KR20020016950A - 인간 융모막 성선자극 호르몬의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 임신부 뇨로부터 HCG 침전물을 회수하는 공정; 회수한 HCG 침전물을 물에 용해시켜, DEAE-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, pH 4.0∼6.0의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 50∼100mM 함유된 pH 5.5∼6.5의 완충용액으로 용출시켜 HCG 용출액을 회수하는 공정; 및 회수한 HCG 용출액을 블루-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, 염화나트륨이 75∼120mM 함유된 pH 8.0∼9.0 의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 1.0∼2.0M 함유된 pH 8.0∼9.0의 완충용액으로 용출시키는 공정을 포함하는 HCG 정제방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 융모막 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotrophin, 이하 "HCG"라 한다)를 고순도 및 고수율로 정제하는 방법에 관한 것이다.
HCG는 여성의 난포 성숙과 난모세포의 형성을 유발하며, 남성에는 정자의 형성에 필수적인 테스토스테론 호른몬 생성을 촉진함시킴으로써 불임증 치료제로 이용되고 있다. 또한 임신여부를 확인시켜주는 표지물질로도 이용되고 있다.
HCG는 임신중의 태반에서 생성되며, α-단위체와 β-단위체가 비공유결합에 의해 연결된 당단백질 호르몬이다. 92개의 아미노산으로 구성된 α-단위체는 HCG와 기능이 유사한 LH, hFSH, hTSH와 유사성(homology)이 있다. 이에 비해 β-단위체는 145개의 아미노산으로 구성되며 HCG 고유의 활성을 부여한다.
임신부 뇨 및 혈액에는 HCG 이외에도 유리형의 α-단위체 및 β-단위체 그리고 HCG의 분해산물로서 β-단위체의 (6-40) 잔기와 (55-92) 잔기가 이황화결합에 의해 연결된 β-코어 분획(β-core fragment, βCF), β-단위체의 카르복시말단 펩티드(βCTP) 그리고 β-단위체의 44번과 45번 잔기사이 또는 47번과 48번 잔기 사이의 펩티드결합이 끊어진 β-니키드 서브유니트(β-nicked subunit)등이 존재한다고 보고된 바 있다(Endocrinology, 1990, Vol. 126, p687; Endocrinology, 1991. Vol. 129, p1541).
HCG 정제를 위한 종래의 정제방법은 벤조산, 카올린 및 셀라이트등에 임신부 뇨를 흡착 및 탈착시킨후 아세톤이나 알콜등을 이용하여 HCG를 침전시키는 방법이 주로 사용되었다. 그러나 흡착 및 유기용매 침전에 따른 정제방법은 특이성이 낮아 HCG외에도 HCG 관련단백질 및 분순물이 혼입될수 있으며, 이러한 정제방법으로 제조된 상업용 제품들조차 HCG 관련 단백질이 이들로부터 정제되어 그 특성이 규명되기도 한 바 있다.
한편, 미국특허 제4,665,161호 및 유럽특허공개 제89,218호에서는 흡착 및 침전법 이외에 컬럼 크로마토그래피 과정를 추가하여 보다 고순도로 HCG를 정제하는 방법을 개시한 바 있다. 임신부 뇨를 흡착제인 알루미노 실리케이트에 통과시켜 농축한 후, 에탄올이나 메탄올 등의 유기용매를 첨가하여 HCG를 선별적으로 침전시켰다. 이렇게 얻어진 단위역가 6,000-7,000IU/mg의 HCG는 재차 낮은 염농도의 중성조건에서 음이온교환체인 DEAE-셀룰로오즈 (DEAE-cellulose) 또는 DEAE-세파덱스 (DEAE-sephadex) 컬럼에 전개되었으며, 100mM NaCl로 용출되었다. 용출액의 HCG 단위활성은 14,000-16,000 IU/mg 으로 종래의 정제방법에 비해 상대적으로 고역가로 HCG를 정제하고 있다.
그러나, 상기 미국특허 제4,665,161호 및 유럽특허공개 제89,218호에서 개시한 정제방법은 에탄올이나 메탄올 등의 유기용매 사용이 불가피하기 때문에, 유기용매 사용으로 인한 HCG 원료자체 및 이로부터 제조한 제제에 유기용매가 잔류할 수 있으므로 안전성 문제가 야기될 수 있고, 또한 유기용매 사용으로 인한 환경문제를 야기할 수 있다.
이에 본 발명자들은 유기용매를 사용하지 않고, HCG를 고수율 및 고순도로 정제하는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 HCG를 고수율 및 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도1은 각 단계별 HCG의 전기영동 결과이다.
1. 분자량 표준단백질
2. 황산 암모늄 침전후의 HCG
3. DEAE-세파로즈 컬럼 용출액의 HCG
4. 블루-세파로즈 컬럼 용출액의 HCG
도 2은 각 단계별 HCG의 웨스턴 분석결과를 나타낸 것이다.
1. 분자량 표준단백질
2. 황산 암모늄 침전후의 HCG
3. DEAE-세파로즈 컬럼 용출액의 HCG
4. 블루-세파로즈 컬럼 용출액의 HCG
본 발명은 임신부 뇨로부터 HCG 침전물을 회수하는 공정; 회수한 HCG 침전물을 물에 용해시켜, DEAE-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, pH 4.0∼6.0의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 50∼100mM 함유된 pH 5.5∼6.5의 완충용액으로 용출시켜 HCG 용출액을 회수하는 공정; 및 회수한 HCG 용출액을 블루-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, 염화나트륨이 75∼120mM 함유된 pH 8.0∼9.0 의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 1.0∼2.0M 함유된 pH 8.0∼9.0의 완충용액으로 용출시키는 공정을 포함하는 HCG 정제방법에 관한 것이다.
임신부 뇨로부터 HCG 침전물 회수하는 방법은 에탄올, 아세톤 같은 유기용매를 첨가하거나 또는 벤조산, 카올린 및 셀라이트 등의 흡착 젤이나 각종 이온교환 젤을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 그러나, 유기용매 침전법은 유기용매가 시료부피의 3-10배로 첨가되어 시료의 부피를 더욱 증가시키며 유기용매의 잔류문제를 유발할 수 있는 단점이 있고, 컬럼 크로마토그래피의 경우는 농축 및 부분정제가 동시에 가능하나 반응조건이 까다로우며 시료 중에 포함된 색소 및 불순물로 인하여 젤의 반복사용이 어려운 단점이 있다.
따라서, HCG의 회수는 염석법 즉, 인산칼륨이나 황산암모늄과 같은 무기염을 첨가함으로써 단백질에 결합된 물 분자를 탈수시키고 단백질의 응집을 유도하여 침전을 형성시키는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 예를들어, 황산암모늄을 pH 7로 조절된 임신부 뇨에 첨가하고 교반하여 HCG 침전을 형성시킨 후, 얻어진 침전물을 원심분리 하거나 또는 여과하여 회수할 수 있다. 첨가되는 황산암모늄은 60~75%의 농도가 바람직하며, 이 공정은 냉장상태에서 수행하는 것이 바람직하다.
회수된 HCG 침전물은 물에 용해시켜 DEAE-세파로즈 컬럼과 블루-세파로즈 컬럼 공정을 수행하게 된다. 여기서 물을 다량으로 사용할 경우 상기 HCG 침전물내에 황산암모늄염이 잔류할 수 있는 문제점을 해결할 수 있으나, 바람직하게는 HCG 침전물을 물에 용해시킨 다음, 한외여과 또는 투석에 의해 침전물에 포함된 염을 제거한 후 DEAE-세파로즈 컬럼 및 블루-세파로즈 컬럼을 수행하는 것이 바람직하다.
DEAE-세파로즈 컬럼이란 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl) 기가 세파로즈 수지에 결합시켜 형성된 음이온 교환체를 충진한 컬럼을 말하며, 상업적으로 시판되는 DEAE-sepharose fast flow (Amersham Pharmacia Biotech Inc., 스웨덴)를 사용할 수도 있다. 또한, 블루-세파로즈 컬럼이란 시바크론 블루 3GA(Cibacron Blue 3GA) 색소를 세파로즈 수지에 공유결합시켜 충진한 컬럼을 말하며, 상업적으로 시판되는 Blue sepharose 6 fast flow (Amersham Pharmacia Biotech Inc., 스웨덴)를 사용할 수도 있다.
DEAE-세파로즈 컬럼은 pH 8.0~9.0에서 아세트산 암모늄 완충용액, 아세트산 나트륨 완충용액, 트리스 완충용액, 또는 인산나트륨 완충용액으로 평형시켜 사용하는 것이 바람직하며, pH 8.6의 10~50mM 트리스 완충용액으로 평형시켜 사용하는 것이 더욱 바람직하다. DEAE-세파로즈 컬럼 공정은 HCG 침전물 함유 수용액을 상기와 같이 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, pH 4.0∼6.0의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 50∼100mM 함유된 pH 5.5∼6.5의 완충용액으로 용출시켜 HCG 용출액을 회수함으로써 수행할 수 있다. 세척용 완충용액의 사용량은 컬럼의 약 10배 이상의 부피로 사용하는 것이 바람직하고, 세척용 완충용액으로는 pH5.0의 15mM 아세트산 나트륨 완충용액이 더욱 바람직하며, 용출매로 사용하는 완충용액으로는 75mM 염화나트륨이 함유된 pH 6.0의 20mM 아세트산 나트륨 완충용액이 더욱 바람직하다.
상기와 같이 회수한 HCG 용출액은 블루-세파로즈 컬럼 공정을 수행함으로써 더욱 고순도로 정제된다. 블루-세파로즈 컬럼 공정은 HCG 용출액을 블루-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, 염화나트륨이 75∼120 mM 함유된 pH 8.5∼9.5의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 1.0∼2.0M 함유된 pH 8.0∼9.0의 완충용액으로 용출시킴으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 정제방법에 사용되는 블루-세파로즈 컬럼은 pH 6.5~7.0의 75mM~100M 인산 나트륨 완충용액으로 평형시켜 사용하는 것이 바람직하며, pH 6.7의 100mM 인산나트륨 용액으로 평형시켜 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
세척용 완충용액으로는 0.1M 염화나트륨이 함유된 pH 9.0의 20mM 트리스 완충용액이 더욱 바람직하며, 용출매로 사용하는 완충용액으로는 염화나트륨이 1.5M 함유된 pH 8.5의 20mM 트리스 완충용액이 더욱 바람직하다.
상기와 같이 얻어진 용출액은 동결건조시킴으로써 고체 형태의 HCG를 제조할 수도 있다.
상기와 같은 본 발명의 HCG 정제방법은 유기용매를 전혀 사용하지 않고 HCG만을 특이적으로 회수할 수 있으며, 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이 전체 회수율이 82% 이상, 단위역가 15,000 IU/mg 이상의 고수율 및 고순도의 정제방법이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시 예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 HCG의 역가 측정은 미국약전의 융모막 성선자극 호르몬의 역가시험법에 의해 측정하였으며, 단백질 정량은 Lowry-Folin의 방법으로 측정하였다.
실시예 1
임신 10-14주의 임신부 뇨 1,000 L에 수산화나트륨 용액을 가하여 pH 7 로 조절한 후, 황산암모늄 472 Kg을 가하고 서서히 교반하여 침전을 유발하였다. 냉장상태에서 16시간 보관한 후, 응집되어 형성된 침전물을 원심분리하여 회수하고, 다시 증류수 10 L을 가하여 녹인 후 한외여과 장치를 이용하여 20mM 트리스 완충용액(pH8.6)으로 치환하여 5L의 용액을 얻었다. 회수된 용액중 HCG 총역가는 24,000,000 IU로서, 단백질 mg당 역가 440-500 IU로서 회수율은 96% 이상이었다.
실시예 2
20 mM 트리스 완충용액(pH8.6)으로 평형시킨 10X15 Cm의 DEAE-세파로즈 컬럼(DEAE-sepharose fast flow, Amersham Pharmacia Biotech Inc., 스웨덴)에 실시예 1에서 얻은 시료를 시간당 1.5 L 로 전개한 후, 15 mM 아세트산 나트륨 용액(pH5.0)으로 컬럼부피의 10 L 이상 세척하였다. 세척 후의 활성형 HCG 분획은 75mM 염화나트륨이 함유된 20mM 아세트산 나트륨 용액 (pH6.0)으로 용출시켰다. 용출액의 단위역가는 2,600∼3,100 IU/mg이었으며 회수율은 92∼96 %이었다.
실시예 3
실시예 2에서 얻은 DEAE-세파로즈 용출액 5 L에 최종 15 mM의 인산나트륨을 첨가하여 pH을 6.7로 조절한 후, 0.1M 인산나트륨(pH6.7)으로 평형시킨 5X20 Cm의 블루-세파로즈 컬럼(Blue sepharose 6 fast flow, Amersham Pharmacia Biotech Inc., 스웨덴)에 시간당 2.5 L로 전개하였다. 0.1M 염화나트륨이 함유된 20 mM 트리스 완충용액(pH9.0)으로 컬럼부피의 1.5 L 이상 세척 후, 1.5M 염화나트륨이 함유된 20mM 트리스 완충용액(pH8.5)으로 용출시켰다. 용출액의 단위역가는 15,000∼16,500 IU/mg으로 DEAE-세파로즈 용출액에 비하여 5배 이상 역가가 증가하였으며, 블루-세파로즈에 HCG가 특이적으로 결합하여 고순도로 용출되었음을 확인할 수 있다. 한편 블루-세파로즈 컬럼 크로마토그래피의 회수율은 90∼95%이었으며, 전체 회수율은 82%를 나타내었다.
실시예 4
상기 실시예의 각 정제단계별 HCG 에 대한 전기영동 및 웨스턴 분석을 수행한 결과는 도1 및 도2와 같다.
Claims (8)
- 임신부 뇨로부터 인간 융모막 성선자극 호르몬((human chorionic gonadotrophin, HCG) 침전물을 회수하는 공정;회수한 HCG 침전물을 물에 용해시켜, DEAE-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, pH 4.0∼6.0의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 50∼100mM 함유된 pH 5.5∼6.5의 완충용액으로 용출시켜 HCG 용출액을 회수하는 공정; 및회수한 HCG 용출액을 블루-세파로즈 컬럼에 전개시킨 다음, 염화나트륨이 75∼120mM 함유된 pH 8.0∼9.0 의 완충용액으로 세척한 후, 염화나트륨이 1.0∼2.0M 함유된 pH 8.0∼9.0의 완충용액으로 용출시키는 공정을 포함하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, HCG 침전물 회수공정이 임신부 뇨를 pH 7로 조절한 후, 황산암모늄을 60∼75%의 농도가 되도록 첨가하여 HCG를 침전시키는 공정을 포함함을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, 회수한 HCG 침전물 수용액을 DEAE-세파로즈 컬럼에 전개시키기 전에, 회수한 HCG 침전물 수용액을 한외여과 또는 투석하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, DEAE-세파로즈 컬럼을 pH 8.0∼9.0의 아세트산 암모늄 완충용액, 아세트산 나트륨 완충용액, 트리스 완충용액, 또는 인산 나트륨 완충용액으로 평형시켜 사용함을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제4항에 있어서, DEAE-세파로즈 컬럼을 pH 8.6의 10∼50mM 트리스 완충용액으로 평형시켜 사용함을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, DEAE-세파로즈 컬럼의 세척용 완충용액이 pH 5.0의 15mM 아세트산 나트륨 완충용액이고, 용출매가 75mM 염화나트륨이 함유된 pH 6.0의 20mM 아세트산 나트륨 완충용액임을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, 블루-세파로즈 컬럼을 pH 6.5~7.0의 75mM~100M 인산 나트륨 완충용액으로 평형시켜 사용함을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
- 제1항에 있어서, 블루-세파로즈 컬럼의 세척용 완충용액이 0.1M 염화나트륨이 함유된 pH 9.0의 20mM 트리스 완충용액이고, 용출매가 염화나트륨이 1.5M 함유된 pH 8.5의 20mM 트리스 완충용액임을 특징으로 하는 HCG 정제방법.
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