DK148617B

DK148617B - Materiale med kationisk karakter, der paa reversibel eller irreversibel maade kan binde biologiske makromolekylaere stoffer og lavmolekylaere stoffer, og fremgangsmaade til dets fremstilling

Info

Publication number: DK148617B
Application number: DK340276AA
Authority: DK
Inventors: Jean-Louis Tayot; Michel Tardy
Original assignee: Merieux Inst
Priority date: 1975-07-29
Filing date: 1976-07-28
Publication date: 1985-08-19
Also published as: ES450832A1; CA1088007A; NL7608388A; NO762631L; NL176144B; NO148250B; BR7604920A; DE2633246A1; AU1632676A; US4673734A; SE7608510L; YU39773B; GB1544867A; BE844657A; JPS5256087A; CH617863A5; JPS608865B2; YU183476A; DK148617C; FR2319399A1

Description

148617

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt materiale med kationisk karakter, der på reversibel eller irreversibel måde kan binde biologiske makromolekylære stoffer og lavmolekylære stoffer, og en fremgangsmåde til dets fremstilling.

Vandopløselige aminerede polysaccharidpolymere, der eventuelt er tværbundne med f.eks. epichlorhydrin eller butandiolbis-epoxypropylether og dermed gjort vanduopløselige, er kendte kat-ioniske materialer, der især anvendes ved separationsprocesser, jf. US patentskrift nr. 3.227.025 og CH patentskrift nr. 515.064.

2 148617 Sådanne materialer har imidlertid i sig selv utilstrækkelige mekaniske egenskaber.

Det er derfor blevet foreslået at understøtte sådanne kationiske materialer med bærematerialer for at forbedre de mekaniske egenskaber. Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2.433.409 er dét kendt at binde et kationisk materiale kemisk til et porøst uorganisk oxid via f.eks. en silanforbindelse, og fra GB patentskrift nr. 1.043.616 er det kendt at binde kationiske materialer direkte ved en svagere fysisk binding til forskelligartede, til dels uporøse materialer, såsom diatoméjord, perlit, trækul, sand, asbest, cellulosepulp, fullers’ jord eller blandinger deraf. Sådanne materialer har ikke særlig veldefinerede mekaniske egenskaber.

Det har nu ifølge den foreliggende opfindelse vist sig, at der fås materialer, der både har en udmærket kemisk aktivitet og en stor mekanisk styrke, når vandopløselige aminerede poly-saccharidpolymere påføres direkte på et porøst uorganisk oxid, som opfylder særlige krav med hensyn til indre overfladeareal og gennemsnitlig porediameter.

Den foreliggende opfindelse angår således et materiale med kationisk karakter,, der på reversibel eller irreversibel måde kan binde biologiske makromolekylære stoffer og lavmolekylære stoffer, hvilket materiale er ejendommeligt ved, at det i det væsentlige består af et porøst uorganisk oxid, der direkte på overfladen er beklædt med en vandopløselig amineret polysaccha-ridpolymer, der eventuelt under eller efter påføringen på oxi- det er tværbundet, hvor det porøse uorganiske oxid har en indre 2 overflade på mindre end eller lig med 100 m /g og en gennemsnitlig porediameter på over eller lig med 25 nm.

Ved forskellige undersøgelser er det vist, at denne type materiale både har gode mekaniske, fysiske, kemiske og biologiske egenskaber af det porøse uorganiske oxid og en hidtil ukendt kemisk overflade, der er særlig egnet til chromatografisk separation af biologiske makromolekylære stoffer.

3 148617

Ifølge opfindelsen kan det porøse uorganiske oxid være siliciumdioxid, aluminiumoxid, magnesiumoxid, titandioxid eller disses syntetiske eller naturlige derivater, såsom glas, sili-cater, kaolin osv.

Den aminerede polysaccharidpolymer er fastgjort til det porøse uorganiske oxid ved adhæsion, idet denne mekanisme ikke udelukkende synes at være af elektrostatisk type, da porøse oxider, såsom aluminiumoxid, hvis overflade ikke er negativ, ligeledes kan beklædes med amineret polysaccharidpolymer og fører til materialer ifølge opfindelsen med udmærkede egenskaber.

Det følger heraf, at beklædningen af amineret polysaccharidpolymer er fastgjort praktisk talt irreversibelt til oxidet. Imidlertid er det under visse betingelser, der beskrives i det følgende, muligt efter en vis anvendelsesperiode at regenerere det porøse uorganiske oxid, der derefter kan anvendes på ny til en ny imprægnering med en amineret polysaccharidpolymer.

Det porøse uorganiske oxid skal som nævnt have en veldefineret kontrolleret porøsitet. Oxidets indre overflade skal væ- 2 re mindre end eller lig med 100 m /gram og om muligt mellem 5 og 2 80 m /gram. Den gennemsnitlige porediameter skal være over eller lig med 25 nm og om muligt mellem 50 og 1000 nm, idet det kan være tilrådeligt at anvende mere præcise intervaller alt efter den tilsigtede anvendelsestype. Ved større overflader eller mindre porediametre bliver oxidets indre overflade utilgængelig for den aminerede polysaccharidpolymer og til slut også for de makromole-kylære stoffer, der skal separeres. Det porøse uorganiske oxid er fortrinsvis siliciumdioxid eller aluminiumoxid og fortrinsvis porøst siliciumdioxid med anionisk karakter, der er fremstillet ved f.eks. fremgangsmåden, der er beskrevet i fransk patentskrift nr. 1.473.239, 1.473.240, 1.475.929 og 1.482.867. Der kan f.eks. anvendes porøst siliciumdioxid, der forhandles af RHONE-POULENC CHIMIE FINE under navnene "SPHEROSILS XOB 030, XOB 015 og XOC 005", idet disse siliciumdioxidsorter har overflader på henholdsvis 50, 2 25 og 10 m /gram.

Den aminerede polysaccharidpolymer, der tjener til imprægnering og dækning af den indre overflade af det porøse uorganiske 4 148617 oxid, bør have en udtalt kationisk karakter og gode hydrofile 4 egenskaber. Den bør have en molekylvægt på mindst 10 og om

C C

-7 muligt mellem 10 og 10 . Den kan have en hvilken som helst opbyg ning og kan især være et amineret derivat af dextran, stivelse, cellulose, agarose eller en naturlig eller syntetisk polymer blandt alle de kendte oser, naturligvis med det forbehold, at den ikke indeholder anioniske grupper, såsom carboxyl- eller sulfongrupper, i nævneværdige mængder, således at polymeren får betydelige negative elek-triske ladninger, der dannes under anvendelsen af materialet som ionbytter.

Polysaccharidpolymerens aminfunktioner kan være primære, sekundære eller tertiære eller eventuelt kvaternære. Imidlertid foretrækkes sekundære, tertiære og kvaternære funktioner.

Ifølge en foretrukken udførelsesform har den aminerede poly-saccharidpolymer følgende formel:

R (CH-)n - N

hvori - R betyder en dextran-, stivelses-, cellulose- eller agaroserest, n betyder et helt tal på 1-10 og fortrinsvis 2-5, og 1 2 R og R , der kan være ens eller forskellige,betyder følgende grupper: - CH3, -CH2 - CH3, -CH2OH, - CH2 - CH20H eller - CH2 - CHOH - CH-j, idet denne polysaccharidpolymer kan være kvaterniseret ved hjælp af et kvaterniseringsmiddel valgt blande alkyl- eller hydroxyal- kylhalogenider, især -iodider og -bromider eller dimethylsulfat.

Blandt forbindelserne af denne type kan der især nævnes forbindelserne, der er kendt under navnene "DEAE DEXTRAN·' (diethylami-noethyldextran) med en molekylvægt på 500.000 og "QAE DEXTRAN" (kvatérneret diethylaminoethyldextran), der forhandles af firmaet PHARMACIA, og forbindelsen, der er kendt under betegnelsen "DEAE" stivelse (diethylaminoethyistivelse) samt kationiske stivelsessorter, såsom de, dér sælges under handelsnavnet "CATO" af firmaet ROQUETTE NATIONAL.

5 148617

Ifølge en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen kan den aminerede polysaccharidpolymer være tværbundet ved hjælp af et tværbindingsmiddel valgt blandt 1,4-butandioldigly-cidylether, epichlorhydrin, epibromhydrin eller et diepoxid med formlen R1 CH2 - Cl! - R1 - N - r3 - CH - CH, <o' No/ 2 hvori R1 betyder en alkylgruppe med 1-20 carbonatomer, fortrins- 2 3 vis en lavere alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, og R og R betyder en carbonhydridkæde med 1-10 carbonatomer, fortrinsvis en lavere alkylengruppe, f.eks. diepoxidet med formlen CEL· I 3 <™2>3 CH, - CH - CH, - N - CH, - CH - CHn X / 2 2 \ / 2 X θ' N0/

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af materialet med kationisk karakter ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det porøse uorganiske oxid imprægneres ved stuetemperatur eller ved opvarmning med en vandig opløsning af amineret polysaccharidpolymer ved en pH-værdi mellem 3 og 12, at det således beklædte uorganiske oxid eventuelt tørres i en ovn ved en temperatur i området ca. 40-120°C, og at den aminerede polysaccharidpolymer eventuelt tværbindes med en opløsning af et tværbindingsmiddel.

Imprægneringen kan gennemføres på to forskellige måder.

Ifølge den første metode anbringes det porøse uorganiske oxid i en chromatograferingssøjle ved direkte udhældning af det tørre homogene pulver. Derefter vaskes og homogeniseres der for at fjerne luftbobler, idet der gennemledes en syreopløsning, f.eks.

0,1 N saltsyre. Der gennemledes derefter en puffer med en pH-værdi på 3-12 (f.eks. en 0,05 M tris-puffer med en pH-værdi på 7) indtil ligevægt.

6 148617

Derefter tilsættes den aminerede polysaccharidpolymer i opløsning koldt eller varmt i den ovennævnte puffer eller i vand, der er. indstillet til samme pH-værdi. Overskuddet af amineret polysaccha-rid fjernes derefter ved eluering med den ovennævnte puffer og derefter med en opløsning af et salt, f*eks. trinatriumcitrat. Fraværelsen i det sidste eluat af amineret polysaccharidpolymer kan fastslås ved elektrophorese på celluloseacetat og farvning af pladen med POnceau-rødt eller ved udfældning i nærværelse af polyacrylsyre.

Det således fremstillede materiale kan på reversibel måde binde. ca. 20-50 mg protein pr. gram understøtning.

Dette materiale udviser en stor stabilitet inden for et stort pH-værdiområde (ca. 3-12).

Ifølge den anden metode imprægneres det porøse uorganiske oxid koldt eller varmt efter vejning med en vandig opløsning af amineret polysaccharidpolymer ved en pH-værdi, der ligeledes er mellem 3 og 12.

. Det imprægnerede materiale tørres derefter eventuelt i en ovn ved en temperatur i området ca. 40-120°C, fortrinsvis ved 80°C, indtil konstant vægt.

Det ovntørrede pulver bliver derefter homogeniseret og sigtet, hvis det er nødvendigt for at fjerne eventuelle agglome-rater. 'Materialet, der er tørret i ovn, kan anvendes i én søjle efter forudgående vask med en 0,05 M pufferopløsning med en pH---- værdi på 4 eller en 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 6,8, og det kan på reversibel måde binde ca. 40-200 mg protein pr. gram understøtning.

Som det fremgår heraf, forøger denne tørring i ovn evnen til binding af proteiner betydeligt.

Tørringen i ovn gør det ligeledes muligt at fremstille et materiale, hvis beklædning af amineret polysaccharidpolymer er fastgjort på7 praktisk talt irreversibel måde.

Dette materiale kan således vaskes med 0,1 N saltsyre, med natriumhydroxidopløsning eller med 0,1 N ammoniakopløsning, uden at dette påvirker dets ionbytningsegenskaber, medens sådanne vaskninger af materiale, der blot er imprægneret i søjle, re- 7 148617 genererer det anvendte porøse uorganiske oxid. Hvis man ønsker at regenerere det porøse uorganiske oxid fra materialerne, der er fremstillet ved tørring i ovn, skal materialet behandles under meget mere drastiske betingelser, f.eks. med rygende salpetersyre .

Det er således ved tørring i ovn muligt at fremstille materialer ifølge opfindelsen til talrige anvendelser, uden at deres udmærkede ionbytningsegenskaber påvirkes.

Ifølge en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det efter imprægnering ved en af de ovenfor beskrevne metoder og efter tørring i ovn ved ca. 50-80°C for at opnå et homogent pulver muligt at behandle det fremstillede produkt med en opløsning af et tværbindingsmiddel i et flygtigt opløsningsmiddel, såsom ethylether. Som tværbindingsmiddel kan der anvendes et hvilket som helst af de tidligere nævnte. Der anvendes dog fortrinsvis 1,4-butandiolglycidylether eller epi-chlorhydrin.

I dette tilfælde omrøres produktet, der skal behandles, indtil fuldstændig afdampning af opløsningsmidlet, således at der opnås en ensartet imprægnering.

Der opvarmes derefter til en temperatur mellem 40 og 120°C, fortrinsvis nær 80°C, i ca. 15 timer. Efter eventuel sigtning anbringes materialet i tør tilstand i en søjle, vaskes med natriumhydroxidopløsning og derefter med en natriumchlorid-opløsning og bringes til slut i ligevægt med den ønskede chroma-tograferingspuffer.

Ved en tværbinding opnås der et materiale, der har udmærkede egenskaber og kan vaskes regelmæssigt med natriumhydroxidopløsning eller 0,1 N ammoniakopløsning eller 0,1 N saltsyre, uden at dette ændrer dets separationsegenskaber eller dets evne til reversibel binding af proteiner.

Kapaciteten af det således fremstillede materiale er mellem 40 og 200 mg protein pr. gram materiale. Ved overflader 2 af det anvendte porøse oxid mellem 10 og 80 m /gram er denne kapacitet næsten konstant.

8 148617

Ligesom ved materialerne, der er fremstillet ved imprægnering og tørring i ovn, er det ligeledes i dette tilfælde muligt at vaske materialet med koncentreret salpetersyre for at regenerere det porøse uorganiske oxid, der tjener som understøtning.

De ovenfor beskrevne hidtil ukendte materialer er anvendelige til rensning eller separation af biologiske makromole-kylære stoffer, især proteiner.

Herved udnyttes de kationiske egenskaber af materialet ifølge opfindelsen til selektivt at binde biologiske makromole-kylære stoffer, der ønskes isoleret eller renset, eller til selektiv tilbageholdelse af urenhederne eller andre uønskede proteiner.

Der kan let opnås en selektiv binding af proteiner ved at indstille pH-værdien og molariteten ifølge metoderne, der er velkendte ved anvendelsen af ionbyttere.

Materialet anvendes i store træk på den måde, at der over dette ledes en opløsning, der indeholder de biologiske ma-kromolekylære stoffer, der ønskes isoleret eller renset, idet pH-værdien og molariteten indstilles således, at det nævnte materiale selektivt enten binder de biologiske makromolekylære stoffer, der ønskes renset eller isoleret, eller de uønskede urenheder.

Hvis materialet binder de makromolekylære stoffer, der ønskes renset eller isoleret, elueres disse derefter med en opløsning med passende pH-værdi og molaritet.

Hvis materialet binder urenhederne, fås de biologiske ma-kromolekylære stoffer direkte i opløsning. Der elueres derefter med en opløsning med passende pH-værdi og molaritet for at fjerne urenhederne og således regererere materialet til en ny operation.

Som eksempler på anvendelser af materialet ifølge opfindelsen kan der nævnes følgende: 9 148617 a) Rensning af gammaglobuliner fra humant eller animalsk serum eller plasma, b) fjernelse af hæmoglobin ved rensning af albumin fra placentablod og koncentrering af de andre proteiner, c) koncentrering af en fortyndet opløsning af proteiner i alkoholisk medium og fjernelse af alkoholen, d) koncentrering og rensning af albumin i en opløsning af natriumcaprylat, e) koncentrering og rensning af gangliosider fra vandige ekstrakter af dyrehjerner.

Disse forskellige anvendelser af materialet ifølge opfindelsen beskrives nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler.

Materialet ifølge opfindelsen finder ligeledes anvendelse til rensning af antistoffer eller antigener. I dette tilfælde bindes antigenerne eller antistofferne til materialet ifølge opfindelsen, og det således modificerede materiale anvendes til rensning og koncentrering af de tilsvarende antistoffer og antigener.

Det er således muligt at binde:

Albumin, alfa-, beta- og gammaglubuliner af human eller animalsk oprindelse, ethvert bakterielt eller viralt antigen, forudsat at disse har negative elektriske ladninger ved en pH-værdi på 6,8. Dette er tilfældet for størstedelen af de kendte proteiner, polysaccharider og nucléinsyrer.

Der kan f.eks. ligeledes nævnes bakterietoxiner, tetanusana-toxin, antigen HB knyttet til hepatitis B, influenzavirus, rabies-

S

virus, herpesvirus, mæslingevirus, rubellavirus, adenovirus, papova-virus, arbovirus, rhinovirus, picornavirus, enterovirus, poxvirus, myxovirus, paranyxovirus, reovirus, coronavirus, eller nedbrydningsprodukter deraf samt deres forskellige antigener.

Ligesom materialerne ifølge opfindelsen kan binde antigener eller antistoffer, kan de også binde forskellige enzymer, hvilket fører til materialer med enzymatisk aktivitet. Som eksempler på enzymer kan nævnes: pepsin, trypsin, chrymotrypsin, plasmin, lac-ticodeshydrogenase, L-aminoacylase, invertase, glucose isomerase, amylglucosidase, glucose oxydase, catalase, lipase, urease.

ίο 148617

Disse bundne makromolekylære stoffer kan være bundet på irreversibel måde, hvis der til slut gennemføres en tværbinding ved hjælp af et tværbindingsmiddel såsom de, der er nævnt ovenfor.

Denne tværbinding gennemføres sædvanligvis ved stuetemperatur. Endelig kan materialerne ifølge opfindelsen ligeledes anvendes til binding af forbindelser med lav molekylvægt, såsom visse aminosyrer eller visse ligander, der indeholder aminfunktioner, alkoholer eller thioler i nærværelse af et koblingsmiddel, såsom glutaralde-hyd eller diepoxyforbindelser, såsom de, der er anført ovenfor.

Det er på denne måde muligt at binde f.eks. lysin, og det fremstillede materiale kan anvendes til rensning eller fjernelse af plasminogen eller plasmin, der er et blodprotein, der har en kraftig affinitet til lysin.

Det er ligeledes muligt at binde forskellige steroider og anvende således modificerede materialer til rensning af deres transportproteiner. Endelig er det muligt at binde forskellige cellereceptorer, f.eks. gangliosider, der i forvejen er desacetylerede for at frigøre deres mest reaktionsdygtige aminfunktioner og anvende disse materialer til fjernelse, neutralisering eller rensning af deres ligander.

Fremstillingen og anvendelsen af materialerne ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 10 g "Sphirosil XO C005" anbringes i en chromatograferings-søjle ved direkte udhældning af det tørre og homogene pulver, hvilket letter fremstillingen af søjlen. Der sættes derefter 100 ml 0,1 N saltsyre til søjlen ved hjælp af en peristaltisk pumpe, der giver en strøm på 500 ml/time, for at vaske og imprægnere søjlen og fjerne alle luftbobler (eluering i opadgående retning er at foretrække) . Der tilsættes derefter en puffer med en pH-værdi på 3-12 (f.eks. en 0,05 M tris-puffer med en pH-værdi på 7) indtil ligevægt, der kontrolleres ved måling af pH-værdien og den specifikke modstand af pufferen, når denne kommer ud fra søjlen. Der tilføres derefter med en hastighed på 100 ml/time ca. 150 ml af en 1%'s opløsning 11 148617 (eller 30 ml af en 5%’s opløsning) af "DEAE dextran" i den ovennævnte puffer eller i vand, der er indstillet til samme pH-værdi. Derefter elueres overskuddet af "DEAE dextran", der ikke er bundet til søjlen, med den ovennævnte puffer og derefter med 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 4 og med 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 8 i en mængde på 1000 ml/time. Til slut bringes søjlen i ligevægt med den ønskede chromatograferingspuffer. Fraværelsen af "DEAE Dextran" i det sidste eluat kan fastslås ved elek-trophorese på celluloseacetat og farvning af pladen med Ponceaurødt eller ved udfældning i nærværelse af polyacrylsyre. Den således imprægnerede understøtning er stabil inden for et stort pH-værdi-område (ca. 3-12), og da den indeholder en anionbytter, er den særlig egnet til rensning eller koncentrering af proteiner. I et passende puffersystem er den i stand til på reversibel måde at binde 20-50 mg protein pr. gram imprægneret understøtning.

I dette eksempel kan "DEAE Dextran" fordelagtigt erstattes med "QAE Dextran".

Eksempel 2 10 g "Sphérosil XO B 015" afvejes og imprægneres med 20 ml af en vandig opløsning af amineret polysaccharid (f.eks. "DEAE Dextran" ) med en koncentration mellem 1 og 10%, fortrinsvis mellem 5 og 8%, og med en pH-værdi, der ligeledes er mellem 3 og 12. Det hele tørres i en ovn ved mellem 50 og 120°C, fortrinsvis ved 80°C, i det nødvendige tidsrum (f.eks. 15 timer) indtil konstant vægt (fjernelse af vand). Det fremstillede pulver homogeniseres og sigtes om fornødent for at fjerne eventuelle agglomerater og anbringes derefter i en søjle.

Efter fyldning af søjlen og forudgående vask med puffer, 0,1 N saltsyre, eller 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 4 eller 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 6,8 eller 0,1 N natriumhydroxidopløsning bringes søjlen i ligevægt med en puffer, der er passende til den ønskede chromatograferingstype. Bindingskapaciteten for proteiner er denne gang højere, idet den er af størrelsesordenen 40-200 mg/gram afhængigt af chromatograferingsbetingel-serne.

148617 12 I dette eksempel kan "DEAE Dexfcran" fordelagtigt erstattes med en anden amineret polysaccharidpolymer, såsom "DEAE-stivelse".

Eksempel 3

Til 10 g "Sphérosil XOB 030", der ved en af de to ovenfor beskrevne metoder er imprægneret med en opløsning af amineret poly-saccharid med en pH-værdi mellem 8 og 13, fortrinsvis 11,5, og derefter er tørret i en ovn for at opnå et homogent pulver, sættes 20 ml af en 0,02-2%rs, fortrinsvis 0,15%'s, opløsning af 1,4-butandiol-diglycidylether i ethylether. Det hele omrøres kontinuerligt ved en temperatur på 40°C indtil fuldstændig afdampning af ethyletheren og for at opnå en ensartet imprægnering med denne diepoxyforbindelse, der tjener som tværbindingsmiddel.

Det hele opvarmes derefter til en temperatur mellem 40 og 120°C, fortrinsvis nær 80°C, i ca. 15 timer. Efter eventuel sigtning -til"slut anbringes understøtningen i tør tilstand i en søjle, vaskes med 1 liter 0,1 N natriumhydroxidopløsning og derefter med 1 liter 1 m natriumchloridopløsning og bringes til slut i ligevægt med chromatograferingspufferen.

Bindingskapaciteten for proteiner er mellem 40 og 200 mg/-gram understøtning afhængigt af chromatograferingsbetingelserne. Ved overflader af den anvendte porøse understøtning på 10-80 m /gram er denne kapacitet næsten konstant.

Eksempel 4

Direkte rensning af gammaglobuliner fra humant eller animalsk serum eller plasma.

Skema for en cyclus på 50 gram understøtning, der er fremstillet ifølge de foregående eksempler 1, 2 eller 3: Søjlen bringes i ligevægt ved en pH-værdi på f.eks. 6,8 (mellem 6,3 og 8) (0,01-0,02 M phosphatpuffer eller 0,05 M tris-salt- syre-puffer eller 1-3 gram natriumchlorid pr. liter) ved en strøm 2 på 200 ml/cm /time.

13 148617

Tilsætning af 50 ml plasma eller serum, der i forvejen er renset ved dialyse med chromatograferingspufferen som dialysevæske og filtreret for at eliminere enhver mulighed for 2 tilstopning. (Gennemsnitlig strømningshastighed 50-100 ml/cm /-time). Ved et materiale, der er fremstillet ifølge eksempel 1, skal mængden af plasma eller serum ændres til 25 ml.

Vaskning af søjlen med chromatograferingspufferen.

Opsamling af udgangstoppen, der består af gammaglobu-liner, der er immunelektrophoretisk rene, med et udbytte mellem 50 og 100% afhængigt af de anvendte puffere. Udbyttet er større ved pH-værdier lavere end 6,8 eller ved større ionstyrker, men der er da risiko for ringere renhed. Et sådant præparat af gammaglobuliner er frit for pyrogene stoffer og antigenet, der er knyttet til'hepatitis B (Ag HB ), der eventuelt er til stede i det rå udgangsmateriale.

Eluering af de andre proteiner, der er tilbageholdt af søjlen, ved hjælp af en puffer med en pH-værdi på 4 eller med chromatograferingspufferen tilsat 10-60 g natriumchlorid pr. liter eller med en 0,05 M citratpuffer med en pH-værdi på 4-8. Denne cyclus varighed er ca. 2 timer, og der kan derefter straks gennemføres en ny cyclus, således at der med et ret simpelt automatisk udstyr kan gennemføres en halv snes cycler hver dag, dvs. en behandlingsmængde nær 10 liter serum eller plasma pr. kg. porøst uorganisk oxid pr.dag.

Eksempel 5

Fjernelse af hæmoglobin ved rensning af albumin fra placentablod og koncentrering af de andre proteiner.

Fraktioneringen af placentablod med alkohol ved metoden ifølge Cohn indeholder et trin med samlet udfældning af globuliner ved en pH-værdi på 6,8 og en ethanolkoncentration på 20-25%. Under disse betingelser forbliver albumin, visse alfa-1- og alfa-2-globuliner og hæmoglobiner i det væsentlige i opløsning i den ovenstående væske. Denne fraskilles ved centrifugering i kulden, fortyndes i det samme volumen destilleret vand (for at formindske koncentrationen af alkohol) , indstilles til en pH-værdi mellem 6 og 7 og klares ved filtrering på membraner af celluloseestere.

14 148617

Skema for en rensninqscyclus på 50 g understøtning (Ved materialet ifølge eksempel 1 er det nødvendigt at anvende 100 g) .

Søjlen bringes i ligevægt med en 0,01 M phosphatpuffer eller en 0,05 M tris-saltsyre-puffer med en pH-værdi på 6-7 (fortrinsvis 2 6,5) ved en strømningshastighed på 200 ml/cm /time.

Tilsætning af 1000 ml af den ovennævnte opløsning, der skal renses, med en gennemsnitlig hastighed på 100 ml/cm /time.

Vaskning af søjlen med chromatograferingspufferen med den samme hastighed. Det rensede hæmoglobin kommer ud fra søjlen med en ubetydelig fortynding, medens de andre proteiner, deriblandt albumin, forbliver bundet til søjlen.

Eluering af proteinerne, der er bundet til søjlen, under de samme betingelser som i eksempel 4. Toppen indeholder de koncentrerede proteiner og er praktisk talt fri for hæmoglobin.

Denne cyclus' varighed er ca. 4 timer. Der kan straks derefter gennemføres en ny cyclus.

Eksempel 6

Koncentrering af en fortyndet opløsning af proteiner i alkoholisk medium og fjernelse af alkoholen.

Fraktioneringen af proteiner ved metoden ifølge Cohn medfører i de forskellige trin uundgåeligt genopløsning af alkoholiske bundfald. Det foretrækkes derfor at fortynde bundfaldet kraftigt for at formindske koncentrationen af tilbageværende alkohol, der fremkommer. Det er derfor nødvendigt dels at fjerne alkoholen og dels at koncentrere de tilstedeværende proteiner. Dette gennemføres sædvanligvis ved koncentrering i vakuum, lyophilisering eller dialyse, men da disse to sidstnævnte trin enten er meget kostbare eller medfører dannelse af pyrogene stoffer, foreslås den følgende fremgangsmåde, der er yderst bekvem, hurtig og økonomisk.

Som eksempel anvendes der en 2%'s albuminopløsning, der indeholder 10% alkohol.

Skema for en rensnings- og koncentreringscyclus på 1 kg understøtning (fremstillet ifølge eksempel 2 eller 3. Hvis understøtningen ifølge eksempel 1 anvendes, skal mængden deraf fordobles).

Denne cyclus' varighed er af størrelsesordenen 4 timer.

15 148617 1) Understøtningen bringes i ligevægt med 0,01 M phosphat-puffer med en pH-værdi på 7 ved en strømningshastighed på 200 ml/-cm^/time.

2) Tilsætning af den alkoholiske opløsning af albumin, der er indstillet til en pH-værdi på 7 ved tilsætning af saltsyre eller natriumhydroxidopløsning afhængigt af pH-værdien i forvejen.

2

Gennemsnitlig strømningshastighed 100 ml/cm /time.

Det er på denne måde muligt at binde 200 g albumin på denne søjle (dvs. 10 liter opløsning pr. cyclus). Hvis albuminet bindes dårligt på søjlen er det tilstrækkeligt at fortynde udgangsopløsningen i forvejen i destilleret vand, således at mediets ionstyrke sænkes.

3) Vaskning med destilleret vand med en hastighed på 200 ml/-cm /time, idet det kontrolleres, at albuminet ikke undslipper, men at alkoholen fjernes fuldstændigt.

4) Eluering af albuminet i en af følgende puffere: 0,1 N natriumchloridopløsning eller 0,05 M citratopløsning med en pH-værdi på 6,8. Der fås sædvanligvis slutkoncentrationer af albumin på ca. 10-20%, fjernelsen af alkohol er fuldstændig, og udbyttet ved operationen er nær 100%. Denne fremgangsmåde kan anvendes ved alle proteiner, hvis isoelektriske punkt ligger under 6,5. Ved proteiner, hvis isoelektriske punkt ligger over denne værdi, kan metoden anvendes, hvis chromatograferingspufferens pH-værdi forøges. Endelig er det klart, at enhver urenhed, der er tilstede i proteinopløsningerne, på denne måde kan fjernes, hvis den er elektrisk neutral (kulhydrater og polysaccharider) eller positivt ladet på samme måde som understøtningen (kationer). Hvis der er tale om negativt ladede urenheder, kan disse ved understøtningen konkurrere med de negative proteiner, der ønskes bundet. Hvis urenhedens affinitet til materialet i dette tilfælde er ringere end proteinets affinitet, og hvis opløsningen kan fortyndes tilstrækkeligt til, at der fås en ionstyrke, der er forenelig med bindingen med proteinet til understøtningen, er det muligt også at fjerne disse anioner.

Den følgende anvendelse viser en sådan separation.

Eksempel 7 16 148617

Koncentrering og rensning af albumin i en opløsning af na-triumcaprylat.

Ved metoder til fraktionering, der er yderst interessante, anvendes natriumcaprylat til koagulering af alle proteiner med undtagelse af albumin, der således forbliver i opløsning i nærværelse af caprylatet. En sådan opløsning indeholder f.eks. 15 g albumin og 3 g caprylat pr. liter.

Skema for en cyclus på 1 kg understøtning (fremstillet ifølge eksempel 2 eller 3. Hvis der anvendes en understøtning ifølge eksempel 1, skal mængden deraf fordobles).

1) Understøtningen bringes i ligevægt med 0,01 M phosphatpuf- 2 fer med en pH-værdi på 6 med en strømningshastighed på 200 ml/cm /-time.

2) Tilsætning af opløsningen af albumin og caprylat indstillet til en pH-værdi på 6 (fortyndet i vand, hvis ionstyrkerne er for høje). Den gennemsnitlige strømningshastighed er 100 ml/cm /time.

Der kan sættes ca. 8 liter af opløsningen til søjlen. Det er let at påvise bindingen og iagttage den kontinuerlige fjernelse af natriumcaprylat (en meget tydelig lugt af ged).

3) Vaskning af søjlen med chromatograferingspuffer, indtil der ikke mere kommer noget ud fra søjlen.

4) Eluering af albuminet ifølge den samme metode som ved de ovenfor nævnte anvendelser. Der fås en 10-20%'s albuminopløsning, der efter koncentrering til 20% til slut indeholder mindre end 2,5 g natriumcaprylat pr. liter. Denne cyclus' totale varighed er ca. 4 timer.

Det er indlysende, at denne metode kan anvendes generelt til rensning og koncentrering af forskellige negativt ladede biologiske stoffer ved bestemte pH-værdier (nucleinsyrer, proteiner, anioniske polysaccharider, anioniske glycolipider). Til demonstration af at denne generelle anvendelse er mulig, og at en sådan søjle udmærket tåler passage af væsker med meget forskellig polaritet, er der gennemført følgende anvendelsesforsøg.

Eksempel 8 17 148617

Koncentrering og rensning af gangliosider ud fra vandige ekstrakter af dyrehjerner.

Gangliosider er glycolipider, og biokemikere undersøger i øjeblikket den særdeles betydningsfulde fysiologiske eller patologiske rolle, de spiller i cellemembraner som receptorer og aktivatorer. De indeholder en del sialinsyre og er af denne grund negativt ladede over en pH-værdi på ca. 3.

Ud fra 1 kg kalvehjerne er det muligt at fremstille ca. 7 liter vandig ekstrakt (ifølge en fremgangsmåde, der er beskrevet af L. SVENNERHOLM: "Gangliosides, isolation" i : Methods in carbohydrate chemistry vol. 6 Edition R.L. Whister and H.N. BEMILLER Acad. Press New York 1972).

Denne vandige ekstrakt føres direkte gennem en søjle af 50 g af et materiale, der er fremstillet ifølge eksempel 3, og som i forvejen er bragt i ligevægt med 0,05 M tris-saltsyre-puffer med en pH-værdi på 6,8. Strømningshastigheden er 200 ml/cm /time. Alle gangliosiderne bindes til søjlen under disse betingelser. En foreløbig vask med følgende opløsninger i den angivne rækkefølge: 0,05 M tris-saltsyre-puffer med en pH-værdi på 6,8 0,1 N natriumhydroxidopløsning.

Vand

Chloroform/methanol/vand i volumenforholdet 30/50/25 gør det muligt at fjerne adskillige urenheder.

Der foretages derefter en eluering af gangliosiderne i koncentreret og renset form ved samme strømningshastighed med en blanding af chloroform, methanol og 0,1 N saltsyre i volumenforholdet 30/60/25.

Umiddelbart efter elueringen neutraliseres den opsamlede top ved tilsætning af 0,1 N natriumhydroxidopløsning, og den inddampes og optages i et hvilket som helst chromatograferingssystem til analyse. Udbyttet er 100%. Det er bemærkelsesværdigt, at søjlen uden ulemper kan passere fra et organisk opløsningsmiddel til en vandig opløsning og omvendt. Dette kan eventuelt udnyttes til særlige rensninger eller til at holde sterile betingelser i søjlen.

Eksempel 9 18 148617

Anvendelse af materialet ifølge opfindelsen som bærer af tetanus-anatoxin til rensning og koncentrering af tetanus-antistoffer.

Den forøgede kapacitet til binding af proteiner, der er beskrevet i de foregående eksempler, kan anvendes til binding af tetanus-anatoxin på en søjle af porøs uorganisk bærer. F.eks. imprægne- 2 res 10 g "Sphérosil XOC 005" (specifik overflade 10 m /gram) med "DEAE Dextran" som beskrevet i eksempel 1 og bringes i ligevægt med 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8. 25 ml tetanus-anatoxin (med en biologisk titer på 1500 Lf (flokkuleringsenheder)) fortyndes til 250 ml i den samme puffer og sættes kontinuerligt til søjlen.

Ved passagens begyndelse er bindingen af tetanus-anatoxin kvantitativ , og der kan ikke påvises noget spor deraf ved kolonnens udgang ved egnede immunologiske metoder indtil en eluatmængde på ca.

200 ml. De sidste 50 ml tilsættes dog alligevel for at sikre en ensartet og fuldstændig belægning med tetanus-anatoxin. Derefter skylles søjlen med chromatograferingspuffer. Det er da muligt at binde tetanus-anatoxinet definitivt ved at tværbinde det, således at det ikke kan elueres inden for et temmelig stort pH-værdiområde (2-12).

Tværbindingen gennemføres ved kontinuerlig cirkulation af 100 ml af en 0,5%'s opløsning af glutaraldehyd i 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8 i 2 timer ved en strømningshastighed på 2 ca. 40 ml/cm /time og stuetemperatur.

Derefter skylles søjlen successivt med følgende pufferopløsninger: 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8 0,2 M glycocolpuffer med en pH-værdi på 8,2 0,2 M glycocolpuffer med en pH-værdi på 7,2 (med og uden ' 60 g natriumchlorid pr. liter) 0,05 M citratpuffer med en pH-værdi på 2,8

Til slut tilbagevenden og opbevaring i 0,2 M glycocolpuffer med en pH-værdi på 7,2.

Søjlen er derefter klar til anvendelse, og der kan gennemføres adskillige identiske rensningscycler. Der er således gennemført flere dusin successive cycler med den samme søjle under bevaring af alle dennes egenskaber.

19 148617

Skema for en rensningscyclus med denne søjle (10 g) 1,5 liter af en opløsning af gammaglobuliner, serum eller plasma, der er indstillet til følgende koncentrationer:

Glycocol 15 g/liter Natriumchlorid 20 g/liter pH-værdi 7,2 og indeholder ca. 5 I.E./ml tetanus-antistoffer sættes til søjlen o med en hastighed på 40 ml/cm /time ved stuetemperatur. Mindre end 5% af tetanus-antistofferne kan ved egnede immunologiske metoder påvises ved søjlens udgang, medens alle de øvrige proteiner passerer søjlen.

Søjlen skylles derefter med 0,2 M glycocolpuffer med en pH-værdi på 7,2, der indeholder 60 g natriumchlorid pr. liter, og derefter med den samme puffer uden natriumchlorid, indtil eluatet fra søjlen kun i ubetydelig grad absorberer ultraviolet lys med en bølgelængde på 280 mn. Hver puffer anvendes i ca. 15 minutter i en

O

mængde på 200 ml/cm /time.

Elueringen af tetanus-antistofferne, der er bundet til søjlen med anatoxin, gennemføres derefter ved anvendelse af en 0,05 m

trinatriumcitrat-citronsyrepuffer med en pH-værdi på 2,8 ved 20°C

o i en mængde på 40 ml/cm /time.

Eluatet fra søjlen opsamles i en afkølet beholder og neutraliseres straks til en pH-værdi på 7 ved kontinuerlig tilsætning af 1 N natriumhydroxidopløsning styret af et pH-meter. Efter at elue-ringstoppen (bestemt ved absorption ved 280 nm) er elueret, bringes søjlen igen i ligevægt med den ovenfor anvendte glycocolpuffer, og der kan umiddelbart derefter gennemføres en ny cyclus. Opløsningen af rensede tetanus-antistoffer kan derefter koncentreres ved traditionelle metoder (ultrafiltrering, udfældning med polyethylengly-col, alkohol eller ammoniumsulfat). Den gennemsnitlige aktivitet af de således rensede opløsninger af tetanus-antistoffer er 30-100 I.E./mg protein. Udbyttet af tetanus-antistoffer varierer fra 20 til 100%.

Ved at følge den ovenfor beskrevne fremgangsmåde strengt er det muligt at binde forskellige antigener eller antistoffer, såsom de, der er nævnt i den foreliggende beskrivelse.

Ved visse antigener, hvis isoelektriske punkt ligger over en pH-værdi på 6, foretrækkes det at gennemføre bindingen til søjlen i en 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 8 i stedet for en pH--værdi på 6,8. Det kan ligeledes være at foretrække at erstatte phos- 20 148617 phationerne med chloridioner ved at anvende 0,01-0,05 M natrium-chloridopløsning med den samme pH-værdi på 8. En anden mulighed er at anvende kvaternære ionbyttere ifølge opfindelsen, der er kraftigt ioniseret ved en pH-værdi på 8. Dette er især tilfældet ved proteiner med antistofvirkning af typen beta-2, gamma--1 eller gamma-2, der hidrører fra f.eks. dyr som geder, får, kaniner, heste eller marsvin, eller mennesker.

Eksempel 10

Til 10 g "Sphérosil XOB 015" imprægneret med "DEAE Dex-tran" ifølge et af eksemplerne 1, 2 eller 3 sættes der 30 ml af en 0,1%'s opløsning af butandioldiglycidylether i ethylether, hvorefter opløsningsmidlet afdampes i løbet af 30 minutter ved 80°C, og til slut tilsættes en opløsning af lysin i vand med en pH--værdi på 11,5 (30 ml 1%'s opløsning). Det hele opvarmes derefter i 15 timer til 80°C. Det fremstillede materiale anbringes i en søjle, og det vaskes derefter med 0,05 M citratpuffer med en pH-værdi på 5,8. Det er i forhold til sammenligningsmaterialer (der ikke indeholder koblingsmiddel) let at påvise, at en stor del af lysinet er blevet bundet definitivt til understøtningen imprægneret med "DEAE Dextran" (der kan anvendes farvereaktioner med ninhydrin til en sådan undersøgelse).

Ved hjælp af søjlen, der på denne måde er fremstillet af materialet dækket med lysin, er det under udmærkede betingelser muligt at rense eller fjerne plasminogen eller plasmin, der er et blodprotein, der har en stor affinitet til lysin.

Betydningen af det indre overfladeareal og den gennemsnitlige porediameter af det anvendte oxid for det kationiske materiales bindingskapacitet og mekaniske egenskaber fremgår af de sammenligningsforsøg, der er omtalt i det følgende.

1. Der fremstilles en søjle (søjle A) til reversibel binding af albumin ifølge søjleimprægneringsmetoden, der er illustreret i eksempel 1. 20 g porøst siliciumoxid i form af et tørt og homogent pulver med en indre overflade på 50 m /g og en porediameter på 60 nm hældes direkte i en chromatografisk søjle.

21 148617

Der indføres derefter 100 ml 0,1 N saltsyre i søjlen ved anvendelse af en peristaltisk pumpe med en strømningshastighed på 50 ml/time for at vaske og imprægnere søjlen og for at uddrive alle luftbobler. Der indføres derpå en puffer med en pH-værdi på 6,8 (0,01 M phosphatpuffer) i søjlen indtil ligevægt, hvilket kontrolleres ved måling af pH-værdien og den specifikke modstand af den puffer, der forlader søjlen. 100 ml af en 1%'s opløsning af diethylaminoethyl-dekstran (DEAE-dekstran, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) i den ovennævnte puffer indføres derefter med en hastighed på 100 ml/time. Søjlen vaskes til slut med en opløsning af natriumchlorid (10 g/liter) til fjernelse af eventuelt ikke-fikseret dekstran.

Fraværelsen af DEAE-dekstran i sluteluatet bestemmes ved elektroforese i celluloseacetat og farvning af pladen med valmuerødt.

Den således fremstillede søjle re-ækvilibreres ved anvendelse af en 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8.

Idet der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor, fremstilles der andre søjler, søjle B til E, ved anvendelse af porøse siliciumdioxidtyper med andre indre overflader og porediametre, og egenskaberne af søjlerne som funktion af det anvendte siliciumdioxid er anført i den følgende tabel A.

Tabel A

Det porøse siliciumdioxids karakteristika Indre overflade Porediameter (m2/g) (nm) søjle A 50 60 søjle B 95 30 søjle C 150 21 søjle D 185 15 søjle E 400 8 22 148617

Efter ækvilibrering af disse søjler (søjle A til E) med en 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8 indføres en 2%'s opløsning af albumin i den samme puffer indtil mætning.

Hver af søjlerne skylles derefter med den samme puffer, indtil der ikke længere observeres albumin, som forlader søjlen, som konstateret ved UV-absorption ved 280 nm.

Albuminet, der er fikseret på hver af søjlerne, elue-res derpå med en fysiologisk natriumchloridopløsning (10 g/li-ter) .

Den eluerede mængde albumin bestemmes derefter ved måling af den optiske tæthed ved 280 nm (en opløsning på 1 mg/ml har en optisk tæthed ved 280 nm på 0,54).

Ved denne undersøgelsesmetode opnås resultaterne, der er anført i den følgende tabel B.

Tabel B

Søjle Eluatvolumen Optisk tæthed Bindingskapacitet (ml) (280 nm) (mg albumin pr. g imprægneret materiale) A 100 2,70 25 mg/g B 100 2,05 19 mg/g C 100 0,4 <5 mg/g D 100 0,26 <5 mg/g E 100 0,25 (5 mg/g

De opnåede resultater viser betydningen af egenskaber ne af det porøse siliciumdioxid, der anvendes til imprægnering, idet der opnås en reversibel bindingskapacitet på over ca. 20 mg albumin pr. g imprægneret materiale ved anvendelse af søjle A og B, dvs. ved anvendelse af porøst siliciumdioxid, hvis indre overflade er mindre end 150 m /g, fortrinsvis 100 m /g og hvis porediameter er større end 21 nm, fortrinsvis 25 nm. 1

Der gennemføres også sammenligningsforsøg, som viser, at der opnås de bedste mekaniske egenskaber, når der som porøs 23 148617 uorganisk bærer anvendes et siliciumdioxid med en porediameter på større end eller lig med 25 nm og en indre overflade på min- 2 dre end eller lig med 100 m /g. Til dette formål fremstilles følgende præparater:

Præparat A

20 g porøst siliciumdioxid med en indre overflade på 95 m /g og en gennemsnitlig porediameter på 30 nm bliver som beskrevet i eksempel 2 vejet og imprægneret med 45 ml af en vandig opløsning af diethylaminoethyl-dekstran (DEAE-dekstran) med en koncentration på 7,5% og en pH-værdi på 11,5. Det således imprægnerede materiale ovntørres ved 80°C i 15 timer. Til det fremkomne homogeniserede pulver sættes der som beskrevet i eksempel 3 50 ml af en 0,2%'s opløsning af 1,4-butandiol-digly-cidylether i ethylether. Den fremkomne blanding omrøres derefter uafbrudt ved en temperatur på 40°C, indtil diethyletheren er fordampet fuldstændigt. Efter tørring ved en temperatur på 80°C i 15 timer vaskes materialet med flere liter 0,1 N natriumhydroxidopløsning, derefter med 0,1 N saltsyre og til slut med pufferen, 0,01 M Na-phosphat med en pH-værdi på 6,8.

Det fremstillede, imprægnerede og tværbundne materiale anbringes derpå i en søjle, og det optager et volumen på 46 ml, dvs. et volumen, der er næsten det samme som volumenet af de anvendte 20 g porøst siliciumdioxid, nemlig 45 ml.

Dette volumen ændres ikke, når en 0,1 N opløsning af NaOH eller 0,1 N saltsyre indføres i søjlen.

Præparat B

20 g porøst siliciumdioxid med en indre overflade på 150 m /g og en gennemsnitlig porediameter på 21 nm bliver som beskrevet i eksempel 2 vejet og imprægneret med 45 ml af en vandig opløsning af diethylaminoethyl-dekstran (DEAE-dekstran) med en koncentration på 7,5% og en pH-værdi på 11,5. Det således imprægnerede materiale ovntørres ved 80°C i 15 timer. Til det fremkomne homogeniserede pulver sættes der som beskrevet i eksempel 3 50 ml af en 0,2%'s opløsning af 1,4-butandiol-digly- 24 148617 cidylether i ethylether. Den fremkomne blanding omrøres derefter uafbrudt ved en temperatur på 40°C, indtil diethyletheren er fordampet fuldstændigt. Efter tørring ved en temperatur på 80°C i 15 timer vaskes materialet med flere liter 0,1 N natriumhydroxidopløsning, derefter med 0,1 N saltsyre og til slut med pufferen, 0,01 M Na-phosphat med en pH-værdi på 6,8.

Det fremstillede, imprægnerede og tværbundne materiale anbringes derpå i en søjle, og det optager et volumen på 65 ml, hvor volumenet, som optages af det ikke-imprægnerede "Spherosil", er 45 ml.

Når en 0,1 N NaOH-opløsning eller 0,1 N saltsyre ledes gennem søjlen, falder volumenet meget hurtigt og stabiliseres ved ca. 51 ml.

Disse prøver viser angående de mekaniske egenskaber af materialerne og især angående præparatets bestandighed, at et imprægneret og tværbundet materiale, der er fremstillet ud fra 2 et porøst siliciumdioxid med en indre overflade under 100 m /g og en porediameter på over 25 nm, giver en ikke sammentrykkelig søjle, hvilket ikke er tilfældet med et tværbundet og imprægneret materiale fremstillet ud fra et porøst siliciumdioxid med en 2 indre overflade over 100 m /g og en porediameter linder 25 nm, idet et sådant materiale giver en sammentrykkelig søjle, der ikke er ret anvendelig i industriel målestok.

Claims

148617 Patentkrav.

1. Materiale med kationisk karakter, der på reversibel eller irreversibel måde kan binde biologiske makromolekylære stoffer og lavmolekylære stoffer, kendetegnet ved, at det i det væsentlige består af et porøst uorganisk oxid, der direkte på overfladen er beklædt med en vandopløselig amineret polysaccharidpolymer, der eventuelt under eller efter påføringen på oxidet er tværbundet, hvor det porøse uorganiske 2 oxid har en indre overflade på mindre end eller lig med 100 m /g og en gennemsnitlig porediameter på over eller lig med 25 nm.

2. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det porøse uorganiske oxid er siliciumdioxid, aluminiumoxid, magnesiumoxid, titandioxid eller et naturligt eller syntetisk derivat deraf.

3. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det porøse uorganiske oxid har en indre overflade på mellem 2 5 og 80 m /g.

4. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det porøse uorganiske oxids gennemsnitlige porediameter er mellem 50 og 1000 nm.

5. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den aminerede polysaccharidpolymer har en molekylvægt på C fi mellem 10J og 10°.

6. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den aminerede polysaccharidpolymer er valgt blandt (a) aminerede polysaccharidpolymere med formlen: R-(CH2)n - /r2