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Eine enzymatische Aktivität der Milch, welche gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit zur Oxydation von Sulfhydrylgruppen des Cystein, des Glutathions (GSH) und von Milchprodukten zu den entsprechenden Disulfiden ist von Friedrich Kiermeier und Ernst Petz (Z. Lebensmit- tel-Unters.-Forsch., Bd. 132,342-351 [1967] ; Bd. 134,97-102, 149-156 [1967]) gezeigt worden.
Es wurde vermutet, dass die von den Rohprodukten katalysierten Reaktionen durch die folgende Gleichung gegeben sind : 2 RSH + 1/2 O2 ---- RSSR + Hua 0.
In Übereinstimmung mit den allgemeinen Regeln für die systematische und triviale Nomenklatur wurde das Enzym als Sulfhydryl-Oxydase bezeichnet.
Das rohe Enzym wurde von Kiermeier und Petz aus der Molkenfraktion von Magermilch erhalten. Ihre Versuche zur Reinigung und Isolierung des Sulfhydryloxydase-Enzyms waren er- folglos.
Es wurde nun ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Sulfhydryloxydase-Enzyms aus Milch gefunden, welches regelmässig Präparate mit mehr als dem 3000fachen Reinheitsgrad im Vergleich zu Magermilch ergibt. Es wurde gefunden, dass Sulfhydryloxydase in im wesentlichen reiner Form die Oxydation von Sulfhydrylgruppen sowohl in niedermolekularen Verbindungen wie auch in Proteinen unter Verwendung von Sauerstoff als Oxydationsmittel katalysiert. Es wurde weiter gefunden, dass das Enzym sowohl in einer im wesentlichen gereinigten wie auch in immobilisierter Form zur Behandlung von Milch verwendbar ist, um den Kochgeschmack aus ihr zu entfernen. Es hat auch den Anschein, als könnte das immobilisierte Enzym in der Biosynthese von Disulfiden in gewissen Proteinen nützlich sein.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Sulfhydryloxydase-Enzym aus Milch.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Teilschritte umfasst : a) Gewinnung einer rohen, unreinen Enzymfraktion der Sulfhydryloxydase aus roher Voll- milch durch Koagulierung des Milchkaseins in der Molke ; b) Auflösen der genannten unreinen Enzymfraktion in einer verdünnten, neutralen Puffer- lösung ; c) Trennbehandlung der unreinen Enzymfraktion in der genannten Pufferlösung zur Ab- trennung einer ersten Enzymfraktion von Materialien mit grösseren Molekülen ; d) Konzentrieren der ersten, gemäss Teilschritt c) erhaltenen Enzymfraktion zur Gewin- nung einer zweiten Enzymfraktion, beispielsweise durch Filtration ; und e) Abtrennen der genannten zweiten Enzymfraktion zur Entfernung der Materialien mit kleineren Molekülen und Isolierung des Enzyms daraus, z.
B. durch Zentrifugierung.
Das auf solche Weise isolierte Sulfhydryloxydase-Enzym liegt in im wesentlichen gereinigter Form vor. Der hier verwendete Ausdruck "in im wesentlichen gereinigter Form" bezieht sich auf eine Sulfhydryloxydase, die eine um wenigstens 50mal grössere Aktivität hat als die der rohen Enzymfraktion, erhalten aus der Molkenfraktion, die aus der Magermilch abgetrennt wird, die ihrerseits aus roher Vollmilch gewonnen wurde. Der hier verwendete Ausdruck "spezifische Aktivität" ist definiert als die Geschwindigkeit der katalytischen Wirkung pro Gewicht des Enzyms. Die rohe Enzymfraktion kann in ähnlicher Weise wie von Kiermeier und Petz beschrieben erhalten werden. Rohe Vollmilch wird behandelt, um Magermilch zu erhalten (d. h. das Fett wird von den Nichtfett-Feststoffen entfernt).
Dann wird die Magermilch behandelt, um die Molke zu gewinnen, indem man das darin befindliche Kasein mit Rennin koaguliert. Die Molke wird gekühlt und Ammonsulfat wird bis zur halben Sättigung zugesetzt. Der danach sich bildende Niederschlag wird im nachfolgenden als die rohe, unreine Enzymfraktion bezeichnet.
Das rohe, unreine Enzym wird behandelt, um eine im wesentlichen gereinigte Form der Sulfhydryloxydase zu bilden, welche dann weiterbehandelt werden kann, um eine spezifische Aktivität zu erhalten, welche wenigstens 100mal grösser ist als jene der rohen Enzymfraktion.
Das wie oben angegeben isolierte Enzym wird in einer neutralen Pufferlösung aufgelöst, um eine dritte Enzymfraktion zu bilden. Das Enzym wird sodann von Materialien geringerer Molekulargrösse abgetrennt und daraus isoliert ; es weist eine erhöhte spezifische Aktivität im Vergleich mit dem wie oben angegeben isolierten auf.
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Die Isolierung der im wesentlichen reinen Sulfhydryloxydase liefert ein Enzym, welches überraschenderweise eine wenigstens 1400mal grössere spezifische Aktivität aufweist, als sie in Magermilch gefunden wird.
Als einleitender Schritt wird die rohe Vollmilch zur Entfernung des Fetts von den Nichtfett-Feststoffen und zur Bildung von Magermilch behandelt. Die Molke wird aus der Magermilch durch Koagulation der Kaseinfraktion mit Rennin erhalten. Die Molke wird entfernt, gekühlt und zu einer halbgesättigten Ammonsulfatlösung zugesetzt, um das Rohenzym auszufällen. Frühere Versuche von anderer Seite, das Enzym mit Hilfe von Methoden zu isolieren wie Gelchromatographie waren erfolglos. Die weitere Behandlung gemäss der Erfindung hingegen war erfolgreich.
Die wie oben erhaltene Rohenzymfraktion wird in einer verdünnten neutralen Pufferlösung aufgelöst (z. B. in einem Phosphatpuffer), um das Enzym stabil zu erhalten. Das gelöste Enzym wird dann der Gleichgewichtseinstellung überlassen (d. h. einem Zeitraum, in dem die Dissoziation des Enzyms stattfinden kann), vorzugsweise unter Kühlung. Die Lösung wird sodann einer Trennbehandlung (z. B. durch Zentrifugieren) unterzogen, um die Enzymfraktion von Materialien höherer Molekulargrösse abzutrennen. Nach dem Zentrifugieren der Lösung wird die Enzymfraktion mit der überstehenden Flüssigkeit entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann von etwa 2, 5 auf 3, 5% Proteinkonzentration konzentriert, z. B. mit Hilfe eines Ultrafilters.
Es können jedoch auch andere Mittel angewendet werden, wie Zugabe von trockenen Molekularsieben oder Eindampfen im Vakuum, die offensichtlich gleich gut geeignet sind. Eine Konzentration von wenigstens etwa 2,5% scheint erforderlich zu sein, um die Molekulargrösse des Enzyms durch Wiederzusammentreten (Reassoziation) zu erhöhen. Die Enzymfraktion wird in Form von Pellets gewonnen (z. B. durch Zentrifugieren), wobei man die Abtrennung von Materialien kleiner Molekülgrösse erreicht. Die in Form des Pellets isolierte aktive Enzymfraktion hat eine spezifische Aktivität, die wenigstens 1400mal grösser ist als jene von Magermilch.
Eine erhöhte spezifische Aktivität des Enzyms wird erzielt, indem man das Pellet, welches die obige Enzymfraktion enthält, in einer neutralen Pufferlösung unter etwa zweifacher Verdünnung löst (bezogen auf das Flüssigkeitsvolumen) und die erhaltene Lösung einer Trennbehandlung unterwirft, um eine noch reinere Form des Enzyms zu erhalten, die eine bis zu 3000fache Erhöhung der spezifischen Aktivität im Vergleich zu Magermilch aufweist.
Die isolierte, im wesentlichen gereinigte Sulfhydryloxydase kann unter Kühlung auf etwa 4 C aufbewahrt werden, ohne dass sie merklich an Aktivität einbüsst. Es wird vorgezogen, die isolierte und im wesentlichen gereinigte Sulfhydryloxydase zu immobilisieren. Andernfalls wird das Enzym ein integraler Bestandteil der Reaktionsmischung und kann nach Abschluss der Reaktion nicht wiedergewonnen werden. Unter Immobilisierung versteht man die Modifizierung des Enzymmoleküls, um seine Bewegung zu begrenzen und es innerhalb eines begrenzten Raumes zu halten. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden, z. B. durch Adsorption des Enzyms an einem unlöslichen Träger, Einschliessen in Gelmatrizen, kovalente chemische Bindung an unlösliche Träger sowie intermolekulare Vernetzung des Enzymmoleküls.
Eine bevorzugte Art der Immobilisierung der isolierten Sulfhydryloxydase gemäss der Erfindung ist die Befestigung des Enzyms an Glaskügelchen. Eine geeignete Methode ist in Biochim. Biophys. Acta 243-256 (1974) beschrieben. Da die immobilisierte Sulfhydryloxydase empfindlich gegen Bakterien, Hitze, PH und Trockenheit ist, muss das Enzym bei der Lagerung vor dem Austrocknen bewahrt bleiben. Vorzugsweise wird die immobilisierte Sulfhydryloxydase in einer neutralen Pufferlösung (Phosphatpuffer) unter Kühlen bis zum Gebrauch gelagert. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung näher, ohne sie jedoch zu beschränken.
Beispiel 1 : Die Reinigung der Sulfhydryloxydase aus Kuhmilch, wobei regelmässig eine mehr als 1400fache Reinheit im Vergleich zur Magermilch erhalten wird, lässt sich nach folgender Methode erzielen. Eine konzentrationsabhängige Assoziation-Dissoziation wurde gemäss dem folgenden Isolationsverfahren eingestellt.
Eine rohe, unreine Enzymfraktion, hergestellt ähnlich wie früher von Kiermeier und Petz beschrieben, wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Demgemäss wurde Magermilch aus roher Vollmilch durch Zentrifugieren bei 4080 x g während 30 min bei 300C hergestellt. Die Molke (Fraktion B) wurde aus der Magermilch durch Koagulieren der Kaseinfraktion mit Rennin erhalten.
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Ungefähr 2 mg Rennin wurden pro 100 ml Magermilch zugesetzt, und die Reaktion wurde 30 min bei 300C ablaufen gelassen. Unter diesen Bedingungen wird lediglich die Phe 105-Met 106 Bindung von k-Kasein hydrolysiert. Der gebildete Topfen wurde durch Zentrifugieren bei 16300 x g
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derschlag (Rohenzym, Fraktion C) durch Zentrifugieren bei 16300 x g innerhalb 60 min bei 4 C abgetrennt.
Das Rohenzym (Fraktion C) wurde in 0, 047 M Na-Phosphat bei PH 7, 0 gelöst, wobei eine Proteinkonzentration von 3% erhalten wurde, und gegen den gleich Puffer bei 4 C dialysiert. Diese Lösung wurde mit dem Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0, 15% verdünnt und über
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eine Proteinkonzentration von etwa 3% mit Hilfe eines Ultrafiltrationssystems unter Verwendung einer Membran konzentriert. Die Lösung wurde abermals bei 2000 x g innerhalb 30 min bei 40C zentrifugiert, aber diesmal erschien die enzymatische Aktivität in dem Pellet (Fraktion F).
Das Pellet stellte Sulfhydryloxydase in einer im wesentlichen gereinigten Form dar.
Beispiel 2 : Kleinere Proteine in der Fraktion F gemäss Beispiel 1 wurden entfernt, indem das Pellet im doppelten Volumen der vorigen Lösung gelöst wurde, man die Lösung über Nacht stehen liess (4 C), um die Dissoziation zu fördern, und das Zentrifugieren bei 2000 x g 30 min lang bei 40C wiederholte. Das erhaltene Pellet (Fraktion H) wurde als das gereinigte Enzym genommen.
Charakteristische Daten von in den verschiedenen Stufen des beschriebenen Vorgangs erhaltenen Fraktionen sind in Tabelle I angeführt. Die Aktivität wurde aus der Geschwindigkeit des Oa-Verbrauchs bestimmt, gemessen mit Hilfe einer oszillierenden Pt-Elektrode unter Verwendung von 0,8 Mol GSH als Substrat. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als 1 mMol O2, verbraucht pro Minute in einem Phosphatpuffer bei PH 7, 0 und 35 C.
Aktivitätstest. Es wurden zwei Testmethoden entwickelt, eine basierend auf dem Verschwinden der Sulfhydrylgruppen und die andere auf der Oz-Verarmung. Bei der ersten Methode wurde die Konzentration der Sulfhydrylgruppen durch Reaktion mit DTNB gemessen. Bei einem typi-
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der durch das Enzym katalysierten Reaktion wurde aus dem linearen Teil einer Kurve Silfhydrylkonzentration gegen Zeit bestimmt.
Bei der zweiten Testmethode wurde die Geschwindigkeit des O-Verbrauchs mit einer oszillierenden Pt-Elektrode unter Verwendung eines Oszillographen Type Gilson, Modell K gemessen.
Bei einem typischen Versuch wurden 0, 2 ml Enzymlösung zu 1, 5 ml an 0, 8 mMol GSH zugesetzt, das bei 35 C in der Elektrodenzelle auf Gleichgewicht eingestellt worden war. Blindversuche mit gekochter Enzymlösung zeigen keinen 02-Verbrauch. Die Geschwindigkeiten der enzymatischen Reaktion wurden aus der Anfangsneigung der Kurven bestimmt.
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Tabelle I Reinigung von Sulfhydryloxydase aus Kuhmilch
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Volumen <SEP> Gesamt-Spez. <SEP> Wiedergeaktivität <SEP> Aktivität <SEP> winnung <SEP> in <SEP> %
<tb> ml <SEP> Einheiten <SEP> Einheiten/mg <SEP> N
<tb> Magermilch <SEP> 1000 <SEP> 160, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 032 <SEP> 100
<tb> Renninmolke <SEP> 930 <SEP> 153, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 174 <SEP> 96
<tb> Rohenzym <SEP> (Fraktion <SEP> C) <SEP> 40 <SEP> 151, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 765 <SEP> 95
<tb> Pellet <SEP> der <SEP> ersten <SEP> Zentrifugierung <SEP> (Fraktion <SEP> F) <SEP> 80 <SEP> 96, <SEP> 0 <SEP> 47, <SEP> 1 <SEP> 60
<tb> Pellet <SEP> der <SEP> zweiten <SEP> Zentrifugierung <SEP> (Fraktion <SEP> H) <SEP> 24 <SEP> 65, <SEP> 1 <SEP> 103, <SEP> 8 <SEP> 41
<tb>
Die Fraktion F zeigte beträchtlich mehr Aktivität als die Fraktion C.
Die Gelchromatographie lieferte lediglich die in das Hohlraumvolumen ausgewaschene Fraktion. Tests mit dem Protein, welches von Stellen in jeder der Banden in einem nicht fleckigen Gel ausgewaschen worden war, zeigten, dass die Enzymaktivität nur oben im Abstandgel und an der Grenzfläche zwischen Abstand- und Trenngel auftrat. Die Proteine aus der Fraktion F, welche in dem Trenngel aufschienen, wurden durch Zentrifugieren einer etwas mehr verdünnten Lösung entfernt. Nur zwei Banden, beide enzymatisch aktiv, wurden bei der Gelelektrophorese der Fraktion H erkennbar.
Weiters war nur eine protein-fleckige Bande nach der Scheiben-Gelelektrophorese dieser Fraktion in Na-Dodecylsulfat sichtbar.
Diese Methode der Reinigung ist in einem Aufsatz von Janolino und Swaisgood"Isolierung und Charakterisierung von Sulfhydryloxydase aus Kuhmilch" beschrieben, man vgl. J. of Biol. Chem.
Bd. 250, Nr. 7,2532-2538 (1975-04-10).
Es hat den Anschein, als sei Eisen ein integrierender Bestandteil des Enzyms. Die Behandlung des Enzyms mit EDTA führte zu einem völligen Verlust der Aktivität, welche jedoch durch Dialyse gegen 1 mMol FeS04 wiederhergestellt werden konnte. Weiters ergab die Atomabsorptionsanalyse und die Neutronenaktivierungsanalyse von getrennten Enzympräparaten jedesmal die Gegenwart von 0,5 Atomen Eisen/Untereinheit.
Im Gegensatz zu den Vermutungen von Kiermeier und Petz (vgl. weiter oben), wurde auf Grund von Untersuchungen der Stöchiometrie von Reaktionen, die durch Sulfhydroxyloxydase katalysiert werden, gefunden, dass die tatsächlich katalysierte Reaktion die einer "aerob Oxydase" ist, entsprechend der Gleichung :
2 RSH + O2 :-RSSR + H
Die Verfahren gemäss den Beispielen 1 und 2 wurden oft wiederholt und führten zu einem reproduzierbaren Produkt, welches eine mehr als 1400- bis 3000fache Zunahme der spezifischen Aktivität im Vergleich zu Magermilch aufweist.
Beispiel 3 : Die Temperatur- und pH-Abhängigkeit des gemäss Beispiel 2 erhaltenen gereinigten Enzyms wurden unter Verwendung eines GSH-Substrats untersucht. Die grösste Aktivität
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Molgewichtsuntersuchungen an Untereinheiten wurden mit dem gereinigten, gemäss Beispiel 2 erhaltenen Enzym durchgeführt. Die gereinigten Präparate gemäss Beispiel 2 zeigten zwei Zonen, von denen jede Aktivität aufwies, wenn sie nach dem Verfahren der Gelelektrophorese auf Polyacrylamidscheiben untersucht wurde, aber nur eine Zone bei der Scheiben-Gelelektrophorese in Na-Dodecylsulfat. Die Sulhydroxyloxydase wurde unter Verwendung einer Reihe von Acrylamidkonzentrationen untersucht. Die scheinbaren durchschnittlichen Molgewichte aus
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lichkeit im wesentlichen linear. Bei Acrylamidkonzentrationen von 10 und 12, 5% waren die für vier unabhängige Präparate des Enzyms erhaltenen Werte in sehr guter Übereinstimmung und ergaben einen Durchschnittswert für das Gewicht der Untereinheit von 89000 900.
In jedem Fall wurde eine einzige Proteinbande bei verschiedenen Gelkonzentrationen und Enzymbeladungen beobachtet.
Es wurden auch Untersuchungen bezüglich der chemischen Zusdammensetzung vorgenommen, wobei man Aminosäureanalyse ebenso wie Kohlehydratanalyse anwendete. Die Aminosäureanalyse wurde ausgeführt, indem man lyophilisierte Proben des gereinigten Enzyms in dickwandige Verbrennungsrohre füllte und konstant siedende (etwa 6 N) HCl zusetzt ; die erhaltenen Lösungen wurden gefroren, entlüftet und die Rohre wurden evakuiert und dicht verschlossen.
Der Prozentsatz an Feuchtigkeit in den lyophilisierten Proben wurde durch Trocknen auf Gewichtskonstanz bei 750C im Vakuum über P 205 bestimmt. Die Hydrolyse wurde in einem ToluolRückflussbad während 16,24, 48 und 72 h durchgeführt, und die Hydrolysate wurden unter Verwendung eines Aminosäure-Analysators, Modell Beckmann 116, analysiert.
Der Halb-Cystingehalt wurde unabhängig als Cysteinsäure nach der Oxydation mit Perameisensäure bestimmt. Tryptophan wurde mit Hilfe chromatographischer Analyse nach enzymatischer Hydrolyse mit Pronase abgeschätzt.
Nach der Kohlehydratanalyse wurde der Gesamt-Hexosegehalt nach der Phenolschwefelsäuremethode bestimmt. Nach der hydrolyse in 0, 1 N HCl bei 800C während 1 h wurde die Sialsäure nach dem Aminoff-Verfahren unter Verwendung eines N-Acetylneuraminsäure-Titers bestimmt.
Hexosamin wurde quantitativ bestimmt nach Hydrolyse in 2 N HCl bei 1000C während 16 h.
Galaktosamin wurde als Titer verwendet und die Werte als N-Acetylhexosamin angegeben. Fukose (S-Deoxy-I.-galaktose) wurde nach der Thioglykolsäure-Schwefelsäure-Methode unter Verwendung von Fukose als Titer abgeschätzt.
Die Ergebnisse der Aminosäure- und Kohlehydratanalysen sind in der Tabelle II wiedergegeben. Diese Daten zeigen, dass praktisch das Gesamtgewicht der Probe (97%) auf Aminosäureund Kohlehydratreste zurückgeht, von denen 89% aus Aminosäure- und 11% aus Kohlehydratresten bestehen.
Aminosäure- und Kohlehydrat-Zusammensetzung von gereinigter Sulfhydryloxydase.
Die Aminosäurewerte sind wiedergegeben als Durchschnitt von 16,24, 48 und 72 h Hydrolysezeit, ausser für Thr, Ser, Val, Ile, Leu, Tyr und Trp. Die Werte für Thr, Ser und Tyr wurden durch Extrapolation auf Hydrolysezeit Null erhalten, jene für Val, Ile und Leu durch Extrapolation auf Hydrolysezeit unendlich. Die Werte für Halb-Cys wurden korrigiert unter der Annahme einer 95%igen Wiedergewinnung der Cysteinsäure nach der Perameisensäure-Oxydation.
Trp wurde nach Abbau mit Pronase bestimmt.
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<tb>
<tb>
Rückstand
<tb> Komponente <SEP> p-Mol/mg <SEP> g/100 <SEP> g <SEP> Zahl/89000 <SEP> g <SEP> nächst
<tb> kommende
<tb> ganze <SEP> Zahl
<tb> Aminosäuren <SEP> : <SEP>
<tb> Lys <SEP> 0,504 <SEP> ¯ <SEP> 0,014 <SEP> 6,46 <SEP> 44,9 <SEP> 45
<tb> His <SEP> 0,124 <SEP> ¯ <SEP> 0,004 <SEP> 1,70 <SEP> 11,0 <SEP> 11
<tb> Arg <SEP> 0, <SEP> 332 <SEP> 0, <SEP> 012 <SEP> 5, <SEP> 19 <SEP> 29, <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP>
<tb> Asp <SEP> 0,608 <SEP> ¯ <SEP> 0,001 <SEP> 8,03 <SEP> 62,1 <SEP> 62
<tb> Thr <SEP> 0, <SEP> 475 <SEP> 4, <SEP> 80 <SEP> 42, <SEP> 3 <SEP> 42
<tb> Ser <SEP> 0, <SEP> 519 <SEP> 4, <SEP> 52 <SEP> 46, <SEP> 2 <SEP> 46
<tb> Glu <SEP> 0.
<SEP> 811 <SEP> 0, <SEP> 018 <SEP> 10, <SEP> 47 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 72
<tb> Pro <SEP> 0, <SEP> 4160, <SEP> 010 <SEP> 4, <SEP> 04 <SEP> 37, <SEP> 0 <SEP> 37
<tb> Gly <SEP> 0,845 <SEP> ¯ <SEP> 0,035 <SEP> 4,83 <SEP> 75,2 <SEP> 75
<tb> Ala <SEP> 0, <SEP> 9671 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 026 <SEP> 6, <SEP> 88 <SEP> 86, <SEP> 1 <SEP> 86
<tb> Halb-Cys <SEP> 0. <SEP> 06110, <SEP> 001 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 5.
<SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Val <SEP> 0, <SEP> 630 <SEP> 6, <SEP> 24 <SEP> 56, <SEP> 1 <SEP> 56
<tb> Met <SEP> 0,082 <SEP> ¯ <SEP> 0,044 <SEP> 1,08 <SEP> 7,3 <SEP> 7
<tb> Ile <SEP> 0, <SEP> 360 <SEP> 4, <SEP> 08 <SEP> 32, <SEP> 0 <SEP> 32
<tb> Leu <SEP> 0, <SEP> 680 <SEP> 7, <SEP> 70 <SEP> 60, <SEP> 5 <SEP> 61
<tb> Tyr <SEP> 0, <SEP> 203 <SEP> 3, <SEP> 32 <SEP> 18, <SEP> 1 <SEP> 18 <SEP>
<tb> Phe <SEP> 0,326 <SEP> ¯ <SEP> 0,012 <SEP> 4,80 <SEP> 29,0 <SEP> 29
<tb> Trp <SEP> 0, <SEP> 058+0, <SEP> 005 <SEP> 1, <SEP> 08 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 5
<tb> Kohlehydrate <SEP> : <SEP>
<tb> Fukose <SEP> 0, <SEP> 030 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 3
<tb> Gesamthexose <SEP> 0, <SEP> 444 <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 7, <SEP> 19 <SEP> 39, <SEP> 5 <SEP> 40
<tb> N-Acetylhexosamin <SEP> 0, <SEP> 143 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 2, <SEP> 90 <SEP> 12, <SEP> 7 <SEP> 13
<tb> N-Acetylneuraminsäure <SEP> 0, <SEP> 013 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1
<tb>
Beispiel 4 : Die Immobilisierung der gemäss Beispiel 2 erhaltenen gereinigten Sulfhydryl- oxydase wurde erreicht, indem das Enzym auf Glasperlen fixiert wurde. Succinilat-Glasperlen wurden aus y-Aminopropyl-Glasperlen (Siebmaschengrösse 40-60, Porendurchmesser 20 pm), und dann mit destilliertem Wasser gewaschen und 24 h in einem 0, 2 M Phosphatpuffer bei PH 4, 75 der Gleichgewichtseinstellung überlassen. Die Perlen wurden dann entgast und zu 0, 5 g der
Perlen wurde kristallines 1-Äthyl-3-dimethyl-aminopropylcarbodiimid (EDC) zugesetzt und die
Reaktion 20 min bei 25 C und einem konstanten PH-Wert von 4, 75 durchgeführt.
Die Perlen wur- den dann mit destilliertem Wasser gewaschen sowie mit einer kalten, neutralen Pufferlösung, um überflüssiges EDC zu entfernen. Das isolierte Enzym (0, 1% Gew. /Vol.) in einer Phosphat- pufferlösung wurde dann mit den Succinilat-Perlen zwischen 16 und 24 h in Berührung gebracht, wonach die Perlen mit einem 0, 1 M Phosphatpuffer von PH 7 gewaschen wurden. Dies führte
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zu einer kovalenten Kupplung des isolierten Enzyms an die Glasperlen und zu einer immobilisierten Sulfhydryloxydase. Wie bereits bemerkt, sollte das immobilisierte Enzym, wenn es nicht im Gebrauch ist, nicht austrocknen gelassen werden und auch nicht extremen Temperaturen ausgesetzt, indem man es unter Kühlung in einer Phosphatpufferlösung von PH 7 lagert.
Beispiel 5 : Die Reaktivierung von immobilisierter Sulfhydryloxydase wird erreicht, indem man das entaktivierte immobilisierte Enzym mit einer wässerigen Lösung von Eisen- D-sulfat in Kontakt bringt. Wie bereits gesagt, scheint Eisen ein integrierender Bestandteil der Sulfhydroxyloxydase zu sein. Die Behandlung des Enzyms mit EDTA führte zu einem völligen Verlust der Aktivität, wie durch die Werte in Tabelle IV gezeigt wird. Dialyse gegen 1 p-Mol Fe ++ stellte 70% der ursprünglichen Aktivität wieder her. Eine gewisse Aktivität konnte auch durch Cu ++ (30%) und Mn ++ (20%) wiederhergestellt werden. Das Elektronenabsorptionsspektrum des
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ten die Gegenwart von etwa 0, 48 g. Atom Fe und etwa 0, 15 g. Atom Cu pro 89000 an.
Die Neutronenaktivierungsanalyse einer getrennten Zubereitung ergab 11, 1 = 0, 3 Jl-g Fe für eine 38, 5 mgProbe, was 0, 46 g. Atom Fe pro 89000 entspricht. Cu konnte unter den angewendeten Bedingungen nicht gefunden werden, und die Analyse auf andere Metalle ergab lediglich Spuren von Zn und Co. Kein Mo oder Mn konnte gefunden werden. Es scheint aber, dass Fe für die enzymatische Aktivität von Sulfhydryloxydase erforderlich ist.
Tabelle IV
Wirkung von Metallionen auf die Aktivität der Sulfhydroxyloxydase.
Die Versuche wurden in Phosphat bei PH 7, 0 und bei 350C unter Verwendung von 0,8 mMol GSH als Substrat durchgeführt. Ein aliquoter Teil einer Vor- ratsenzymlösung wurde entnommen und in Gegenwart von 1,0 mMol EDTA untersucht. Nach der Behandlung anderer aliquoter Teile der Vorratslösung mit EDTA wurden diese gegen verschiedene Metallionen dialysiert. Es wurden
Blindversuche mit gekochtem Enzym und auch mit dem das Metallion ent- haltenden Dialysat durchgeführt. In beiden Fällen wurde eine bemerkbare Oz-Aufnahme nicht beobachtet.
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<tb>
<tb>
Behandlung <SEP> Enzymaktivität
<tb> p-Mol <SEP> O2 <SEP> verbraucht <SEP> pro <SEP> Minute <SEP> : <SEP>
<tb> Sulfhydryloxydase <SEP> (Kontrolle)
<tb> Enzym <SEP> 0, <SEP> 368 <SEP>
<tb> + <SEP> EDTA <SEP> (1, <SEP> 0 <SEP> Mol) <SEP> 0, <SEP> 012 <SEP>
<tb> + <SEP> FeS04 <SEP> 0, <SEP> 256 <SEP>
<tb> + <SEP> CuSQ. <SEP> 0, <SEP> 109 <SEP>
<tb> + <SEP> MINCI, <SEP> 0, <SEP> 085 <SEP>
<tb> + <SEP> CoCl2 <SEP> 0, <SEP> 021 <SEP>
<tb> + <SEP> ZnSQ. <SEP> 0, <SEP> 029 <SEP>
<tb> + <SEP> MoBr <SEP> a) <SEP> 0, <SEP> 008 <SEP>
<tb>
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oxydierte es höchstwahrscheinlich zu höheren Wertigkeitsstufen.
Aus der vorstehenden Diskussion und den Beispielen kann ersehen werden, dass das er-
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findungsgemässe erfolgreiche Isolierungsverfahren konzentrationsabhängige Assoziations-Dissoziations- Charakteristiken verwendet, um ein Enzym zu erhalten, das unerwarteterweise im wesentlichen rein ist und ein hohes Ausmass an spezifischer Aktivität aufweist.
Die Erfindung in ihren weiteren Aspekten ist nicht auf die speziell gezeigten und beschriebenen Einzelheiten beschränkt, sondern es können im Rahmen der Patentansprüche Abänderungen vorgenommen werden, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Isolierung von Sulfhydryloxydase-Enzym aus. Milch, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Teilschritte umfasst : a) Gewinnung einer rohen, unreinen Enzymfraktion der Sulfhydryloxydase aus roher Voll- milch durch Koagulierung des Milchkaseins in der Molke ; b) Auflösen der genannten unreinen Enzymfraktion in einer verdünnten, neutralen Puf- ferlösung ; c) Trennbehandlung der unreinen Enzymfraktion in der genannten Pufferlösung zur Ab- trennung einer ersten Enzymfraktion von Materialien mit grösseren Molekülen ; d) Konzentrieren der ersten, gemäss Teilschritt c) erhaltenen Enzymfraktion zur Gewinnung einer zweiten Enzymfraktion, beispielsweise durch Filtration ;
und e) Abtrennen der genannten zweiten Enzymfraktion zur Entfernung der Materialien mit kleineren Molekülen und Isolierung des Enzyms daraus, z. B. durch Zentrifugierung.
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