JPS61129199A - ヒト・インタ−フエロンβの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト・インターフエロンβ（以下、ＩＦＮ−β
と略す）の精製法に関する。

［従来の技術］ ＩＦＮ−βはヒト細胞がウィルスや合成核酸などに刺激
されることによって、細胞が産生ずる抗ウィルス活性や
抗腫瘍活性をもつタンパク質である。ＩＦＮ−βの産生
にはヒト培養細胞をポリ■：ボリＣなどのインターフェ
ロンインデューナーで刺激して産生ずる方法と、ｒＦＮ
−β遺伝子を大腸菌や酵母などの微生物や動物細胞に組
み込んで産生させる遺伝子組換えによる方法があり、現
在どちらも開発が進んでいる。このＩＦＮ−βを医薬品
として利用するためには、細胞や微生物によって産生さ
れた粗ＩＦＮ−βを安全性が認められた純度にまで精ｔ
！純化しなければならない。したがって、ＩＦＮ−βを
いかに効率良く高純度に精製分離するかが、ＩＦＮ−β
を医薬品として開発する際の極めて重要な技術となる。

特に遺伝子組換え法により得られたＩＦＮ−βを精製す
る場合には、微生物由来タンパク質、異種動物由来タン
パク質が精製対象液に多量に含まれているために、これ
らを完全に取り除く必要があり、高度な精製法が要求さ
れる。

ＩＦＮ−βを精製するためには各種のクロマトグラフィ
ーが開発°され、特にＩＦＮ−βに親和性のある物質を
結合した担体を用いる、いわゆるアフィニティークロマ
トグラフィーが良い成績を納めている。ＩＦＮ−βの精
製は、通常二段あるいは三段のクロマトグラフ、Ｃ−の
組み合せによって行われているが、収率や純度の点でま
だ改良すべき余地が残っている。

アフィニティークロマトグラフィーの中で最も特異性が
高いものは抗ＩＦＮ−β抗体をリガンドとして用いる抗
体クロマトグラフィーであり、その試みもいくつか報告
されている（　Ｏｋａｍｕｒａら、［３ｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　、　１９．３８３１　（１９８０）、＠　ｏ
ｃｈｋｅｐｐｅｌ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　、　２９１　、
５００　（１９８１）　、　Ｎｏｖｉｃｋら、Ｊ　９ｇ
ｅｎ、Ｖ　１ｒｏ１．　、６４　。

９０５　（１９８３））。しかし、特異性が極めて高い
にもかかわらず、抗体クロマトグラフィー一段ではまだ
完全純化は難しく、実用的には次に何らかの精製手段を
つなげる必要がある。

［発明が解決しようとする問題点〕 ＩＦＮ−βの精製において、抗体クロマトグラフィーは
特異性が極めて高いにもかかわらず、次の問題点を残し
ている。

まず、高特異性ではあるがこの方法だけでは■ＦＮ−β
の完全純化は難しいことである。原理的には抗ＩＦＮ−
β抗体はＩＦＮ−βだけを吸着するが、実際には抗ＩＦ
Ｎ−β抗体を不溶化した担体にはＩＦＮ−β以外の夾雑
タンパク質も微開であるが吸着され、溶出液にそれが混
入することがある。また、リガンドである抗ＩＦＮ−β
抗体がわずかながらも溶出液中に離脱してくる恐れもあ
る。ＩＦＮ−βの完全純化のためには、これらの夾雑物
を除去しなければならず、抗体クロマトグラフィーの次
に何らかの精製手段をつなげる必要がある。

本発明は上記の抗体クロマトグラフィーの問題点を解決
し、ｒＦＮ−βの精製法において抗体クロマトグラフィ
ーの高特異性を損うことなく、■ＦＮ−βを高純度かつ
高収率で精製することを目的とする。

し問題点を解決するための手段］ 本発明は、ＩＦＮ−β溶液を抗ＩＦＮ−β抗体を不溶化
した担体に接触させる工程、該担体への吸着物を溶出剤
にて溶出させる工程、溶出物を金属をキレート化させた
担体に接触させる工程、および該金属キレート担体に吸
着したヒト・インターフエロンβを溶出剤にて溶出させ
る工程からなるｒＦＮ−βの精製法である。

ここで言うＩＦＮ−βとは、ヒト培養細胞をウィルスや
合成核酸などで刺激させることにより産生されるＴＦＮ
−β、および遺伝子組換え技術を用いてＩＦＮ−β構造
遺伝子を組み込んだ大腸菌、酵母などの微生物や、ハム
スター、サルなどの動物細胞により産生されるｊＦＮ−
βを指す。

精製初段のリガンドに用いられる抗ＩＦＮ−β抗体は、
ＩＦＮ−βを結合し得る抗体であれば特に限定されない
が、常法により動物に免疫して得られる抗体あるいは細
胞融合技術によるモノクローナル抗体を指す。これらの
抗体の不溶化には、セルロース、アガロース、架橋デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスなどの担
体が用いられ、不溶化反応はいずれもペプチド中の７ミ
ノ基あるいはカルボキシル基と導入された活性化置換基
との結合により行われる。主な活性化置換基として、シ
アン化ブロム活性基（たとえば、“ＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４Ｂ”：ファルマシア社）、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル基（たとえば゛活性化ＣＨ−セフ
ァ０−ス４Ｂ″；ファルマシア社、“アフィゲル−ｉｏ
”：バイオラッド社）、スルホンエステル基（たとえば
゛トレシル活性化セファ０−ス４Ｂ”：ファルマシア社
）、ホルミル基（たとえば“′ホルミルーセルロファイ
ン″；チッソ（株））、ヒドラジド誘導体（たとえば″
オイパーギットＣ゛°；ローム・ファーマ社）、アンヒ
ドリド基（たとえば゛オイパーギット△″：ローム・フ
ァーマ社）などが挙げられる。

抗ＩＦＮ−β抗体を不溶化した担体（以下、抗ＩＦＮ−
β抗体不溶化担体と略す）を用いた抗体りＯマドグラフ
ィーの実際の操作は次のように行う。すなわち、まずヒ
ト細胞培養上清、遺伝子組換え大腸菌破砕遠心上清ある
いは遺伝子組換え動物細胞培養上清などの粗ＩＦＮ−β
溶液を抗ＩＦＮ−β抗体不溶化担体と接触吸着させる。

吸着法はバッチ法、カラム法どららでも可能であるが、
カラム法の方が吸着効率が高い。吸着条件はＥ）Ｈ５〜
９、のぞましくはｐＨ６〜８であり、１Ｍ程度の無機塩
は存在していても吸着に影響はない。

吸着後、適当な中性緩衝液で十分に担体を洗って夾雑タ
ンパク質を除去した後、ｐｉ−ｔ２〜３の酸性緩衝液あ
るいはチオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム
などのカオトロピック塩や界面活性剤を含む中性かアル
カリ性緩衝液で吸着した１ＦＮ−βを溶出させる。多く
の場合、酸性緩衝液が用いられ、その組成は、たとえば
０．１Ｍクエン酸、０．１〜０．２Ｍグリシン塩酸、１
Ｍ酢酸、イオン強度０．０５以下の塩酸、硫酸、ギ酸な
どであり、適宜無機塩（たとえば０．５〜１Ｍ塩化ナト
リウム）や水溶性有機溶媒（たとえばグリセロールやエ
チレングリコール〉、界面活性剤（たとえば゛［・リド
ンＸ−１００”）などを加えることもある。どのような
組成の酸性緩衝液を選択するかは、目的とするＩＦＮ−
βの溶出効果、その緩衝液中におりるＩＦＮ−βの安定
性、リガンドである抗体への影響、そして次につづくク
ロマト系への適応性などを考慮する必要がある。

精製ステップ二段目に導入されるべきりＯマド系は、タ
ンパク質の分離能が高く、かつ高収率であることが必要
とされる。この点、タンパク質の精製に多くの場合用い
られるイオン交換クロマトグラフィー（たとえばスルホ
プロピル基によるイオン交換クロマトグラフィー）はＩ
ＦＮ−βと夾雑タンパク質の分離が悪く、また収率も低
く不適であった。またＩＦＮ−βの精製法として報告さ
れているアフィニティークロマトグラフィーでも、コン
カナバリンＡをリガンドしたクロマトグラフィーは糖鎖
をもたない遺伝子組換え型ＩＦＮ−βには不適である。

本発明者らは、抗体クロマトグラフィーの利点を活かし
ながら、かつわずかに残っている夾雑タンパク質を効果
的に取り除くことが可能な二段目の精製ステップに導入
すべくクロマトグラフィーを鋭意研究の結果、金属をキ
レート化させた担体を用いた金属キレートクロマトグラ
フィーがこれらの要求に適うことを見出した。

本発明に適用した金属キレートクロマトグラフィーは、
すでに単独に血清タンパク質の分Ｎ１精製法としてｐｏ
ｌ’ａｔｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ　、　２５８．５９８（
１９７５））によって報告されており、また■ＦＮ−β
に関してはＥｄｙら（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ　
＋１２５２．５９３４　　（１９７７））やＨｅ１ｎｅ
ら　（Ｊ。

ｇｅｎ　、ｖｉｒｏｌ、　、　５土、４７　（１９８１
））によって報告されているが、収率や精製度の点で十
分でない。したがって、抗体クロマト法と連結して、か
つ抗体クロマトグラフィーから混入する恐れのある免疫
グロブリンの除去も狙った本発明を予測さけるものでは
ない。

金属キレートクロマドグラフイーのリガンドである金属
は、キレート能を有する交換基、たとえばビスカルボキ
シメチルイミノ ＣＯＯＨ）２　］が結合したキレート基を有する不溶性
多糖類系担体、または三次元架橋したポリオレフィン系
担体などにキレートされる。好ましくはビスカルボキシ
メチルイミノ基を有するアガロースなどの不溶性多糖類
系担体が用いられ、たとばエポキシ鎖をスペーサーとし
た市販されているキレート化担体（“キレ−ティング・
セファロース６Ｂ”：ファルマシア社）は下式のような
化学構造をもつ。

（ただしＭｅはＺｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎ１２＋またはＣ
Ｕ　２＋を示す〉 金属のキレート化は、キレート基をもっ担体（′たとえ
ば゛キレーティング・セファロース６Ｂ″（ファルマシ
ア社）、あるいは“エポキシ活性化セファ０−ス６Ｂ”
　（ファルマシア社）にイミノジ酸をカップリングさせ
た担体）に５Ｑｍｌｙｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に１
％の金属塩を含む溶液を接触させることで行われ、１ｎ
＋Ｉゲル当り２０〜３０μＭの金属がキレートされる。

こうして調整された金属キレート担体へのタンパク質の
吸着は主に中性領域で行われ、その吸着反応にはタンパ
ク質分子中のヒスチジン残基とシスティン残基が関与し
ていると考えられている。

抗体クロマトグラフィーと金属キレートクロマトグラフ
ィーの組み合せによるＩＦＮ−βの精製は次のように行
う。抗体クロマトグラフィーで溶出されたＩＦＮ−β溶
液をそのまま、あるいは中性にｐＨを調整した後、金属
キレート担体に接触させるが、好ましくは中性条件下で
接触さ才る。

金属キレート担体に吸着させた後、高イオン強度の弱酸
性緩衝液、たとえば０．５〜ＩＭ塩化ナトリウムを含む
酢酸緩衝液（＋）Ｈ６，０〜８．０）で担体を洗浄する
ことにより、ＩＦＮ−β以外の夾雑タンパク質はほとん
どすべて除去することができる。ＩＦＮ−βの溶出には
０．５〜１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液（１）Ｈ
３，Ｏ〜６゜０）あるいは０．１Ｍ程度のエチレンジア
ミン四酢酸やイミノジ酢酸、あるいはヒスチジン等の中
性緩ｍ液が用いられる。どの溶出剤を用いるかは、金属
種とｒＦＮ−βとの結合力によって左右され、適宜適当
な溶出剤が選択される。また緩衝液の濃度および液口は
特に限定されるものではなく、ｐ）−１を保持するのに
必要な濃度および吸着されたＩＦＮ−βが実質的に回収
されるのに必要な檄が用いられる。

このようにして本発明方法でＩＩされたＩＦＮ−βは高
濃度であり、混入の恐れのある抗体（免疫グロブリン）
も酵素免疫測定法（ＥＩＡ）では認められなかった。す
なわち、抗体りＯマドグラフィーから溶出したＩＦＮ−
βを金属キレート担体に吸着させることにより、ＩＦＮ
−βに特異性の高い二種類の７フイニテイークロマトグ
ラフイーを直結し、簡便にして高品位の精製ＩＦＮ−β
を得る本発明を完成した。

［発明の効果］ ＩＦＮ−βは現在、抗腫瘍剤および抗ウィルス剤として
の期待からその臨床評価のために大量に供給されること
が社会的にも要請されている。■ＦＮ−βの今までの量
的制約の原因は、細胞による産生ｍ自体が少ないこと、
高収率、高精製度で行える精製法の開発が難しかったこ
とである。しかしながら、遺伝子操作技術により、生産
量的には大量に供給されることが可能となってきた現在
、高性能な精製法を開発することが大きな課題であった
。

本発明方法で精製されたＩＦＮ−βは極めて高純度であ
り、夾雑タンパク質や免疫グロブリンの混入は放射性免
疫測定法（ＲＩＡ）や酵素免疫測定法（ＥＩＡ）では認
められなかった。すなわち、抗体クロマトグラフィーで
高度に精製し、さらに金属キレートクロマトグラフィー
によりわずかに残存している夾雑タンパク質を除去でき
ることを見出した。本発明は、特異性と分離能の高い二
種類のアフィニティークロマトグラフィーを直結し、簡
便にして高品位の精製ＩＦＮ−βを得る方法である。

これまで述べてきたように、本発明はＩ　ＦＮ−βの精
製法において新技術を提供するものである。

数あるアフィニティークロマトグラフィーのうち、抗体
クロマトグラフィーはその高い特異性のゆえに注目され
てはきたが、実用に際しては、精製度の不足、抗体のリ
ークのおそれなどの問題が残っていた。本発明は抗体ク
ロマトグラフィーと金属キレートクロマトグラフィーを
組み合せ、これらの問題を一挙に解決するものである。

したがって、本発明による精製法では抗体クロマトグラ
フィーの高特異性が十分に活かされ、高精製度、高収率
で［ＦＮ−βの精製が可能であり、本発明方法により得
られる精製ＩＦＮ−β標品は高品位で安全性の高いもの
である。しかもクロマト操作も簡便で、再現性も高く大
量処理にも適う精製法である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。実施例中のｒＦＮ−０話性は、ヒト羊膜由来のＦＬ細
胞と水胞性口炎ウィルス（ＶＳＶ）を用いた細胞変性効
果（ＣＰＥ）阻止法により測定し、標準ＩＦＮ−βによ
り国際単位（ＩＵ）にｗ４算したものである。

実施例１ １ＦＮ−β構造遺伝子を組み込んだ大腸菌を十分培養増
殖させた後、高圧により菌体を破砕した。

ざらに、０．５％ポリエチレンイミンを加えて核酸を除
去した後、７０％飽和硫安を加えてタンパク質を塩析し
、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０　ｍＭリン酸緩衝液（
１）Ｈ７，４）で再溶解し、精製原液とした。精製原液
のタンパク質量は３０ｍＧ／ｍｌであり、ＩＦＮ−β活
性は６Ｘ１０’３１Ｕ／ｍ１であった。

この精製原液１００ｍ１を、ＩＦＮ−βで感作したマウ
ス牌臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞により
産生された抗ＩＦＮ−βのマウスモノクローナル抗体（
特願昭５８−１９３３７号）を不溶化さけたアガロース
カラム５ｍ１（１６φｘ２５ｍｍ）に４°Ｃで吸着させ
た。素通り液には加えた堡の約９０％のタンパク質が含
まれていたが、ＩＦＮ−β活性は認められなかった。つ
づいて抗体カラムを１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）１００ｍ１で洗浄した後
、１５ｍ　Ｍ塩酸（イオン強度０．０１５、ｐＨ２゜０
）５０ｍｌでＩＦＮ−βを溶出した。１ＦＮ−β活性の
回収率は１００％で、純度はドデシル硫酸ナトリウム含
有ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析で７８％
であった。比活性は１５０倍上昇した。

つづいて、“′キレーティング・ＵファＯ−ス６Ｂ　Ｉ
Ｉカラム２ｍ１（１０φｘ２（３ｍｍ）に５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐｉ−１５，０）で１％溶液とした塩化亜鉛、
塩化コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅の各金属塩溶液を
４ｍｌ流して各金属キレートカラムを調整した。そして
抗体カラムから溶出されたｒＦＮ−β活性を含む溶液を
ｐＨ６，０〜８．０に調整し、上記の各金属ギレート力
ラムに４℃で流して、ＩＦＮ−βを吸着させた。吸着後
５　　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）２０ｍｌ、さら
に０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４＞２０ｍ１および０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍ１ｉｔｌ緩衝液（１）ｌ−１’５．６
）　２０ｍ１で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）１０ｍｌおよび
５０％エチレングリコールを含む０．１Ｍヒスチジン（
１）８７．４）１０ｍｌでＩＦＮ−βを回収した。各キ
レ−１〜担体のＩＦＮ−β活性の回収率および精製度は
表１のようになった。

実施例２ ヒト正常二倍体線維芽細胞を５％胎児牛血清を含むイー
グルＭＥＭ培地を用いて３７℃で培養して十分増殖させ
た後、ポリＩ：ポリＣでＩＦＮ−βを誘発した。５Ａ発
後の培養上清には、２．０×１０’ＩｔＪ／ｍｌのＩＦ
Ｎ−β活性があり、タンパク質量はン５μ（１／ｍｌあ
った。

この培養上清５Ｄ、を精製原液として、実施例１で用い
た抗体カラム１　ｍｌ　（１０φｘ１３ｍｍ＞に４℃吸
着さぼた。素通り液には加えた量の９９％のタンパク質
が含まれていたが、ＩＦＮ−β活性は認められなかった
。つづいて抗体カラムを５０％エチレングリコールを含
む１５ｍＭ酢酸緩衝液（１）Ｈ４，０）２０ｍｌで洗浄
した後、１５ｒｍＭ塩酸（イオン強ｇ　Ｏ，０１５、ｐ
Ｈ２，０）　１０ｍｌでＩＦＮ−βを溶出した。ＩＦＮ
−β活性の回収率は９５％で、比活性は１２５倍上昇し
た。

つづいて、この抗体カラムのＩ　Ｆ、Ｎ−β活性を含む
溶出液をｐＨ７に調整し、実施例１で用いた亜鉛キレー
トカラム１ｍ１（１０φ　ｘ１３ｍｍ）に４℃で流し、
ＩＦＮ−βを吸着させた。吸着後０゜５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）−１５，ｅ＞　２０
ｍ１で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むＯ，
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４゜５）１０ｍｌでＩＦＮ−βを
溶出させた。Ｉ　ＦＮ−β活性の回収率は７２％で、比
活性はざらに３（台上界した。この結果、精製原液に対
するＩ　ＦＮ−β活性の回設率は６８％で、比活性は約
３８０倍上昇し／Ｃａ この精製ＩＦＮ−β試料は、ドデシル硫酸ナトリウム含
有ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一なタンパク質
バンドとして現れ、抗体カラムのリガンドであるマウス
免疫グロブリンは、酵素免疫測定法（Ｅ　ＩＡ）による
分析で検出されなかった。

実施例３ ヒトＩＦＮ−β構造道伝子を組み込んだハムスター細胞
を１０％の胎児牛血清を含む“Ｘ′Ｉｌ　ｐｈａ（−）
”　（Ｇ　Ｉ　８００社）１８養液で培養した。この培
養上清には２．２　ｘ１０４　ｒＵ／ｍｌの［ＦＮ−β
活性と３．６ｍｏ／ｍｌのタンパク質が含まれていた。

この培養上清５αを精製原液として、実施例１で用いた
抗体カラム１ｍ１（１０φ　ｘ１３ｍｍ＞に、４℃吸着
させた。本通り液には加えた量の９９％のタンパク質が
藷まれでいたが、ＩＦＮ−β活性は認められなかった。

つづいて抗体カラムを５０％エチレングリコールを含む
１５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）２０ｍｌで洗浄した
後、１５ｍＭ塩酸（イオン強度０．０１５、ｐＨ２，０
）１０ｍｌでＩＦＮ−βを溶出した。ＩＦＮ−β活性の
回収率は９８％で、比活性は８．３００倍上昇した。

つづいて、この抗体カラムのＩ　’Ｆ　Ｎ−β活性を含
む溶出液をｐｉ−１７に調整し、実施例１で用いたコバ
ルトキレートカラム１ｍ１（１０φｘｉ３ｍｍ）に４℃
で流し、ＩＦＮ−βを吸着させた。吸着後０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）２
０ｍｌで洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（１）ｌ−１４，５）１０ｍｌｒＩＦ
Ｎ−βを溶出させた。ＩＦＮ−βの回収率は８０％で、
比活性はざらに６倍上弄した。この結果、精製原液に対
する［ＦＮ−βの回収率は７８％で、比活性は約５０．
０００倍上昇した。

この精製ＩＦＮ−β試料は、ドデシル硫酸ナトリウム含
有ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一のタンパク費
バンドとして現れ、抗体カラムのリガンドであるマウス
免疫グロブリンは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による分
析で検出されなかった。

比較例１ 抗体カラムから溶出した実施例１の溶出液を、さらに“
スルホプロピルセファデックスＣ２５”（ファルマシア
社）２１１＋（１０φｘ２６１ｍ）に４℃で吸着させた
。つづいて５　ｍＭリン酸緩衝液（１）Ｉ−１７，４＞
２０ｍ１で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍｌを流し、
ＩＦＮ−β活性のある両分を集めた。ｒＦＮ−β回収率
は２０％で、ｒＦＮ純度はドデシル硫酸ナトリウム含有
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析で９２％で
あった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト・インターフエロンβ溶液を抗ヒト・インタ
   ーフエロンβ抗体を不溶化した担体に接触させる工程、
   該担体への吸着物を溶出剤にて溶出させる工程、溶出物
   を金属をキレート化させた担体に接触させる工程、およ
   び該金属キレート担体に吸着したヒト・インターフエロ
   ンβを溶出剤にて溶出させる工程からなるヒト・インタ
   ーフエロンβの精製法。
2. （２）金属をキレート化させた担体が、亜鉛、コバルト
   、ニッケルおよび銅からなる群から選ばれた少くとも一
   種の金属をキレートさせた担体である特許請求の範囲第
   （１）項記載の精製法。