JP2002500013A - ヒトプロインシュリンの製造方法 - Google Patents

ヒトプロインシュリンの製造方法

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ユング−ウー キム，
ワング−シク リー，
チャング−キュウ キム，
ヨング−イン キム，
ジェ−ニイ フュー，
ジェオング−ウー シン，
スング−ジン オー，
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チョング クン ダング コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトプロインシュリンの製造方法に関する。より具体的に、本発明は化学式（Ｉ）のヒトプロインシュリンの製造方法に関する。式中、Ｒが酵素的または化学的に分解できるアミノ酸残基またはペプチドであり、そして、Ｘが、Ａ−１ないしＡ−２１の領域がインシュリンＡ鎖で、Ｂ−１ないしＢ−３０の領域がインシュリンＢ鎖である場合、インシュリンＡ鎖中のＡ−１のアミノ基とインシュリンＢ鎖中のＢ−３０のカルボキシル基との結合であって、酵素的または化学的にＡ鎖またはＢ鎖から分離することができる結合である。本発明のヒトプロインシュリンの製造方法によると、溶解とスルホン化、濃縮、脱塩および精製の工程を単純化し、再生反応の収率を向上させることから、再現性を確保しながらヒトプロインシュリンを生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 発明の技術分野 本発明は、ヒトプロインシュリンの製造方法に関する。より具体的に、本発明
は下記化学式（Ｉ）のヒトプロインシュリンの製造方法に関する。
【０００２】
【化３】
【０００３】 Ｒが酵素的または化学的に分解できるアミノ酸残基またはペプチドであり、そ
して、 Ｘが、Ａ−１ないしＡ−２１の領域がインシュリンＡ鎖で、Ｂ−１ないしＢ−
３０の領域がインシュリンＢ鎖である場合、インシュリンＡ鎖中のＡ−１のアミ
ノ基とインシュリンＢ鎖中のＢ−３０のカルボキシル基との結合であって、酵素
的または化学的にＡ鎖またはＢ鎖から分離することができる結合である。
【０００４】 化学式（Ｉ）において、Ａ鎖、Ｂ鎖には、６個のシステイン残基からなる３個
のジサルファイド結合（Ａ−６とＡ−１１、Ａ−７とＢ−７、Ａ−２０とＢ−１
９）が存在する。
【０００５】従来技術 一般に、ヒトインシュリン前駆体（プロインシュリン）は当該遺伝子を大腸菌
のプラスミドＤＮＡに挿入することにより、目的とする成熟インシュリン（イン
シュリン）を生産する段階を含む組換えＤＮＡの技術により製造されてきた。
【０００６】 図１から分かるように、プロインシュリンを含む融合タンパク質は大腸菌細胞
内で封入体の形で発現され、細胞破砕の後、遠心分離により得られた封入体は非
イオン性またはイオン性の界面活性剤、または低濃度の変性剤で洗浄される。こ
のような処理は遠心分離とともに繰り返して行われ、目的タンパク質の純度を増
加させる（参照：Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ５６， ６１−１０８， １９９７）。洗浄された封
入体は分子間の疎水性作用との誤ったジサルファイド結合の形成を最小化するた
め、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または２−メルカプトエタノールなどの還元
剤を含む尿素または塩酸グアニジン溶液などの変性剤で溶解するか、またはＮａ
ＯＨによりアルカリ溶解する（参照：Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ４１，３−１３
， １９９３）。溶解された封入体は手早く遠心分離し、上澄液を冷却水で希釈
して沈澱物として回収する（参照：ＥＰ ０ ０５５ ９４５ Ａ２）。回収さ
れた封入体はプロインシュリンとβ−ガラクトシダーゼなどの異種タンパク質が
メチオニン残基の架橋化により、つながって融合状態で存在する。なお、封入体
は融合部をシアノゲンブロマイド（ＣＮＢｒ）で切断し、プロインシュリンに存
在する６個の−ＳＨ基を−Ｓ−ＳＯ3 - に置換することにより、プロインシュリ
ンをプロインシュリンＳ−スルホン酸塩に転換し、プロインシュリンの安定性を
増加させ、かつ後続工程の再生反応の効率を高める（参照：ＥＰ ０ ０５５
９４５ Ａ２）。プロインシュリンＳ−スルホン酸塩は自然構造を有するように
２−メルカプトエタノール、ＤＴＴなどの還元剤または酸化・還元グルタチオン
のような酸化還元系により再生される（参照：Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ４１，
３−１３， １９９３）。このように得られた自然状態のプロインシュリンは
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢでＡ鎖とＢ鎖をつなげているＸ（または
、Ｃ鎖）を取り除くことにより活性形インシュリンに転換される（参照：Ｋｅｍ
ｍｌｅｒ Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂ．Ｃ．， ２４６， ６７８６−６
７９０， １９７１）。インシュリンは逆相高性能クロマトグラフィー（ＲＰ−
ＨＰＬＣ）などを通して精製し（参照：Ｋｒｏｅｆｆ， Ｅ．Ｐ． ｅｔ ａｌ
．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ４６１， ４５−６１， １９８９）
、最終段階で亜鉛−結晶化法により結晶化される（参照：Ｍｉｒｓｋｙ， ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ４２，
１８６９−１８７２， １９６３； Ｂｒａｄｅｒ Ｍ．Ｌ．，ＴＩＢＳ， １
６， ３４１−３４５， １９９１）。
【０００７】 一方、このような従来技術は溶解とスルホン化の過程と精製、濃縮および脱塩
の過程が複雑であり、再生反応の効率が落ち、産業的な生産においてプロインシ
ュリンの収率の向上が期待されなかった。従って、当業界では、より簡単で効率
的な工程を通して生物学的な活性の優秀な活性形プロインシュリンの改良された
製造方法が切実に要求されてきた。
【０００８】発明の概要 本発明者らは従来のヒトプロインシュリンの製造方法においての問題点を解決
するために鋭意努力した結果、溶解とスルホン化の工程および精製、濃縮、脱塩
の工程を単純化し、再生反応の収率向上および規模の増加の際に再現性を確保し
得るヒトプロインシュリンの製造方法を確立することから本発明を完成するに至
った。
【０００９】 結局、本発明の主な目的は、単純な工程と再生反応の収率を高めることのでき
るヒトプロインシュリンの製造方法を提供することである。
【００１０】 上述した本発明の目的および構成は、以下の添付図面および説明によりさらに
明確になる。
【００１１】発明の詳細な説明 本発明のヒトプロインシュリンの製造方法によると、封入体の形で発現された
ヒトインシュリン前駆体を尿素溶液または塩酸グアニジン溶液で溶解させる過程
中、ソジウムテトラチオネート（Ｎａ2 Ｓ4 Ｏ4 ）とソジウムサルファイト（Ｎ
ａ2 ＳＯ3 ）を同時に処理することにより、封入体を精製する際にプロインシュ
リンのシステイン残基の−ＳＨ基を−ＳＳＯ3 - に置換し、下記化学式（II）の
プロインシュリンＳ−スルホン酸塩を取得した後、これを水溶性媒質内で２−メ
ルカプトエタノールと混合反応させ、前記化学式（Ｉ）のプロインシュリンに転
換させる。
【００１２】
【化４】
【００１３】 式中、ＲおよびＸは上記と同様である。
【００１４】 以下、本発明のヒトプロインシュリンの製造方法を図２および図３を参考にし
、より詳しく説明する。ヒトプロインシュリンの製造において、全ての工程は便
宜上、室温下で行うこともできるが、約４℃の低い温度で行う方が好ましい。
【００１５】第１工程 ：封入体の精製 本発明者らは組換えヒトプロインシュリンを製造するため、大腸菌で発現され
る修飾されたβ−ガラクトシダーゼとプロインシュリンの融合タンパク質を用い
た（参照：大韓民国特許公告第９４−１８５５）。封入体の形で発現されたプロ
インシュリンの融合タンパク質を含む大腸菌を１：５ないし１０（ｗ／ｖ）の比
率で緩衝溶液に溶解させ、約９，０００ｐｓｉの圧力で破砕し、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００と蒸留水で封入体を洗浄し遠心分離することにより、封入体を精製し
た。
【００１６】第２工程 ：溶解およびスルホン化 精製された封入体は１：１０ないし２０（ｗ／ｖ）の比率、より好ましくは１
：５ないし１０（ｗ／ｖ）の比率で６Ｍないし８Ｍの尿素溶液または塩酸グアニ
ジン溶液を含む０．０２Ｍないし０．１Ｍのトリス緩衝溶液（ｐＨ８ないしｐＨ
１０）に溶解させた。この際、０．１Ｍないし０．６Ｍ、より好ましくは０．２
Ｍないし０．５Ｍのソジウムサルファイト（Ｎａ2 ＳＯ3 ）と０．０１Ｍないし
０．１Ｍ、より好ましくは０．０５Ｍないし０．１Ｍのソジウムテトラチオネー
ト（Ｎａ2 Ｓ4 Ｏ4 ）を同時に添加し攪拌することにより、スルホン化反応を誘
導し目的とするプロインシュリンの−ＳＨ基を−ＳＳＯ3 - に置換した。この際
のｐＨは７．０ないし９．５辺りに維持し、反応温度は４℃ないし８℃程度に維
持した。このようにして、プロインシュリン配列内の−ＳＨ基を亜硫酸化（−Ｓ
ＳＯ3 - ）して取得したスルホン化されたプロインシュリンを得た。
【００１７】第３工程 ：シアノゲンブロマイド切断 スルホン化反応の後、反応混合液を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離に
より沈殿物を取り除き、得られた上澄液に５ないし２０：１（ｖ／ｖ）の比率で
冷却水を加えた後、ｐＨを５ないし６程度に調整し沈殿物を取得した。沈澱され
たタンパク質を１０−３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで７０％（ｖ／ｖ）のギ酸
に溶解し、タンパク質の量に対してモル比が１００：１になるようにシアノゲン
ブロマイドを処理し、プロインシュリンＳ−スルホン酸塩を融合タンパク質から
分離した後、減圧乾燥した。
【００１８】第４工程 ：イオン交換クロマトグラフィー プロインシュリンＳ−スルホン酸塩を１ｍＭのＥＤＴＡと７Ｍの尿素を含む２
０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）で３０ｍｇ／ｍｌになるまで溶解した後
、同一の緩衝溶液で平衡化されたＤＥＡＥ−セファセル樹脂に積み込み、０−１
ＭのＮａＣｌの濃度勾配でプロインシュリンＳ−スルホン酸塩を溶出させた結果
、０．３Ｍ−０．５ＭのＮａＣｌの濃度区間で溶出されることを確認した。
【００１９】第５工程 ：再生（プロインシュリンＳ−スルホン酸塩のプロインシュリンへの転
換） 精製されたプロインシュリンＳ−スルホン酸塩は脱塩化の過程または前処理な
しに、溶出液のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌないし１０ｍｇ／ｍｌになるよう
に１Ｍの尿素を含む５０ｍＭのグリシン緩衝溶液（ｐＨ１０．６）で希釈し、さ
らに窒素ガスを注入することにより酸素脱気した後、密封して他の容器に前記と
同様な、１Ｍ尿素を含む５０ｍＭのグリシン緩衝溶液（ｐＨ１０．６）に２−メ
ルカプトエタノールをプロインシュリンＳ−スルホン酸塩の−ＳＳＯ3 - 残基当
たり１ないし３当量比で添加した。その後、タンパク質溶液と２−メルカプトエ
タノールの添加された緩衝溶液をかさが０．１ｍｌないし１０Ｌである混合容器
に二個の容器をつなげ、手早く１：１の比率（ｖ／ｖ）で混合し、再生反応溶液
を貯蔵容器で徐々に攪拌して４℃ないし５℃で１５時間ないし２０時間反応させ
た（参照：図３）。このような再生工程により、プロインシュリンＳ−スルホン
酸塩の８０％まで自然の状態のプロインシュリンに転換することができた。
【００２０】第６工程 ：吸着クロマトグラフィー 再生されたプロインシュリンを精製、濃縮するため、再生反応混合液のｐＨを
約３ないし４に調整し、極性メタクリレート系の樹脂であるＨＰ−２ＭＧに再生
されたプロインシュリンを含む混合タンパク質の量を樹脂１リットル当たり８ｇ
に調節し接触させる。この際、積み込む試料のタンパク質濃度はプロインシュリ
ンの再生反応条件に応じ０．１ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの範囲の内で調節
する。吸着段階が完了したら、酢酸緩衝溶液（ｐＨ３ないしｐＨ４）で洗浄し、
アセトン約１５％ないし５０％（ｖ／ｖ）を含む酢酸緩衝溶液（ｐＨ３ないしｐ
Ｈ４）、好ましくは３０％ないし５０％（ｖ／ｖ）のアセトンを含む酢酸緩衝溶
液（ｐＨ３−ｐＨ４）により溶出させる。次いで、活性分画を減圧乾燥および凍
結乾燥し、再生ヒトプロインシュリンを粉末の形で取得したり、活性分画に溶出
物のｐＨをＮａＯＨで５ないし７、好ましくは５ないし６に調整し、０．００４
％ないし４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００４％ないし０．０４％（ｗ／ｖ）
の濃度で塩化亜鉛を加えることにより、沈澱物の形で取得する。
【００２１】 本発明のヒトプロインシュリンの製造方法は従来の製造方法に比べ、次のよう
な長所を有する：第一、溶解とスルホン化を同時に行うことにより、大量生産の
工程を単純化することができる。第二、高濃度の試料が分子間の重合化（ｐｏｌ
ｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）から生じるゲル化現象のような変性を予防することが
できる。第三、溶解の際、分子間の誤ったジサルファイト結合のため、試料にお
いて溶解度が減少する問題を根本的に解決する。これは時々２−メルカプトエタ
ノールまたはＤＴＴなどの還元剤処理により解決し得るが、サルファイトとテト
ラチオネートによるスルホン化の方がより安定であり、溶解度の面でもより好ま
しい。第四、シアノゲンブロマイド反応の前段階にシステイン基の−ＳＨ基を−
Ｓ−ＳＯ3 - に置換することにより、溶解とその後の工程から発生し得るシステ
イン基の非可逆的変性、例えばシステインがシステイン酸に変性するなどの現象
を防ぐことができる（参照：米国特許第４，４５１，３９６）。第五、シアノゲ
ンブロマイド反応の後、乾燥してから脱塩などの前処理なしにイオン交換クロマ
トグラフィーまたは吸着クロマトグラフィーを行うことにより、工程の連続性を
与えるという長所を有する。
【００２２】 本発明のいま一つの特徴は、インシュリンの産業的生産において重要な段階の
一つである再生反応を効率的に行うことである。とりわけ、混合容器を用い連続
的に反応させることにより、収率の向上および生産規模の増加の際の再現性を確
保した。さらに再生反応の後、工業用吸着樹脂により自然状態のプロインシュリ
ンを反応混合物から精製、濃縮および脱塩を同時に行うことができる。
【００２３】 従来、再生反応を必ず伴うプロインシュリンの製造において、上記化学式（Ｉ
）のポリペプチドはシステイン残基をスルホン化してプロインシュリンＳ−スル
ホン酸塩を形成した後、ｐＨ７ないしｐＨ１１．５の中性またはアルカリ条件下
、各−ＳＳＯ3 - 残基当たり１当量ないし５当量の２−メルカプトエタノールと
反応させる方法を用いた（参照：米国特許第４，４３０，２６６）。前記提示の
回分式の条件下、約６０％の再生収率を見せ、追加的な収率の向上のため、再生
反応の後、ｐＨを４ないし６に調整し直して正しく再生できなかった中間物質を
凝集体の形で取得し、さらにこのものをスルホン化してから再生の再循環系を導
入する工程を行うことにより、約８０％の収率を得た（参照：米国特許第４，８
０１，６８４）。しかしながら、本発明の反応工程はただ一回の再生反応からプ
ロインシュリンＳ−スルホン酸塩の８０％まで自然状態のプロインシュリンに転
換することができ、工程の短縮および収率の向上をともに成し遂げた。
【００２４】 今までの再生反応に対する多くの研究の結果、タンパク質の再生収率を落とす
主な因子は、再生反応の際に中間物質等の間に露出されている疎水性部位等の間
の非共有性結合による凝集体の形成と知られている。なお、このような凝集体の
形成にはタンパク質の濃度、反応のかさ、温度およびｐＨなどの要因が影響を及
ぼすと知られている。その中でも、タンパク質の濃度は収率に大きい影響を及ぼ
すので、収率を考慮し低いタンパク質の濃度で再生反応を行う場合、産業的生産
の経済性を悪化させることから、組換えタンパク質を適切な濃度で再生するため
の効率的な方案等が提示された。例えばアルギニンなどの凝集阻害剤またはポリ
エチレングリコールなどの界面活性剤および変性剤を添加する方法などが提示さ
れた。かつ、反応途中のタンパク質を段階的に高める方法なども提示された。
【００２５】 それにもかかわらず、インシュリンを産業的な規模で生産するためには、再生
反応に一定した規模以上の反応かさを必要とし、この際、プロインシュリンＳ−
スルホン酸塩と２−メルカプトエタノールなどの各反応液内の構成要素等の均一
な混合が迅速に行われにくくなり、凝集現象が加速化され、結局再生の収率が低
くなる。故に、本発明者らはプロインシュリンＳ−スルホン酸塩と２−メルカプ
トエタノールを混合する際、平衡に達するにかかる時間を最小化するため、それ
ぞれを小さい混合容器で連続混合しながら再生反応を誘導した結果、高濃度のプ
ロインシュリンＳ−スルホン酸塩を用いながらも、高収率でプロインシュリンを
製造することができた。
【００２６】 一般に、組換え非活性形プロインシュリンの再生反応の後、再生プロインシュ
リンを精製するため、セファデックスＧ−５０などのゲル濾過クロマトグラフィ
ーとイオン交換クロマトグラフィーなどを行う。このためには、まず反応液の緩
衝液を交換する必要があり、かつ脱塩化過程が伴われた（参照：米国特許第４，
４３０，２６６）。脱塩化に幅広く用いられている通常的な方法には、ゲル濾過
法、透析および限外濾過がある。この中で、ゲル濾過法はセファデックスＧ−２
５などのポリデクストランと呼ばれるゲルを用いたクロマトグラフィー法で、物
質の分子量または構造に応じゲルの一定の穴を通過するにかかる時間の差を利用
する。一方、透析法はゲルの代わりに透析膜を用いる反面、限外濾過法はホロー
ファイバーやカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）などのカートリッジ（ｃａｒｔｒｉ
ｄｇｅ）とディスク膜（ｄｉｓｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いる。
【００２７】 しかしながら、上記方法は次のようないくつかの問題点を有している。例えば
、ゲル濾過法の試料処理の容量は、試料の量または濃度より、カラムに充填され
たゲルのかさに依存するため（処理容量：ゲルのかさの１０％ないし２５％）、
試料の濃度が希釈されるほどカラムのサイズが大きくなる。さらに、溶出された
試料の濃度が希釈されるため、かさが増え後続工程に問題を起こす恐れがある。
透析法は、透析膜での試料の非特異的な結合による試料の損失と処理容量の制限
などが問題になる反面、限外濾過法は大きい処理容量および濃縮の効果を有して
いるが、特別な施設を備えなければならないし、非特異的な結合、ファウリング
（ｆｏｕｌｉｎｇ）およびプラギング（ｐｌｕｇｇｉｎｇ）などから試料の損失
と流速の減少が発生する。
【００２８】 本発明は従来の上記方法の原理とは違って、吸着クロマトグラフィーを利用し
て脱塩化することにより、上記列挙の方法等の問題点、すなわち処理容量の制限
、溶出試料の希釈、非選択的な結合および経済的な負担を解決した。例えば、活
性形プロインシュリンを含む再生反応液を約ｐＨ３ないしｐＨ４に調整し、極性
メタクリルレート系の樹脂に適用し、約１５％ないし５０％（ｖ／ｖ）のアセト
ンを含む緩衝溶液（ｐＨ３ないしｐＨ４）で再生プロインシュリンをほとんど回
収した。この際、用いられる極性メタクリルレート系の樹脂はＨＰ−２ＭＧとい
う商標で三菱化学（株）から市販されており、比較的極性の高い有機物の吸着に
適切である。本発明においては吸着および脱着が脱塩、濃縮および精製の効率の
面で、カラム条件下で工程を行うことがより好ましいが、回分法でも行うことが
できる。本発明のヒトプロインシュリンの製造方法によると、活性形プロインシ
ュリンの回収率が９０％以上であり、吸着段階で積み込む試料の濃度によって数
倍から数十倍の濃縮効果を有する。
【００２９】 すなわち、再生プロインシュリンを経済的に脱塩、濃縮および精製するだけで
なく、溶出液自体を後続工程に直接用いることもできる。
【００３０】 以下、実施例を通して本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、こ
れら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
【００３１】実施例１ ：封入体の精製 封入体の形でプロインシュリンの融合タンパク質を発現する大腸菌（参照：大
韓民国特許公告第９４−１８５５）を１：５ないし１０（ｗ／ｖ）の比率で、５
０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％の蔗糖、０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む０．１Ｍのトリ
ス緩衝溶液（ｐＨ７．９）に溶解させ９，０００ｐｓｉの圧力で細胞を破砕した
。破砕液を５，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し沈澱物を取得した後、
得られた沈殿物の含水重量３００ｇの封入体を１０倍のかさに該当する２％のト
リトンＸ−１００と蒸留水で洗浄し遠心分離することにより、精製された封入体
を得た。
【００３２】実施例２ ：アルカリによる封入体の溶解 実施例１より得られた封入体を２０倍のかさの蒸留水で均一に懸濁し、３時間
攪拌し、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈殿物を取り除いた。上澄
液を１Ｍの塩酸でｐＨ５．５に調整し、５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し
て沈澱物を取り除いた後、沈澱したタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌになるまで７０
％（ｖ／ｖ）のギ酸で溶解し、タンパク質の量に対し１００：１のモル比に該当
するシアノゲンブロマイドを加え、２５℃で１２時間攪拌した。次いで、減圧蒸
留して完全に乾燥し、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５
）で溶解した後、ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネートの最終濃度
が各々０．３Ｍと０．１Ｍになるまで添加し、６時間攪拌した。その後、ＨＰＬ
Ｃで分析し、スルホン化プロインシュリンの濃度を計った（参照：表１）。
【００３３】実施例３ ：塩酸グアニジンおよび還元剤による封入体の溶解 実施例１より得られた封入体を１０倍のかさの下記各変性剤を含む緩衝溶液に
懸濁した：第一、６Ｍ−７Ｍの塩酸グアニジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解した；第二、６Ｍ−７Ｍの塩酸グアニ
ジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解
し、１ｍＭの２−メルカプトエタノールを加えた；第三、６Ｍ−７Ｍの塩酸グア
ニジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶
解し、ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネートの最終濃度が各々０．
３Ｍと０．１Ｍになるまで添加した。その後、前記３種類の溶液を各々４℃で１
２時間攪拌し、反応液を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈殿物を取
り除いた。次いで、上澄液に約１０倍のかさの冷却水を添加し、５，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離して沈澱物を取り除いた。該沈澱したタンパク質を１０ｍ
ｇ／ｍｌになるまで７０％（ｖ／ｖ）のギ酸で溶解し、タンパク質の量に対し１
００：１のモル比に該当するシアノゲンブロマイドを加え、２５℃で１２時間攪
拌した。次いで、減圧蒸留して完全に乾燥し、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭのトリ
ス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解した後、ソジウムサルファイトとソジウムテト
ラチオネートの最終濃度が各々０．３Ｍと０．１Ｍになるまで添加し、２５℃で
６時間攪拌した。その後、ＨＰＬＣで分析し、スルホン化プロインシュリンの濃
度を計った（参照：表１）。
【００３４】実施例４ ：尿素および還元剤による封入体の溶解 実施例１より得られた封入体を１０倍のかさの下記各変性剤を含む緩衝溶液に
懸濁した：第一、７Ｍ−８Ｍの尿素と１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのトリス
緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解した；第二、７Ｍ−８Ｍの尿素と１ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解し、１ｍＭの２−メル
カプトエタノールを加えた；第三、７Ｍ−８Ｍの尿素と１ｍＭのＥＤＴＡを含む
２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解し、ソジウムサルファイトとソ
ジウムテトラチオネートの最終濃度が各々０．３Ｍと０．１Ｍになるまで添加し
た。その後、前記３種類の溶液を各々４℃で１２時間攪拌し、反応液を１２，０
００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈殿物を取り除いた。次いで、上澄液に約１
０倍のかさの冷却水を添加し、５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈澱物
を取り除いた。該沈澱したタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌになるまで７０％（ｖ／
ｖ）のギ酸で溶解し、タンパク質の量に対し１００：１のモル比に該当するシア
ノゲンブロマイドを加え、２５℃で１２時間攪拌した。次いで、減圧蒸留して完
全に乾燥し、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ９．５）で溶解
した後、ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネートの最終濃度が各々０
．３Ｍと０．１Ｍになるまで添加し、２５℃で６時間攪拌した。その後、ＨＰＬ
Ｃで分析し、スルホン化プロインシュリンの濃度を計った（参照：表１）。 表１：実施例２ないし実施例４において、各溶解方法がスルホン化に及ぼす影
響
【００３５】
【表１】
【００３６】 ＊各群の試料はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と冷却蒸留水で洗浄した封入体３０
ｇ（含水重量）を用い、コントロールは溶解工程を経ていない非処理群であって
、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と蒸留水で洗浄した封入体をシアノゲンブロマイド
処理した。
【００３７】 表１から分かるように、尿素または塩酸グアニジンにソジウムサルファイトと
ソジウムテトラチオネート処理したら、非処理群より１．５倍ないし２倍程度の
精製収率が増加される効果を見せた。一方、還元剤を添加していない塩酸グアニ
ジンのみで溶解した場合には、７０％（ｖ／ｖ）のギ酸を加えたらゲル化現象が
現れたため、溶解後のタンパク質の量やスルホン化の収率を測定することができ
なかった。これは分子間の疎水性作用またはジサルファイド結合形成による重合
現象と推定された。なお、２−メルカプトエタノールの添加は収率に相当の損失
をもたらし、これも同様の原因と推定された。
【００３８】 スルホン化プロインシュリンの融合タンパク質の場合、−ＳＳＯ3 - の置換に
より全体的な分子がマイナス電荷を含むため、分子間の相互作用を防ぎ、アルカ
リ溶解の場合はタンパク質の安全性に影響を及ぼすため、タンパク質を変性させ
ることが立証された。かつ、産業的な利用の面では、サルファイトとテトラチオ
ネートを添加した尿素と塩酸グアニジンとの結果があまり相違しないことから、
尿素の溶解は相当の費用節減の効果を有することが分かった。
【００３９】 なお、スルホン化反応を含む溶解過程を経てシアノゲンブロマイド処理した後
、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液で溶解した試料をＨＰＬＣにより
分析した結果、サルファイトとテトラチオネートを添加してもスルホン化の収率
は増加しなかった。
【００４０】実施例５ ：尿素の溶解およびスルホン化 実施例２ないし４の結果に基づき、封入体を尿素溶液に溶解し、スルホン化の
工程を行った。すなわち、含水重量１１０ｇの精製された封入体を含水重量の１
０倍のかさの８Ｍの尿素と１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（
ｐＨ８．５）で溶解した後、ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネート
を各々最終濃度が０．３Ｍと０．１Ｍになるまで添加し、４℃で１２時間攪拌し
た。その後、反応液を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈澱物を取り
除き、上澄液に約１０倍のかさの冷却水を加えた。次いで、２Ｎの塩酸溶液によ
りｐＨを５．５辺りに調整した後、５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈
澱物を取り除いた。この際、含水重量は２５０ｇ、タンパク質は約４０ｇと定量
された。
【００４１】実施例６ ：シアノゲンブロマイド処理 沈澱したタンパク質を７０％（ｖ／ｖ）ギ酸２Ｌで溶解し、タンパク質の量に
対し１００：１のモル比に該当するシアノゲンブロマイドを加え、２５℃で１２
時間攪拌した。次いで、減圧蒸留して完全に乾燥し、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭ
のトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）で溶解しＨＰＬＣで分析した。
【００４２】実施例７ ：陰イオン交換クロマトグラフィー ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを時間当たり１．５カラムのかさの流速で２．５
×３０ｃｍのカラムに充填し、７Ｍの尿素を含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡させた。平衡が完了した後、実施例６の試料を樹脂１ｍｌ当た
り２０ｍｇずつ積み込み、１カラムのかさの平衡緩衝溶液で洗浄した。０Ｍ−１
ＭのＮａＣｌを含む平衡緩衝溶液を用い、濃度勾配により溶出した。次いで、０
．３５Ｍ−０．４５ＭのＮａＣｌの濃度区間の溶出液を集めてＨＰＬＣで分析し
た結果、純度は８０％以上で、回収率は９１％であった。
【００４３】実施例８ ：プロインシュリンＳ−スルホン酸塩の再生 逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製された活性形組換えプ
ロインシュリンを逆にスルホン化して取得したプロインシュリンＳ−スルホン酸
塩１ｇを５０ｍＭのグリシン緩衝溶液５００ｍｌ（ｐＨ１０．６）で溶解し、さ
らに窒素ガスを注入することにより酸素脱気した後、密封した溶液と、他の容器
にある５０ｍＭのグリシン緩衝溶液（ｐＨ１０．６）５００ｍｌに１０４μｌの
２−メルカプトエタノールを添加し、さらに窒素ガスを注入することにより酸素
脱気した後、密封した２種類の溶液を同じ５０ｍｌ／ｈｒの流速でかさが１ｍｌ
である混合容器内に流入させ攪拌しながら、手早く注入した。混合された再生反
応溶液を時間当たり１００ｍｌの流速で窒素ガスにより脱気された反応容器（ｒ
ｅｓｅｒｖｏｉｒ）に移し、徐々に攪拌しながら４℃で１８時間反応させた。反
応の終了した後、２Ｍの塩酸でｐＨ２．９±０．１に酸性化し、ＨＰＬＣで分析
した結果、再生の収率は５５％であった。
【００４４】実施例９ ：再生に対するタンパク質濃度の影響 タンパク質濃度以外は、実施例８と同様の反応条件下で同時に行われる一連の
反応において、プロインシュリンＳ−スルホン酸塩からプロインシュリンへの転
換収率にタンパク質濃度が与える影響を調べた（参照：表２）。 表２：再生に対するタンパク質濃度の影響
【００４５】
【表２】
【００４６】実施例１０ ：再生に対する−ＳＨ：−ＳＳＯ3 - の比率の影響 −ＳＨ：−ＳＳＯ3 - の比率以外は、実施例８と同様の反応条件下で同時に行
われる一連の反応において、プロインシュリンＳ−スルホン酸塩からプロインシ
ュリンへの転換収率に与える−ＳＨ：−ＳＳＯ3 - の比率の影響を調べた（参照
：表３）。 表３：再生に対する−ＳＨ：−ＳＳＯ3 - の比率の影響
【００４７】
【表３】
【００４８】実施例１１ ：再生に対する尿素濃度の影響 尿素濃度以外は、実施例８と同様の反応条件下で同時に行われる一連の反応に
おいて、プロインシュリンＳ−スルホン酸塩からプロインシュリンへの転換収率
に与える尿素濃度の影響を調べた（参照：表４）。 表４：再生に対する尿素濃度の影響
【００４９】
【表４】
【００５０】実施例１２ ：陰イオン交換クロマトグラフィーより精製されたプロインシュリン
Ｓ−スルホン酸塩の再生 実施例７より得られた１０ｇのプロインシュリンＳ−スルホン酸塩を含む溶出
液を最終かさが５Ｌになるように１Ｍの尿素を含む５０ｍＭのグリシン緩衝溶液
（ｐＨ１０．６）で希釈した。さらに窒素ガスを注入することにより脱気した後
、密封した。他の容器にある１Ｍの尿素を含む５０ｍＭのグリシン緩衝溶液５Ｌ
に７８１μｌの２−メルカプトエタノールを添加し、さらに窒素ガスを注入する
ことにより脱気した後、密封して２種類の溶液を同じ５００ｍｌ／ｈｒの流速で
かさが１ｍｌである混合容器内に流入させ攪拌しながら、手早く混合した。混合
された再生溶液を時間当たり１Ｌ／ｈｒの流速で窒素ガスにより脱気された反応
容器に移し、徐々に攪拌しながら４℃で１８時間反応させた。反応の終了した後
、２Ｍの塩酸でｐＨ２．９±０．１に酸性化し、ＨＰＬＣで分析した結果、再生
の収率は８１％であった。
【００５１】実施例１３ ：組換えヒトプロインシュリンの吸着クロマトグラフィーによる精製 極性メタクリレート系の樹脂であるＨＰ−２ＭＧ樹脂（三菱化学（株）、日本
国）を常温で６時間、樹脂１ｇ当たり５ｍｌのアセトンで湿潤化し、樹脂を順番
に０．１ＮのＮａＯＨ、蒸留水、０．１ＮのＨＣｌ、蒸留水および２０ｍＭの酢
酸（ｐＨ３．２±０．２）で充分洗浄してカラムに充填した。その後、カラムの
かさの３倍の平衡緩衝溶液（２０ｍＭの酢酸、ｐＨ３．２±０．２）を時間当た
りカラムのかさの１倍の流速で通過させ平衡させた。次いで、実施例１２より得
られた再生プロインシュリンを含む反応液を樹脂１Ｌ当たりタンパク質が８ｇに
なるまで積み込んだ。その後、カラムを２０ｍＭの酢酸緩衝溶液（ｐＨ３．２±
０．２）１カラムのかさで洗浄し、再生プロインシュリンを３０％のアセトンを
含む同一の緩衝溶液で溶出した。その結果、再生プロインシュリンの９２％以上
が回収され、グリシン、尿素などの夾雑物が取り除かれた。また、約１０倍の濃
縮効果と約１．３倍以上のタンパク質純度の増加をＨＰＬＣおよび定量のタンパ
ク質分析により確認した。一方、上記活性形プロインシュリンを含む溶出液を減
圧によりアセトンを取り除いて凍結乾燥するか、または溶出液のｐＨを１ＮのＮ
ａＯＨでｐＨ５．４に調整し、塩化亜鉛を最終濃度が０．０４％になるまで加え
て再生プロインシュリンを回収した。
【００５２】 以上詳細に説明し、立証した通り、本発明はヒトプロインシュリンの製造方法
において、溶解とスルホン化、濃縮、脱塩および精製の工程を単純化し、再生反
応の収率を向上させることから、再現性を確保しながらヒトプロインシュリンを
生産することができる効率的なプロインシュリンの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、従来の組換え大腸菌で発現されたプロインシュリンの融
合タンパク質からヒトプロインシュリンを製造する方法を示す工程図である。
【図２】 図２は、本発明の組換え大腸菌で発現されたプロインシュリンの
融合タンパク質からヒトプロインシュリンを製造する方法を示す工程図である。
【図３】 図３は、本発明のヒトプロインシュリンの製造方法において、再
生システムを示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リー， ワング−シク 大韓民国、ソウル 135−10、カングナム −グ、アプグジェオング−ドング、ミソン グ アパートメント ３−806 (72)発明者 キム， チャング−キュウ 大韓民国、ソウル 153−030、クムチュン −グ、シフング−ドング、ラッキー アパ ートメント ９−301 (72)発明者 キム， ヨング−イン 大韓民国、キュンギ−ド 423−010、クァ ングミュング、クァングミュング−ドン グ、ハンジン アパートメント 107−510 (72)発明者 フュー， ジェ−ニイ 大韓民国、キュンギ−ド 423−064、クァ ングミュング、ハアン４−ドング、ジュウ コング アパートメント 1008−602 (72)発明者 シン， ジェオング−ウー 大韓民国、キュンギ−ド 425−140、アン サン、シュンブ−ドング、ジュウコング アパートメント 1513−202 (72)発明者 オー， スング−ジン 大韓民国、キュンギ−ド 427−030、クァ チョン、ウォンムン−ドング、ジュウコン グ アパートメント 279−408 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 DA06 GA19 HA01 4B064 AG16 CA02 CA19 CC24 CD01 CD11 CD16 CE09 CE11 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BD01 BD15 BD22 BD25 BD35 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA41 BA50 CA40 DA37 EA27 FA50 FA58 FA74 GA23

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）封入体の形でプロインシュリンの融合タンパク質を発
    現する大腸菌細胞を緩衝溶液に懸濁させ、そして該細胞を溶解することにより、
    封入体を取得する工程； （ii）工程（ｉ）で得られた該封入体を変性剤を含む緩衝溶液中に懸濁させる
    と同時に、ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネートでスルホン化し、
    下記化学式（II）のプロインシュリンＳ−スルホン酸塩の融合タンパク質を取得
    する工程； （iii ）工程（ii）で得られたプロインシュリンＳ−スルホン酸塩の融合タン
    パク質を遠心分離して取得した沈澱物をギ酸に溶解し、さらにシアノゲンブロマ
    イドで処理して該融合タンパク質からプロインシュリンＳ−スルホン酸塩を分離
    して減圧乾燥する工程； （iv）工程（iii ）で得られた乾燥したプロインシュリンＳ−スルホン酸塩を
    緩衝溶液に溶解し、該プロインシュリンを陰イオン交換クロマトグラフィーで精
    製する工程； （ｖ）工程（iv）で得られた該精製プロインシュリンＳ−スルホン酸塩を第一
    緩衝溶液に希釈し、さらに窒素ガスを注入することにより酸素を除いて第一混合
    物を取得し、第一混合物と、２−メルカプトエタノールの添加された第二緩衝溶
    液とを混合セル中で混合し、貯蔵容器で攪拌することにより、次の化学式（Ｉ）
    のプロインシュリンを含む再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）反応の混合物を取得する
    工程；および、 （vi）工程（ｖ）で得られた再生反応の混合物を吸着クロマトグラフィー樹脂
    に添加し、水性溶出剤で溶出させることにより、再生されたプロインシュリンを
    取得する工程、 を含むヒトプロインシュリンの製造方法であって、 【化１】 【化２】 Ｒが酵素的または化学的に分解できるアミノ酸残基またはペプチドであり、そし
    て、 Ｘが、Ａ−１ないしＡ−２１の領域がインシュリンＡ鎖で、Ｂ−１ないしＢ−３
    ０の領域がインシュリンＢ鎖である場合、インシュリンＡ鎖中のＡ−１のアミノ
    基とインシュリンＢ鎖中のＢ−３０のカルボキシル基との結合であって、酵素的
    または化学的にＡ鎖またはＢ鎖から分離することができる結合である方法。
  2. 【請求項２】 変性剤が尿素または塩酸グアニジンである請求項１記載のヒ
    トプロインシュリンの製造方法。
  3. 【請求項３】 変性剤の濃度が６Ｍないし８Ｍである請求項１記載のヒトプ
    ロインシュリンの製造方法。
  4. 【請求項４】 封入体が、変性剤を含む０．０２Ｍないし０．１Ｍのトリス
    緩衝溶液（ｐＨ８ないしｐＨ１０）に懸濁されるものである請求項１記載のヒト
    プロインシュリンの製造方法。
  5. 【請求項５】 ソジウムサルファイトとソジウムテトラチオネートの濃度が
    それぞれ０．１Ｍないし０．６Ｍと０．０１Ｍないし０．１Ｍである請求項１記
    載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  6. 【請求項６】 封入体が、変性剤を含む緩衝溶液に１０ないし２０（ｗ／ｖ
    ）の比率で懸濁されるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方
    法。
  7. 【請求項７】 封入体が、変性剤を含む緩衝溶液に４℃ないし８℃の反応温
    度で懸濁されるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  8. 【請求項８】 乾燥したプロインシュリンＳ−スルホン酸塩が１ｍＭのＥＤ
    ＴＡおよび７Ｍの尿素を含むトリス緩衝溶液（ｐＨ７ないしｐＨ９）に溶解され
    、かつ、同じ緩衝溶液で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて
    精製されるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  9. 【請求項９】 精製プロインシュリンＳ−スルホン酸塩が、１Ｍの尿素を含
    むグリシン緩衝溶液（ｐＨ９ないしｐＨ１１）によって０．１ｍｇ／ｍｌないし
    １０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈されるものである請求項１記載のヒトプロインシュ
    リンの製造方法。
  10. 【請求項１０】 プロインシュリンＳ−スルホン酸塩の−ＳＳＯ3 - 基当た
    り１ないし３当量比の２−メルカプトエタノールが１Ｍの尿素を含む緩衝溶液に
    添加されるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  11. 【請求項１１】 希釈されたプロインシュリンＳ−スルホン酸塩を含む緩衝
    溶液と２−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液とが１：１の比率（ｖ／ｖ）で
    混合されるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  12. 【請求項１２】 用いた緩衝溶液が５０ｍＭのグリシン緩衝溶液（ｐＨ１０
    ．６）である請求項１０または１１いずれかに記載のヒトプロインシュリンの製
    造方法。
  13. 【請求項１３】 容積が０．１ｍｌないし１０Ｌの混合セルで混合するもの
    である請求項１１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  14. 【請求項１４】 吸着クロマトグラフィーに極性メタクリレート系の樹脂を
    用いるものである請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  15. 【請求項１５】 再生反応の混合物が、極性メタクリレート系の樹脂にｐＨ
    ３ないしｐＨ４で吸着されるものである請求項１４記載のヒトプロインシュリン
    の製造方法。
  16. 【請求項１６】 再生されたプロインシュリンを溶出させる前に、極性メタ
    クリレート系の樹脂が酢酸緩衝溶液（ｐＨ３ないしｐＨ４）で洗浄されるもので
    ある請求項１４記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  17. 【請求項１７】 水性溶出液がアセトンを１５％ないし５０％（ｖ／ｖ）含
    む酢酸緩衝溶液（ｐＨ３ないしｐＨ４）である請求項１記載のヒトプロインシュ
    リンの製造方法。
  18. 【請求項１８】 水性溶出液で溶出された再生ヒトプロインシュリンが再生
    プロインシュリンを含む溶出液から塩化亜鉛の添加により回収されるものである
    請求項１記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
  19. 【請求項１９】 再生プロインシュリンを含む溶出液に、ｐＨ５ないしｐＨ
    ７の範囲で、０．００４％ないし４％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるまで塩化亜鉛
    が添加されるものである請求項１８記載のヒトプロインシュリンの製造方法。
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