JPH01211496A - リンホトキシンの精製方法 - Google Patents
リンホトキシンの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は生物学的活性を有するポリペプチドであるリ
ンホトキシン(LT)の精製法に関する。
ンホトキシン(LT)の精製法に関する。
LTは抗腫瘍剤として期待賂れており抗ウィルス剤とし
て使用される可能性もある。
て使用される可能性もある。
〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕蛋白質の
ah方法は一般に知られており、塩析、デル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、成層クロマトグラフィーの
ごとき技法を含む。これらの技法のそれぞれは公知であ
るが、所与の蛋白質の精製のために上記の技法のいずれ
かを適用することができる範囲を予想することは非常に
困難である。要求される精製の程度、蛋白質の生物学的
活性の損失の程度及び要求される蛋白質の均一性の程度
を包含する種々の因子が生成物の精製を最適化するため
に多くの実験を要求する。
ah方法は一般に知られており、塩析、デル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、成層クロマトグラフィーの
ごとき技法を含む。これらの技法のそれぞれは公知であ
るが、所与の蛋白質の精製のために上記の技法のいずれ
かを適用することができる範囲を予想することは非常に
困難である。要求される精製の程度、蛋白質の生物学的
活性の損失の程度及び要求される蛋白質の均一性の程度
を包含する種々の因子が生成物の精製を最適化するため
に多くの実験を要求する。
天然型LTの精り法は、例えば“特開
昭58−16687号公報、特開昭59−84827号
公報、特開昭61−186324号公報等に記載されて
いるが、組換え型LTは同様の方法を用いて精製するこ
とは困難である。
公報、特開昭61−186324号公報等に記載されて
いるが、組換え型LTは同様の方法を用いて精製するこ
とは困難である。
組換ILTの精製法としては、塩析と免疫アフィニティ
ークロマトグラフィーを利用する方法妙ζ特開昭61−
56197号公報及び[Gray等、Nature (
1984) 312 : 721 724 )にある。
ークロマトグラフィーを利用する方法妙ζ特開昭61−
56197号公報及び[Gray等、Nature (
1984) 312 : 721 724 )にある。
しかし免疫アフィニティーを用いるには、LTの活性を
失わないようなLTに対する抗体が必要であり、その取
得は、困難であり汎用性に欠けさらに、スケールアップ
も容易でない。
失わないようなLTに対する抗体が必要であり、その取
得は、困難であり汎用性に欠けさらに、スケールアップ
も容易でない。
又、ヒ) L T i Fe2を含む動物細胞培養液か
らhhする方法として金属アフィニティークロマトグラ
フィーを用いる方法が特開昭63−3796号公報に開
示されているが、金属アフィニティー単独または記載の
陰イオン交換クロマトグラフィーゲル濾過の組合せのみ
では、高純度のLTを得ることは困難である。
らhhする方法として金属アフィニティークロマトグラ
フィーを用いる方法が特開昭63−3796号公報に開
示されているが、金属アフィニティー単独または記載の
陰イオン交換クロマトグラフィーゲル濾過の組合せのみ
では、高純度のLTを得ることは困難である。
方法である。
本発明は、リンホトキシンの産生遺伝子を組入れた組換
え宿主中で生産式れるリンホトキシンを精製する方法で
あって、下記(at〜(el工程を組合わせ又は繰り返
し、純度95%以上エンrトキシン0.05/ljL/
リンホトキシン1〜以下とすることを特徴とするリンホ
トキシンの精製方法である。
え宿主中で生産式れるリンホトキシンを精製する方法で
あって、下記(at〜(el工程を組合わせ又は繰り返
し、純度95%以上エンrトキシン0.05/ljL/
リンホトキシン1〜以下とすることを特徴とするリンホ
トキシンの精製方法である。
(a) リンホトキシン含有液にカチオン性高分子凝
集剤t−添加処理する工程 (b)、リンホトキシン含有液を硫酸アンモニウムによ
る塩析処理し、リンホトキシンを沈殿させ、再溶解する
工程 (() リンホトキシン含有液を40〜70℃で熱処
理し、混在する蛋白質を沈殿させ除去する工程fa+
+)ンホトキシン含有液を陰イオン交換クロマトグラ
フィー処理する工程 (e) リンホトキシン含有液を金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィー処理する工程さらに本発明で
は、上記(al〜(elの各工程に、(f)リンホトキ
シン含有液をデル濾過処理す、る工程、の付加及び上記
工程(alが他の工程に先行することを特徴とするリン
ホトキシンの精製方法をも課題解決の手段とするもので
ある。
集剤t−添加処理する工程 (b)、リンホトキシン含有液を硫酸アンモニウムによ
る塩析処理し、リンホトキシンを沈殿させ、再溶解する
工程 (() リンホトキシン含有液を40〜70℃で熱処
理し、混在する蛋白質を沈殿させ除去する工程fa+
+)ンホトキシン含有液を陰イオン交換クロマトグラ
フィー処理する工程 (e) リンホトキシン含有液を金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィー処理する工程さらに本発明で
は、上記(al〜(elの各工程に、(f)リンホトキ
シン含有液をデル濾過処理す、る工程、の付加及び上記
工程(alが他の工程に先行することを特徴とするリン
ホトキシンの精製方法をも課題解決の手段とするもので
ある。
以下具体的に説明する。本発明で使用するゝリンホトキ
シン(LT)’は、特開昭63−8398号公報に示す
アミノ酸配列と実質的に同等であり、ある極の腫瘍細胞
系統に対する細胞抑制作用を持つリンホカインの1分子
であることを意味する。
シン(LT)’は、特開昭63−8398号公報に示す
アミノ酸配列と実質的に同等であり、ある極の腫瘍細胞
系統に対する細胞抑制作用を持つリンホカインの1分子
であることを意味する。
また、LTはマクロファージ活性化作用をも有するもの
であり、その生物活性は、マウスLP3細胞(L細胞の
亜株)に対するits、 yitro #I胞変性アッ
セイにより確認されている〔小林等、ジャーナル拳オデ
・イムノロジー(J、 Immunol )122.7
91 (1979))。
であり、その生物活性は、マウスLP3細胞(L細胞の
亜株)に対するits、 yitro #I胞変性アッ
セイにより確認されている〔小林等、ジャーナル拳オデ
・イムノロジー(J、 Immunol )122.7
91 (1979))。
LTの1実質的に同等なアミノ酸配列′とは、アミノ酸
配列が同一であるか変化した形すなわちアミノ酸配列が
同一であるかあるいはその生物活性を破壊しない範囲で
変化した形を意味する。変化した形とは、1または複数
のアミノ酸の変化(欠失、付加、置換)、アミノ酸残基
の酸化還元、誘導体化、側鎖の修飾等によりI+T分子
が修飾された分子を意味する。前記特開昭63−839
8号公報の他、特開昭63−8399号公報及び本出願
人による%願昭62−160115号明細書記載のアミ
ノ酸配列がこれに相当する。本発明で使用する’LT産
生遺伝子′とは前記のLT分子を決定する配列を有する
遺伝子を意味する。
配列が同一であるか変化した形すなわちアミノ酸配列が
同一であるかあるいはその生物活性を破壊しない範囲で
変化した形を意味する。変化した形とは、1または複数
のアミノ酸の変化(欠失、付加、置換)、アミノ酸残基
の酸化還元、誘導体化、側鎖の修飾等によりI+T分子
が修飾された分子を意味する。前記特開昭63−839
8号公報の他、特開昭63−8399号公報及び本出願
人による%願昭62−160115号明細書記載のアミ
ノ酸配列がこれに相当する。本発明で使用する’LT産
生遺伝子′とは前記のLT分子を決定する配列を有する
遺伝子を意味する。
本発明で1組換え宿主′とは組換分子生物学的方法によ
りLTをコードするDNAが導入された細胞であり、定
義の範囲内で真核細胞、例えは、哺乳類細胞、真核微生
物細胞、原核細胞、例えば、バシルス属(Bacill
us )のバシルス・ズブチリス(Bacillus
5ubtilis ) 、xシエリシャ属(Eaahe
riahia)のイー・コリ(E、 coli )など
が含まれる。
りLTをコードするDNAが導入された細胞であり、定
義の範囲内で真核細胞、例えは、哺乳類細胞、真核微生
物細胞、原核細胞、例えば、バシルス属(Bacill
us )のバシルス・ズブチリス(Bacillus
5ubtilis ) 、xシエリシャ属(Eaahe
riahia)のイー・コリ(E、 coli )など
が含まれる。
本発明でLTを含有する水性混合物′とは、組換宿主の
培養物由来の混合物、例えば組換L?遺伝子を発現する
純銅宿主を高圧ホモジナイず−〔例えばラボラトリ−・
ホモジナイザ−(ゴーリンC0RP、社製)〕処理、超
音波処理等で破砕した混合物、あるいはそこから遠心濾
過等で沈殿を除去したもの、あるいは精製工程(a)〜
(flの1工程あるいはその幾つかを組あわせて部分精
製したものを意味する。
培養物由来の混合物、例えば組換L?遺伝子を発現する
純銅宿主を高圧ホモジナイず−〔例えばラボラトリ−・
ホモジナイザ−(ゴーリンC0RP、社製)〕処理、超
音波処理等で破砕した混合物、あるいはそこから遠心濾
過等で沈殿を除去したもの、あるいは精製工程(a)〜
(flの1工程あるいはその幾つかを組あわせて部分精
製したものを意味する。
本発明でN製工程(atで用いるカチオン性高分子凝集
剤には、キトサン、微粒子状イオン交換ゲル、4級アン
モニウム塩、メタクリレート1合体、ポリエチレンイミ
ン等がある。市販されてbるものとしては、バイオクリ
ル(東ソー株式会社製)、C−−5、O−9(栗田工条
株式会社H)などがこれに相当する。工程(alはn製
の初期に用いるのが好ましく、LTを含む菌体破砕液、
あるいは―体破砕上清を処理するのに適する。菌体破砕
液を処理する場合、ポリエチレンイミンを用いるには、
あらかじめ−を中性付近(pH6〜9)に調整した5〜
20%のポリエチレンイミン溶液をLT含有液に攪拌し
ながら徐々に加え細胞破砕物、核酸、及びLT以外の蛋
白質を凝集させて除去する。ポリエチレンイミンの添加
量は宿主かに、 coliの場合、菌体のOD660が
1当り20μμ以上、特に25〜35μμがLTの収出
等もよく望ましい。
剤には、キトサン、微粒子状イオン交換ゲル、4級アン
モニウム塩、メタクリレート1合体、ポリエチレンイミ
ン等がある。市販されてbるものとしては、バイオクリ
ル(東ソー株式会社製)、C−−5、O−9(栗田工条
株式会社H)などがこれに相当する。工程(alはn製
の初期に用いるのが好ましく、LTを含む菌体破砕液、
あるいは―体破砕上清を処理するのに適する。菌体破砕
液を処理する場合、ポリエチレンイミンを用いるには、
あらかじめ−を中性付近(pH6〜9)に調整した5〜
20%のポリエチレンイミン溶液をLT含有液に攪拌し
ながら徐々に加え細胞破砕物、核酸、及びLT以外の蛋
白質を凝集させて除去する。ポリエチレンイミンの添加
量は宿主かに、 coliの場合、菌体のOD660が
1当り20μμ以上、特に25〜35μμがLTの収出
等もよく望ましい。
20μg未満では核酸の除去が不充分であり、また不必
要に多く添加すると未反応のポリエチレンイミンを溶液
中に多量に含むことKなり、以下の精製工程に影響を及
ぼすこととなる。自体f&砕上清を処理する場合、適当
なポリエチレンイミンの濃度は、菌体のoI)sao
” 1当り10μg以上、特に20〜30μgが収出も
よく望ましい。
要に多く添加すると未反応のポリエチレンイミンを溶液
中に多量に含むことKなり、以下の精製工程に影響を及
ぼすこととなる。自体f&砕上清を処理する場合、適当
なポリエチレンイミンの濃度は、菌体のoI)sao
” 1当り10μg以上、特に20〜30μgが収出も
よく望ましい。
精製工程tblで用いる硫酸アンモニウムによる塩析は
LT金含有粗抽出物から核酸等を除去した段階程K(工
程(alで精製した後〕のLT含有液を処理するのに適
した方法である。硫酸アンモニウムは、LT含有液に粉
末あるいは飽和水溶液の形で徐々に添加し2時間以上塩
析を行う。硫酸アンモニウムの濃度は、最終濃度が、2
0%飽和以上、好ましくは、低温にて40−45%飽和
、12時間以上塩析を行うのが収出、精製度から好まし
い。
LT金含有粗抽出物から核酸等を除去した段階程K(工
程(alで精製した後〕のLT含有液を処理するのに適
した方法である。硫酸アンモニウムは、LT含有液に粉
末あるいは飽和水溶液の形で徐々に添加し2時間以上塩
析を行う。硫酸アンモニウムの濃度は、最終濃度が、2
0%飽和以上、好ましくは、低温にて40−45%飽和
、12時間以上塩析を行うのが収出、精製度から好まし
い。
この塩析によりLTは沈li画分に回収され、その沈殿
を水溶液に溶解し硫酸アンモニウム#に度を6.5%飽
和以下にすることでLTのほぼ全活性を回収することが
できる。この際溶解しない沈殿を除、去することでより
精製度を上げることができる。
を水溶液に溶解し硫酸アンモニウム#に度を6.5%飽
和以下にすることでLTのほぼ全活性を回収することが
できる。この際溶解しない沈殿を除、去することでより
精製度を上げることができる。
工程(・C)で用いる熱処理はどの精製工程のI、?含
有液に用いても有効である。好ましくは、工8(a)の
処理をした以降のいずれかの工程において、さらに好ま
しくは、工程(b)の塩析の後の工程として行うのがよ
い。熱処理に有効な温度は、LT含有液の温度が40〜
70℃、好ましくは55−65°Cの間であり、処理時
間は5分以上、好ましくは10〜60分である。熱処理
の工程金行うことで他の精製工程だけでは除去困難な、
混在しているSD8電気泳動で分子量的25.OCI
CJを示す蛋白質を除去することができる。
有液に用いても有効である。好ましくは、工8(a)の
処理をした以降のいずれかの工程において、さらに好ま
しくは、工程(b)の塩析の後の工程として行うのがよ
い。熱処理に有効な温度は、LT含有液の温度が40〜
70℃、好ましくは55−65°Cの間であり、処理時
間は5分以上、好ましくは10〜60分である。熱処理
の工程金行うことで他の精製工程だけでは除去困難な、
混在しているSD8電気泳動で分子量的25.OCI
CJを示す蛋白質を除去することができる。
工程(a)で用いるイオン交換クロマトグラフィーに用
いる担体には、陰イオン交換基であるジエチルアミノエ
チル(DIAI ) 、第4級アミノエチル(1;LI
C) 及び、陰イオン交換基であるカルボキシメチル(
CM)等が結合したものがある。市販されているものと
してはDIAI[f−セファロース、(3M−セファロ
ース(ファルマシア ファインケミカル社)、Dl!:
AM−セルロファイン、CM−セルロファイン(生化学
工業社)、DEAK−)ヨパール(東ソー社)等がこれ
に相当する。イオン交換クロマトグラフィーを用いる工
程は、前処理を終えてから用いるのが望ましく工程(a
)を終了した工程以降ならどの工程でもよく、好ましく
はlal〜(c)までを終えた工程以降の工程として用
いるのが有効である。またイオン交換クロマトグラフィ
ーは担体を組合わせ、くり返すことで精製度を上昇させ
ることができる。この段階でLTは担体、緩衝液の条件
により未吸漸画分として得ることも、吸着はせ、水素イ
オン濃度(−)、塩濃度等の変化による段階的あるいは
濃度勾配により溶出させることも可能である。例えば、
DEAE−セルロ7アイン A−200(生化学工業社
)の担体を用いると10 mM トリス−塩酸(pH7
,0〜8.5 )に0〜0.1Mの食塩を加えた緩衝液
で平衡化した条件下でLTは未吸着画分に得られる。ま
たDICAI!t−セルロファイン A−500(生化
学工業社)の担体を用いると、0.01Mの食塩を含む
iQmMトリス−塩酸緩衝液(m 8.0〜8.3)で
平衡化したカラムではLTは吸着され、食塩濃度を[1
,05Mに上昇させることで溶出される。CM−セファ
ロース(ファルマシア ファイン ケミカル社)の担体
では0.2−0.5 Mの食塩を含む5mMリン酸緩衝
液(pH6,0)で平衡化したカラムではLTは吸着さ
れ水素イオン濃度(−)を7に上昇させたり食塩濃度を
1.0Mに上昇させることで溶出される。収率、比活性
の上昇等を考慮し、DEAR−セルロファインA −2
00、DKAE−セルロファインA300、それぞれ単
独、または組み合わせて用いることが好ましい。緩衝液
は徨々のものが選歌でき、−、イオン強度の組合わせも
自由に変更することができる。上記の条件は好ましい例
の1つであるKすぎない。
いる担体には、陰イオン交換基であるジエチルアミノエ
チル(DIAI ) 、第4級アミノエチル(1;LI
C) 及び、陰イオン交換基であるカルボキシメチル(
CM)等が結合したものがある。市販されているものと
してはDIAI[f−セファロース、(3M−セファロ
ース(ファルマシア ファインケミカル社)、Dl!:
AM−セルロファイン、CM−セルロファイン(生化学
工業社)、DEAK−)ヨパール(東ソー社)等がこれ
に相当する。イオン交換クロマトグラフィーを用いる工
程は、前処理を終えてから用いるのが望ましく工程(a
)を終了した工程以降ならどの工程でもよく、好ましく
はlal〜(c)までを終えた工程以降の工程として用
いるのが有効である。またイオン交換クロマトグラフィ
ーは担体を組合わせ、くり返すことで精製度を上昇させ
ることができる。この段階でLTは担体、緩衝液の条件
により未吸漸画分として得ることも、吸着はせ、水素イ
オン濃度(−)、塩濃度等の変化による段階的あるいは
濃度勾配により溶出させることも可能である。例えば、
DEAE−セルロ7アイン A−200(生化学工業社
)の担体を用いると10 mM トリス−塩酸(pH7
,0〜8.5 )に0〜0.1Mの食塩を加えた緩衝液
で平衡化した条件下でLTは未吸着画分に得られる。ま
たDICAI!t−セルロファイン A−500(生化
学工業社)の担体を用いると、0.01Mの食塩を含む
iQmMトリス−塩酸緩衝液(m 8.0〜8.3)で
平衡化したカラムではLTは吸着され、食塩濃度を[1
,05Mに上昇させることで溶出される。CM−セファ
ロース(ファルマシア ファイン ケミカル社)の担体
では0.2−0.5 Mの食塩を含む5mMリン酸緩衝
液(pH6,0)で平衡化したカラムではLTは吸着さ
れ水素イオン濃度(−)を7に上昇させたり食塩濃度を
1.0Mに上昇させることで溶出される。収率、比活性
の上昇等を考慮し、DEAR−セルロファインA −2
00、DKAE−セルロファインA300、それぞれ単
独、または組み合わせて用いることが好ましい。緩衝液
は徨々のものが選歌でき、−、イオン強度の組合わせも
自由に変更することができる。上記の条件は好ましい例
の1つであるKすぎない。
工程fθ)で用いる金属キレートアフィニティークロマ
トグラフィーで用−る担体には、イミノジ酢酸等を結合
しである金属キレート樹脂、例えば1キレ−ティングセ
ファロース(ファルマシア ファイン ケミカル社)、
キレーテイングセルロファイン(生化学工業社)などの
市販品がある。金属キレートアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いる工程は、前処理を終えてから用するこ
とが望ましく、工;I (a)終了後のどの工程でもよ
い。好ましくは(a)〜(c)工程終了後がよい、工程
(d)、(elの順はどちらが前でも良好な結果を得ら
れる。キレート樹脂にキレート結合させる金属としては
Ou”、Zn”+などがあり、どちらもLTの精製に有
効であるが、Zn”+を用いる方がより好ましい。金属
キレート担体を用いる問題として、蛋白質によっては高
濃度で金属イオンと結合して沈殿を生じるものがある。
トグラフィーで用−る担体には、イミノジ酢酸等を結合
しである金属キレート樹脂、例えば1キレ−ティングセ
ファロース(ファルマシア ファイン ケミカル社)、
キレーテイングセルロファイン(生化学工業社)などの
市販品がある。金属キレートアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いる工程は、前処理を終えてから用するこ
とが望ましく、工;I (a)終了後のどの工程でもよ
い。好ましくは(a)〜(c)工程終了後がよい、工程
(d)、(elの順はどちらが前でも良好な結果を得ら
れる。キレート樹脂にキレート結合させる金属としては
Ou”、Zn”+などがあり、どちらもLTの精製に有
効であるが、Zn”+を用いる方がより好ましい。金属
キレート担体を用いる問題として、蛋白質によっては高
濃度で金属イオンと結合して沈殿を生じるものがある。
LTとZn”+などがその好例である。
即ち、金属イオンを結合した金属キレートカラムを用込
ていると、カラムより多少の金属イオンが遊離し溶出液
中に混入して蛋白質の1部がそのことにより沈殿して不
溶化してしまう。この解決法として金属をキレートさせ
たキレート担体のカラムの後にポストカラムとして金属
をキレート葛せていない担体のカラムを結合させる。こ
の方法で溶出液中に金属イオンが漏出してくるのを阻止
することが可能となる金属キレートアフィニティークロ
マトグラフィーをLTの精製として用いる際にはこの工
夫がN要である。アフィニティークロマトグラフィーで
はLTは吸着する条件で癌加し、適切な緩衝液で溶出す
ることが望ましい。
ていると、カラムより多少の金属イオンが遊離し溶出液
中に混入して蛋白質の1部がそのことにより沈殿して不
溶化してしまう。この解決法として金属をキレートさせ
たキレート担体のカラムの後にポストカラムとして金属
をキレート葛せていない担体のカラムを結合させる。こ
の方法で溶出液中に金属イオンが漏出してくるのを阻止
することが可能となる金属キレートアフィニティークロ
マトグラフィーをLTの精製として用いる際にはこの工
夫がN要である。アフィニティークロマトグラフィーで
はLTは吸着する条件で癌加し、適切な緩衝液で溶出す
ることが望ましい。
工程if)のデル濾過は工程(atの後ならどの段階に
用いてもよいが、望ましくは精製の最後に用いるのがよ
い。精製の最後の工程として用いる際、通常LTは既に
95%以上の純度となっている。しかしLTt−医薬品
として用いるには溶媒の組成、微量のパイロ−ジエンの
混入が問題となってくる。
用いてもよいが、望ましくは精製の最後に用いるのがよ
い。精製の最後の工程として用いる際、通常LTは既に
95%以上の純度となっている。しかしLTt−医薬品
として用いるには溶媒の組成、微量のパイロ−ジエンの
混入が問題となってくる。
デル濾過を行うことで溶媒の交換より一層のパイロ−ジ
エンの除去を行うことができる。ここで用いるデル濾過
の担体としては、スーパーローズ、セファロース、セフ
ァクリル(以上ファルマシア・ファイン春ケミカル社)
バイオデル(Bio Rad社)、セルロファイン(生
化学工業社)等いずれでもよいがLTのI&層が少ない
セファクリル、スーパーローズ、バイオデル等が好まし
い。
エンの除去を行うことができる。ここで用いるデル濾過
の担体としては、スーパーローズ、セファロース、セフ
ァクリル(以上ファルマシア・ファイン春ケミカル社)
バイオデル(Bio Rad社)、セルロファイン(生
化学工業社)等いずれでもよいがLTのI&層が少ない
セファクリル、スーパーローズ、バイオデル等が好まし
い。
以上(a)〜(e)又はlal〜(f)の工程を組合わ
せたり繰り返すことで純度95%以上、エンvトキシン
宮量0−05 nE/IQ L T以下のLTt−得る
ことカテきる。
せたり繰り返すことで純度95%以上、エンvトキシン
宮量0−05 nE/IQ L T以下のLTt−得る
ことカテきる。
本発明でLTの純度とは、蛋白質純度分析(EID8−
PAGE後述)による値t−奮う。工程の組合わせの例
としては、 1 ) (at →(b) −) (C1→(d)
−* (el 4 (flII ) (a)−+
(bl −+ (c)4 (a> + (al n
(el →(fllit ) (al −+ (b
l −+ (cl −+ tel 4 (d) −+
ff1lv ) (al + (bl 4 (c)
→(at + (el −+ (d) →1flv
) (al 4 (0) −+ (bl −+ (
al −+ (e)−* (flVl) (a)−
+(cl−+(bl−+(dl−+(d)−+(e)−
+(f)Vll) (a) →(at →(b)
+ (e) →(dl −+ (flviil)
(at→(c) →(bl→(al −+ (el →
(al →(fllx ) (at →(bl →
(at →(cl −+ (el −+ (flX m
) (at −4(bl −* (at −+ (
cl 4 (d)4 (el →(f)XiXf)
(al −+ lbl −+ (e) →lcl→(
al −(r)xjj4) (a)−+(b)−+
(el−+(al−+1cl−+(f)などが組合わせ
中でも好ましく 、(1)(1)(Iiilなどは特に
好ましい例である。より具体的に第1図に示す。
PAGE後述)による値t−奮う。工程の組合わせの例
としては、 1 ) (at →(b) −) (C1→(d)
−* (el 4 (flII ) (a)−+
(bl −+ (c)4 (a> + (al n
(el →(fllit ) (al −+ (b
l −+ (cl −+ tel 4 (d) −+
ff1lv ) (al + (bl 4 (c)
→(at + (el −+ (d) →1flv
) (al 4 (0) −+ (bl −+ (
al −+ (e)−* (flVl) (a)−
+(cl−+(bl−+(dl−+(d)−+(e)−
+(f)Vll) (a) →(at →(b)
+ (e) →(dl −+ (flviil)
(at→(c) →(bl→(al −+ (el →
(al →(fllx ) (at →(bl →
(at →(cl −+ (el −+ (flX m
) (at −4(bl −* (at −+ (
cl 4 (d)4 (el →(f)XiXf)
(al −+ lbl −+ (e) →lcl→(
al −(r)xjj4) (a)−+(b)−+
(el−+(al−+1cl−+(f)などが組合わせ
中でも好ましく 、(1)(1)(Iiilなどは特に
好ましい例である。より具体的に第1図に示す。
前記中、具体的に説明するため、固有の樹脂、担体、限
外濾過膜名を記述したが、これによりこの発明の範v5
を限定するものではない。
外濾過膜名を記述したが、これによりこの発明の範v5
を限定するものではない。
実施例1
シラスミドpDR12により大腸菌株W3110を形質
転換した。このプラスミーはtaa 7″ロモーター制
御のもとにヒ)LTをコードするc DNAを含有する
。このプラスミドにより産生されるLTは特開昭63−
8399号公報で示すアミノ酸配列を有している。この
細胞をM9培地にて1@養しイソプロピル−β−D−チ
オガラクトシp(工PTG)を添加してLT生産を誘導
した。
転換した。このプラスミーはtaa 7″ロモーター制
御のもとにヒ)LTをコードするc DNAを含有する
。このプラスミドにより産生されるLTは特開昭63−
8399号公報で示すアミノ酸配列を有している。この
細胞をM9培地にて1@養しイソプロピル−β−D−チ
オガラクトシp(工PTG)を添加してLT生産を誘導
した。
集菌
細胞浮遊液を加圧下で中空繊維細孔(0,22μ)ポリ
スルホン膜(Romicon社)を通して循環させるこ
とにより約10倍に濃縮し、さらに破砕用緩衝液(50
mM Tris−HOl(p)18.0 )、10mM
EDTA。
スルホン膜(Romicon社)を通して循環させるこ
とにより約10倍に濃縮し、さらに破砕用緩衝液(50
mM Tris−HOl(p)18.0 )、10mM
EDTA。
5 mM Na1l )にて透析濃縮し残w培地を除去
、濃厚細胞懸濁液を得た。
、濃厚細胞懸濁液を得た。
細胞破砕
高圧ホモジナイザー(ラボラトリーホモジナイデー:プ
ーリンC0RP、社)にて濃厚細胞懸濁液を6000
psiの圧力で2回処理し細胞の破砕を行った。
ーリンC0RP、社)にて濃厚細胞懸濁液を6000
psiの圧力で2回処理し細胞の破砕を行った。
破砕用緩衝液にて10%に希釈、p)i8.2に調整し
たポリエチレンイミンt−m体量に応じ(菌体濃度0D
66oが1当り60μgのポリエチレンイミン)60分
間かけて添加、60分攪拌後、凝集物を遠心(10,0
00,9)にて除去しLTを含む上fprを分離した。
たポリエチレンイミンt−m体量に応じ(菌体濃度0D
66oが1当り60μgのポリエチレンイミン)60分
間かけて添加、60分攪拌後、凝集物を遠心(10,0
00,9)にて除去しLTを含む上fprを分離した。
粗精製
工程(bl:前処理済のLT含有液に細粒化した硫酸ア
ンモニウムを飽和濃度が43%になるように4°IF拌
下添加した。1晩放置後、塩析により生じた沈殿を12
,000,9の遠心にて採取1 [1mM−Tris−
H(!1 緩衝液(# 7.5 >に溶液中の硫酸アン
モニウム濃度が6.5%飽和以下になるように溶解した
。不溶性の沈殿を12,000,9の遠心により除去し
LTt−含む上滑を得た。
ンモニウムを飽和濃度が43%になるように4°IF拌
下添加した。1晩放置後、塩析により生じた沈殿を12
,000,9の遠心にて採取1 [1mM−Tris−
H(!1 緩衝液(# 7.5 >に溶液中の硫酸アン
モニウム濃度が6.5%飽和以下になるように溶解した
。不溶性の沈殿を12,000,9の遠心により除去し
LTt−含む上滑を得た。
工程(C):工程(b)終了後のLT含有液に熱を加え
、溶液の温度が60℃になってから10分間攪拌を継続
した。生じた沈x’ti s、o o o 、9の遠心
にて除去し、LTを含む上清を得た。
、溶液の温度が60℃になってから10分間攪拌を継続
した。生じた沈x’ti s、o o o 、9の遠心
にて除去し、LTを含む上清を得た。
工程(c)終了後の上清を限外濾過にて分子量カットオ
フ8.000カツトのポリエーテルスルホン膜(ツバ1
3kXF工I、TRoN社)t−用い濃縮した。透析は
次工程で用いる緩衝液を追加し濃縮を繰り返すことで行
った。
フ8.000カツトのポリエーテルスルホン膜(ツバ1
3kXF工I、TRoN社)t−用い濃縮した。透析は
次工程で用いる緩衝液を追加し濃縮を繰り返すことで行
った。
実施例2
実施例1により得たLT含有液を予め
Q、1M NaC1,0−01%ポリオキシエチレン(
20)ンルビタンモノラウレー) (Tween 20
和光純桑)を含む10 mM Tris−HO1緩衝液
(pH7,5)で平衡化したDHAX−セルロファイン
A−200(生化学工業社)の力2ムにチャージし、
LTを含む未吸着画分を採取した。
20)ンルビタンモノラウレー) (Tween 20
和光純桑)を含む10 mM Tris−HO1緩衝液
(pH7,5)で平衡化したDHAX−セルロファイン
A−200(生化学工業社)の力2ムにチャージし、
LTを含む未吸着画分を採取した。
陰イオン交換クロマトグラフィー(1)の工程により得
たLT含有液を実施例1中の方法と同様の方法にて、0
−01 M NILOI 、0−01%Tween 2
0を含む10 mM Tris−HOIMI衝液で[i
i透析を行ツタ。
たLT含有液を実施例1中の方法と同様の方法にて、0
−01 M NILOI 、0−01%Tween 2
0を含む10 mM Tris−HOIMI衝液で[i
i透析を行ツタ。
このLT浴溶液予め同緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ルロファイン A−500(生化学工業社)のカラムに
チャージし、LTを成層洗浄した後、0−05 M N
a01を含む同緩衝液で溶出し、I、Tt−含む水溶液
を得た。
ルロファイン A−500(生化学工業社)のカラムに
チャージし、LTを成層洗浄した後、0−05 M N
a01を含む同緩衝液で溶出し、I、Tt−含む水溶液
を得た。
金属キレートアフィニティークロマトグラフィI M
Na(!1、l[]mM酢酸亜鉛を含む酢酸緩衝液(p
H4,0)でZn”+を結合させた千レーティングセフ
ァロース(ファルマシア社製)でZnキレートカラムを
作製し、その直後に金属イオンを結合していないキレ−
チイングセ7アロースカラムを後カラムとして接続した
。これらのカラムを予めl M Na1l、0.01%
Tween 20 t”含む2Q mMリン&緩衝液(
pH7,6)で平衡化した。前工程で得たLT富有液を
同緩衝液で透析曖細しカラムにチャージした。同緩衝液
にて洗浄後、0.2Mイミダゾールを含む、同緩衝液に
て溶出、LTt−富む水浴液を得た。
Na(!1、l[]mM酢酸亜鉛を含む酢酸緩衝液(p
H4,0)でZn”+を結合させた千レーティングセフ
ァロース(ファルマシア社製)でZnキレートカラムを
作製し、その直後に金属イオンを結合していないキレ−
チイングセ7アロースカラムを後カラムとして接続した
。これらのカラムを予めl M Na1l、0.01%
Tween 20 t”含む2Q mMリン&緩衝液(
pH7,6)で平衡化した。前工程で得たLT富有液を
同緩衝液で透析曖細しカラムにチャージした。同緩衝液
にて洗浄後、0.2Mイミダゾールを含む、同緩衝液に
て溶出、LTt−富む水浴液を得た。
前工程で侍たLT含有液を0.8%Mailを含む5m
M、l、lン酸収慟液(pi−17,2)で平衡化した
セファクリル5−200(ファルマシア社製)のカラム
にチャージし、LT浴出画分を分取した。
M、l、lン酸収慟液(pi−17,2)で平衡化した
セファクリル5−200(ファルマシア社製)のカラム
にチャージし、LT浴出画分を分取した。
以上の工程により純度95%以上のLTを得ることがで
きる。その各工程における結果を第1表に示す。
きる。その各工程における結果を第1表に示す。
第1表で示したように精製の各工程ごとにLTの比活性
は上昇し、デル濾過終了の際には原液(菌体破砕液)の
630倍になっていた。
は上昇し、デル濾過終了の際には原液(菌体破砕液)の
630倍になっていた。
実施例3
実施例10集菌、前処理、粗精製を以下の方法でかつ工
程1bl−透析−1程(clの順で行った後、実施例2
の方法で精製を行い純度95%以上のLTを得た。
程1bl−透析−1程(clの順で行った後、実施例2
の方法で精製を行い純度95%以上のLTを得た。
集菌
細胞浮遊液を連続遠心にて処理し、連続的に沈殿を採取
、破砕用緩衝液にて洗浄後同緩衝液にて濃厚細胞!@淘
液を調整した。
、破砕用緩衝液にて洗浄後同緩衝液にて濃厚細胞!@淘
液を調整した。
前処理
細胞破砕液より細胞破片t−20,[lDO,9の連続
遠心にて除去、その上清に実施例1、工程(a)と同様
に調整したポリエチレンイミン溶液を菌体濃度0D15
601当り25μ9のポリエチレンイミン賃になるよう
に添加−様な方法でLTを含む上清を分離した。
遠心にて除去、その上清に実施例1、工程(a)と同様
に調整したポリエチレンイミン溶液を菌体濃度0D15
601当り25μ9のポリエチレンイミン賃になるよう
に添加−様な方法でLTを含む上清を分離した。
粗精製
実施例1の工程(b)で塩析により生じた沈殿を溶解、
沈殿除去を行わずに工81c)を終了した。
沈殿除去を行わずに工81c)を終了した。
実施例4
実施例2の工程(atのイオン交換クロマトグラフィー
’!1DEAl−セルo77(yA−2001回のみと
し、以下工8 (el 、(f)と行うことで純度95
%以上の高純度LTt−得た。イオン交換クロマトグラ
フィーは、D−05M Na1l Q、Q 1%TW
86n 20を含むl Q mM Trls−HCI緩
衝液(PH8,3ンを用い、同緩衝液にて力2ムを平衡
化未吸層分画を採取することでLT分1i1ilを得た
。
’!1DEAl−セルo77(yA−2001回のみと
し、以下工8 (el 、(f)と行うことで純度95
%以上の高純度LTt−得た。イオン交換クロマトグラ
フィーは、D−05M Na1l Q、Q 1%TW
86n 20を含むl Q mM Trls−HCI緩
衝液(PH8,3ンを用い、同緩衝液にて力2ムを平衡
化未吸層分画を採取することでLT分1i1ilを得た
。
実施例5
実施例2の工程(a)のイオン交侠りロマトグラフイー
ヲDhAle−tルo、;y7(y A−50011
mのみとし、他は実施例2と同様の操作を行うことで純
度95%以上のLTを得た。
ヲDhAle−tルo、;y7(y A−50011
mのみとし、他は実施例2と同様の操作を行うことで純
度95%以上のLTを得た。
実施例6
実施例4の工程をtel (dl (flの順に行い金
属アフィニティークロマトグラフィーの後、イオン交換
クロマトグラフィーを行うことで純度95%以上のLT
を得た。
属アフィニティークロマトグラフィーの後、イオン交換
クロマトグラフィーを行うことで純度95%以上のLT
を得た。
実施例7
シラスミドpLT 13 taa 6−8により大腸菌
株JM105を形質転換した。このプ2スミ−により産
生されるLTは特開昭63−8398号公報で示すアミ
ノ酸配列を有している。この細胞を用すて産生したLT
を実施例1、実施例6の方法と同様の方法で精製し純度
9590以上のLTを得た。
株JM105を形質転換した。このプ2スミ−により産
生されるLTは特開昭63−8398号公報で示すアミ
ノ酸配列を有している。この細胞を用すて産生したLT
を実施例1、実施例6の方法と同様の方法で精製し純度
9590以上のLTを得た。
実施例8
デラスミ)’pDK10tKJ:9大腸lie W 3
1 f Oを形質転換した。このシラスミドにより産生
されるLTのアミノ酸配列は特願昭62−160115
号明細書に記載した。この細胞を用いて産生じたLTを
実施例1、実施例2の方法と同様の方法で精製し純度9
5%以上のLTを得た。
1 f Oを形質転換した。このシラスミドにより産生
されるLTのアミノ酸配列は特願昭62−160115
号明細書に記載した。この細胞を用いて産生じたLTを
実施例1、実施例2の方法と同様の方法で精製し純度9
5%以上のLTを得た。
実施例9(熱処理条件)
工程(clの熱処理条件を検討した。温度条件の検討法
としては、実施例1に準じて硫安塩析後透析の操作を行
った部分精製LT標品と、実施例3に準じ工程(a)−
(bl −((1)終了後の部分精製LT評品を試料と
し、第2表の温度条件下10分間の熱処理を行った。
としては、実施例1に準じて硫安塩析後透析の操作を行
った部分精製LT標品と、実施例3に準じ工程(a)−
(bl −((1)終了後の部分精製LT評品を試料と
し、第2表の温度条件下10分間の熱処理を行った。
第2表で示した様に熱処理は40〜70℃が適切である
。精製純度の上昇、収藁、安定性を考え、55〜65℃
が最適であることがわかった。また、60℃処理による
安定性を検討したところLTは60℃で少なくとも4時
間は安定で、活性の低下は認められなかった。
。精製純度の上昇、収藁、安定性を考え、55〜65℃
が最適であることがわかった。また、60℃処理による
安定性を検討したところLTは60℃で少なくとも4時
間は安定で、活性の低下は認められなかった。
比較例(熱処理の効果)
実施例3の方法で熱処理工程(工程c)を行わなかった
もの即ち(al −(bl −(at−61−(flの
工程で精製したものと実施例3の方法により得たLT標
品の比較をEID8−電気泳動にて調べた。熱処理工程
を行わないと混在する分子[25,000付近の蛋白質
の除去が内離であった。
もの即ち(al −(bl −(at−61−(flの
工程で精製したものと実施例3の方法により得たLT標
品の比較をEID8−電気泳動にて調べた。熱処理工程
を行わないと混在する分子[25,000付近の蛋白質
の除去が内離であった。
測定法
1)純度分析
デル濾過終了後のLTに関し乾燥Xt試験、OEM元素
分析、Naイオンの定量、ビュウレット法による蛋白質
定量(BI3Aを基準蛋白質とした)、フェノール硫酸
法による抛の定量、ジフェニルアミン法による核酸定量
を行った。実施例1.2により精製したLTは全有機物
中蛋白質が98%以上であり、糖含量1%以下、核酸含
量0.1%以下の純度であった。
分析、Naイオンの定量、ビュウレット法による蛋白質
定量(BI3Aを基準蛋白質とした)、フェノール硫酸
法による抛の定量、ジフェニルアミン法による核酸定量
を行った。実施例1.2により精製したLTは全有機物
中蛋白質が98%以上であり、糖含量1%以下、核酸含
量0.1%以下の純度であった。
2) *白質純度分析(11(8D8−PAGE )
rルf11m終了後のLTを8DB−ポリアクリルアミ
ド電気泳動(8D8−PAGE )により分析した。
rルf11m終了後のLTを8DB−ポリアクリルアミ
ド電気泳動(8D8−PAGE )により分析した。
8DS−PAGEにより蛋白質は分子サイズにより分離
され、泳動後クマーシー・ブリリアント・デル−(CB
B )染色をすることで定量測定をし得る。
され、泳動後クマーシー・ブリリアント・デル−(CB
B )染色をすることで定量測定をし得る。
LT最終精製物を、5%−2−メルカプトエタノール、
10%グリセリン、2.6%8DS、o、oo1%ブロ
ム・フェノール・ブルーr含tr 62.5 mMTr
is−HOI (pH6,8)で[]、31n9/dの
濃度に希釈し、100℃5分間の処理f:する。このL
Tを6kg/デルレーンでJIL延0.7mm15%ア
クリルアミドデルにチャージし電気泳動した。泳動終了
後デルスラブを0.1%OBB、15%メタノール、1
0%酢酸の染色液中に浸し染色、30%メタノール、1
0%酢酸の洗浄液で脱染した。泳動像をデンシトメータ
ーにて550 nmの波長でスキャンニングした。LT
によるピークの面積を測定し、スキャンにおいて測定さ
れた全面積(蛋白質の発色に由来するもの)で除し、そ
れに100を乗じて実施例1.2で精製したLTの蛋白
質純度を決定した所、LTは99%以上の純度であった
。
10%グリセリン、2.6%8DS、o、oo1%ブロ
ム・フェノール・ブルーr含tr 62.5 mMTr
is−HOI (pH6,8)で[]、31n9/dの
濃度に希釈し、100℃5分間の処理f:する。このL
Tを6kg/デルレーンでJIL延0.7mm15%ア
クリルアミドデルにチャージし電気泳動した。泳動終了
後デルスラブを0.1%OBB、15%メタノール、1
0%酢酸の染色液中に浸し染色、30%メタノール、1
0%酢酸の洗浄液で脱染した。泳動像をデンシトメータ
ーにて550 nmの波長でスキャンニングした。LT
によるピークの面積を測定し、スキャンにおいて測定さ
れた全面積(蛋白質の発色に由来するもの)で除し、そ
れに100を乗じて実施例1.2で精製したLTの蛋白
質純度を決定した所、LTは99%以上の純度であった
。
3)蛋白質純度分析(2)(逆相クロマトグラフィー)
デル濾過終了後のT、、T@終精製物を逆相クロマトグ
ラフィーにより分析した。bTIIR9/dの濃度に0
.1%トリフルオ酢酸(TFA )水溶液にて調整し、
同溶液で平衡化した逆相カラムμBondpace((
Waters社製)に100μlをチャージ、0.1%
TFA存在下アセトニド替ルo−i oo%の直線濃度
勾配にて溶出した。蛋白質の検出は214 nmの吸収
を測定することによった。
デル濾過終了後のT、、T@終精製物を逆相クロマトグ
ラフィーにより分析した。bTIIR9/dの濃度に0
.1%トリフルオ酢酸(TFA )水溶液にて調整し、
同溶液で平衡化した逆相カラムμBondpace((
Waters社製)に100μlをチャージ、0.1%
TFA存在下アセトニド替ルo−i oo%の直線濃度
勾配にて溶出した。蛋白質の検出は214 nmの吸収
を測定することによった。
実施例1.2の方法で精製したLTはアセトニトリル裏
皮60%の位置に単一のピークとして検出されOD21
4のピーク総面積中99%以上を占めていた。
皮60%の位置に単一のピークとして検出されOD21
4のピーク総面積中99%以上を占めていた。
4)エンrトキシン(LP8 )の定量LT最終標品中
のバイロージエンtt−エンドトキシンの定量を行うこ
とで測定した。測定には)カブトガニ血球抽出液と発色
合成基質を用いた合成基質法のトキシヵラーシステム(
生化学工業■)を用い、pニトロアニリンの遊離量から
エンートキシン濃夏を調べたゆ対照標準エンvトキシン
には市販品のE、 coli 0111由米の生化学工
業(株)社製のものを用いた。
のバイロージエンtt−エンドトキシンの定量を行うこ
とで測定した。測定には)カブトガニ血球抽出液と発色
合成基質を用いた合成基質法のトキシヵラーシステム(
生化学工業■)を用い、pニトロアニリンの遊離量から
エンートキシン濃夏を調べたゆ対照標準エンvトキシン
には市販品のE、 coli 0111由米の生化学工
業(株)社製のものを用いた。
5)IITの生物活性による精製度
LT感受性マクスLP・3 in vitro継代細胞
を用すてLTの生物活性を測定した。LTの活性の強さ
はユニット(U)で表わし、Uは以下の方法で定義した
。即ち、DM−160無血清培地にてLP3M胞k 3
X I Q” cexla /mlになるよ5KM整
し、96me11平底マイクロウェルプレート(Fal
con社m)に50 til / well テ分注T
ル。
を用すてLTの生物活性を測定した。LTの活性の強さ
はユニット(U)で表わし、Uは以下の方法で定義した
。即ち、DM−160無血清培地にてLP3M胞k 3
X I Q” cexla /mlになるよ5KM整
し、96me11平底マイクロウェルプレート(Fal
con社m)に50 til / well テ分注T
ル。
18時間培養後2倍希釈系列で希釈した試料(LT浴溶
液25μlとアクチノマイシンD40 fil/mis
10%yes y含むDM−160j@地を加えδ
らに18時間培奈する。その後、クリスタルバイオレッ
トにて染色し生存M胞の割合全色素の取込み量で判定す
る。LT1ユニットを50%のLP3細胞を殺すのに必
要な量として定義する。蛋白定量は牛血清アルブミン(
BSA )を標準蛋白質としLowry法により求めた
。LT含有液のLTに基づく生物活性を測定しその蛋白
裏皮で除し、蛋白質1〜当りの生物活性をUで表したも
のを比活性とし、精製度の指標の1つとする。
液25μlとアクチノマイシンD40 fil/mis
10%yes y含むDM−160j@地を加えδ
らに18時間培奈する。その後、クリスタルバイオレッ
トにて染色し生存M胞の割合全色素の取込み量で判定す
る。LT1ユニットを50%のLP3細胞を殺すのに必
要な量として定義する。蛋白定量は牛血清アルブミン(
BSA )を標準蛋白質としLowry法により求めた
。LT含有液のLTに基づく生物活性を測定しその蛋白
裏皮で除し、蛋白質1〜当りの生物活性をUで表したも
のを比活性とし、精製度の指標の1つとする。
6)収率
破砕液に対する各工程後の総生物活性を百分藁で示した
。
。
本発明の′nt!R方法により、医薬品として用いるこ
とが可能な程度の高純度、即ちパイロ−ジエン、核酸、
リンホトキシン以外の蛋白質ヲ実質的に含まない均一な
リンホトキシンを大量に取得することが可能になった。
とが可能な程度の高純度、即ちパイロ−ジエン、核酸、
リンホトキシン以外の蛋白質ヲ実質的に含まない均一な
リンホトキシンを大量に取得することが可能になった。
第1図は、本発明の特に好まし?i製工程の組合せの例
を図示したものである。 特許出願人 電気化学工莱株式会社
を図示したものである。 特許出願人 電気化学工莱株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)リンホトキシンの産生遺伝子を組入れた組換え宿
主中で生産されるリンホトキシンを精製する方法であつ
て、下記(a)〜(e)工程を組合わせ又は繰り返し、
純度95%以上、エンドトキシン 0.05kg/リンホトキシン1mg以下とすることを
特徴とするリンホトキシンの精製方法。 (a)リンホトキシン含有液にカチオン性高分子凝集剤
を添加処理する工程 (b)リンホトキシン含有液を硫酸アンモニウムによる
塩析処理し、リンホトキシンを沈殿させ、再溶解する工
程 (c)リンホトキシン含有液を40〜70℃で熱処理し
、混在する蛋白質を沈殿させ除去する工程 (d)リンホトキシン含有液を陰イオン交換クロマトグ
ラフィー処理する工程 (e)リンホトキシン含有液を金属キレートアフイニテ
ィークロマトグラフィー処理する工程(2)第(1)項
記載の(a)〜(e)の各工程に、(f)リンホトキシ
ン含有液をゲル濾過処理する工程を付加することを特徴
とするリンホトキシンの精製方法。 (3)工程(a)が他の工程に先行することを特徴とす
る第(1)〜(2)項記載のリンホトキシンの精製方法
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3500088A JPH01211496A (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | リンホトキシンの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3500088A JPH01211496A (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | リンホトキシンの精製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01211496A true JPH01211496A (ja) | 1989-08-24 |
Family
ID=12429852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3500088A Pending JPH01211496A (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | リンホトキシンの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01211496A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0449151A2 (en) * | 1990-03-27 | 1991-10-02 | Chuichi Hirayama | Material of adsorbing pyrogen |
-
1988
- 1988-02-19 JP JP3500088A patent/JPH01211496A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0449151A2 (en) * | 1990-03-27 | 1991-10-02 | Chuichi Hirayama | Material of adsorbing pyrogen |
US5401499A (en) * | 1990-03-27 | 1995-03-28 | Shinkohjinkasei Co., Ltd. | Method of adsorbing pyrogens |
US5498409A (en) * | 1990-03-27 | 1996-03-12 | Chuichi Hirayama | Material for adsorbing pyrogen |
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