KR830000368B1 - 에이스로포이에틴의 흡착분리법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

에이스로포이에틴의 흡착분리법

본 발명은 인뇨에서 에리스로포이에틴을 선택적으로 분리하기 위한 신규의 흡착분리법에 관한 것이다.

에리스로포이에틴은 적혈구 조혈을 특이적으로 작극 증진시키는 홀몬으로서 혈액간세포를 적혈구에 분화하는데, 필수의 인자이고, 이것의 저하결핍은 빈혈의 원인이 된다.

따라서 이 에리스로포이에틴은 빈혈 특히 신장성(腎臟性) 빈혈의 치료약으로서 유망시되어 있으나 입수가 어렵기 때문에 실용화되어 있지 않는 것이 실정이다.

에리스로포이에틴은 단백질이기 때문에 의약용도에 있어서는 항원성이 없는 사람에 유래하는 원료에서 제조하는 것이 바람직하고 인혈, 재생 불량성 빈혈등 특히 에리스로포이에틴 배설량이 많은 환자뇨등도 생각할 수 있으나, 실용화상의 애로인 공급난을 해소하기 위하여서는 이들로부터 총함량으로서는 휠씬 많은 건강인뇨로부터의 실용적 채취법을 개발하는 것이 가장 유리하다.

종래의 에리스로포이에틴의 분리, 정제의 연구는 환자뇨, 인혈등 소량의 원료을 사용한 것이 대다수이고, 농도가 낮기 때문에 대량의 원액처리가 필요한 건강인뇨로부터의 채취법으로서는 이들 종래방법은 축농율, 수율조작법, 경비의 점에서 부적당하다.

인뇨의 대량처리에는 직접 인뇨에 흡착제를 접촉시켜 에리스로포이에틴을 분리하는 방법이 실용적이라고 생각되나, 환자뇨도 포함하여 그와 같은 방법은 알려져 있지 않다. 종래 흡착제를 사용하는 에리스로포이에틴의 분리, 정제는 미리 침전제나 유기용매에 의한 침전, 염석, 투석등에 의하여 부분 정제한 에리스로포이에틴을 예를들면 음이온 교환제등에 흡착시키는 것이다. 그러나 본 발명자의 연구에 의하면 디에틸아미노에틸셀룰로오즈, 강염기성 또는 약염기성 이온교환수지를 직접 인뇨에 접촉시켜도 에리스로포이에틴을 거이 흡착시킬 수가 없었다.

거기서 본 발명자는 직접 인뇨에서 에리스로포에이틴을 선택적으로 흡착 분리할 수 있다. 실용적인 흡착제를 탐색하여 이하의 흡착제를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 pH를 6 내지 8에 조정한 인뇨에 다공성 폴리스티렌계흡착수지, 키토산, 또는 규조토의 어느것인가 일종을 칼럼법 또는 적당한 교반조내에서 현탁액으로 하고, 접촉시켜 에리스로포이에틴을 선택적으로 흡착하는 방법이다.

pH의 조정은 염산등의 광산 또는 유기산 및 수산화나트륨, 암모니아등의 알칼리를 사용하여 행할 수가 있다.

인뇨의 pH를 6 내지 8의 범위이외의 pH로는 에리스로포이에틴의 흡착율은 pH 6 내지 8의 경우보다도 저하한다.

흡착제에 흡착한 에리스로포이에틴은 각각의 흡착제에 적당한 용리법(溶離法)에 의하여 회수한다. 다공성 폴리스티렌계 흡착수지로부터의 용리회수에는 메틸알콜, 에틸알콜등의 유기용매, 알카리 또는 이들을 병용하여 행하면 된다. 키토산, 규조토로부터의 용리회수에는 수산화나트륨, 암모니아, 탄산나트륨등의 알칼리를 사용하여 행하면 된다.

여기서 말하는 인뇨라 함은 원뇨 또는 원뇨속의 미량유용성분(예를들면 유로키나제등)을 채취한 후의 에리스로포이에틴을 함유하는 것 같은 폐뇨를 말한다.

또 인뇨는 pH가 7이상의 조건으로는 경우에 따라 침전이 생기는 수가 있으므로 미리 약알칼리성으로서 생긴 침전을 제거하여 두는 것이 취급상 바람직하지만, 이 조작에 의하여서도 뇨속의 에리스로포이에틴은 상실되지 않고 또 이 조작을 실시하지 않아도 본 발명의 방법의 효과는 변치 않는다.

본 발명의 방법에 의한 수율은 높고 본 발명에 사용하는 흡착제는 값이 싸고, 뇨속의 에리스로포이에틴함량이나, 흡착제의 종류에 의하여서도 좌우되지만, 통상 그 첨가량도 처리하여야 할 뇨에 대하여 1%(W/V)이하의 소량으로도 충분하다. 또 이때문에 농축율도 높다는 이점이 있다. 또 이들의 흡착제는 통액성, 침강성도 우수하고 취급도 용이하다.

본 발명의 방법을 사용하면 종래 불가능하였든 건강인뇨 에리스로포이에틴의 실용적 대량조제도 가능해진다.

본 발명에 있어서의 에리스로포이에틴량의 정량은 적당히 농축, 투석한 피검시료를 코우트(P. M. Cotes)의 감압 다혈증 마우스법(P. M. Cotes & D. R. Bang ham, Nature Vol 19, P, 1065, 1961년)으로 역가 검정하고 에리스로포이에틴 국제표준품( WHO 2nd Internatioal Reference Preparation of Erythropoitin 67/343)의 검량선에 의하여 국제단위(IU)로 하여 표시하였다(L. Annable, P. M. Cotes & M. V. Muss ett, Bul. Wlb Hlth Org. Vol. 47 p. 99 1972년). 단백질 정량은 정제 우혈청 알부민을 표준으로 하여 부렛트법을 사용하였다(A. G. Gornall, C. S. Bard.awill, M. M. David, J. Biol. chem. Vol 177, P751, 1949년).

다음에 실시예에 의하여 본 발명을 설명한다.

[실시예 1]

에리스로포이에틴 14.9 IU를 함유하는 건강한 남자 수집뇨 10ℓ에 2N NaOH수용액을 적하하여 pH 8.50으로 하고 생긴 침전을 경사법에 의하여 제거한 후 2N HC l수용액을 적하하여 pH 7.5로 하고, 다공성 폴리스티렌계 흡착수지“앰버라이트 XAD―7”(롭 앤드 하스사제) 100g을 첨가하였다. 실온하 1.5시간 교반한 후, 상등액을 경사법에 의하여 제거하고 상기의 흡착수지를 회수하였다. 상등액중 에리스로포이에틴함량은 1.0 IU이하로 흡착율은 93%이상이었다.

흡착후의 상기의 흡착수지에 에틸알코올 80%(V/V)를 함유, pH 9. 24의 0. 01 M 트리스 완충액 400ml를 첨가하고, 7℃하에 3시간 교반한 후, 여과하고 용리액을 얻었다. 용리회수 에리스로포이에틴량은 13. 6IU로 회수율 91%이었다. 또 비활성(比活性)(총단백질량당의 에리스로포이에틴 역가 IU/mg 단백질)은 원뇨에 비교하여 6. 1배로 증가하였다.

또 인뇨를 pH 8. 50으로 하여 생긴 침전을 제거한 후에 있어서도 인뇨중, 에리스로포이에틴은 그 90. 3%가 상등액에 잔존하고 있는 것이 인정되었다.

흡착시의 뇨 pH조건을 pH 5. 72로 한 경우는 흡착율은 23%로 저하하였다.

[실시예 2]

에리스로포이에틴 7. 50 IU를 함유하는 건강인 남자 수집뇨 10ℓ에 2N NaOH수용액을 적하하여 pH 8. 50으로 하고 생긴 침전을 경사법에 의하여 제거한 후 2N HCl 수용액을 적가하고 pH 7. 0으로 하고 키토산“프로―낙크N”(쿄오와 유시고오교오(주)제) 87g을 첨가하였다. 실온하 1. 5시간 교반한 후 상등액을 경사법에 의하여 제거하여 프로낙크 N를 회수하였다.

흡착후의 프로낙크 N에 0. 5M NaCl를 함유하는 pH 11. 00의 0. 1M 탄산나트륨 완충액을 첨가하고 7℃하 세시간 교반한 후 여과하고 용리액을 얻었다. 용리회수에리스로포이에틴량은 5. 93IU로 회수율 79%이었다. 또 비활성은 원뇨에 비교하여 14. 6배로 증가하였다. 흡착시의 뇨 pH조건을 pH 5. 98로 한 경우는 회수율은 48%로 저하하였다.

[실시예 3]

에리스로포이에틴 11. 2IU를 함유하는 건강인 남자 수집뇨 10ℓ에 2N NaOH 수용액을 적가하고 pH 8. 50으로 하고 생긴 침전을 경사법에 의하여 제거한 후 2N HCl 수용액을 적하하고 pH 7. 00으로 하고 규조토(하이프로스―퍼―셀(Hyflo Super Cel)(죤즈, 맨푸사제) 100g를 첨가하였다. 실온하 35분 교반한 후 상등액을 경사법으로 제거하고 규조토를 회수하였다.

흡착 후의 규조토에 4% NH₃수용액(pH 12. 3) 400ml를 첨가하고 7℃하 35분 교반한 후 여과하고 용리액을 얻었다. 용출회수 에리스로포이에틴량은 5. 69IU로 회수율 50. 8%이었다. 또 비활성은 원뇨에 비교하여 12. 7배로 증가하였다. 흡착시의 뇨 pH조건을 pH 4. 30으로 한 경우는 회수율은 9.7%로 저하하였다.

Claims (1)

1. pH 6 내지 8의 인뇨에 다공성 폴리스티렌계 흡착수지, 키토산 또는 규조토를 접촉시키고 인뇨에리스로포이에틴을 선택적으로 흡착시키고 분리하는 것을 특징으로 하는 에리스로포이에틴의 흡착분리법.