 o
3. Adsorbens ifølge krav b-2, kendetegnet ved, 10 at det polymere bæremateriale som basespecifik og/eller struk turspecifik kompleksdanner for nucleinsyrer, bærer resten af et farvestof af følgende almene formler I eller II R - 15 »3 A® 20 1 © 2 ^ri nr2 il J J (II) NR2 3 0 hvor X er en CH-gruppe eller et nitrogenatom, Y er et oxygenatom, et svovlatom, en NH-gruppe eller en gruppe med formlen 35 n 150536 /O~n<r1>2 5 R^ uafhængigt af hinanden er hydrogenatomer eller methylgrupper, 2 3 R er et hydrogenatom eller en methylgruppe, R er et hydrogen- 4 atom eller en methylgruppe, R er et hydrogenatom eller en methylgruppe,og er en anion, såsom en chloridanion, en 10 perchloration eller en oxalation, eller resten af et interkalerende farvestof indeholdende et planart polycyklisk, såsom bi-, tri- eller tetracyklisk kon-.:· denseret ringsystem, der kan indeholde heteroatomer, såsom 15 nitrogen, oxygen og svovl.
4· Adsorbens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den basespecifikke og/eller strukturspecifikke kompleksdanner har følgende formel 20 V (CH3) nh2 25
5 Udbytte 0,665 g kromatografisk rent farvestof. Eksempel 5. Fremstilling af 9-(acryloylamino-ethylamino)-3-chlor-7-methoxy= 10 akridin. 854 mg 3,9-dichlor-7-methoxy-akridin bliver sammen med 1 ml ethylen= diamin og 7,7 g phenol opvarmet i 30 minutter i oliebad til 60°C. .. Smelten optages i 200 ml chloroform og 150 ml vand, indstilles til 15 pH 4 med eddikesyre og ækvilibreres. Den organiske fase efterekstra-heres 3 til 4 gange med 0,1 m natriumacetatstødpude og kasseres så. De vandige ekstrakter indstilles til pH 9,5 med sodaopløsning, ekstra-20 heres med chloroform-n-butanol (20:1), og den organiske fase filtreres over siliconpapir og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i 0. 1 m natriumacetatstødpude, rester af dimeriseret produkt frafil-treres, og opløsningen indstilles til pH 10. Efter 1 time ved stuetemperatur frafiltreres bundfaldet, vaskes med lidt fortyndet ammo= 25 niakopløsning (4°C) og tørres. Udbytte: 50-80% af det teoretiske. i 206 mg af den fremkomne aminoforbindelse opløses i 25 ml chloroform i varmen, og efter afkøling tilsættes 0,3 ml acrylchlorid. Opløsningen farver sig straks mørkere. Efter nogle minutter udskiller acryloyl= 30 derivatet sig. Efter frasugning og vask med noget chloroform, får man 122 mg (50% af det teoretiske) 9-(acryloylamino-ethylamino)-3-chlor-7-methoxyakridin i kromatografisk ren form. Patentkrav. 35
6. Adsorbens ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at det polymere bærermateriale er en polymer eller en copolymer af monomere, der foruden de til dannelse af den polymere eller copolymere nødvendige funktionelle grupper 5 har mindst én yderligere funktionel gruppe, hvorover den polymere "spacer" kan bindes kovalent til den affine rest.
7. Adsorbens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det polymere bæremateriale er et poly-bisacrylamid, hvorpå 10 den for den biopolymere affine rest er podet ved copolymerisa-tion i nærværelse af et overskud af en yderligere copolymeri-serbar monomer, eller bærermaterialet er en tværbundet hydfrofil polymer med hydroxy- eller aminogrupper, hvori der bagefter er indført acryloylgrupper, som f.eks. cellulose, sepharose, 15 aminoalkylcellulose og sepharose, eller bærermaterialet er amineret epoxypropylmethacrylat.
8. Adsorbens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den for nucleinsyrer affine rest, som bærer en fri dobbelt-20 binding, er kovalent bundet til dette polymere bærermateriale i nærværelse af acrylamid ved copolymerisation over de frie dobbeltbindinger i polybisacrylamidet.
9. Fremgangsmåde til fremstilling af et adsorbens ifølge 25 krav 1 til 8, kendetegnet ved, at man først ved polymerisation eller polykondensation af mindst én monomer, som yderligere har en funktionel gruppe, hvorunder den for nucleinsyrer affine rest kan bindes direkte eller over en polymer "spacer" på i og for sig kendt måde danner det polymere 30 bæremateriale, eventuelt sønderdeler det polymere bæremateriale til den ønskede partikelstørrelse, og så påpoder den for nucleinsyrer affine rest, enten direkte eller ved copolymerisation i nærværelse af mindst én yderligere monomer som copolymer, eller at man på i og for sig kendt måde ved perlepolymerisation 35 fremstiller partikler af den ønskede størrelse. 150536
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at man poder den for nucleinsyrer affine rest, som har en copolymeriserbar dobbeltbinding, i nærværelse af et overskud 5 af en yderligere copolymeriserbar monomer, som copolymer på polybisacrylamid.
11# Fremgangsmåde ifølge krav io, kendetegnet ved, at man udfører podecopolymerisationen i vand eller i 10 et indifferent opløsningsmiddel i nærværelse af en sædvanlig polymerisationskatalysator.
12, Fremgangsmåde ifølge krav io, kendetegnet ved, at man som den for nucleinsyrer affine rest, der har 15 en copolymeriserbar dobbeltbinding, anvender acrylphenylneu- talrødt eller acrylmalakitgrønt, og som yderligere copolymeriserbar monomer acrylamid.
13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet 20 ved, at man påpoder en copolymer af acrylamid og acrylphenyl-neutralrødt eller acrylmalakitgrønt med en polymerisationsgrad på 200 til 300.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet 25 ved, at man anvender den for nucleinsyrer affine rest, som har en copolymeriserbar dobbeltbinding, og den yderligere copolymeriserbare monomer i et vægtforhold på 1:100 til 1:5000.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet 30 ved, at man arbejder med et forhold på ca. 1:3000.
16. Anvendelse af adsorbenter ifølge krav 1-8 til adskillelse af blanding af enstrengede og/eller tostrengede nucleinsyrer, især af DNA-blandinger. 3 5 Fremdragne publikationer: Ann.Rev.Biochem. 40 (1971) side 259-278 J.of Biochem. 54 (1975) side 385-394.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2709094 | 1977-03-02 | ||
| DE2709094A DE2709094C2 (de) | 1977-03-02 | 1977-03-02 | Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK90878A DK90878A (da) | 1978-09-03 |
| DK150536B true DK150536B (da) | 1987-03-23 |
| DK150536C DK150536C (da) | 1987-10-19 |
Family
ID=6002605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK090878A DK150536C (da) | 1977-03-02 | 1978-02-28 | Adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nucleinsyrer |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4335226A (da) |
| JP (1) | JPS53131294A (da) |
| AT (1) | AT364734B (da) |
| CA (1) | CA1122208A (da) |
| CH (1) | CH651222A5 (da) |
| CS (2) | CS231161B2 (da) |
| DE (1) | DE2709094C2 (da) |
| DK (1) | DK150536C (da) |
| FR (1) | FR2416721A1 (da) |
| GB (2) | GB1597892A (da) |
| HU (1) | HU182462B (da) |
| IT (1) | IT1095439B (da) |
| NL (1) | NL7802022A (da) |
| SE (1) | SE7802249L (da) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2534486B1 (fr) * | 1982-10-15 | 1987-11-20 | Commissariat Energie Atomique | Support particulaire greffe en surface, son procede de preparation et adsorbants pour chromatographie d'affinite incorporant ce support, ainsi que leur utilisation, notamment en biologie |
| US4665184A (en) * | 1983-10-12 | 1987-05-12 | California Institute Of Technology | Bifunctional molecules having a DNA intercalator or DNA groove binder linked to ethylene diamine tetraacetic acid |
| DE3407814A1 (de) * | 1984-03-02 | 1985-09-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| JPS60226829A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-11-12 | Daicel Chem Ind Ltd | 多糖誘導体より成る分離剤 |
| US5368737A (en) * | 1984-03-29 | 1994-11-29 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Separation agent comprising acyl-or carbamoyl-substituted polysaccharide |
| US5562614A (en) * | 1993-11-22 | 1996-10-08 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Programmable manifold system for automatic fluid delivery |
| US5489387A (en) * | 1984-03-29 | 1996-02-06 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide |
| US5229002A (en) * | 1984-03-29 | 1993-07-20 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide |
| DE3619303A1 (de) * | 1986-06-07 | 1987-12-10 | Merck Patent Gmbh | Optisch aktive adsorbentien |
| DE3811042A1 (de) * | 1988-03-31 | 1989-10-19 | Merck Patent Gmbh | Ionenaustauscher |
| US5342785A (en) * | 1988-07-05 | 1994-08-30 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Method for determining pyrogen content |
| US4957620A (en) * | 1988-11-15 | 1990-09-18 | Hoechst Celanese Corporation | Liquid chromatography using microporous hollow fibers |
| JP2925753B2 (ja) * | 1990-02-23 | 1999-07-28 | ダイセル化学工業株式会社 | 光学異性体の分離方法 |
| JP3583429B2 (ja) * | 1993-07-16 | 2004-11-04 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 疎水クロマトグラフィーのための分離剤 |
| DE4333674A1 (de) * | 1993-10-02 | 1995-04-06 | Merck Patent Gmbh | Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie |
| DE4333821A1 (de) * | 1993-10-04 | 1995-04-06 | Merck Patent Gmbh | Ionenaustauscher |
| DE4334353A1 (de) * | 1993-10-08 | 1995-04-13 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und Träger für die Gelpermeationschromatographie |
| JP3249408B2 (ja) | 1996-10-25 | 2002-01-21 | 昭和シェル石油株式会社 | 薄膜太陽電池の薄膜光吸収層の製造方法及び製造装置 |
| US7214410B2 (en) * | 2002-10-04 | 2007-05-08 | Shipley Company, L.L.C. | Process for selecting solvents for forming films of ferroelectric polymers |
| RU2257200C1 (ru) * | 2004-05-12 | 2005-07-27 | Кутушов Михаил Владимирович | Лекарственное средство |
| KR20090005184A (ko) * | 2006-04-18 | 2009-01-12 | 다우 코닝 코포레이션 | 구리 인듐 디셀레나이드-기재 광전지 장치 및 그의 제조 방법 |
| JP4933610B2 (ja) * | 2006-04-18 | 2012-05-16 | ダウ・コーニング・コーポレイション | 銅インジウム二セレン化物をベースとする光起電デバイス及びその光起電デバイスを作製する方法 |
| KR20080112381A (ko) * | 2006-04-18 | 2008-12-24 | 다우 코닝 코포레이션 | 카드뮴 텔루라이드 기재 광전지 장치 및 그 제조 방법 |
| JP5908840B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-04-26 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びデバイス、キット |
| MX340985B (es) * | 2010-09-29 | 2016-08-01 | Intervet Int Bv | Compuestos de n-heteroarilo. |
| TWI538235B (zh) | 2011-04-19 | 2016-06-11 | 弗里松股份有限公司 | 薄膜光伏打裝置及製造方法 |
| US20140196894A1 (en) * | 2013-01-15 | 2014-07-17 | University Of Kansas | Fluorescent tags for detection of swellable polymers |
| WO2015050767A1 (en) * | 2013-10-03 | 2015-04-09 | 3M Innovative Properties Company | Ligand-functionalized substrates with enhanced binding capacity |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3640983A (en) * | 1966-11-09 | 1972-02-08 | Shojiro Horiguchi | Method of making coupler-bonded-polymers and chromogen-bonded-polymers nd polymers made thereby |
| US3983001A (en) * | 1972-05-10 | 1976-09-28 | Ceskoslovenska Akademie Ved | Isolation of biologically active compounds by affinity chromatography |
| SE7411373L (da) * | 1973-09-10 | 1975-03-11 | Research Corp | |
| US4017476A (en) * | 1974-03-15 | 1977-04-12 | Mobil Oil Corporation | Preparation of finely divided styrene-divinylbenzene organic pigments |
| FR2268022B1 (da) * | 1974-04-22 | 1977-06-24 | Rhone Poulenc Ind | |
| US4046750A (en) * | 1974-09-30 | 1977-09-06 | California Institute Of Technology | Ionene modified small polymeric beads |
| LU73094A1 (da) * | 1975-07-29 | 1977-03-24 | ||
| US4035316A (en) * | 1975-11-24 | 1977-07-12 | California Institute Of Technology | Cell specific, variable density, polymer microspheres |
| US4213860A (en) * | 1976-06-30 | 1980-07-22 | Board of Regents, State of Florida for and on behalf of the University of Florida | Affinity chromatography and substrate useful therefor |
| US4194877A (en) * | 1977-11-28 | 1980-03-25 | United States Of America | Dye-containing polymer composition |
-
1977
- 1977-03-02 DE DE2709094A patent/DE2709094C2/de not_active Expired
-
1978
- 1978-02-23 NL NL7802022A patent/NL7802022A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-02-24 US US05/880,914 patent/US4335226A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-02-24 IT IT20640/78A patent/IT1095439B/it active
- 1978-02-27 GB GB30076/79A patent/GB1597892A/en not_active Expired
- 1978-02-27 CH CH2106/78A patent/CH651222A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-02-27 CA CA000297732A patent/CA1122208A/en not_active Expired
- 1978-02-27 GB GB7673/78A patent/GB1597891A/en not_active Expired
- 1978-02-28 SE SE7802249A patent/SE7802249L/xx unknown
- 1978-02-28 DK DK090878A patent/DK150536C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-03-01 FR FR7805823A patent/FR2416721A1/fr active Granted
- 1978-03-01 CS CS781289A patent/CS231161B2/cs unknown
- 1978-03-01 AT AT0146078A patent/AT364734B/de not_active IP Right Cessation
- 1978-03-01 HU HU78BO1702A patent/HU182462B/hu unknown
- 1978-03-01 CS CS781289A patent/CS231169B2/cs unknown
- 1978-03-02 JP JP2403078A patent/JPS53131294A/ja active Granted
-
1981
- 1981-10-07 US US06/309,543 patent/US4394487A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT7820640A0 (it) | 1978-02-24 |
| DE2709094A1 (de) | 1978-09-07 |
| FR2416721A1 (fr) | 1979-09-07 |
| DK150536C (da) | 1987-10-19 |
| US4394487A (en) | 1983-07-19 |
| DK90878A (da) | 1978-09-03 |
| CS7801289A2 (en) | 1984-02-13 |
| FR2416721B1 (da) | 1983-01-21 |
| JPS53131294A (en) | 1978-11-15 |
| HU182462B (en) | 1984-01-30 |
| DE2709094C2 (de) | 1984-11-22 |
| SE7802249L (sv) | 1978-09-03 |
| ATA146078A (de) | 1981-04-15 |
| AT364734B (de) | 1981-11-10 |
| CH651222A5 (de) | 1985-09-13 |
| US4335226A (en) | 1982-06-15 |
| GB1597892A (en) | 1981-09-16 |
| NL7802022A (nl) | 1978-09-05 |
| JPS6219892B2 (da) | 1987-05-01 |
| CS231161B2 (en) | 1984-10-15 |
| CS188180A2 (en) | 1984-02-13 |
| CS231169B2 (en) | 1984-10-15 |
| GB1597891A (en) | 1981-09-16 |
| IT1095439B (it) | 1985-08-10 |
| CA1122208A (en) | 1982-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK150536B (da) | Adsorbens til affinitetsspecifik adskillelse af nucleinsyrer | |
| JP5346585B2 (ja) | カチオン性オリゴヌクレオチド、同ヌクレオチドの自動調製法およびそれらの使用 | |
| JP4510381B2 (ja) | 水溶性でカチオン性のポリチオフェン誘導体を使用する、負に荷電したポリマーの検出 | |
| US9102935B2 (en) | Nucleic acid purification method | |
| US5811538A (en) | Process for the purification of oligomers | |
| JPH07506345A (ja) | オリゴチオヌクレオチド | |
| IE911176A1 (en) | Oligonucleotide analogs | |
| CN110156844A (zh) | 组合物和缀合寡核苷酸的方法 | |
| JP4148991B2 (ja) | 短核酸の精製方法 | |
| US4207200A (en) | Soluble complex former for the affinity specific separation of macromolecular substances, its preparation and its use | |
| EP1674570B1 (en) | Method of isolating nucleic acid using material positively charged at first pH and containing amino group and carboxyl group | |
| US6632938B2 (en) | Processes of purifying oligonucleotides | |
| CN118384859A (zh) | Nhs活化的羧基化琼脂糖及其制备和在核酸去除中的应用 | |
| CN101748117A (zh) | 反应表面的样品裂解和涂层 | |
| US20240025935A1 (en) | Ribonucleic acid purification | |
| CA1131225A (en) | Dyestuffs as affine residues | |
| CS242863B2 (cs) | Způsob výroby nových sloučenin typu akryloylaminobarviv | |
| JP4651666B2 (ja) | 単一の反応槽において処理される生体試料中に存在する、標的の核酸の標識及び精製方法 | |
| CN115836080A (zh) | 包含二氯乙酸的组合物、其制备方法及其用途 | |
| Morgan et al. | Large-scale purification of haptenated oligonucleotides using high-performance liquid chromatography | |
| WO2021153717A1 (ja) | 人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー | |
| JPH03184992A (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体及びその製造方法 | |
| JPH03292899A (ja) | 核酸塩基配列の変異又は特定の塩基配列を有する核酸の存在を検出する方法 | |
| JPS6396553A (ja) | 充填剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |