JPS61234792A - マウスインタ−フエロンの精製法 - Google Patents
マウスインタ−フエロンの精製法Info
- Publication number
- JPS61234792A JPS61234792A JP60076714A JP7671485A JPS61234792A JP S61234792 A JPS61234792 A JP S61234792A JP 60076714 A JP60076714 A JP 60076714A JP 7671485 A JP7671485 A JP 7671485A JP S61234792 A JPS61234792 A JP S61234792A
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- JP
- Japan
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- mouse interferon
- interferon
- adsorbent
- mouse
- phosphate
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はマウスインターフェロンの精製法に関する。
［従来の技術］
インターフェロンは、抗ウィルス作用、抗癌作用をはじ
めとする多目的作用を持つタンパク質であり、近年、医
薬品としての開発は急速に進んでいる。しかし、インタ
ーフェロンの生体内での挙動や薬効およびその物性につ
いてはまだ不明な点が多く解明されるべき問題は多い。
めとする多目的作用を持つタンパク質であり、近年、医
薬品としての開発は急速に進んでいる。しかし、インタ
ーフェロンの生体内での挙動や薬効およびその物性につ
いてはまだ不明な点が多く解明されるべき問題は多い。
このような問題を動物を用いて非臨床的に評価する場合
、インターフェロンの種特異性のためにヒトのインター
フェロンは用いることができず、その動物のインターフ
ェロンが必要となる。ざらにこのような動物を用いたモ
デル実験の場合でも、正常な評価を下すためには、大量
にしかも全く不純物を含まないまでに精製されたその動
物種のインターフェロンを用いることが必要である。非
臨床実験に使われる動物にはマウス、ラット、ウサギ、
イヌ、サルなどが挙げられるが、なかでもマウスは最も
広く一般的に用いられ、インターフェロン研究の分野で
も例外ではない。それゆえ、インターフェロンを医薬品
として開発するためには、マウス−マウスインターフェ
ロンの同種系の動物実験による正当な評価が重要でおり
、それに用いる高品位のマウスインターフェロンが必要
とされている。
、インターフェロンの種特異性のためにヒトのインター
フェロンは用いることができず、その動物のインターフ
ェロンが必要となる。ざらにこのような動物を用いたモ
デル実験の場合でも、正常な評価を下すためには、大量
にしかも全く不純物を含まないまでに精製されたその動
物種のインターフェロンを用いることが必要である。非
臨床実験に使われる動物にはマウス、ラット、ウサギ、
イヌ、サルなどが挙げられるが、なかでもマウスは最も
広く一般的に用いられ、インターフェロン研究の分野で
も例外ではない。それゆえ、インターフェロンを医薬品
として開発するためには、マウス−マウスインターフェ
ロンの同種系の動物実験による正当な評価が重要でおり
、それに用いる高品位のマウスインターフェロンが必要
とされている。
従来、マウスインターフェロンの精製法は、Ｉｗａｋｕ
ｒａら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３．５０７４
（１９７８） ） 、Ｄｅ Ｈａｅｙｅｒ−Ｇｕｉｇｎ
ａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ、２７１．６２２ （１９７２
））他多数報告されているが、その中でもマウスインタ
ーフェロンに対する抗体を用いた方法は１段の精製によ
り高純度の標品を得ることができる優れた方法である。
ｒａら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３．５０７４
（１９７８） ） 、Ｄｅ Ｈａｅｙｅｒ−Ｇｕｉｇｎ
ａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ、２７１．６２２ （１９７２
））他多数報告されているが、その中でもマウスインタ
ーフェロンに対する抗体を用いた方法は１段の精製によ
り高純度の標品を得ることができる優れた方法である。
しかし、特異性の高い抗体はその調製法がむずかしく、
大量に得るのが困難であるために、大量精製には適用し
にくい。このため、抗体法にかわる安価で大量に入手可
能な担体によるマウスインターフェロンの高純度かつ大
量精製法の確立が必要とされている。
大量に得るのが困難であるために、大量精製には適用し
にくい。このため、抗体法にかわる安価で大量に入手可
能な担体によるマウスインターフェロンの高純度かつ大
量精製法の確立が必要とされている。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明は前記のように非臨床的研究に必要な、高品位の
精製マウスインターフェロンの供給をするために、マウ
スインターフェロンの高純度精製法の確立を目的とする
。
精製マウスインターフェロンの供給をするために、マウ
スインターフェロンの高純度精製法の確立を目的とする
。
［問題を解決するための手段］
本発明はマウスインターフェロン溶液を、シリカ系吸着
剤に接触させる工程、該吸着剤への吸着物を溶出剤にて
溶出させる工程、この溶出液をリン酸塩からなる吸着剤
に接触させる工程、リン酸塩からなる吸着剤への吸着物
を溶出剤にて溶出させる工程からなるマウスインターフ
ェロンの精製法である。
剤に接触させる工程、該吸着剤への吸着物を溶出剤にて
溶出させる工程、この溶出液をリン酸塩からなる吸着剤
に接触させる工程、リン酸塩からなる吸着剤への吸着物
を溶出剤にて溶出させる工程からなるマウスインターフ
ェロンの精製法である。
ここでいうマウスインターフェロンとはα型、β型およ
びγ型のいずれでもよく、たとえばマウスＣ−２４細胞
、マウスＣ−２４３細胞などのマウス細胞により産生き
れるマウスインターフェロン、および遺伝子組換え技術
を用いてマウスインターフェロン構造遺伝子を組込んだ
大腸菌、酵母などの微生物や、ハムスター、サルなどの
動物細胞により産生されるマウスインターフェロン等が
挙げられる。
びγ型のいずれでもよく、たとえばマウスＣ−２４細胞
、マウスＣ−２４３細胞などのマウス細胞により産生き
れるマウスインターフェロン、および遺伝子組換え技術
を用いてマウスインターフェロン構造遺伝子を組込んだ
大腸菌、酵母などの微生物や、ハムスター、サルなどの
動物細胞により産生されるマウスインターフェロン等が
挙げられる。
本発明で使用する吸着剤は、シリカを含む吸着剤であれ
ばいずれも用いうるが、たとえば“コントロール ポア
グラス” （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ
社製）、“マイクロビーズシリカ″（富士デビンン社製
）などがある。
ばいずれも用いうるが、たとえば“コントロール ポア
グラス” （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ
社製）、“マイクロビーズシリカ″（富士デビンン社製
）などがある。
精製初段に用いられるシリカ系吸着剤によるマウスイン
ターフェロンの精製操作は次のように行なう。すなわち
、まずマウスインターフェロンを含む溶液をシリカ系吸
着剤に接触吸着させる。吸着はバッチ法、カラム法、ど
ちらでも可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い
。マウスインターフェロンは、ｐＨ６〜９で吸着される
。
ターフェロンの精製操作は次のように行なう。すなわち
、まずマウスインターフェロンを含む溶液をシリカ系吸
着剤に接触吸着させる。吸着はバッチ法、カラム法、ど
ちらでも可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い
。マウスインターフェロンは、ｐＨ６〜９で吸着される
。
溶離は溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎水度によって決
定される。たとえば酸性領域（１）Ｈ２〜５）でマウス
インターフェロンは溶離する。また高イオン強度下では
広いＤＨ領域（１）Ｈ２〜９）での溶離が可能となる。
定される。たとえば酸性領域（１）Ｈ２〜５）でマウス
インターフェロンは溶離する。また高イオン強度下では
広いＤＨ領域（１）Ｈ２〜９）での溶離が可能となる。
このイオン強度はリン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸等の
緩酊塩の濃度を上げたり塩化ナトリウム、塩化カリウム
のような中性塩の添加（０，２〜１．０Ｍ）により増加
させることができる。ざらに溶出剤中にエチレングリコ
ール、プロピレングリコール等の疎水的相互作用を弱め
る溶剤を含む場合、あるいは“トリトンＸ−１００”、
コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む（０，１〜１
％）場合には、その溶出力はざらに強くなる。
緩酊塩の濃度を上げたり塩化ナトリウム、塩化カリウム
のような中性塩の添加（０，２〜１．０Ｍ）により増加
させることができる。ざらに溶出剤中にエチレングリコ
ール、プロピレングリコール等の疎水的相互作用を弱め
る溶剤を含む場合、あるいは“トリトンＸ−１００”、
コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む（０，１〜１
％）場合には、その溶出力はざらに強くなる。
溶出剤の組成や濃度、液量は特に限定されるものではな
く、それぞれ材料とした粗マウスインターフェロン中に
含まれる夾雑タンパク質を除去するのに有効なｐＨを保
持するのに必要な濃度、吸着されたマウスインターフェ
ロンを実用的に回収するのに必要な量が用いられる。
く、それぞれ材料とした粗マウスインターフェロン中に
含まれる夾雑タンパク質を除去するのに有効なｐＨを保
持するのに必要な濃度、吸着されたマウスインターフェ
ロンを実用的に回収するのに必要な量が用いられる。
その中でも夾雑タンパク質をほとんど溶出させることな
くマウスインターフェロンだけを選択的に溶離させるこ
とにより高純度のマウスインターフェロンを得ることが
できるものとして、ｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ４，５
〜５．５の酸性緩衝液でタンパク質中の疎水的相互作用
を弱めるエチレングリコール、プロピレングリコール等
の有機溶媒を０〜１５％（Ｖ／Ｖ）含む溶液が特に好ま
しく用いられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液等が用いられる。このような溶出剤は、マウスイ
ンターフェロンに対して安定かつ温和な条件であり、し
かも２段目のクロマトグラフィーにそのまま直接適用で
きるものである。
くマウスインターフェロンだけを選択的に溶離させるこ
とにより高純度のマウスインターフェロンを得ることが
できるものとして、ｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ４，５
〜５．５の酸性緩衝液でタンパク質中の疎水的相互作用
を弱めるエチレングリコール、プロピレングリコール等
の有機溶媒を０〜１５％（Ｖ／Ｖ）含む溶液が特に好ま
しく用いられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液等が用いられる。このような溶出剤は、マウスイ
ンターフェロンに対して安定かつ温和な条件であり、し
かも２段目のクロマトグラフィーにそのまま直接適用で
きるものである。
ざらに本発明者らは上記クロマトグラフィーで得られる
精製マウスインターフェロン溶出液中にわずかに残存し
た夾雑タンパク質を効果的に除去するために、二段目の
精製ステップに導入すべくクロマトグラフィーを検討し
た。各種クロマトグラフィーを鋭意研究の結果、リン酸
塩からなる吸着剤を用いたクロマトグラフィーが本要求
に適うことを見出した。
精製マウスインターフェロン溶出液中にわずかに残存し
た夾雑タンパク質を効果的に除去するために、二段目の
精製ステップに導入すべくクロマトグラフィーを検討し
た。各種クロマトグラフィーを鋭意研究の結果、リン酸
塩からなる吸着剤を用いたクロマトグラフィーが本要求
に適うことを見出した。
ここでいう吸着剤はリン酸塩からなる吸着剤であれば、
いずれも用いうるがたとえば、一般的にハイトロキシル
アパタイトと呼ばれるリン酸カルシウム塩などがある。
いずれも用いうるがたとえば、一般的にハイトロキシル
アパタイトと呼ばれるリン酸カルシウム塩などがある。
このようなリン酸カルシウム塩は゛バイオゲルＨＴ Ｐ
”、“バイオゲルＨＴ”＜ Ｂ １ｏ−ｒａｄ社製）
などの商品名で市販されている。
”、“バイオゲルＨＴ”＜ Ｂ １ｏ−ｒａｄ社製）
などの商品名で市販されている。
リン酸塩からなる吸着剤によるマウスインターフェロン
の精製操作は次のように行う。シリカ系吸着剤から溶出
されたマウスインターフェロン溶液を好ましくはＩ）ｌ
−１５以上の条件下で吸着させる。
の精製操作は次のように行う。シリカ系吸着剤から溶出
されたマウスインターフェロン溶液を好ましくはＩ）ｌ
−１５以上の条件下で吸着させる。
吸着はバッチ法、カラム法どちらでも可能であるが、カ
ラム法の方が吸着効率が高い。
ラム法の方が吸着効率が高い。
溶離は、リン酸緩衝液で行い、ｐＨ５以上が好ましく、
リン酸緩衝液濃度は０．１Ｍ以上で用いられる。溶出剤
の組成、液量は特に限定されるものではなく、最適な溶
離条件は存在する夾雑タンパク質、およびマウスインタ
ーフェロンの量、カラムの寸法などに応じて適宜決定さ
れる。
リン酸緩衝液濃度は０．１Ｍ以上で用いられる。溶出剤
の組成、液量は特に限定されるものではなく、最適な溶
離条件は存在する夾雑タンパク質、およびマウスインタ
ーフェロンの量、カラムの寸法などに応じて適宜決定さ
れる。
このようにしてマウスインターフェロンをシリカ系吸着
剤に吸着溶離させ、ざらにこの溶出液を銅キレート担体
に吸着溶離させることにより、粗マウスインターフェロ
ン中に混在していた夾雑タンパク質を除去して、選択的
にマウスインターフェロンを精製分離することができる
。
剤に吸着溶離させ、ざらにこの溶出液を銅キレート担体
に吸着溶離させることにより、粗マウスインターフェロ
ン中に混在していた夾雑タンパク質を除去して、選択的
にマウスインターフェロンを精製分離することができる
。
［発明の効果］
マウスインターフェロンはマウスを用いたインターフェ
ロンの非臨床試験およびタンパク質化学的なインターフ
ェロン研究のために必要とされていながら、その簡便に
してかつ大量調製可能な高純度精製法が未だ報告されて
いない。
ロンの非臨床試験およびタンパク質化学的なインターフ
ェロン研究のために必要とされていながら、その簡便に
してかつ大量調製可能な高純度精製法が未だ報告されて
いない。
本発明は簡便にしてかつ大量処理を可能とし、しかも高
純度のマウスインターフェロンを得る精製法である。水
沫で得られるマウスインターフェロンは精製前に比べ、
比活性で数十倍に、しかもドデシル硫酸ナトリウム存在
下のポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
による検定で・は純度９９％まで精製され、非臨床試験
に用いるのに充分な精製標品である。初段に用いられる
シリカ系吸着剤は硬質で化学的にも安定で取り扱いが楽
なため、特に精製初段で大量の粗原液を処理するのに適
している。さらに２段目の精製ステップとなるリン酸塩
からなる吸着剤を用いたクロマトグラフィーはマウスイ
ンターフェロンに特異性が高く、これにより一部残存し
ていた夾雑タンパク質を除去することができる。このよ
うに本発明により特異性と分離能の高い二種類のアフィ
ニティークロマトグラフィーを何ら特殊操作を加えるこ
となく直結し、簡便にして高純度の精製マウスインター
フェロンを大量に得ることが可能になった。
純度のマウスインターフェロンを得る精製法である。水
沫で得られるマウスインターフェロンは精製前に比べ、
比活性で数十倍に、しかもドデシル硫酸ナトリウム存在
下のポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
による検定で・は純度９９％まで精製され、非臨床試験
に用いるのに充分な精製標品である。初段に用いられる
シリカ系吸着剤は硬質で化学的にも安定で取り扱いが楽
なため、特に精製初段で大量の粗原液を処理するのに適
している。さらに２段目の精製ステップとなるリン酸塩
からなる吸着剤を用いたクロマトグラフィーはマウスイ
ンターフェロンに特異性が高く、これにより一部残存し
ていた夾雑タンパク質を除去することができる。このよ
うに本発明により特異性と分離能の高い二種類のアフィ
ニティークロマトグラフィーを何ら特殊操作を加えるこ
となく直結し、簡便にして高純度の精製マウスインター
フェロンを大量に得ることが可能になった。
次に実施例を挙げて本発明をざらに具体的に説明する。
実施例中のマウスインターフェロン活性は、マウスＬＹ
細胞と水泡性口内炎ウィルス（ＶＳ■）を細胞変性効果
（ＣＰＥ）阻止法により測定し、標準マウスインターフ
ェロンにより国際単位（ＩＵ）に換算した。
細胞と水泡性口内炎ウィルス（ＶＳ■）を細胞変性効果
（ＣＰＥ）阻止法により測定し、標準マウスインターフ
ェロンにより国際単位（ＩＵ）に換算した。
実施例１
マウスインターフェロン−β構造遺伝子を組込んだ大腸
菌（微工研菌寄第７６６２号）を培養１多、菌体を破砕
し遠心上清として粗マウスインターフェロンーβ溶液を
得た。この粗マウスインターフェロン溶液には１．６ｘ
１０７１Ｕ／ｍｌのマウスインターフェロン活性を含み
、１９ｍｇ／ｍＩのタンパク質が含まれていた。この溶
液２５００ｍ１を“コントロール ポア グラス”３０
０ｍ１（４４φＸ２００ｍｍ＞に４°Ｃ１流速１５０ｍ
１／ｈｒで流した。つづいてこのカラムを５０％エチレ
ングリコールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
＞３３００ｍｌで洗浄した後、０゜５Ｍ塩化ナトリウム
と１５％エチレングリコールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５，０）で溶出した。マウスインターフェロン−
βは活性回収率８０％で比活性は１０倍に上昇し、純度
８０％まで精製された。
菌（微工研菌寄第７６６２号）を培養１多、菌体を破砕
し遠心上清として粗マウスインターフェロンーβ溶液を
得た。この粗マウスインターフェロン溶液には１．６ｘ
１０７１Ｕ／ｍｌのマウスインターフェロン活性を含み
、１９ｍｇ／ｍＩのタンパク質が含まれていた。この溶
液２５００ｍ１を“コントロール ポア グラス”３０
０ｍ１（４４φＸ２００ｍｍ＞に４°Ｃ１流速１５０ｍ
１／ｈｒで流した。つづいてこのカラムを５０％エチレ
ングリコールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
＞３３００ｍｌで洗浄した後、０゜５Ｍ塩化ナトリウム
と１５％エチレングリコールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５，０）で溶出した。マウスインターフェロン−
βは活性回収率８０％で比活性は１０倍に上昇し、純度
８０％まで精製された。
つぎに、マウスインターフェロン−β活性を含む上記溶
出液２２ｍ１を、０．ＩＮ ＮａＯＨでｐＨ８に調整
し、ハイトロキシルアパタイト′“バイオゲルＨＴ”２
ｍ１（１０φｘ２５ｍｍ）に４℃、流速２ｍｌ／ｈｒで
流した。つづいてこのカラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐｔ−１７，４）’ｌ Ｑｍ ｌで洗浄した後、０．１
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４＞でマウスインターフェ
ロン−βを溶出した。マウスインターフェロン−βは活
性回収率８５％で純度は９９％まで精製された。この結
果、精製原液に対するマウスンターフェロンーβの比活
性は約３８倍に上昇し、純度９９％の精製標品が得られ
た。
出液２２ｍ１を、０．ＩＮ ＮａＯＨでｐＨ８に調整
し、ハイトロキシルアパタイト′“バイオゲルＨＴ”２
ｍ１（１０φｘ２５ｍｍ）に４℃、流速２ｍｌ／ｈｒで
流した。つづいてこのカラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐｔ−１７，４）’ｌ Ｑｍ ｌで洗浄した後、０．１
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４＞でマウスインターフェ
ロン−βを溶出した。マウスインターフェロン−βは活
性回収率８５％で純度は９９％まで精製された。この結
果、精製原液に対するマウスンターフェロンーβの比活
性は約３８倍に上昇し、純度９９％の精製標品が得られ
た。
Claims (2)
- （１）マウスインターフェロン溶液を、シリカ系吸着剤
に接触させる工程、該吸着剤への吸着物を溶出剤にて溶
出させる工程、この溶出液をリン酸塩からなる吸着剤に
接触させる工程、リン酸塩からなる吸着剤への吸着物を
溶出剤にて溶出させる工程からなるマウスインターフェ
ロンの精製法。 - （２）シリカ系吸着剤への吸着物を溶出させる溶出剤が
ｐＨ４〜６の緩衝液である特許請求の範囲第（１）項記
載の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60076714A JPS61234792A (ja) | 1985-04-12 | 1985-04-12 | マウスインタ−フエロンの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60076714A JPS61234792A (ja) | 1985-04-12 | 1985-04-12 | マウスインタ−フエロンの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61234792A true JPS61234792A (ja) | 1986-10-20 |
Family
ID=13613217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60076714A Pending JPS61234792A (ja) | 1985-04-12 | 1985-04-12 | マウスインタ−フエロンの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61234792A (ja) |
-
1985
- 1985-04-12 JP JP60076714A patent/JPS61234792A/ja active Pending
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