JPH01211496A - リンホトキシンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生物学的活性を有するポリペプチドであるリ
ンホトキシン（ＬＴ）の精製法に関する。

ＬＴは抗腫瘍剤として期待賂れており抗ウィルス剤とし
て使用される可能性もある。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕蛋白質の
ａｈ方法は一般に知られており、塩析、デル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、成層クロマトグラフィーの
ごとき技法を含む。これらの技法のそれぞれは公知であ
るが、所与の蛋白質の精製のために上記の技法のいずれ
かを適用することができる範囲を予想することは非常に
困難である。要求される精製の程度、蛋白質の生物学的
活性の損失の程度及び要求される蛋白質の均一性の程度
を包含する種々の因子が生成物の精製を最適化するため
に多くの実験を要求する。

天然型ＬＴの精り法は、例えば“特開 昭５８−１６６８７号公報、特開昭５９−８４８２７号
公報、特開昭６１−１８６３２４号公報等に記載されて
いるが、組換え型ＬＴは同様の方法を用いて精製するこ
とは困難である。

組換ＩＬＴの精製法としては、塩析と免疫アフィニティ
ークロマトグラフィーを利用する方法妙ζ特開昭６１−
５６１９７号公報及び［Ｇｒａｙ等、Ｎａｔｕｒｅ　（
１９８４）　３１２　：　７２１　７２４　）にある。

しかし免疫アフィニティーを用いるには、ＬＴの活性を
失わないようなＬＴに対する抗体が必要であり、その取
得は、困難であり汎用性に欠けさらに、スケールアップ
も容易でない。

又、ヒ）　Ｌ　Ｔ　ｉ　Ｆｅ２を含む動物細胞培養液か
らｈｈする方法として金属アフィニティークロマトグラ
フィーを用いる方法が特開昭６３−３７９６号公報に開
示されているが、金属アフィニティー単独または記載の
陰イオン交換クロマトグラフィーゲル濾過の組合せのみ
では、高純度のＬＴを得ることは困難である。

方法である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、リンホトキシンの産生遺伝子を組入れた組換
え宿主中で生産式れるリンホトキシンを精製する方法で
あって、下記（ａｔ〜（ｅｌ工程を組合わせ又は繰り返
し、純度９５％以上エンｒトキシン０．０５／ｌｊＬ／
リンホトキシン１〜以下とすることを特徴とするリンホ
トキシンの精製方法である。

（ａ）　　リンホトキシン含有液にカチオン性高分子凝
集剤ｔ−添加処理する工程 （ｂ）、リンホトキシン含有液を硫酸アンモニウムによ
る塩析処理し、リンホトキシンを沈殿させ、再溶解する
工程 （（）　　リンホトキシン含有液を４０〜７０℃で熱処
理し、混在する蛋白質を沈殿させ除去する工程ｆａ＋　
　＋）ンホトキシン含有液を陰イオン交換クロマトグラ
フィー処理する工程 （ｅ）　リンホトキシン含有液を金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィー処理する工程さらに本発明で
は、上記（ａｌ〜（ｅｌの各工程に、（ｆ）リンホトキ
シン含有液をデル濾過処理す、る工程、の付加及び上記
工程（ａｌが他の工程に先行することを特徴とするリン
ホトキシンの精製方法をも課題解決の手段とするもので
ある。

以下具体的に説明する。本発明で使用するゝリンホトキ
シン（ＬＴ）’は、特開昭６３−８３９８号公報に示す
アミノ酸配列と実質的に同等であり、ある極の腫瘍細胞
系統に対する細胞抑制作用を持つリンホカインの１分子
であることを意味する。

また、ＬＴはマクロファージ活性化作用をも有するもの
であり、その生物活性は、マウスＬＰ３細胞（Ｌ細胞の
亜株）に対するｉｔｓ、　ｙｉｔｒｏ　＃Ｉ胞変性アッ
セイにより確認されている〔小林等、ジャーナル拳オデ
・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　）１２２．７
９１　（１９７９））。

ＬＴの１実質的に同等なアミノ酸配列′とは、アミノ酸
配列が同一であるか変化した形すなわちアミノ酸配列が
同一であるかあるいはその生物活性を破壊しない範囲で
変化した形を意味する。変化した形とは、１または複数
のアミノ酸の変化（欠失、付加、置換）、アミノ酸残基
の酸化還元、誘導体化、側鎖の修飾等によりＩ＋Ｔ分子
が修飾された分子を意味する。前記特開昭６３−８３９
８号公報の他、特開昭６３−８３９９号公報及び本出願
人による％願昭６２−１６０１１５号明細書記載のアミ
ノ酸配列がこれに相当する。本発明で使用する’ＬＴ産
生遺伝子′とは前記のＬＴ分子を決定する配列を有する
遺伝子を意味する。

本発明で１組換え宿主′とは組換分子生物学的方法によ
りＬＴをコードするＤＮＡが導入された細胞であり、定
義の範囲内で真核細胞、例えは、哺乳類細胞、真核微生
物細胞、原核細胞、例えば、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　）のバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　、ｘシエリシャ属（Ｅａａｈｅ
ｒｉａｈｉａ）のイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）など
が含まれる。

本発明でＬＴを含有する水性混合物′とは、組換宿主の
培養物由来の混合物、例えば組換Ｌ？遺伝子を発現する
純銅宿主を高圧ホモジナイず−〔例えばラボラトリ−・
ホモジナイザ−（ゴーリンＣ０ＲＰ、社製）〕処理、超
音波処理等で破砕した混合物、あるいはそこから遠心濾
過等で沈殿を除去したもの、あるいは精製工程（ａ）〜
（ｆｌの１工程あるいはその幾つかを組あわせて部分精
製したものを意味する。

本発明でＮ製工程（ａｔで用いるカチオン性高分子凝集
剤には、キトサン、微粒子状イオン交換ゲル、４級アン
モニウム塩、メタクリレート１合体、ポリエチレンイミ
ン等がある。市販されてｂるものとしては、バイオクリ
ル（東ソー株式会社製）、Ｃ−−５、Ｏ−９（栗田工条
株式会社Ｈ）などがこれに相当する。工程（ａｌはｎ製
の初期に用いるのが好ましく、ＬＴを含む菌体破砕液、
あるいは―体破砕上清を処理するのに適する。菌体破砕
液を処理する場合、ポリエチレンイミンを用いるには、
あらかじめ−を中性付近（ｐＨ６〜９）に調整した５〜
２０％のポリエチレンイミン溶液をＬＴ含有液に攪拌し
ながら徐々に加え細胞破砕物、核酸、及びＬＴ以外の蛋
白質を凝集させて除去する。ポリエチレンイミンの添加
量は宿主かに、　ｃｏｌｉの場合、菌体のＯＤ６６０が
１当り２０μμ以上、特に２５〜３５μμがＬＴの収出
等もよく望ましい。

２０μｇ未満では核酸の除去が不充分であり、また不必
要に多く添加すると未反応のポリエチレンイミンを溶液
中に多量に含むことＫなり、以下の精製工程に影響を及
ぼすこととなる。自体ｆ＆砕上清を処理する場合、適当
なポリエチレンイミンの濃度は、菌体のｏＩ）ｓａｏ　
”　１当り１０μｇ以上、特に２０〜３０μｇが収出も
よく望ましい。

精製工程ｔｂｌで用いる硫酸アンモニウムによる塩析は
ＬＴ金含有粗抽出物から核酸等を除去した段階程Ｋ（工
程（ａｌで精製した後〕のＬＴ含有液を処理するのに適
した方法である。硫酸アンモニウムは、ＬＴ含有液に粉
末あるいは飽和水溶液の形で徐々に添加し２時間以上塩
析を行う。硫酸アンモニウムの濃度は、最終濃度が、２
０％飽和以上、好ましくは、低温にて４０−４５％飽和
、１２時間以上塩析を行うのが収出、精製度から好まし
い。

この塩析によりＬＴは沈ｌｉ画分に回収され、その沈殿
を水溶液に溶解し硫酸アンモニウム＃に度を６．５％飽
和以下にすることでＬＴのほぼ全活性を回収することが
できる。この際溶解しない沈殿を除、去することでより
精製度を上げることができる。

工程（・Ｃ）で用いる熱処理はどの精製工程のＩ、？含
有液に用いても有効である。好ましくは、工８（ａ）の
処理をした以降のいずれかの工程において、さらに好ま
しくは、工程（ｂ）の塩析の後の工程として行うのがよ
い。熱処理に有効な温度は、ＬＴ含有液の温度が４０〜
７０℃、好ましくは５５−６５°Ｃの間であり、処理時
間は５分以上、好ましくは１０〜６０分である。熱処理
の工程金行うことで他の精製工程だけでは除去困難な、
混在しているＳＤ８電気泳動で分子量的２５．ＯＣＩ　
ＣＪを示す蛋白質を除去することができる。

工程（ａ）で用いるイオン交換クロマトグラフィーに用
いる担体には、陰イオン交換基であるジエチルアミノエ
チル（ＤＩＡＩ　）　、第４級アミノエチル（１；ＬＩ
Ｃ）　及び、陰イオン交換基であるカルボキシメチル（
ＣＭ）等が結合したものがある。市販されているものと
してはＤＩＡＩ［ｆ−セファロース、（３Ｍ−セファロ
ース（ファルマシア　ファインケミカル社）、Ｄｌ！：
ＡＭ−セルロファイン、ＣＭ−セルロファイン（生化学
工業社）、ＤＥＡＫ−）ヨパール（東ソー社）等がこれ
に相当する。イオン交換クロマトグラフィーを用いる工
程は、前処理を終えてから用いるのが望ましく工程（ａ
）を終了した工程以降ならどの工程でもよく、好ましく
はｌａｌ〜（ｃ）までを終えた工程以降の工程として用
いるのが有効である。またイオン交換クロマトグラフィ
ーは担体を組合わせ、くり返すことで精製度を上昇させ
ることができる。この段階でＬＴは担体、緩衝液の条件
により未吸漸画分として得ることも、吸着はせ、水素イ
オン濃度（−）、塩濃度等の変化による段階的あるいは
濃度勾配により溶出させることも可能である。例えば、
ＤＥＡＥ−セルロ７アイン　Ａ−２００（生化学工業社
）の担体を用いると１０　ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７
，０〜８．５　）に０〜０．１Ｍの食塩を加えた緩衝液
で平衡化した条件下でＬＴは未吸着画分に得られる。ま
たＤＩＣＡＩ！ｔ−セルロファイン　Ａ−５００（生化
学工業社）の担体を用いると、０．０１Ｍの食塩を含む
ｉＱｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｍ　８．０〜８．３）で
平衡化したカラムではＬＴは吸着され、食塩濃度を［１
，０５Ｍに上昇させることで溶出される。ＣＭ−セファ
ロース（ファルマシア　ファイン　ケミカル社）の担体
では０．２−０．５　Ｍの食塩を含む５ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）で平衡化したカラムではＬＴは吸着さ
れ水素イオン濃度（−）を７に上昇させたり食塩濃度を
１．０Ｍに上昇させることで溶出される。収率、比活性
の上昇等を考慮し、ＤＥＡＲ−セルロファインＡ　−２
００、ＤＫＡＥ−セルロファインＡ３００、それぞれ単
独、または組み合わせて用いることが好ましい。緩衝液
は徨々のものが選歌でき、−、イオン強度の組合わせも
自由に変更することができる。上記の条件は好ましい例
の１つであるＫすぎない。

工程ｆθ）で用いる金属キレートアフィニティークロマ
トグラフィーで用−る担体には、イミノジ酢酸等を結合
しである金属キレート樹脂、例えば１キレ−ティングセ
ファロース（ファルマシア　ファイン　ケミカル社）、
キレーテイングセルロファイン（生化学工業社）などの
市販品がある。金属キレートアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いる工程は、前処理を終えてから用するこ
とが望ましく、工；Ｉ　（ａ）終了後のどの工程でもよ
い。好ましくは（ａ）〜（ｃ）工程終了後がよい、工程
（ｄ）、（ｅｌの順はどちらが前でも良好な結果を得ら
れる。キレート樹脂にキレート結合させる金属としては
Ｏｕ”、Ｚｎ”＋などがあり、どちらもＬＴの精製に有
効であるが、Ｚｎ”＋を用いる方がより好ましい。金属
キレート担体を用いる問題として、蛋白質によっては高
濃度で金属イオンと結合して沈殿を生じるものがある。

ＬＴとＺｎ”＋などがその好例である。

即ち、金属イオンを結合した金属キレートカラムを用込
ていると、カラムより多少の金属イオンが遊離し溶出液
中に混入して蛋白質の１部がそのことにより沈殿して不
溶化してしまう。この解決法として金属をキレートさせ
たキレート担体のカラムの後にポストカラムとして金属
をキレート葛せていない担体のカラムを結合させる。こ
の方法で溶出液中に金属イオンが漏出してくるのを阻止
することが可能となる金属キレートアフィニティークロ
マトグラフィーをＬＴの精製として用いる際にはこの工
夫がＮ要である。アフィニティークロマトグラフィーで
はＬＴは吸着する条件で癌加し、適切な緩衝液で溶出す
ることが望ましい。

工程ｉｆ）のデル濾過は工程（ａｔの後ならどの段階に
用いてもよいが、望ましくは精製の最後に用いるのがよ
い。精製の最後の工程として用いる際、通常ＬＴは既に
９５％以上の純度となっている。しかしＬＴｔ−医薬品
として用いるには溶媒の組成、微量のパイロ−ジエンの
混入が問題となってくる。

デル濾過を行うことで溶媒の交換より一層のパイロ−ジ
エンの除去を行うことができる。ここで用いるデル濾過
の担体としては、スーパーローズ、セファロース、セフ
ァクリル（以上ファルマシア・ファイン春ケミカル社）
バイオデル（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）、セルロファイン（生
化学工業社）等いずれでもよいがＬＴのＩ＆層が少ない
セファクリル、スーパーローズ、バイオデル等が好まし
い。

以上（ａ）〜（ｅ）又はｌａｌ〜（ｆ）の工程を組合わ
せたり繰り返すことで純度９５％以上、エンｖトキシン
宮量０−０５　ｎＥ／ＩＱ　Ｌ　Ｔ以下のＬＴｔ−得る
ことカテきる。

本発明でＬＴの純度とは、蛋白質純度分析（ＥＩＤ８−
ＰＡＧＥ後述）による値ｔ−奮う。工程の組合わせの例
としては、 １　）　　　（ａｔ　→（ｂ）　−）　（Ｃ１→（ｄ）
　−＊　（ｅｌ　４　（ｆｌＩＩ　）　　　（ａ）−＋
　（ｂｌ　−＋　（ｃ）４　（ａ＞　＋　（ａｌ　ｎ　
（ｅｌ　→（ｆｌｌｉｔ　）　　　（ａｌ　−＋　（ｂ
ｌ　−＋　（ｃｌ　−＋　ｔｅｌ　４　（ｄ）　−＋　
ｆｆ１ｌｖ　）　　　（ａｌ　＋　（ｂｌ　４　（ｃ）
　→（ａｔ　＋　（ｅｌ　−＋　（ｄ）　→１ｆｌｖ　
）　　　（ａｌ　４　（０）　−＋　（ｂｌ　−＋　（
ａｌ　−＋　（ｅ）−＊　（ｆｌＶｌ）　　　（ａ）−
＋（ｃｌ−＋（ｂｌ−＋（ｄｌ−＋（ｄ）−＋（ｅ）−
＋（ｆ）Ｖｌｌ）　　　（ａ）　→（ａｔ　→（ｂ）　
＋　（ｅ）　→（ｄｌ　−＋　（ｆｌｖｉｉｌ）　　　
（ａｔ→（ｃ）　→（ｂｌ→（ａｌ　−＋　（ｅｌ　→
（ａｌ　→（ｆｌｌｘ　）　　　（ａｔ　→（ｂｌ　→
（ａｔ　→（ｃｌ　−＋　（ｅｌ　−＋　（ｆｌＸ　ｍ
）　　　（ａｔ　−４（ｂｌ　−＊　（ａｔ　−＋　（
ｃｌ　４　（ｄ）４　（ｅｌ　→（ｆ）ＸｉＸｆ）　　
　（ａｌ　−＋　ｌｂｌ　−＋　（ｅ）　→ｌｃｌ→（
ａｌ　−（ｒ）ｘｊｊ４）　　　（ａ）−＋（ｂ）−＋
（ｅｌ−＋（ａｌ−＋１ｃｌ−＋（ｆ）などが組合わせ
中でも好ましく　、（１）（１）（Ｉｉｉｌなどは特に
好ましい例である。より具体的に第１図に示す。

前記中、具体的に説明するため、固有の樹脂、担体、限
外濾過膜名を記述したが、これによりこの発明の範ｖ５
を限定するものではない。

〔実施例〕

実施例１ シラスミドｐＤＲ１２により大腸菌株Ｗ３１１０を形質
転換した。このプラスミーはｔａａ　７″ロモーター制
御のもとにヒ）ＬＴをコードするｃ　ＤＮＡを含有する
。このプラスミドにより産生されるＬＴは特開昭６３−
８３９９号公報で示すアミノ酸配列を有している。この
細胞をＭ９培地にて１＠養しイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシｐ（工ＰＴＧ）を添加してＬＴ生産を誘導
した。

集菌 細胞浮遊液を加圧下で中空繊維細孔（０，２２μ）ポリ
スルホン膜（Ｒｏｍｉｃｏｎ社）を通して循環させるこ
とにより約１０倍に濃縮し、さらに破砕用緩衝液（５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯｌ（ｐ）１８．０　）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ。

５　ｍＭ　Ｎａ１ｌ　）にて透析濃縮し残ｗ培地を除去
、濃厚細胞懸濁液を得た。

細胞破砕 高圧ホモジナイザー（ラボラトリーホモジナイデー：プ
ーリンＣ０ＲＰ、社）にて濃厚細胞懸濁液を６０００　
ｐｓｉの圧力で２回処理し細胞の破砕を行った。

破砕用緩衝液にて１０％に希釈、ｐ）ｉ８．２に調整し
たポリエチレンイミンｔ−ｍ体量に応じ（菌体濃度０Ｄ
６６ｏが１当り６０μｇのポリエチレンイミン）６０分
間かけて添加、６０分攪拌後、凝集物を遠心（１０，０
００，９）にて除去しＬＴを含む上ｆｐｒを分離した。

粗精製 工程（ｂｌ：前処理済のＬＴ含有液に細粒化した硫酸ア
ンモニウムを飽和濃度が４３％になるように４°ＩＦ拌
下添加した。１晩放置後、塩析により生じた沈殿を１２
，０００，９の遠心にて採取１　［１ｍＭ−Ｔｒｉｓ−
Ｈ（！１　緩衝液（＃　７．５　＞に溶液中の硫酸アン
モニウム濃度が６．５％飽和以下になるように溶解した
。不溶性の沈殿を１２，０００，９の遠心により除去し
ＬＴｔ−含む上滑を得た。

工程（Ｃ）：工程（ｂ）終了後のＬＴ含有液に熱を加え
、溶液の温度が６０℃になってから１０分間攪拌を継続
した。生じた沈ｘ’ｔｉ　ｓ、ｏ　ｏ　ｏ　、９の遠心
にて除去し、ＬＴを含む上清を得た。

工程（ｃ）終了後の上清を限外濾過にて分子量カットオ
フ８．０００カツトのポリエーテルスルホン膜（ツバ１
３ｋＸＦ工Ｉ、ＴＲｏＮ社）ｔ−用い濃縮した。透析は
次工程で用いる緩衝液を追加し濃縮を繰り返すことで行
った。

実施例２ 実施例１により得たＬＴ含有液を予め Ｑ、１Ｍ　ＮａＣ１，０−０１％ポリオキシエチレン（
２０）ンルビタンモノラウレー）　（Ｔｗｅｅｎ　２０
和光純桑）を含む１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ１緩衝液
（ｐＨ７，５）で平衡化したＤＨＡＸ−セルロファイン
　Ａ−２００（生化学工業社）の力２ムにチャージし、
ＬＴを含む未吸着画分を採取した。

陰イオン交換クロマトグラフィー（１）の工程により得
たＬＴ含有液を実施例１中の方法と同様の方法にて、０
−０１　Ｍ　ＮＩＬＯＩ　、０−０１％Ｔｗｅｅｎ　２
０を含む１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯＩＭＩ衝液で［ｉ
ｉ透析を行ツタ。

このＬＴ浴溶液予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロファイン　Ａ−５００（生化学工業社）のカラムに
チャージし、ＬＴを成層洗浄した後、０−０５　Ｍ　Ｎ
ａ０１を含む同緩衝液で溶出し、Ｉ、Ｔｔ−含む水溶液
を得た。

金属キレートアフィニティークロマトグラフィＩ　Ｍ　
Ｎａ（！１、ｌ［］ｍＭ酢酸亜鉛を含む酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）でＺｎ”＋を結合させた千レーティングセフ
ァロース（ファルマシア社製）でＺｎキレートカラムを
作製し、その直後に金属イオンを結合していないキレ−
チイングセ７アロースカラムを後カラムとして接続した
。これらのカラムを予めｌ　Ｍ　Ｎａ１ｌ、０．０１％
Ｔｗｅｅｎ　２０　ｔ”含む２Ｑ　ｍＭリン＆緩衝液（
ｐＨ７，６）で平衡化した。前工程で得たＬＴ富有液を
同緩衝液で透析曖細しカラムにチャージした。同緩衝液
にて洗浄後、０．２Ｍイミダゾールを含む、同緩衝液に
て溶出、ＬＴｔ−富む水浴液を得た。

前工程で侍たＬＴ含有液を０．８％Ｍａｉｌを含む５ｍ
Ｍ、ｌ、ｌン酸収慟液（ｐｉ−１７，２）で平衡化した
セファクリル５−２００（ファルマシア社製）のカラム
にチャージし、ＬＴ浴出画分を分取した。

以上の工程により純度９５％以上のＬＴを得ることがで
きる。その各工程における結果を第１表に示す。

第１表で示したように精製の各工程ごとにＬＴの比活性
は上昇し、デル濾過終了の際には原液（菌体破砕液）の
６３０倍になっていた。

実施例３ 実施例１０集菌、前処理、粗精製を以下の方法でかつ工
程１ｂｌ−透析−１程（ｃｌの順で行った後、実施例２
の方法で精製を行い純度９５％以上のＬＴを得た。

集菌 細胞浮遊液を連続遠心にて処理し、連続的に沈殿を採取
、破砕用緩衝液にて洗浄後同緩衝液にて濃厚細胞！＠淘
液を調整した。

前処理 細胞破砕液より細胞破片ｔ−２０，［ｌＤＯ，９の連続
遠心にて除去、その上清に実施例１、工程（ａ）と同様
に調整したポリエチレンイミン溶液を菌体濃度０Ｄ１５
６０１当り２５μ９のポリエチレンイミン賃になるよう
に添加−様な方法でＬＴを含む上清を分離した。

粗精製 実施例１の工程（ｂ）で塩析により生じた沈殿を溶解、
沈殿除去を行わずに工８１ｃ）を終了した。

実施例４ 実施例２の工程（ａｔのイオン交換クロマトグラフィー
’！１ＤＥＡｌ−セルｏ７７（ｙＡ−２００１回のみと
し、以下工８　（ｅｌ　、（ｆ）と行うことで純度９５
％以上の高純度ＬＴｔ−得た。イオン交換クロマトグラ
フィーは、Ｄ−０５Ｍ　Ｎａ１ｌ　　Ｑ、Ｑ　１％ＴＷ
８６ｎ　２０を含むｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ＰＨ８，３ンを用い、同緩衝液にて力２ムを平衡
化未吸層分画を採取することでＬＴ分１ｉ１ｉｌを得た
。

実施例５ 実施例２の工程（ａ）のイオン交侠りロマトグラフイー
ヲＤｈＡｌｅ−ｔルｏ、；ｙ７（ｙ　　Ａ−５００１１
ｍのみとし、他は実施例２と同様の操作を行うことで純
度９５％以上のＬＴを得た。

実施例６ 実施例４の工程をｔｅｌ　（ｄｌ　（ｆｌの順に行い金
属アフィニティークロマトグラフィーの後、イオン交換
クロマトグラフィーを行うことで純度９５％以上のＬＴ
を得た。

実施例７ シラスミドｐＬＴ　１３　ｔａａ　６−８により大腸菌
株ＪＭ１０５を形質転換した。このプ２スミ−により産
生されるＬＴは特開昭６３−８３９８号公報で示すアミ
ノ酸配列を有している。この細胞を用すて産生したＬＴ
を実施例１、実施例６の方法と同様の方法で精製し純度
９５９０以上のＬＴを得た。

実施例８ デラスミ）’ｐＤＫ１０ｔＫＪ：９大腸ｌｉｅ　Ｗ　３
１　ｆ　Ｏを形質転換した。このシラスミドにより産生
されるＬＴのアミノ酸配列は特願昭６２−１６０１１５
号明細書に記載した。この細胞を用いて産生じたＬＴを
実施例１、実施例２の方法と同様の方法で精製し純度９
５％以上のＬＴを得た。

実施例９（熱処理条件） 工程（ｃｌの熱処理条件を検討した。温度条件の検討法
としては、実施例１に準じて硫安塩析後透析の操作を行
った部分精製ＬＴ標品と、実施例３に準じ工程（ａ）−
（ｂｌ　−（（１）終了後の部分精製ＬＴ評品を試料と
し、第２表の温度条件下１０分間の熱処理を行った。

第２表で示した様に熱処理は４０〜７０℃が適切である
。精製純度の上昇、収藁、安定性を考え、５５〜６５℃
が最適であることがわかった。また、６０℃処理による
安定性を検討したところＬＴは６０℃で少なくとも４時
間は安定で、活性の低下は認められなかった。

比較例（熱処理の効果） 実施例３の方法で熱処理工程（工程ｃ）を行わなかった
もの即ち（ａｌ　−（ｂｌ　−（ａｔ−６１−（ｆｌの
工程で精製したものと実施例３の方法により得たＬＴ標
品の比較をＥＩＤ８−電気泳動にて調べた。熱処理工程
を行わないと混在する分子［２５，０００付近の蛋白質
の除去が内離であった。

測定法 １）純度分析 デル濾過終了後のＬＴに関し乾燥Ｘｔ試験、ＯＥＭ元素
分析、Ｎａイオンの定量、ビュウレット法による蛋白質
定量（ＢＩ３Ａを基準蛋白質とした）、フェノール硫酸
法による抛の定量、ジフェニルアミン法による核酸定量
を行った。実施例１．２により精製したＬＴは全有機物
中蛋白質が９８％以上であり、糖含量１％以下、核酸含
量０．１％以下の純度であった。

２）　　＊白質純度分析（１１（８Ｄ８−ＰＡＧＥ　）
ｒルｆ１１ｍ終了後のＬＴを８ＤＢ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ　）により分析した。

８ＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質は分子サイズにより分離
され、泳動後クマーシー・ブリリアント・デル−（ＣＢ
Ｂ　）染色をすることで定量測定をし得る。

ＬＴ最終精製物を、５％−２−メルカプトエタノール、
１０％グリセリン、２．６％８ＤＳ、ｏ、ｏｏ１％ブロ
ム・フェノール・ブルーｒ含ｔｒ　６２．５　ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＯＩ　（ｐＨ６，８）で［］、３１ｎ９／ｄの
濃度に希釈し、１００℃５分間の処理ｆ：する。このＬ
Ｔを６ｋｇ／デルレーンでＪＩＬ延０．７ｍｍ１５％ア
クリルアミドデルにチャージし電気泳動した。泳動終了
後デルスラブを０．１％ＯＢＢ、１５％メタノール、１
０％酢酸の染色液中に浸し染色、３０％メタノール、１
０％酢酸の洗浄液で脱染した。泳動像をデンシトメータ
ーにて５５０　ｎｍの波長でスキャンニングした。ＬＴ
によるピークの面積を測定し、スキャンにおいて測定さ
れた全面積（蛋白質の発色に由来するもの）で除し、そ
れに１００を乗じて実施例１．２で精製したＬＴの蛋白
質純度を決定した所、ＬＴは９９％以上の純度であった
。

３）蛋白質純度分析（２）（逆相クロマトグラフィー）
デル濾過終了後のＴ、、Ｔ＠終精製物を逆相クロマトグ
ラフィーにより分析した。ｂＴＩＩＲ９／ｄの濃度に０
．１％トリフルオ酢酸（ＴＦＡ　）水溶液にて調整し、
同溶液で平衡化した逆相カラムμＢｏｎｄｐａｃｅ（（
Ｗａｔｅｒｓ社製）に１００μｌをチャージ、０．１％
ＴＦＡ存在下アセトニド替ルｏ−ｉ　ｏｏ％の直線濃度
勾配にて溶出した。蛋白質の検出は２１４　ｎｍの吸収
を測定することによった。

実施例１．２の方法で精製したＬＴはアセトニトリル裏
皮６０％の位置に単一のピークとして検出されＯＤ２１
４のピーク総面積中９９％以上を占めていた。

４）エンｒトキシン（ＬＰ８　）の定量ＬＴ最終標品中
のバイロージエンｔｔ−エンドトキシンの定量を行うこ
とで測定した。測定には）カブトガニ血球抽出液と発色
合成基質を用いた合成基質法のトキシヵラーシステム（
生化学工業■）を用い、ｐニトロアニリンの遊離量から
エンートキシン濃夏を調べたゆ対照標準エンｖトキシン
には市販品のＥ、　ｃｏｌｉ　０１１１由米の生化学工
業（株）社製のものを用いた。

５）ＩＩＴの生物活性による精製度 ＬＴ感受性マクスＬＰ・３　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ継代細胞
を用すてＬＴの生物活性を測定した。ＬＴの活性の強さ
はユニット（Ｕ）で表わし、Ｕは以下の方法で定義した
。即ち、ＤＭ−１６０無血清培地にてＬＰ３Ｍ胞ｋ　３
　Ｘ　Ｉ　Ｑ”　ｃｅｘｌａ　／ｍｌになるよ５ＫＭ整
し、９６ｍｅ１１平底マイクロウェルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ社ｍ）に５０　ｔｉｌ　／　ｗｅｌｌ　テ分注Ｔ
　ル。

１８時間培養後２倍希釈系列で希釈した試料（ＬＴ浴溶
液２５μｌとアクチノマイシンＤ４０　ｆｉｌ／ｍｉｓ
　　１０％ｙｅｓ　ｙ含むＤＭ−１６０ｊ＠地を加えδ
らに１８時間培奈する。その後、クリスタルバイオレッ
トにて染色し生存Ｍ胞の割合全色素の取込み量で判定す
る。ＬＴ１ユニットを５０％のＬＰ３細胞を殺すのに必
要な量として定義する。蛋白定量は牛血清アルブミン（
ＢＳＡ　）を標準蛋白質としＬｏｗｒｙ法により求めた
。ＬＴ含有液のＬＴに基づく生物活性を測定しその蛋白
裏皮で除し、蛋白質１〜当りの生物活性をＵで表したも
のを比活性とし、精製度の指標の１つとする。

６）収率 破砕液に対する各工程後の総生物活性を百分藁で示した
。

〔発明の効果〕

本発明の′ｎｔ！Ｒ方法により、医薬品として用いるこ
とが可能な程度の高純度、即ちパイロ−ジエン、核酸、
リンホトキシン以外の蛋白質ヲ実質的に含まない均一な
リンホトキシンを大量に取得することが可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の特に好まし？ｉ製工程の組合せの例
を図示したものである。 特許出願人　　電気化学工莱株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リンホトキシンの産生遺伝子を組入れた組換え宿
   主中で生産されるリンホトキシンを精製する方法であつ
   て、下記（ａ）〜（ｅ）工程を組合わせ又は繰り返し、
   純度９５％以上、エンドトキシン ０．０５ｋｇ／リンホトキシン１ｍｇ以下とすることを
   特徴とするリンホトキシンの精製方法。 （ａ）リンホトキシン含有液にカチオン性高分子凝集剤
   を添加処理する工程 （ｂ）リンホトキシン含有液を硫酸アンモニウムによる
   塩析処理し、リンホトキシンを沈殿させ、再溶解する工
   程 （ｃ）リンホトキシン含有液を４０〜７０℃で熱処理し
   、混在する蛋白質を沈殿させ除去する工程 （ｄ）リンホトキシン含有液を陰イオン交換クロマトグ
   ラフィー処理する工程 （ｅ）リンホトキシン含有液を金属キレートアフイニテ
   ィークロマトグラフィー処理する工程（２）第（１）項
   記載の（ａ）〜（ｅ）の各工程に、（ｆ）リンホトキシ
   ン含有液をゲル濾過処理する工程を付加することを特徴
   とするリンホトキシンの精製方法。 （３）工程（ａ）が他の工程に先行することを特徴とす
   る第（１）〜（２）項記載のリンホトキシンの精製方法
   。