WO2021153717A1 - 人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー - Google Patents

人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー Download PDF

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WO2021153717A1
WO2021153717A1 PCT/JP2021/003166 JP2021003166W WO2021153717A1 WO 2021153717 A1 WO2021153717 A1 WO 2021153717A1 JP 2021003166 W JP2021003166 W JP 2021003166W WO 2021153717 A1 WO2021153717 A1 WO 2021153717A1
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carrier
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池田　壽文
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池田　壽文
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to an affinity chromatography packing material based on an artificial nucleic acid, and an affinity chromatography column filled with the packing material.
  • the present invention also relates to a method and a kit for detecting a target nucleic acid using a column packed with an affinity chromatography packing material based on an artificial nucleic acid.
  • affinity chromatography that separates the target molecule using binding affinity (affinity).
  • affinity affinity
  • the target molecule is separated by binding affinity such as antigen-antibody reaction, binding of protein to its receptor, and complementary binding of nucleic acid.
  • a carrier on which a ligand that specifically binds to a target molecule is immobilized is packed in an affinity column, and a sample is flowed through the affinity column.
  • the target molecule contained in the sample binds to the ligand, while the other molecules pass through the affinity column, so that there is a difference in elution from the affinity column between the target molecule and the other molecule.
  • the difference can be used to separate or identify the target molecule.
  • an artificial nucleic acid is a nucleic acid in which physical properties such as hydrogen bond mode, higher-order structure, and polarity are changed by chemically modifying the nucleobase, sugar, and phosphate diester. Specific functions can be chemically introduced into artificial nucleic acids, which makes it possible to do things that natural nucleic acids cannot. For example, it is possible to produce an artificial nucleic acid having a high resistance function to nuclease and a fluorescent light emitting function according to a microscopic environment.
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • S-oligonucleotide S-oligo
  • morpholino oligonucleotides and the like are known.
  • PNA is a compound having a structure similar to nucleic acid, in which the skeleton is formed by peptide bonds instead of phosphate bonds.
  • PNA has excellent hybridization affinity with DNA, has no negative charge repulsion due to phosphate groups, is not affected by salt concentration, and has good biological stability and heat resistance. Have.
  • Non-Patent Document 1 PNA, which is a kind of artificial nucleic acid, is fixed to a carrier with a His tag and packed in a column. This method shows the possibility of affinity chromatography using PNA, but no actual example of how a specific target nucleic acid could be concentrated and purified has been reported, and this affinity has not been reported. It is doubtful whether the target DNA can actually be purified using chromatography.
  • An object of the present invention is to prepare an affinity column having excellent nucleic acid affinity and stability, and to detect and identify nucleic acid by using the affinity column.
  • nucleic acid affinity temperature and pH by binding a nucleic acid containing an artificial nucleic acid as a ligand to a carrier via a peptide bond, a disulfide bond or a linker.
  • the present invention has been completed based on the finding that a packing material for affinity chromatography having excellent storage stability can be obtained without being affected by the above.
  • the present invention includes the following embodiments: [1] A packing material for affinity chromatography comprising a carrier and a nucleic acid ligand immobilized on the carrier.
  • the nucleic acid ligand comprises at least one artificial nucleic acid selected from the group consisting of peptide nucleic acid (PNA), lock nucleic acid (LNA) and S-oligo.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA lock nucleic acid
  • S-oligo S-oligo.
  • a packing material for affinity chromatography wherein the nucleic acid ligand is immobilized on the carrier by a peptide bond, a disulfide bond, or a link via a linker.
  • [3] The packing material for affinity chromatography according to [1] or [2], wherein the nucleic acid ligand is 8 to 30 mer.
  • Affinity chromatography packing material according to any one of.
  • [5] A first carrier on which a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the first sequence is immobilized, and a second carrier on which a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the second sequence is immobilized.
  • [6] The packing material for affinity chromatography according to [4] or [5], wherein the first sequence and the second sequence have complementary sequences to different regions of the target nucleic acid.
  • [7] The packing material for affinity chromatography according to [4] or [5], wherein the first sequence and the second sequence have sequences different by 1 to 3 bases.
  • the linker is selected from the group consisting of SMCC, EMCS, LC-SMCC, SM (PEG) 2, SIA, Sulfo-SANPAH, MBS, and an epoxy resin curing agent, according to [1] to [7].
  • Affinity chromatography filler according to any one.
  • a plurality of linkers are fixed on the surface of the carrier, and a plurality of linkers are fixed.
  • the packing material for affinity chromatography comprises a carrier on which a nucleic acid ligand having a sequence complementary to one sequence of the target nucleic acid is immobilized.
  • the nucleic acid ligand in which the packing material for affinity chromatography has a sequence complementary to the first sequence of the target nucleic acid and a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the second sequence of the target nucleic acid.
  • the packing material for affinity chromatography is used for a first carrier in which a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the first sequence of the target nucleic acid is immobilized and a second sequence of the target nucleic acid.
  • a kit for detecting a target nucleic acid in a sample which comprises the packing material for affinity chromatography according to any one of [1] to [11].
  • the present invention provides a packing material and a column for affinity chromatography. Since the packing material and column for affinity chromatography of the present invention are based on artificial nucleic acids, they are excellent in nucleic acid affinity and storage stability. Therefore, by using such an affinity chromatography packing material and a column, it is possible to detect and identify the target nucleic acid in a short time and with high sensitivity. Therefore, the present invention is useful in fields such as nucleic acid detection and identification, diagnostic agents, and molecular biology research.
  • Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (1) is shown.
  • the chemical structure of LNA12mer (GacAatGtaGct) -C 6 -SH (3) is shown.
  • the chemical structure of S-oligo 12mer (GacAatGtaGct) -C 3- SH (4) is shown.
  • a synthetic scheme for immobilizing ligand PNA (1) on an affinity column is shown.
  • a synthetic scheme for immobilizing ligand PNA (2) on an affinity column is shown.
  • a synthetic scheme for immobilizing ligands PNA (1) and PNA (2) on an affinity column is shown.
  • a synthetic scheme for immobilizing ligand LNA (3) on an affinity column is shown.
  • a synthetic scheme for immobilizing the ligand S-oligo (4) on the affinity column is shown.
  • the outline of the evaluation method of the affinity column is shown.
  • the conceptual diagram of the variation of the form of immobilizing the ligand on the affinity column is shown. It is a graph which shows the evaluation result of the affinity column using the ligand PNA (1). It is a graph which shows the evaluation result of the affinity column using the ligand PNA (2). It is a graph which shows the evaluation result of the affinity column containing two kinds of carriers which two kinds of ligands PNA (1) and PNA (2) are fixed, respectively. It is a graph which shows the evaluation result of the affinity column containing the carrier which two kinds of ligands PNA (1) and PNA (2) are fixed. It is a graph which shows the outline and result of the evaluation of the affinity column for DNA having a base mismatch.
  • the present invention is an affinity chromatography filler comprising a carrier and a nucleic acid ligand immobilized on the carrier.
  • the nucleic acid ligand comprises at least one artificial nucleic acid selected from the group consisting of peptide nucleic acid (PNA), lock nucleic acid (LNA) and S-oligo.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA lock nucleic acid
  • S-oligo S-oligo.
  • the present invention relates to a packing material for affinity chromatography, wherein the nucleic acid ligand is fixed to the carrier by a peptide bond, a disulfide bond or a bond via a linker.
  • the packing material for affinity chromatography contains a carrier in which a nucleic acid containing an artificial nucleic acid is immobilized as a ligand that binds to a target nucleic acid.
  • An artificial nucleic acid is a nucleic acid in which physical properties such as hydrogen bond mode, higher-order structure, and polarity are changed by chemically modifying the nucleobase, sugar, and phosphate diester. Examples of artificial nucleic acids are shown below.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • RNA type N type
  • the arrow part is fixed to completely fix it to N type. Will be). It forms a strong double strand with the target single-stranded DNA / RNA via Watson-Crick hydrogen bonds. Since the sugar conformation is fixed in advance, it is considered that the loss of entropy during double chain formation with RNA is significantly reduced. This allows LNAs to form unprecedentedly stable duplexes.
  • the double chain forming ability of an artificial nucleic acid is evaluated by measuring the melting temperature (Tm) of the double chain.
  • Tm melting temperature
  • Phosphorothioate (also referred to as S-oligonucleotide or S-oligo) is an oligo DNA in which all phosphate groups at the binding site between nucleotides are sulfurized (structure below), and as described above, nuclease resistance is increased. Has (Wahlestedt et al., (2000) PNAS 97, 5633-5638).
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA is a compound having a structure similar to nucleic acid, in which the skeleton is formed by peptide bonds instead of phosphate bonds. PNA has excellent hybridization affinity with DNA, has no negative charge repulsion due to phosphate groups, is not affected by salt concentration, and has good biological stability and heat resistance. Have.
  • Morpholino is an oligonucleotide that has a morpholin ring instead of ribose or deoxyribose in nucleic acids (RNA, DNA).
  • the nucleic acid ligand contains at least one artificial nucleic acid, and may be composed of all artificial nucleic acids or may partially contain artificial nucleic acids.
  • an artificial nucleic acid may be contained every few bases (2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, etc.), or the end immobilized on the carrier of the nucleic acid ligand. May include the artificial nucleic acid in the opposite end region.
  • the nucleic acid ligand shall have an appropriate affinity for the target nucleic acid to be isolated or detected in affinity chromatography.
  • the nucleic acid ligand has a sequence that binds (hybridizes) to the target nucleic acid, for example, one that has a sequence complementary to one sequence (target sequence) of the target nucleic acid.
  • sequence means a base sequence unless described separately.
  • the packing material for affinity chromatography according to the present invention comprises a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the first sequence and a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the second sequence. Includes a fixed carrier.
  • the packing material for affinity chromatography relates to a first carrier on which a nucleic acid ligand having a sequence complementary to the first sequence is immobilized and a second sequence.
  • a second carrier on which a nucleic acid ligand having a complementary sequence is immobilized.
  • the first sequence and the second sequence may have sequences complementary to different regions of the same target nucleic acid, or may be complementary to regions of another target nucleic acid. It may have a different arrangement.
  • the first and second sequences have sequences that differ by 1-3 bases (eg, 1 base), i.e., the first and second sequences are 1-3 bases.
  • Each has a complementary sequence to a region containing a polymorphism (for example, a single nucleotide polymorphism).
  • Complementarity refers to the base pairing of nucleic acid base pairs, with adenine (A) and thymine (U) or uracil (U), guanine (G) and cytosine (C). It is a correspondence. As used herein, it means not only complete complementarity, but also partial complementarity that retains the ability to bind to a sequence because it has partial complementarity to that sequence.
  • the length of the nucleic acid ligand is selected to have an appropriate affinity for the target nucleic acid to be isolated or detected in affinity chromatography. In consideration of retention of affinity and ease of synthesis, the length of the nucleic acid ligand is generally 8 to 30 mer, preferably 10 to 25 mer, and more preferably 10 to 23 mer.
  • nucleic acid ligand that is, the determination of the overall length, the type and arrangement of the artificial nucleic acid contained, etc., should be determined by those skilled in the art in consideration of the type and length of the target nucleic acid, the purpose, the type of eluate to be used, and the like. Can be done appropriately. Nucleic acid ligands can also be prepared by conventional methods, for example, using a synthesizer capable of synthesizing artificial nucleic acids.
  • the carrier for fixing the ligand a carrier commonly used in affinity chromatography can be used, and the material and form can be appropriately selected according to the application, the type of eluate, the amount of elution, and the like. ..
  • carriers in the form of porous particles, gels, resin magnetic beads and the like can be used. It is preferable to use a carrier that is resistant to treatments such as heating, elution, and washing, and has excellent storage stability.
  • Immobilization of the ligand on the carrier can be performed by a peptide bond, a disulfide bond or a bond via a linker.
  • a peptide bond is formed by reacting a primary amino group on the ligand side after making an active ester with a peptide condensing agent such as HATU where the reaction end of the carrier is a carboxylic acid. It is possible to obtain.
  • the reaction end of the carrier is a primary amino group, it is also possible to obtain a peptide bond by converting it into an active ester and then preliminarily activating the carboxylic acid on the ligand side and reacting it. be.
  • a disulfide bond it is possible to bond via an oxidation reaction using a disulfide bond in which the reaction ends of both the carrier and the ligand are each SH group.
  • a heterocross linker for example, an epoxy resin curing agent, a homocross linker, or the like can be used as the linker.
  • a heterocrosslinker for example, a reagent that shares both N-hydroxysuccinimide ester and maleimide on both sides of the hydrocarbon mother nucleus and each active group crosslinks an amino group and a sulfhydryl group can be used.
  • SMCC succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), EMCS (N- ⁇ -malemidocaproyl-oxysuccinimide ester), LC-SMCC (succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy- ( 6-amidocaproate)), SM (PEG) 2 (PEGylated SMCC crosslinker), SIA (succinimidyliodoacetate), Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate), MBS (3-Maleimidobenzoic Acid) N-Succinimidyl Ester) and the like.
  • Epoxy resin curing agents can also be used as reagents for cross-linking amino groups or sulfhydryl groups, and for example, jER Cure (registered trademark) (Mitsubishi Chemical) is commercially available.
  • jER Cure registered trademark
  • the homocross linker for example, a reagent having the same N-hydroxysuccinimide ester or imide ester or maleimide at both ends of the hydrocarbon chain and performing cross-linking between amino groups or sulfhydryl groups can be used, and specifically. Examples include DSG (disuccinimidylglutarate), DMP (dimethylpimelimidate), and BMOE (bismaleimidoethane).
  • a reagent composed of a polyethylene glycol chain in addition to the hydrocarbon chain and performing cross-linking between amino groups or sulfhydryl groups can also be used.
  • BS (PEG) 5 PEGylated bis
  • BM (PEG) 3 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol) and the like can be used.
  • SMCC which is one of the preferred linkers, is a cross-linker having an active ester group and a maleimide group.
  • an SH group introduced into a ligand by reacting two NH groups bonded to a carrier with an active ester group of SMCC.
  • the maleimide group of SMCC By reacting with the maleimide group of SMCC, the ligand can be immobilized on the carrier via SMCC.
  • One or more linkers can be immobilized on the surface of the carrier.
  • One ligand can be immobilized on a carrier on which one linker is immobilized.
  • the ligand may be bound to a part of the plurality of linkers, or the ligand may be bound to all of the plurality of linkers.
  • capping agents such as 1,4-diaminobutane (amino group), H-Arg-NH 2 ⁇ 2HCl ( guanidino group), 5-amino valeric acid (carboxyl group), amylamine (methyl group), 4 -Phenylbutylamine (phenyl group), Fmoc-Lys-OH / HCl (amino group / carboxyl group) and the like can be mentioned.
  • one kind of ligand that is, a ligand having the same sequence
  • two or more kinds of ligands that is, a plurality of ligands having different sequences
  • a spacer may be introduced into the nucleic acid ligand and / or carrier in consideration of the ease of chemical reaction, the stability of the chemical structure, the improvement of solubility, and the like.
  • C3, C6, C10 and the like can be used as spacers.
  • the packing material for affinity chromatography according to the present invention can bind to a target nucleic acid with excellent binding affinity by introducing an artificial nucleic acid into a ligand, and is not affected by salt concentration and is biologically stable. It has excellent (degradation resistance to nucleases and proteases) and thermal stability. In addition, it can be used repeatedly and has the advantage of low cost.
  • the present invention relates to an affinity chromatography column packed with the above affinity chromatography packing material.
  • the column for affinity chromatography is not particularly limited as long as it is conventionally used in affinity chromatography.
  • Various types of columns for affinity chromatography are commercially available, and those skilled in the art should appropriately select the material, form, and volume according to the application, the type of eluate, the amount of elution, the equipment used, and the like. Can be done.
  • the affinity chromatography column according to the present invention may further include heating means.
  • the heating means may be integrally present with the column or may be removable from the column. Further, the heating means may be one that heats the entire column or a part that heats a part of the column.
  • the nucleic acid ligand used in the packing material for affinity chromatography according to the present invention can be used by heating means without heat denaturation.
  • the invention is a method of detecting or identifying a target nucleic acid in a sample.
  • the present invention relates to a method comprising a step of detecting or identifying a target nucleic acid based on elution from the affinity chromatography column.
  • the nucleic acid ligand used in the packing material for affinity chromatography according to the present invention can bind to the target nucleic acid. Utilizing this binding affinity, when a sample is introduced into an affinity chromatography column packed with a packing material, the target nucleic acid binds to the nucleic acid ligand while other molecules pass through, so that it elutes from the column.
  • the target nucleic acid in the sample can be detected or identified by examining.
  • the sample is not particularly limited as long as it is a sample for which the target nucleic acid is to be detected or identified.
  • examples thereof include biological fluid samples (blood, serum, plasma, urine, etc.), tissue or cell samples, and environmental samples (soil, rivers, etc.).
  • biological fluid samples blood, serum, plasma, urine, etc.
  • tissue or cell samples tissue or cell samples
  • environmental samples soil, rivers, etc.
  • blood samples it is preferable to store them in ice or refrigerate after blood collection.
  • plasma it is preferable to use EDTA as an anticoagulant, but heparin, sodium citrate and other substances known or widely used in the art can be used.
  • detection or identification of a target nucleic acid in a sample means determining whether or not the target nucleic acid is present in the sample, and measuring the amount or concentration of the target nucleic acid in the sample. do.
  • the sample is introduced into an affinity chromatography column filled with the affinity chromatography packing material according to the present invention.
  • the introduction of the sample into the column is not particularly limited.
  • the sample can be introduced as is or diluted with a suitable solution or buffer into the column by free fall or using a syringe.
  • the elution of the sample from the affinity chromatography column is examined, and the target nucleic acid is detected or identified according to the eluted fraction.
  • Elution of the sample can be examined using methods or instruments known in the art, such as liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS).
  • LC / MS liquid chromatography / mass spectrometry
  • the target nucleic acid binds to the ligand nucleic acid and elution is delayed. Therefore, it is possible to detect or identify the target nucleic acid based on the characteristics of such elution.
  • the ligand nucleic acid binds by distinguishing between base mismatches.
  • ligand nucleic acids can distinguish between 1-3 base mismatches, preferably 1-2 base mismatches, especially 1 base mismatches. Therefore, the method according to the present invention can also be used to detect a target nucleic acid having a base mismatch.
  • the method according to the present invention may include a step of heating the sample before or after introducing the sample into the column. Since double-stranded nucleic acids cannot bind to nucleic acid ligands, it is preferable to heat-denature the double-stranded nucleic acids to form single-stranded nucleic acids.
  • the heating temperature can be equal to or higher than the melting temperature of the double-stranded nucleic acid, for example, 75 to 100 ° C.
  • the present invention relates to a kit for detecting a target nucleic acid in a sample, which comprises a packing material for affinity chromatography.
  • a kit for detecting a target nucleic acid in a sample which comprises a packing material for affinity chromatography.
  • the detection or identification of the target nucleic acid in the sample can be easily and easily performed.
  • the kit according to the present invention may contain other components useful for detecting the target nucleic acid, such as an eluent for affinity chromatography, a control, and an instruction manual.
  • Affinity column carrier and column preparation (1) Affinity column carrier.
  • ChromSpeed TM CM103 Mitsubishi Chemical
  • ChromSpeed TM CM103 is a methacrylic acid-based weakly acidic cation exchange resin, which is used for purification of antibiotics and amino acids.
  • ChromSpeed TM CM103 was used for purification of antibiotics and amino acids.
  • ChromSpeed TM CM103 this time because we thought that it would be possible to prepare an affinity column that can obtain a precise and pure target product by using a carrier whose purpose is biopharmacy purification.
  • PNA since PNA is expensive, it has been an issue to prepare a cartridge with the amount of ligand as small as possible. Therefore, a lure type cartridge Type Mini (0.1 mL) manufactured by Tomoe Seisakusho Co., Ltd. was also used in some cases.
  • Example 2 Synthesis of PNA (ligand) for affinity column A PNA for affinity column having the structure shown in FIG. 1 was synthesized.
  • the cross-linking agent linker
  • SMCC cyclohexane in the spacer portion and having an active ester group and a maleimide group was used.
  • the maleimide group reacts with the SH group
  • the active ester group reacts specifically with the NH 2 group.
  • a structure was constructed in which Fmoc-Cys (Mmt) -OH having an SH group was introduced into the ligand.
  • Fmoc-Aund (11) -OH was introduced as a spacer (Fig. 1).
  • the nucleotide sequence of the PNA portion was GACAAT GTAGCT (SEQ ID NO: 1).
  • Fmoc-PNA12mer-C 10- Cys the usual Fmoc solid-phase synthesis method was used.
  • a fully automatic microwave synthesizer Initiator + Alstra manufactured by Biotage was used.
  • the carrier used was Fmoc-NH-SAL-PEG Resin (0.22 mmol / g) whose N-terminal was protected by an Fmoc group.
  • the PNA condensation reagent used N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) and ethyl cyanoglioxylate-2-oxime (Oxyma) recommended by the automatic synthesizer Initiator + Alstra, with 5 equivalents of PNA monomer and 5 equivalents of DIC.
  • Fmoc-Cys (Mmt) -OH and Fmoc-Aund (11) -OH is O- (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'- Using tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) and N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), Fmoc-Cys (Mmt) -OH 5 eq, Fmoc-Aund (11) -OH 5 eq, HATU 6.5 eq, DIPEA 2.3 equivalents were used. As a result, Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (1) was obtained.
  • Example 3 Design of artificial nucleic acid (ligand) for affinity column other than PNA (1) Design of LNA (3) An LNA for affinity column having the structure shown in FIG. 2 was synthesized. LNA was purchased from GeneDesign, Inc. In designing the LNA, the mixmer showed stronger enzyme resistance than the gapmer, so the structure was such that LNA was inserted every 3 bases in 12mer (in the sequence GacAatGtaGct (SEQ ID NO: 3)). , Uppercase indicates where it was inserted). In addition, the structure was similar to that of PNA during immobilization, and a spacer (C6) and thiol were modified at the 3'end to unify the conditions.
  • C6 spacer
  • Example 4 Immobilization of ligand PNA (1) on an affinity column As described below, PNA (1) prepared in Example 2 was immobilized on an affinity column ChromSpeed TM CM103.
  • Reagent used ⁇ Diisopropylethylamine (DIPEA) ⁇ 11-[(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) amino] undecanoic acid (Fmoc-Aund (11) -OH) ⁇ N, N'-dimethylformamide (DMF) ⁇ Dichloromethane (DCM) ⁇ N-Methylpyrrolidone (NMP) ⁇ O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) ⁇ 20% piperidine / NMP ⁇ N, N'-discusin imidazole carbonate (DSC) 6-[(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) amino] caproic acid (Fmoc-Acp (6) -OH) ⁇ ChromSpeed TM CM103 ⁇ Hexamethylenediamine (1,6-diaminohexan
  • 1,6-diaminohexane (0.929 g, 8 mmol) was suspended with NMP (1 mL) and DMF (1 mL), then added to 6 and stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was removed and washed once with DMF (2 mL) and 5 times with MeOH (2 mL) to obtain 7.
  • Fmoc was quantified with an absorptiometer, and the amount of Fmoc-Acp (6) -OH introduced was calculated.
  • 20% piperidine / DMF 400 ⁇ L was added to a well-dried solid-phase carrier (5 to 10 mg), and the solution was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the solution was diluted 50-fold with DMF, and the absorbance at 301 nm was measured.
  • the amount of Fmoc group was calculated with the molar absorbance ⁇ (301 nm) as 7800 M -1 cm -1
  • the amount of Fmoc-Acp (6) -OH introduced this time was 0.20838 mmol / g. ..
  • SMCC (17.1 mg, 0.051 mmol) was dissolved in DMF (3 mL), added to 9 (48.9 mg), and stirred at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution was removed and washed with DMF (2 mL) to remove excess Sulfo-SMCC. Then, washing with DMF was repeated, and the absorbance (280 nm) was measured for each 1 mL, and washing was continued until the absorbance was completely eliminated to obtain 10.
  • the ligand Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (1, 1.94 mg, 0.51 ⁇ mol) was dissolved in DMF (500 ⁇ L) and HFIP (100 ⁇ L), added to 10, and stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was removed and washed with DMF (2 mL) to remove excess Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (1). Then, washing with DMF was repeated, and the absorbance (260 nm) was measured for each 1 mL, and washing was continued until the absorbance was completely eliminated, and 11 was obtained. When Fmoc was quantified with an absorptiometer, the amount of Fmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH 2 (1) introduced into 10 was 0.01532 mmol / g.
  • the immobilization of PNA (2) on ChromSpeed TM CM103 was carried out using an EYELA personal organic synthesizer in the same manner as the immobilization of PNA (1) in Example 4 (FIG. 5). That is, the synthesis of 10 was carried out in the same manner as in Example 4, and the ligand was changed to FMOC-PNA12MER-C 10- Cys-NH 2 (2).
  • the ligand Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (2, 1.93 mg, 0.51 ⁇ mol) was dissolved in DMF (600 ⁇ L) and HFIP (200 ⁇ L), added to 10, and stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was removed and washed with DMF (2 mL) to remove excess Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (2). Then, washing with DMF was repeated, and the absorbance (260 nm) was measured for each 1 mL, and washing was continued until the absorbance was completely eliminated to obtain 13.
  • Fmoc was quantified with an absorptiometer, the amount of Fmoc-PNA12mer-C 10- Cys-NH 2 (2) introduced into 10 was 0.0113 mmol / g.
  • Immobilization of the mixture (1: 1) of PNA (1) and PNA (2) on ChromSpeed TM CM103 was performed using an EYELA personal organic synthesizer in the same manner as the immobilization of PNA (1) in Example 4. It was carried out (Fig. 6). That is, the synthesis of 10 was carried out in the same manner as in Example 4, and the ligand was changed to the Fmoc-PNA12mer-C 10- Cys-NH 2 (1 and 2) mixture.
  • Each ligand Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 (1, 1.62 mg, 0.85 ⁇ mol: 2, 1.61 mg, 0.85 ⁇ mol) was mixed, dissolved in DMF (600 ⁇ L) and HFIP (200 ⁇ L), and added to 10. , Stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was removed and washed with DMF (2 mL) to remove excess Fmoc-PNA12mer-C 10 -Cys-NH 2 . Then, washing with DMF was repeated, and the absorbance (260 nm) was measured for each 1 mL, and washing was continued until the absorbance was completely eliminated to obtain 15.
  • LNA (3) on ChromSpeed TM CM103 was carried out in the same manner as the immobilization of PNA (1) in Example 4 (Fig. 7). That is, the synthesis of 10 was carried out as described above, and the ligand was changed to LNA 12mer L (GacAatGtaGct: SEQ ID NO: 3) -C 6- SH (3).
  • LNA (3) was dissolved in DMSO and TE buffer, added to 10, and stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was gradually removed and washed with DMSO (2 mL) to remove excess LNA (3). Then, washing with DMSO was repeated, and the absorbance (260 nm) was measured for each 1 mL, and washing was continued until the absorbance was completely eliminated to obtain 17. The absorbance (260 nm) of each fraction (1 ml) of the washing liquid was measured with a spectrophotometer, and washing was repeated until the LNA (3) completely disappeared.
  • S-oligo (4) was dissolved in DMSO and TE buffer, added to 10, and stirred overnight at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was gradually removed and washed with DMSO (2 mL) to remove excess S-oligo (4). Then, the washing with DMSO was repeated, and the absorbance (260 nm) was measured for each 1 mL, and the washing was continued until the absorbance was completely eliminated, and 19 was obtained. The absorbance (260 nm) of each fraction (1 ml) of the washing liquid was measured with a spectrophotometer, and washing was repeated until the S-oligo (4) completely disappeared.
  • Example 9 Preparation of DNA oligos Table 1 shows the target single-stranded DNA sequences to be captured. For these, standard oligos purchased from Eurofin Genomics Co., Ltd. were used.
  • oligo Since the above oligo is a dried product, its concentration was adjusted with reference to the molar yield before use. After adjustment, all were stored in the refrigerator.
  • -A 150 ⁇ L of TE solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) was added to prepare 100 pmol / ⁇ L.
  • -B 200 ⁇ L of TE solution was added to prepare 100 pmol / ⁇ L.
  • -C 150 ⁇ L of TE solution was added to prepare 100 pmol / ⁇ L.
  • -D 150 ⁇ L of TE solution was added to prepare 100 pmol / ⁇ L.
  • -E 381 ⁇ L of TE solution was added to prepare 100 pmol / ⁇ L.
  • -AB A (25 ⁇ L) and B (25 ⁇ L) were mixed and heated in hot water for 5 minutes, then gradually lowered in temperature and cooled to prepare 50 pmol / ⁇ L double-stranded DNA.
  • -AB-C Prepared by mixing AB (1 ⁇ L) and C (9 ⁇ L).
  • -AB-D Prepared by mixing AB (1 ⁇ L) and D (9 ⁇ L). -Each was further diluted 50-fold and 1000-fold to adjust to 2 pmol / ⁇ L and 100 fmol / ⁇ L.
  • Affinity column evaluation experiment-1 (1) Basic procedure-Column cleaning method and initialization Using a disposable syringe (10 mL), 10 mL of distilled water was poured from the top of the cartridge to remove DMSO in the cartridge. Then, in order to completely remove the DMSO present on the upper part of the cartridge, the cartridge was turned upside down and the same cleaning was performed. Then, after confirming the absence of DMSO-derived absorption at UV 260 nm, 12 mL of 1xSSC was flowed to initialize the cartridge.
  • the sample was applied to the affinity column according to the procedure of (1) above, each fraction was collected, and the RFU value was determined.
  • the RFU value of each wavelength of the fluorescent dye before passing the sample through the cartridge and the RFU value of each of the filtrate after passing through the cartridge were compared using a fluorometer.
  • Example 11 Affinity column evaluation experiment-2 Affinity columns containing PNAs with different sequences as ligands were evaluated. Specifically, as shown in FIG. 10 (b), the same procedure as in Example 10 is performed using an affinity column containing a carrier on which PNA (2) prepared in Example 5 is immobilized as a ligand. Then, the sample was applied to the affinity column, each fraction was collected, and the RFU value was calculated.
  • Example 12 Affinity column evaluation experiment-3 Affinity columns containing two carriers were evaluated. Specifically, as shown in FIG. 10 (c), the carrier on which PNA (1) prepared in Example 4 is immobilized and the PNA (2) prepared in Example 5 are immobilized as ligands. Using the affinity column containing the carrier, the sample was applied to the affinity column in the same procedure as in Example 10, each fraction was collected, and the RFU value was determined. Note that PNA (1) and PNA (2) have sequences complementary to different sequences of the target DNA.
  • Example 13 Affinity column evaluation experiment-4 Affinity columns containing two ligands were evaluated. Specifically, as shown in FIG. 10 (d), an affinity column containing a carrier on which PNA (1) prepared in Example 4 and PNA (2) prepared in Example 5 are immobilized as ligands is provided. Using the same procedure as in Example 10, the sample was applied to the affinity column, each fraction was collected, and the RFU value was determined. Note that PNA (1) and PNA (2) have sequences complementary to different sequences of the target DNA.
  • the oligo D prepared in Example 9 was used as a single-stranded DNA sample (SSDNA).
  • SSDNA single-stranded DNA sample
  • This oligo D is 3 bases different from the oligo C evaluated in Example 10, and as shown in A in FIG. 15, PNA (1) is complementary to the region containing the base mismatch. It has a different sequence.
  • PNA (1) is complementary to the region containing the base mismatch. It has a different sequence.
  • affinity column containing a carrier on which PNA (1) was immobilized as a ligand the sample was applied to the affinity column in the same procedure as in Example 10, and each fraction was collected. Then, the RFU value was calculated. The result is shown in B of FIG.
  • Example 15 Selection of a capping agent capable of better improving the affinity ability of the ligand It is possible to cap the site other than the place where the ligand is immobilized on the carrier.
  • a stationary phase was prepared using several types of capping agents, and the effects of purification on an affinity column were compared.

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Abstract

本発明は、担体と、前記担体に固定された核酸リガンドとを備えたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤であって、前記核酸リガンドが、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（LNA）及びS-オリゴからなる群より選択される少なくとも1つの人工核酸を含み、前記核酸リガンドが、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介した結合により前記担体に固定されている、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。

Description

人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー
　本発明は、人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー用充填剤、及び該充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに関する。また本発明は、人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー充填剤が充填されたカラムを用いて標的核酸を検出するための方法及びキットに関する。
　目的分子を分離・同定するための技術として、結合親和性（アフィニティー）を利用して目的分子を分離するアフィニティークロマトグラフィーがある。例えば、抗原抗体反応、タンパク質とその受容体との結合、核酸の相補的結合などの結合親和性によって目的分子を分離することが行われている。具体的には、目的分子に特異的に結合するリガンドを固定した担体をアフィニティーカラムに充填し、サンプルをアフィニティーカラムに流す。サンプル中に含まれる目的分子はリガンドに結合する一方、その他の分子はアフィニティーカラム内を素通りするため、目的分子とその他の分子とでアフィニティーカラムからの溶出に差が生じる。その差を利用して、目的分子を分離又は同定することが可能である。
　一方、人工核酸とは、核酸塩基・糖・リン酸ジエステル部に化学修飾を加えることで水素結合様式や高次構造さらには極性などの物性を変化させた核酸のことである。人工核酸には特定の機能を化学的に導入することができ、天然の核酸にはできないことが可能になる。例えばヌクレアーゼに対する高い耐性機能や微視的な環境に応じた蛍光発光性機能などを有する人工核酸の作製が可能である。そのような人工核酸の例として、ペプチド核酸（PNA）、Locked Nucleic Acid（LNA）、ホスホロチオエート（S-オリゴヌクレオチド、S-オリゴ）、モルフォリノオリゴヌクレオチドなどが知られている。
　例えば、PNAは、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格が形成されている、核酸に類似した構造をもつ化合物である。PNAはDNAとの優れたハイブリダイゼーション親和性を有し、リン酸基による負電荷の反発がなく、塩濃度の影響を受けず、生物学的安定性及び熱耐性が良好であるなどの特性を有する。
　従来技術において、人工核酸の一種であるPNAをHisタグで担体に固定し、カラムに充填した報告がある（非特許文献１）。この方法は、PNAを使ったアフィニティークロマトグラフィーの可能性を示すものであるが、具体的なターゲット核酸をどのようにして濃縮精製することができたかという実例までは報告されておらず、このアフィニティークロマトグラフィーを使用して実際にターゲットDNAを精製できるか否かは疑義がある。
Orum H., Nielsen P.E., Jorgensen M., Larsson C., Stanley C., Koch T. BioTechniques第19巻第3号, 第472-480頁 (1995年)
　本発明は、優れた核酸親和性や安定性を有するアフィニティーカラムを作製し、それを利用して核酸を検出及び同定することを目的とする。
　前記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、本発明者は、リガンドとして人工核酸を含む核酸をペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介して担体に結合させることにより、核酸親和性が温度及びpHによる影響を受けず、保存安定性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を得ることができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
　例えば、本発明は以下の実施形態を包含する：
［１］担体と、前記担体に固定された核酸リガンドとを備えたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤であって、
　前記核酸リガンドが、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（LNA）及びS-オリゴからなる群より選択される少なくとも1つの人工核酸を含み、
　前記核酸リガンドが、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介した結合により前記担体に固定されている、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［２］前記核酸リガンドがPNAを含む、［１］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［３］前記核酸リガンドが8～30マーである、［１］又は［２］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［４］第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンド、及び第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［５］第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第1の担体と、第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第2の担体とを含む、［１］～［３］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［６］第1の配列と第2の配列とが標的核酸の異なる領域に対して相補的な配列を有する、［４］又は［５］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［７］第1の配列と第2の配列とが1～3塩基異なる配列を有する、［４］又は［５］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［８］前記リンカーが、SMCC、EMCS、LC-SMCC、SM(PEG)2、SIA、Sulfo-SANPAH、MBS、及びエポキシ樹脂硬化剤からなる群より選択される、［１］～［７］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［９］前記担体の表面に複数のリンカーが固定され、
　前記複数のリンカーのうち一部に前記核酸リガンドが結合している、［１］～［８］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［１０］前記複数のリンカーのうち前記核酸リガンドが結合していないリンカーにキャッピング剤が結合している、［９］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［１１］前記担体が、樹脂、多孔質粒子、ゲル、及び磁気ビーズからなる群より選択される、［１］～［１０］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラム。
［１３］加熱手段を備える、［１２］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カラム。
［１４］サンプル中の標的核酸を検出又は同定する方法であって、
　サンプルを［１］～［１１］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに導入する工程、
　前記アフィニティークロマトグラフィー用カラムからの溶出に基づいて標的核酸を検出又は同定する工程
を含む方法。
［１５］前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の一の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、［１４］に記載の方法。
［１６］前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンド、及び標的核酸の第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、［１４］に記載の方法。
［１７］前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第1の担体と、標的核酸の第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第2の担体とを含む、［１４］に記載の方法。
［１８］第1の配列と第2の配列とが1～3塩基異なる配列を有する、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］［１］～［１１］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を含む、サンプル中の標的核酸を検出するためのキット。
　本発明により、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤及びカラムが提供される。本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤及びカラムは、人工核酸に基づくものであるため、核酸親和性及び保存安定性に優れている。そのため、かかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤及びカラムを使用することで、短時間かつ高感度に標的核酸を検出及び同定することが可能である。したがって、本発明は、核酸の検出及び同定、診断薬、分子生物学研究などの分野において有用である。
Fmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1）の化学構造を示す。 LNA12mer (GacAatGtaGct)-C6-SH（3）の化学構造を示す。 S-オリゴ12mer (GacAatGtaGct)-C3-SH（4）の化学構造を示す。 アフィニティーカラムにリガンドPNA（1）を固定するための合成スキームを示す。 アフィニティーカラムにリガンドPNA（2）を固定するための合成スキームを示す。 アフィニティーカラムにリガンドPNA（1）及びPNA（2）を固定するための合成スキームを示す。 アフィニティーカラムにリガンドLNA（3）を固定するための合成スキームを示す。 アフィニティーカラムにリガンドS-オリゴ（4）を固定するための合成スキームを示す。 アフィニティーカラムの評価方法の概要を示す。 アフィニティーカラムにリガンドを固定する形態のバリエーションの概念図を示す。 リガンドPNA（1）を用いたアフィニティーカラムの評価結果を示すグラフである。 リガンドPNA（2）を用いたアフィニティーカラムの評価結果を示すグラフである。 2種類のリガンドPNA（1）及びPNA（2）がそれぞれ固定されている2種類の担体を含むアフィニティーカラムの評価結果を示すグラフである。 2種類のリガンドPNA（1）及びPNA（2）が固定されている担体を含むアフィニティーカラムの評価結果を示すグラフである。 塩基ミスマッチを有するDNAに対するアフィニティーカラムの評価の概要及び結果を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2020年1月31日出願の特願2020-015458の優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に援用する。
　一態様において、本発明は、担体と、前記担体に固定された核酸リガンドとを備えたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤であって、
　前記核酸リガンドが、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（LNA）及びS-オリゴからなる群より選択される少なくとも1つの人工核酸を含み、
　前記核酸リガンドが、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介した結合により前記担体に固定されている、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。
　本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、標的核酸と結合するリガンドとして人工核酸を含む核酸が固定された担体を含むものである。人工核酸とは、核酸塩基・糖・リン酸ジエステル部に化学修飾を加えることで水素結合様式や高次構造さらには極性などの物性を変化させた核酸のことである。人工核酸の例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　LNA（Locked Nucleic Acid）とは核酸の糖部コンホメーションを完全にN型（RNA型）に固定した人工核酸である（下記構造において矢印部分が固定されていることによって完全なN型に固定される）。標的となる一本鎖DNA/RNAとはワトソン・クリック型水素結合を介して強固に二重鎖を形成する。糖部コンホメーションがあらかじめ固定されているためRNAとの二重鎖形成時のエントロピーの損失が大幅に少なくなると考えられる。これによりLNAはこれまでに類を見ないほど安定な二重鎖を形成することが可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　一般に人工核酸の二重鎖形成能は二重鎖の融解温度（Tm）を測定することで評価される。LNAと標的RNAからなる二重鎖のTm値を詳細に解析したところLNA修飾1か所当たり+4～+6度ものTm値の上昇が認められた（Obika S et al., Tetrahedron Lett, 39:5401-5404, 1998）。
　また天然のオリゴヌクレオチドに比べて高い酵素耐性能を有している。DNA/RNAハイブリッド二本鎖を形成しているRNAを切断し、一本鎖DNAを生じるリボヌクレアーゼであるRNaseH の活性について試験され、LNAが天然のヌクレオチドに比べて高い酵素耐性を有していることが報告されている（Wahlestedt et al., (2000) PNAS 97, 5633-5638）。また、LNAがギャップマーよりもミックスマーの方がより高い酵素耐性を示していることも知られている。別の人工核酸であるホスホロチオエートも同じような酵素耐性を示していることが分かった。ホスホロチオエート（S-オリゴヌクレオチド又はS-オリゴとも称する）とはヌクレオチド間の結合部位にあるすべてのリン酸基を硫黄化したオリゴDNAのことであり（下記構造）、前述の通り、ヌクレアーゼの耐性を有する（Wahlestedt et al., (2000) PNAS 97, 5633-5638）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　別の人工核酸はペプチド核酸（PNA）である。PNAは、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格が形成されている、核酸に類似した構造をもつ化合物である。PNAはDNAとの優れたハイブリダイゼーション親和性を有し、リン酸基による負電荷の反発がなく、塩濃度の影響を受けず、生物学的安定性及び熱耐性が良好であるなどの特性を有する。
　また別の人工核酸はモルフォリノオリゴヌクレオチドである。モルフォリノとは、核酸（RNA、DNA）のリボース又はデオキシリボースの代わりにモルフォリン環を有するオリゴヌクレオチドである。
　核酸リガンドは、少なくとも1つの人工核酸を含むものであり、全て人工核酸からなるものであってもよいし、一部に人工核酸を含むものであってもよい。一部に人工核酸を含む場合、例えば、数塩基（2塩基、3塩基、4塩基、5塩基など）おきに人工核酸を含んでもよいし、あるいは核酸リガンドの担体に固定化されている端とは反対の端の領域に人工核酸を含むようにしてもよい。
　核酸リガンドは、アフィニティークロマトグラフィーにおいて単離又は検出の対象となる標的核酸に対して適度なアフィニティーを有するものとする。好ましくは、核酸リガンドは、標的核酸に結合（ハイブリダイズ）する配列を有するもの、例えば、標的核酸の一の配列（標的配列）に対して相補的な配列を有するものである。なお、本明細書において「配列」とは、別に記載しない場合、塩基配列を意味する。
　一実施形態において、本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンド、及び第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む。
　別の実施形態において、本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第1の担体と、第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第2の担体とを含む。
　上記実施形態において、第1の配列及び第2の配列は、同じ標的核酸の異なる領域に対して相補的な配列を有するものであってもよいし、別の標的核酸の領域に対して相補的な配列を有するものであってもよい。具体的な実施形態において、第1の配列及び第2の配列は1～3塩基（例えば、1塩基）異なる配列を有する、すなわち、第1の配列及び第2の配列は、1～3塩基の多型（例えば、1塩基多型）を含む領域に対してそれぞれ相補的な配列を有する。
　「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合する核酸の塩基の対応を指し、アデニン（A）とチミン（U）又はウラシル（U）、グアニン（G）とシトシン（C）との対応である。本明細書では、完全な相補性だけではなく、ある配列に対して部分的な相補性を有することからその配列に結合することができる能力を保持している部分的な相補性も意味する。
　核酸リガンドの長さは、アフィニティークロマトグラフィーにおいて単離又は検出の対象となる標的核酸に対して適度なアフィニティーを有するように選択される。アフィニティーの保持と合成容易性などを考慮して、核酸リガンドの長さは、一般的に8～30マー、好ましくは10～25マー、より好ましくは10～23マーである。
　核酸リガンドの設計、すなわち全体の長さ、含まれる人工核酸の種類及び配置などの決定は、当業者であれば、標的核酸の種類及び長さ、目的、使用する溶出液の種類などを考慮して適当に行うことができる。また、核酸リガンドの調製も慣用的な方法により、例えば人工核酸を合成することができる合成装置を使用して、行うことができる。
　リガンドを固定する担体は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて慣用的に使用されている担体を使用することができ、用途、溶出液の種類、溶出量などに応じて、材質及び形態を適宜選択することができる。例えば、多孔質粒子、ゲル、樹脂磁気ビーズなどの形態の担体を使用することができる。加熱、溶出、洗浄などの処理に対して耐性であり、保存安定性に優れた担体を使用することが好ましい。
　担体へのリガンドの固定は、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介した結合により行うことができる。ペプチド結合を利用する場合は、担体の反応末端がカルボン酸になっているところにHATUなどのペプチド縮合剤により活性エステル体とした後でリガンド側の1級アミノ基を反応させることでペプチド結合を得ることが可能である。また、担体の反応末端が1級アミノ基になっている場合は、活性エステル体とした後でリガンド側のカルボン酸をあらかじめ活性エステル化しておいて反応させることでペプチド結合を得ることも可能である。ジスルフィド結合の場合は、担体とリガンドの両方の反応末端がそれぞれSH基になっているものを用いて、酸化反応を介して結合させることが可能である。
　リンカーを介して担体へリガンドを固定する場合、リンカーは、例えばヘテロクロスリンカー、エポキシ樹脂硬化剤、ホモクロスリンカーなどを使用することができる。ヘテロクロスリンカーとしては、例えば炭化水素母核の両側にN-ヒドロキシスクシンイミドエステルとマレイミドの両方を共有し、それぞれの活性基がアミノ基、スルフヒドリル基の架橋を行う試薬が利用可能であり、具体的にはSMCC（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）、EMCS（N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester）、LC-SMCC（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)）、SM(PEG)2（PEGylated SMCC crosslinker）、SIA（succinimidyl iodoacetate）、Sulfo-SANPAH（sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate）、MBS（3-Maleimidobenzoic Acid N-Succinimidyl Ester）などが挙げられる。エポキシ樹脂硬化剤もまたヘテロクロスリンカーと同様に、アミノ基又はスルフヒドリル基の架橋を行う試薬として利用可能であり、例えばjERキュア(登録商標)（三菱ケミカル）などが市販されている。ホモクロスリンカーとしては、例えば炭化水素鎖の両末端に同一のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル又はイミドエステル又はマレイミドを有し、アミノ基間又はスルフヒドリル基間の架橋を行う試薬が利用可能であり、具体的にはDSG（disuccinimidyl glutarate）、DMP（dimethyl pimelimidate）、BMOE（bismaleimidoethane）などが挙げられる。また別のホモクロスリンカーとして、炭化水素鎖以外にポリエチレングリコール鎖で構成され、アミノ基間又はスルフヒドリル基間の架橋を行う試薬も利用可能であり、具体的にはBS(PEG)5（PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate）、BM(PEG)3（1,11-bismaleimido-triethyleneglycol）などを使用することができる。
　好ましいリンカーの1つであるSMCCは、活性エステル基及びマレイミド基を有するクロスリンカーであり、例えば、担体に結合させたNH2基とSMCCの活性エステル基とを反応させ、リガンドに導入したSH基とSMCCのマレイミド基とを反応させることにより、担体にSMCCを介してリガンドを固定することができる。
　担体の表面には1つ以上のリンカーを固定することができる。1つのリンカーが固定された担体には、リガンドを1つ固定することができる。一方、担体の表面に複数のリンカーが固定される場合、その複数のリンカーの一部にリガンドが結合していてもよいし、複数のリンカーの全部にリガンドが結合していてもよい。複数のリンカーの一部にリガンドが結合している場合には、リガンドが結合していないリンカーにキャッピング剤を結合させることが好ましい。そのようなキャッピング剤としては、例えば1,4-ジアミノブタン（アミノ基）、H-Arg-NH2・2HCl（グアニジノ基）、5-アミノ吉草酸（カルボキシル基）、アミルアミン（メチル基）、4-フェニルブチルアミン（フェニル基）、及びFmoc-Lys-OH・HCl（アミノ基・カルボキシル基）などが挙げられる。また、担体の表面に複数のリンカーが固定される場合、1種類のリガンド（すなわち同じ配列を有するリガンド）が結合してもよいし、2種類以上のリガンド（すなわち異なる配列を有する複数のリガンド）が結合してもよい。
　化学反応の容易性、化学構造の安定性、溶解性の向上などを考慮して、核酸リガンド及び／又は担体にスペーサーを導入してもよい。例えば、C3、C6、C10などをスペーサーとして使用することができる。
　本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、リガンドへの人工核酸の導入により、優れた結合親和性で標的核酸と結合することができ、また塩濃度の影響を受けず、生物学的安定性（ヌクレアーゼ及びプロテアーゼに対する分解耐性）及び熱安定性に優れるものである。また、繰り返し使用することができ、低コストの利点がある。
　別の態様において、本発明は、上記のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに関する。アフィニティークロマトグラフィー用のカラムは、アフィニティークロマトグラフィーにおいて慣用的に使用されているものであれば特に限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィー用のカラムは様々な種類が市販されており、当業者であれば、用途、溶出液の種類、溶出量、使用する機器などに応じて、材質、形態及び容積を適宜選択することができる。
　本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用カラムは、加熱手段をさらに備えてもよい。加熱手段は、カラムと一体的に存在するものであってもよいし、カラムから取り外し可能なものであってもよい。また加熱手段は、カラムの全体を加熱するものであってもよいし、一部を加熱するものであってもよい。本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に使用される核酸リガンドは、加熱手段により加熱に対しても熱変性することなく使用することが可能である。
　さらなる態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸を検出又は同定する方法であって、
　サンプルを上記のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに導入する工程、
　前記アフィニティークロマトグラフィー用カラムからの溶出に基づいて標的核酸を検出又は同定する工程
を含む方法に関する。
　本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に使用される核酸リガンドは、標的核酸と結合することができる。この結合親和性を利用して、サンプルを充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに導入した場合、標的核酸は核酸リガンドに結合する一方、他の分子は素通りすることから、カラムからの溶出を調べることで、サンプル中の標的核酸を検出又は同定することができる。
　サンプルは、標的核酸について検出又は同定しようとするサンプルであれば特に限定されるものではない。例えば生体液サンプル（血液、血清、血漿、尿等）、組織又は細胞サンプル、環境サンプル（土壌、河川等）が挙げられる。血液サンプルの場合、採血後は氷冷又は冷蔵保存することが好ましい。また、血漿を使用する場合には、抗凝固剤としてEDTAを使用することが好ましいが、ヘパリン、クエン酸ナトリウムなど当該分野で公知又は汎用されているものを使用することができる。
　本発明において、「サンプル中の標的核酸の検出又は同定」とは、サンプル中に標的核酸が存在するか否かを決定すること、並びにサンプル中の標的核酸の量又は濃度を測定することを意味する。
　本発明に係る方法では、サンプルを本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに導入する。サンプルのカラムへの導入は、特に限定されるものではない。例えば、サンプルをそのまま又は適当な溶液若しくは緩衝液で希釈して、自然落下により又はシリンジを使用してカラムに導入することができる。
　続いて、アフィニティークロマトグラフィー用カラムからのサンプルの溶出を調べ、その溶出する画分に応じて標的核酸を検出又は同定する。サンプルの溶出は、例えば液体クロマトグラフィー/質量分析法（LC/MS）などの当技術分野で公知の方法又は装置を使用して調べることができる。カラムに固定されているリガンド核酸が有する配列と相補的な配列を有する標的核酸がサンプルに含まれる場合には、その標的核酸はリガンド核酸と結合して溶出が遅くなる。そのため、そのような溶出の特徴を基に標的核酸を検出又は同定することが可能である。また、リガンド核酸は、塩基ミスマッチを区別して結合する。例えば、リガンド核酸は、1～3塩基のミスマッチ、好ましくは1～2塩基のミスマッチ、特には1塩基ミスマッチを区別し得る。そのため、本発明に係る方法は、塩基ミスマッチを有する標的核酸の検出にも使用可能である。
　本発明に係る方法は、サンプルをカラムに導入する前又は導入した後に、サンプルを加熱する工程を含んでもよい。二本鎖核酸は核酸リガンドに結合することができないため、加熱により二本鎖核酸を熱変性させて一本鎖核酸の形態とすることが好ましい。加熱する温度は、二本鎖核酸の融解温度以上、例えば75～100℃とすることができる。
　他の態様において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を含む、サンプル中の標的核酸を検出するためのキットに関する。本発明に係るキットにより、サンプル中の標的核酸の検出又は同定を容易かつ簡便に行うことができる。本発明に係るキットは、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤以外にも標的核酸の検出に有用な他の成分、例えばアフィニティークロマトグラフィー用の溶出剤、対照、説明書などを含んでもよい。
　以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
［実施例１］アフィニティーカラム用担体及びカラムの準備
（１）アフィニティーカラム用担体
　アフィニティー担体には様々な製品が存在する。ChromSpeedTMCM103（三菱ケミカル）はメタクリル酸系の弱酸性陽イオン交換樹脂であり、抗生物質やアミノ酸の精製等に使用される。用途がバイオ医薬品精製である担体を使用することにより、精密であり純粋な目的物を得ることができるアフィニティーカラムを作製できるのではないかと考え、今回はChromSpeedTMCM103を用いることとした。
（２）アフィニティーカラム用カートリッジ
　アフィニティー担体を充填するカートリッジには、Sigma-Aldrich社の0.5 mL Empty PP Rev Tube Kitを用いた。これは、任意の充填剤を用いたSPEカートリッジの作製が可能なエンプティーカラムである。また、PNAが高価であるため、なるべくリガンド量を少なくした状態でカートリッジを作製することが課題として存在していたため、株式会社巴製作所のルアー型カートリッジ Type Mini (0.1 mL)も場合により使用した。
（３）アフィニティーカラム用担体へのPNA固定化方法
　合成したリガンドであるPNAは芳香環にNH2基を有しているため担体にリガンドを固定化させる際にペプチド結合は利用できない。そこで2つ以上の分子を共有結合により化学的に結合することのできる架橋剤を使用することとした。
［実施例２］アフィニティーカラム用PNA（リガンド）の合成
　図１に示す構造を有するアフィニティーカラム用PNAを合成した。架橋剤（リンカー）はスペーサー部分にシクロヘキサンを有し、活性エステル基及びマレイミド基を有するSMCCを使用した。マレイミド基はSH基と反応し、活性エステル基はNH2基と特異的に反応する。このSMCCの特徴を活用するためにSH基を有するFmoc-Cys（Mmt）-OHをリガンドに導入する構造にした。また、PNA12merとFmoc-Cys（Mmt）-OHの立体障害を回避するため、スペーサーとしてFmoc-Aund（11）-OH（C10）を導入する構造とした（図１）。PNA部分の塩基配列はGACAATGTAGCT（配列番号1）とした。
　Fmoc-PNA12mer-C10-Cysの合成は通常のFmoc固相合成法を用いた。合成には、Biotage社製全自動マイクロウェーブ合成装置Initiator+Alstraを使用した。担体はN-末端がFmoc基で保護されているFmoc-NH-SAL-PEG Resin（0.22 mmol/g）を使用した。PNAの縮合試薬は自動合成装置Initiator+Alstraで推奨されるN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）とエチルシアノグリオキシレート-2-オキシム（Oxyma）を使用し、PNAモノマー 5当量、DIC 5当量、Oxyma 5当量の割合で用いた。また、Fmoc-Cys(Mmt）-OHとFmoc-Aund(11)-OHの縮合試薬はO-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を使用し、Fmoc-Cys（Mmt）-OH 5当量、Fmoc-Aund(11)-OH 5当量、HATU 6.5当量、DIPEA 2.3当量の割合で用いた。これによりFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1）を得た。
［実施例３］PNA以外のアフィニティーカラム用人工核酸（リガンド）の設計
（１）LNA（3）の設計
　図２に示す構造を有するアフィニティーカラム用LNAを合成した。LNAは株式会社ジーンデザイン社から購入した。LNAの設計にあたって、ギャップマーと比較するとミックスマーである方がより強く酵素耐性を強く示していたので、12mer中で3塩基ごとにLNAを挿入する構造にした（配列GacAatGtaGct（配列番号3）において、大文字が挿入した箇所を示す）。また、固定化の際にPNAと同様の構造をとり、条件統一をとるために3’末端にスペーサー（C6）とチオールを修飾した。
（２）S-オリゴ（4）の設計
　図３に示す構造を有するアフィニティーカラム用S-オリゴを合成した。ホスホロチオエートを有するS-オリゴはユーロフィン株式会社から購入した。挿入条件を統一するためにLNA同様3塩基ごとにホスホロチオエートを挿入した（配列GacAatGtaGct（配列番号4）において、大文字が挿入した箇所を示す）。また、3’末端にスペーサー（C3）とチオールを修飾した。
［実施例４］アフィニティーカラムへのリガンドPNA（1）の固定化
　以下に説明するように、アフィニティーカラムChromSpeedTMCM103に実施例２で調製したPNA（1）を固定化した。
（１）使用試薬
・ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)
・11-[(9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ]ウンデカン酸 (Fmoc-Aund（11）-OH)・N,N’-ジメチルホルムアミド (DMF)
・ジクロロメタン (DCM)
・N-メチルピロリドン (NMP)
・O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート (HATU)
・20% ピペリジン/NMP
・N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)
・6-[(9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ]ヘキサン酸(Fmoc-Acp(6)-OH)
・ChromSpeedTMCM103
・ヘキサメチレンジアミン (1,6-ジアミノヘキサン)
・4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸N-スクシンイミジルエステル (SMCC)
・L-システイン
（２）合成スキーム
　合成スキームを図４に示す。ChromSpeedTMCM103へのPNA（1）の固定化はEYELA製パーソナル有機合成機（CCS-600）を使用した。Fmoc定量法を用いてChromSpeedTMCM103の単位容積当たりの反応可能なカルボン酸量を確認するため、まずFmoc-Acp(6)-OHを導入した。
　ChromSpeedTMCM103（5, 約0.08 meq/ml）へのPNA固定化の前準備として、MeOHに浸っている5（2 mL）をDMFで置換し乾燥した。DSC（0.313 g, 1.2 mmol）をDMF（2 mL）に溶解した後でDIPEA（195μL, 1.2 mmol）を加えた反応液を、5に加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液を除去し、再度同濃度のDSC反応液による活性化の操作を行った。反応終了後、反応液を除去し、DMF（2 mL）で洗浄し6を得た。
　次に1,6-ジアミノヘキサン（0.929 g, 8 mmol）をNMP（1 mL）、DMF（1 mL）により懸濁したあと、6に加え室温で終夜攪拌した。反応終了後で反応液を除去しDMF（2 mL）で1回、MeOH（2 mL）で5回洗浄し7を得た。
　次にFmoc-Acp(6)-OH（0.141 g, 0.4 mmol）、HATU（0.1977 g, 0.52 mmol）、DIPEA（90μL, 0.52 mmol）をNMP（1.5 mL）に溶解し7へ加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液を除去し、再度同濃度のFmoc-Acp(6)-OH反応液による縮合反応を室温で30分間行った。ニンヒドリン試験で陰性であることを確認した後で反応液を除去し、DMF（2 mL）で2回、DCM（2 mL）で2回、MeOH（2 mL）で2回洗浄し8を得た。
　次に吸光光度計にてFmoc定量をし、Fmoc-Acp(6)-OHの導入量を算出した。よく乾燥させた固相担体（5～10 mg）に20%ピペリジン/DMF（400μL）を加え室温で30分間攪拌した溶液をDMFで50倍に希釈した溶液をサンプルとし、その301 nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数ε（301 nm）を7800 M-1cm-1としてFmoc基の量を算出したところ、今回のFmoc-Acp(6)-OHの導入量は0.20838 mmol/gであった。
　20%ピペリジン/DMFで脱Fmoc反応を行い、9を得た。
　次にSMCC（17.1 mg, 0.051 mmol）をDMF（3 mL）に溶解し9（48.9 mg）へ加え室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液を除去しDMF（2 mL）で洗浄し、過剰なSulfo-SMCCを除去した。その後、DMFでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（280 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、10を得た。
　次にリガンドであるFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1, 1.94 mg, 0.51μmol）をDMF （500μL）, HFIP（100μL）で溶解し10に加え、室温で終夜攪拌をした。反応終了後、反応液を除去しDMF（2 mL）で洗浄し、過剰なFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1）を除去した。その後、DMFでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（260 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、11を得た。吸光光度計にてFmoc定量したところ、10へのFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1）の導入量は0.01532 mmol/gであった。
　次に、未反応のSMCCを失活させる目的でキャッピング反応を行った。L-システイン（61.8 mg, 0.51 mmol）をNMP（10 mL）に溶解し11に加え、室温で3時間攪拌をした。反応終了後、反応液を除去し、DMF（5 ml）で洗浄し、過剰なL-システインを除去した。
　最後に20%ピペリジン/DMFを加えて5分間撹拌してFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1）のFmoc基を除去し12を得た。
［実施例５］アフィニティーカラムへのリガンドPNA（2）の固定化
　以下に説明するように、アフィニティーカラムChromSpeedTMCM103にPNA（2）を固定化した。
　実施例２と同様の手順で、PNA（1）の塩基配列GACAATGTAGCT（配列番号1）の代わりに塩基配列GAAACCCAGCAG（配列番号2）を有するPNA（2）を合成した。
　ChromSpeedTMCM103へのPNA（2）の固定化は、実施例４のPNA（1）の固定化と同様にEYELA製パーソナル有機合成機を使用して実施した（図５）。即ち、10の合成までは実施例４と同じように実施し、リガンドはFMOC-PNA12MER-C10-Cys-NH2（2）に変更した。
　リガンドであるFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（2, 1.93 mg, 0.51μmol）をDMF（600μL）, HFIP（200μL）で溶解し10に加え、室温で終夜攪拌をした。反応終了後、反応液を除去しDMF（2 mL）で洗浄し、過剰なFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（2）を除去した。その後、DMFでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（260 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、13を得た。吸光光度計にてFmoc定量したところ、10へのFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（2）の導入量は0.0113 mmol/gであった。
　次に、未反応のSMCCを失活させる目的でキャッピング反応を行った。L-システイン（6.18 mg, 0.051 mmol）をNMP（10 mL）に溶解し13に加え、室温で3時間攪拌をした。反応終了後、反応液を除去し、DMF（5 ml）で洗浄し、過剰なL-システインを除去した。
　最後に20%ピペリジン/DMFを加えて5分間撹拌してFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（2）のFmoc基を除去し14を得た。
［実施例６］アフィニティーカラムへのリガンドPNA（1）及びPNA（2）の固定化
　以下に説明するように、アフィニティーカラムChromSpeedTMCM103にPNA（1）とPNA（2）の混合物（1:1）を固定化した。
　ChromSpeedTMCM103へのPNA（1）とPNA（2）の混合物（1:1）の固定化は、実施例４のPNA（1）の固定化と同様にEYELA製パーソナル有機合成機を使用して実施した（図６）。即ち、10の合成までは実施例４と同じように実施し、リガンドはFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1 and 2）混合物に変更した。
　リガンドである各Fmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1, 1.62 mg, 0.85μmol：2, 1.61 mg, 0.85μmol）を混合しDMF（600μL）, HFIP（200μL）で溶解し10に加え、室温で終夜攪拌をした。反応終了後、反応液を除去しDMF（2 mL）で洗浄し、過剰なFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2を除去した。その後、DMFでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（260 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、15を得た。
　次に、未反応のSMCCを失活させる目的でキャッピング反応を行った。L-システイン（10.4 mg, 0.085 mmol）をNMP（10 mL）に溶解し15に加え、室温で3時間攪拌をした。反応終了後、反応液を除去し、DMF（5 ml）で洗浄し、過剰なL-システインを除去した。
　最後に20%ピペリジン/DMFを加えて5分間撹拌してFmoc-PNA12mer-C10-Cys-NH2（1 and 2）のFmoc基を除去し16を得た。
［実施例７］アフィニティーカラムへのリガンドLNA（3）の固定化
　以下に説明するように、アフィニティーカラムChromSpeedTMCM103にLNA（3）を固定化した。
　ChromSpeedTMCM103へのLNA（3）の固定化は実施例４のPNA（1）の固定化と同様にして実施した（図７）。即ち、10の合成までは前述の通りに実施し、リガンドはLNA 12mer L(GacAatGtaGct：配列番号3)-C6-SH（3）に変更した。
　LNA（3）をDMSO、TEバッファーにて溶解し、10に加え室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を徐去しDMSO（2 mL）で洗浄し、過剰なLNA（3）を除去した。その後、DMSOでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（260 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、17を得た。分光光度計にて、洗浄液の各フラクション（1 ml）の吸光度（260 nm）を測定し、LNA（3）が完全に消失するまで洗浄を繰り返した。
　次に、未反応のSMCCを失活させる目的でキャッピング反応を行った。Fmoc-L-システインをDMSOにて溶解し、17に加えて室温で10分攪拌した（(i)の反応）。反応終了後、反応液を除去し、DMSOの洗浄を2回、DCMでの洗浄を2回行い、18を得た。なお、最後に、20%ピペリジン/NMPを加えて5分間撹拌してLNA（3）のFmoc基を除去してもよい（(ii)の反応）。
　次に、分光光度計にてFmoc定量を実施したところ、LNA（3）の導入量は0.01474 mmol/gであった。
［実施例８］アフィニティーカラムへのリガンドS-オリゴ（4）の固定化
　以下に説明するように、アフィニティーカラムChromSpeedTMCM103にS-オリゴ（4）を固定化した。
　ChromSpeedTMCM103へのS-オリゴ（4）の固定化は実施例４のPNA（1）の固定化と同様にして実施した（図８）。即ち、11の合成までは前述の通りに実施し、リガンドはS-オリゴ12mer H-(GacAatGtaGct：配列番号4)-C3-SH（4）に変更した。
　S-オリゴ（4）をDMSO、TEバッファーにて溶解し、10に加え室温で終夜攪拌した。反応終了後、反応液を徐去しDMSO（2 mL）で洗浄し、過剰なS-オリゴ（4）を除去した。その後、DMSOでの洗浄を繰り返し1 mLごとの吸光度（260 nm）を測定し、吸光度が完全になくなるまで洗浄を続け、19を得た。分光光度計にて、洗浄液の各フラクション（1 ml）の吸光度（260 nm）を測定し、S-オリゴ（4）が完全に消失するまで洗浄を繰り返した。
　次に、未反応のSMCCを失活させる目的でキャッピング反応を行った。Fmoc-L-システインをDMSOにて溶解し、19に加えて室温で10分攪拌した（(i)の反応）。反応終了後、反応液を除去し、DMFでの洗浄を15回行い、過剰なL-システインを除去し20を得た。なお、最後に、20%ピペリジン/NMPを加えて5分間撹拌してS-オリゴ（4）のFmoc基を除去してもよい（(ii)の反応）。
　次に、分光光度計にてFmoc定量を実施したところ、S-オリゴ（4）の導入量は0.00618 mmol/gであった。
［実施例９］DNAオリゴの調製
　捕捉対象のターゲット一本鎖DNA配列を表１に示す。これらはユーロフィンジェノミクス株式会社から購入したスタンダードオリゴを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記オリゴは乾燥品であるためモル収量を参考に濃度調整をして使用した。調整後はすべて冷蔵庫で保存した。
・A：TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA）150μLを加え100 pmol/μLに調製した。
・B：TE溶液200μLを加え100 pmol/μLに調製した。
・C：TE溶液150μLを加え100 pmol/μLに調製した。
・D：TE溶液150μLを加え100 pmol/μLに調製した。
・E：TE溶液 381μLを加え100 pmol/μLに調製した。
・AB：A（25μL）、B（25μL）を混合し熱水にて5分加熱後、徐々に温度を下げ冷却させ50 pmol/μLの二重鎖DNAを作製した。
・AB-C：AB（1μL）、C（9μL）を混合し作製した。
・AB-D：AB（1μL）、D（9μL）を混合し作製した。
・それぞれをさらに50倍、1000倍希釈し、2 pmol/μL及び100 fmol/μLに調整した。
［実施例１０］アフィニティーカラム評価実験－１
（１）基本手順
・カラムの洗浄方法と初期化
　ディスポーザブルシリンジ（10 mL）を使い、カートリッジ上部から蒸留水を10 mL流し、カートリッジ内のDMSOを除去した。次いで、カートリッジ上部に存在するDMSOを完全に除去するために、カートリッジを上下反転させ同様の洗浄を行った。その後、UV 260nmにおいてDMSOに由来する吸光が存在しないことを確認したうえで、1xSSCを12 mL流し、カートリッジを初期化した。
・サンプルのアプライ
　ピペットマン（2μL用）を用いて、カートリッジ上部から100 fmol/μlの濃度に調整したサンプルを2μl注入し、自然落下でカートリッジにサンプルを浸み込ませた。この時、サンプル100 fmol/μl（2μl）をNanodrop3300にて測定して、そのRFU値を100％とし、それぞれフラクションから得られたRFU値の累積値を百分率で求めた。
・フラクションの回収方法
　1xSSCを移動相として使用し、自然落下で得られたものを200μlずつ回収した。
・回収したDNAの確認方法
　それぞれのフラクション（画分）はNanodrop3300にて測定して、そのRFU値を求めた。それぞれフラクションから得られたRFU値の累積値を計算した。横軸をフラクション番号、縦軸をDNA回収率（%）としてプロットし、DNAの溶出状況を可視化した。
（２）一本鎖DNAの保持の確認
　作製したアフィニティーカラムに一本鎖DNAが保持されるか否かを確認するため、図９に示すようにアフィニティーカラム評価実験を行った。まず、目的物である二本鎖DNAの末端に蛍光色素TAMRA（TMR）を結合させておき、除去したい一本鎖DNAの末端に蛍光色素FAMを結合させた。具体的には、実施例９において調製したオリゴCを一本鎖DNAサンプル（SSDNA）として使用し、オリゴABを二本鎖DNAサンプル（DSDNA）として使用し、オリゴAB-Cを一本鎖DNA及び二本鎖DNAの混合サンプル（SSDNA, DSDNA）として使用した。使用したアフィニティーカラムは、図１０の（a）に示すように、リガンドとして実施例４で調製したPNA（1）が固定されている担体を含むものとした。
　上記（１）の手順にしたがってサンプルをアフィニティーカラムにアプライし、それぞれの画分を回収し、RFU値を求めた。サンプルをカートリッジに通す前の蛍光色素それぞれの波長のRFU値と、カートリッジを通した後のろ液のそれぞれのRFU値を蛍光光度計を使用し比較した。
　結果を図１１に示す。一本鎖DNAは画分10以降に出現し（図１１のA及びC）、二本鎖DNAは画分1～4で100％回収された（図１１のB及びC）。この結果から、リガンドとしてのPNAは、相補鎖配列を有する一本鎖DNAを認識し、アフィニティーカラム内に保持する一方、二本鎖DNAは相補鎖配列を有していてもPNAには認識されないことがわかった。
［実施例１１］アフィニティーカラム評価実験－２
　異なる配列を有するPNAをリガンドとして含むアフィニティーカラムを評価した。具体的には、図１０の（b）に示すように、リガンドとして実施例５で調製したPNA（2）が固定されている担体を含むアフィニティーカラムを使用して、実施例１０と同様の手順で、サンプルをアフィニティーカラムにアプライし、それぞれの画分を回収し、RFU値を求めた。
　結果を図１２に示す。一本鎖DNAは画分8以降に出現し（図１２のA及びC）、二本鎖DNAは画分1～3で回収された（図１２のB及びC）。この結果から、実施例１０と同様に、リガンドとしてのPNAは、相補鎖配列を有する一本鎖DNAを認識し、アフィニティーカラム内に保持する一方、二本鎖DNAは相補鎖配列を有していてもPNAには認識されないことがわかった。
［実施例１２］アフィニティーカラム評価実験－３
　2種類の担体を含むアフィニティーカラムを評価した。具体的には、図１０の（c）に示すように、リガンドとして実施例４で調製したPNA（1）が固定されている担体と実施例５で調製したPNA（2）が固定されている担体を含むアフィニティーカラムを使用して、実施例１０と同様の手順で、サンプルをアフィニティーカラムにアプライし、それぞれの画分を回収し、RFU値を求めた。なお、PNA（1）とPNA（2）は、ターゲットDNAのそれぞれ別の配列に対して相補的な配列を有するものである。
　結果を図１３に示す。一本鎖DNAは画分12以降に出現し（図１３のA及びC）、二本鎖DNAは主に画分1～3で回収された（図１３のB及びC）。この結果を、実施例１０及び１１（図１１及び１２）と比較すると、2種類のリガンドをそれぞれ固定した2種類の担体を含むアフィニティーカラムは、1種類のリガンドを使用した場合よりも良好な分離能で一本鎖DNAと二本鎖DNAを分離することができることがわかった。
［実施例１３］アフィニティーカラム評価実験－４
　2種類のリガンドを含むアフィニティーカラムを評価した。具体的には、図１０の（d）に示すように、リガンドとして実施例４で調製したPNA（1）と実施例５で調製したPNA（2）が固定されている担体を含むアフィニティーカラムを使用して、実施例１０と同様の手順で、サンプルをアフィニティーカラムにアプライし、それぞれの画分を回収し、RFU値を求めた。なお、PNA（1）とPNA（2）は、ターゲットDNAのそれぞれ別の配列に対して相補的な配列を有するものである。
　結果を図１４に示す。一本鎖DNAは画分13以降に出現し（図１４のA及びC）、二本鎖DNAは主に画分1～4で回収された（図１４のB及びC）。この結果を、実施例１０及び１１（図１１及び１２）と比較すると、2種類のリガンドを固定した担体を含むアフィニティーカラムは、1種類のリガンドを使用した場合よりも良好な分離能で一本鎖DNAと二本鎖DNAを分離することができることがわかった。
［実施例１４］アフィニティーカラム評価実験－５
　作製したアフィニティーカラムが塩基ミスマッチを識別するか否かを確認するため、以下のアフィニティーカラム評価実験を行った。
　実施例９において調製したオリゴDを一本鎖DNAサンプル（SSDNA）として使用した。このオリゴDは、実施例１０で評価を行ったオリゴCとは3塩基異なるものであり、図１５のAに示すように、PNA（1）は、その塩基ミスマッチを含む領域に対して相補的な配列を有するものである。リガンドとして実施例４で調製したPNA（1）が固定されている担体を含むアフィニティーカラムを使用して、実施例１０と同様の手順で、サンプルをアフィニティーカラムにアプライし、それぞれの画分を回収し、RFU値を求めた。その結果を図１５のBに示す。
　図１５のBでは、サンプルは複数の画分で溶出し、一本鎖DNAを分離できなかった。図１２のA及び図１５のBの結果から、リガンドとしてのPNAは、塩基ミスマッチを認識して一本鎖DNAに結合し、分離できることがわかる。
［実施例１５］リガンドのアフィニティー能をより良く向上させることが可能なキャッピング剤の選定
　担体上のリガンドが固定化された以外の箇所をキャッピングすることが可能である。数種類のキャッピング剤を用いて固定相を作製し、アフィニティーカラムで精製を行う際に与える影響について比較した。
　キャッピング剤が有する官能基として、アミノ基・カルボキシル基・メチル基・グアニジノ基・フェニル基の5種類を候補とし、これに加えアミノ基とカルボキシル基を1つずつ有するキャッピング剤の計6種類の比較を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、正電荷を持つ1,4-ジアミノブタン (アミノ基)とH-Arg-NH2・2HCl (グアニジノ基)をコーティング剤に用いたカラムが最も一本鎖DNAの保持能力が高く、負電荷を持つ5-アミノ吉草酸 (カルボキシル基)、電荷を持たないアミルアミン (メチル基)と4-フェニルブチルアミン(フェニル基)、電荷が±0となるFmoc-Lys-OH・HCl (アミノ基・カルボキシル基)の順で一本鎖DNAの保持能力が低くなっていることがわかった。
　そのため、一本鎖DNAの単離又は検出の際には、担体のリガンド固定領域以外の箇所を上記のようなコーティング剤を使用してコーティングすることが好ましいことがわかった。

Claims (19)

  1. 　担体と、前記担体に固定された核酸リガンドとを備えたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤であって、
    　前記核酸リガンドが、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（LNA）及びS-オリゴからなる群より選択される少なくとも1つの人工核酸を含み、
    　前記核酸リガンドが、ペプチド結合、ジスルフィド結合又はリンカーを介した結合により前記担体に固定されている、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  2. 　前記核酸リガンドがPNAを含む、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  3. 　前記核酸リガンドが8～30マーである、請求項１又は２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  4. 　第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンド、及び第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  5. 　第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第1の担体と、第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第2の担体とを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  6. 　第1の配列と第2の配列とが標的核酸の異なる領域に対して相補的な配列を有する、請求項４又は５に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  7. 　第1の配列と第2の配列とが1～3塩基異なる配列を有する、請求項４又は５に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  8. 　前記リンカーが、SMCC、EMCS、LC-SMCC、SM(PEG)2、SIA、Sulfo-SANPAH、MBS、及びエポキシ樹脂硬化剤からなる群より選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  9. 　前記担体の表面に複数のリンカーが固定され、
    　前記複数のリンカーのうち一部に前記核酸リガンドが結合している、請求項１～８のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  10. 　前記複数のリンカーのうち前記核酸リガンドが結合していないリンカーにキャッピング剤が結合している、請求項９に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  11. 　前記担体が、樹脂、多孔質粒子、ゲル、及び磁気ビーズからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラム。
  13. 　加熱手段を備える、請求項１２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カラム。
  14. 　サンプル中の標的核酸を検出又は同定する方法であって、
    　サンプルを請求項１～１１のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムに導入する工程、
    　前記アフィニティークロマトグラフィー用カラムからの溶出に基づいて標的核酸を検出又は同定する工程
    を含む方法。
  15. 　前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の一の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンド、及び標的核酸の第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された担体を含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 　前記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が、標的核酸の第1の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第1の担体と、標的核酸の第2の配列に対して相補的な配列を有する核酸リガンドが固定された第2の担体とを含む、請求項１４に記載の方法。
  18. 　第1の配列と第2の配列とが1～3塩基異なる配列を有する、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を含む、サンプル中の標的核酸を検出するためのキット。
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