JP2001323000A - Ｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）とｌｈ（黄体化ホルモン）の分離と精製工程 - Google Patents
Ｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）とｌｈ（黄体化ホルモン）の分離と精製工程Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は粗製ＨＭＧから、特に閉経期又は閉
経期後の女性の尿抽出物から出発してＦＳＨ及びＬＨの
分離と精製のための、特に簡単で経済的な新工程を提供
する。 【解決手段】 なるべくなら尿の粗製ＨＭＧから出発し
てＦＳＨとＬＨの分離と精製のための、特に簡単且つ経
済的な新しい工程で、以下の諸段階より成っている：エ
タノール水溶液中での粗製ＨＭＧウイルス荷の選択的排
出；ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン樹脂上のイオン交換
クロマトグラフィー；配位子としてアントラキノン誘導
体を有している樹脂上の親和力クロマトグラフィー；強
塩基性陰イオン樹脂上の選択的イオン交換クロマトグラ
フィー。特に純粋な形で且つ高い比活性を持つには、そ
れにより得られたホルモン類は続いて脱発熱物質処理段
階を受けられる。
経期後の女性の尿抽出物から出発してＦＳＨ及びＬＨの
分離と精製のための、特に簡単で経済的な新工程を提供
する。 【解決手段】 なるべくなら尿の粗製ＨＭＧから出発し
てＦＳＨとＬＨの分離と精製のための、特に簡単且つ経
済的な新しい工程で、以下の諸段階より成っている：エ
タノール水溶液中での粗製ＨＭＧウイルス荷の選択的排
出；ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン樹脂上のイオン交換
クロマトグラフィー；配位子としてアントラキノン誘導
体を有している樹脂上の親和力クロマトグラフィー；強
塩基性陰イオン樹脂上の選択的イオン交換クロマトグラ
フィー。特に純粋な形で且つ高い比活性を持つには、そ
れにより得られたホルモン類は続いて脱発熱物質処理段
階を受けられる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は粗製ＨＭＧから、特
に閉経期又は閉経期後の女性の尿抽出物から出発してＦ
ＳＨ及びＬＨの分離と精製のための、特に簡単で経済的
な新工程に関する。
に閉経期又は閉経期後の女性の尿抽出物から出発してＦ
ＳＨ及びＬＨの分離と精製のための、特に簡単で経済的
な新工程に関する。
【０００２】
【従来の技術】卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体化
ホルモン（ＬＨ）は普通性腺刺激ホルモン又はヒト妊孕
性ホルモンとして知られている。その主な生理的効果が
配偶子形成の促進及び／又はその生物学的過程に含まれ
るステロイドの生産に向けられている斯かる化合物は、
閉経期又は閉経期後の女性の尿からばかりでなく、脳下
垂体及びヒトと動物の血漿からも十分に入手可能であ
る。
ホルモン（ＬＨ）は普通性腺刺激ホルモン又はヒト妊孕
性ホルモンとして知られている。その主な生理的効果が
配偶子形成の促進及び／又はその生物学的過程に含まれ
るステロイドの生産に向けられている斯かる化合物は、
閉経期又は閉経期後の女性の尿からばかりでなく、脳下
垂体及びヒトと動物の血漿からも十分に入手可能であ
る。
【０００３】ＦＳＨとＬＨは粗製抽出物として市場でも
入手可能な通常ＨＭＧ（ヒト閉経期尿性ゴナドトロピ
ン）として知られている、混合物の形の自然源から抽出
される；この混合物はその他の尿蛋白に関連して約１：
１の比のＦＳＨとＬＨから成っている。それにもかかわ
らず、これらの抽出物は低い純度を持ち、そのことは主
に異種タンパク質からの汚染のせいで、治療の目的でヒ
トへのこれらの投与とは適合しない。
入手可能な通常ＨＭＧ（ヒト閉経期尿性ゴナドトロピ
ン）として知られている、混合物の形の自然源から抽出
される；この混合物はその他の尿蛋白に関連して約１：
１の比のＦＳＨとＬＨから成っている。それにもかかわ
らず、これらの抽出物は低い純度を持ち、そのことは主
に異種タンパク質からの汚染のせいで、治療の目的でヒ
トへのこれらの投与とは適合しない。
【０００４】本質的には遠心分離、沈殿、クロマトグラ
フィー及び濾過技術に基づいた、天然起源の生成物（脳
下垂体、血漿又は尿）からスタートする幾つかのＦＳＨ
とＬＨ精製工程が上述のタンパク質汚染を減少させる目
的で当業界で発展させられた。
フィー及び濾過技術に基づいた、天然起源の生成物（脳
下垂体、血漿又は尿）からスタートする幾つかのＦＳＨ
とＬＨ精製工程が上述のタンパク質汚染を減少させる目
的で当業界で発展させられた。
【０００５】米国特許Ｎｏ．３，６７４，８６５は尿抽
出物からのＦＳＨ生成法を述べている；全部で２１の異
なった段階より成っているこの工程は尚結果として３：
１と６：１の間の範囲の比率のＦＳＨとＬＨの混合物を
生じている。
出物からのＦＳＨ生成法を述べている；全部で２１の異
なった段階より成っているこの工程は尚結果として３：
１と６：１の間の範囲の比率のＦＳＨとＬＨの混合物を
生じている。
【０００６】米国特許Ｎｏ．３，９７３，００４（Ｄｅ
ｒｗｅｎｔ抄録）は硫酸アンモニウムでの選択沈殿によ
る脳下垂体からのＦＳＨの分離法を述べている、一方米
国特許Ｎｏ．４，１１５，３７５（米国特許請求抄録）
では、ポリエチレングリコールが沈殿剤として使用され
ている。
ｒｗｅｎｔ抄録）は硫酸アンモニウムでの選択沈殿によ
る脳下垂体からのＦＳＨの分離法を述べている、一方米
国特許Ｎｏ．４，１１５，３７５（米国特許請求抄録）
では、ポリエチレングリコールが沈殿剤として使用され
ている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】それにも拘わらず、上
記諸工程は不十分な比活性と純度を持っている獲得生成
物へ導く欠点に悩んでいる。特に、タンパク質汚染の存
在がアレルギー反応を誘導し、従って上記のホルモン類
は適用するのにかなりの困難を伴う筋内注射のような、
特殊な投与経路によってのみ摂取できる。
記諸工程は不十分な比活性と純度を持っている獲得生成
物へ導く欠点に悩んでいる。特に、タンパク質汚染の存
在がアレルギー反応を誘導し、従って上記のホルモン類
は適用するのにかなりの困難を伴う筋内注射のような、
特殊な投与経路によってのみ摂取できる。
【０００８】最近、免疫親和力クロマトグラフィー及び
特殊モノクロナール抗体（欧州特許ＥＰ０，３２２，４
３８；欧州特許出願ＥＰＡ０，３２８，２４８、Ｄｅｒ
ｗｅｎｔ抄録）又は組換え型ＤＮＡ技術（国際特許出願
ＷＯ８５／０１９５８）を用いた幾つかの精製工程が立
上げられた。これらは高い比活性を持つ製品を得ること
を可能にするけれども、これらの工程は宿主細胞からの
ウイルス、異種タンパク質及びＤＮＡ残基からの起り得
る汚染の厳しい問題に悩んでいる；即ちなぜ斯かる工程
から結果する生成物がそれらを治療に使用するに先立っ
て可能性のある汚染物質を排除するために注意深く精製
されテストされねばならないかである。
特殊モノクロナール抗体（欧州特許ＥＰ０，３２２，４
３８；欧州特許出願ＥＰＡ０，３２８，２４８、Ｄｅｒ
ｗｅｎｔ抄録）又は組換え型ＤＮＡ技術（国際特許出願
ＷＯ８５／０１９５８）を用いた幾つかの精製工程が立
上げられた。これらは高い比活性を持つ製品を得ること
を可能にするけれども、これらの工程は宿主細胞からの
ウイルス、異種タンパク質及びＤＮＡ残基からの起り得
る汚染の厳しい問題に悩んでいる；即ちなぜ斯かる工程
から結果する生成物がそれらを治療に使用するに先立っ
て可能性のある汚染物質を排除するために注意深く精製
されテストされねばならないかである。
【０００９】それ故、上述の被害に遭うことなく、より
高い純度とより高い比活性の生成物の獲得を可能にする
明白な必要性がある。
高い純度とより高い比活性の生成物の獲得を可能にする
明白な必要性がある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】粗製ＨＭＧから出発し
て、高い純度と比活性を持つこれらホルモンの獲得を可
能にしているＦＳＨとＬＨの分離と精製工程が本発明の
目的である。前記工程は以下の段階より成っている： １）８０−９０容量％エタノール水溶液中で前記粗製Ｈ
ＭＧのウイルス荷の選択的排出； ２）ｐＨ７．０から８．０までイオン強度を増加した０
−７０ｍＭＮａＣｌを含んでいる、１０−５０ｍＭ燐酸
塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール水溶液で選択的
にＬＨとＦＳＨを溶離する、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イ
オン樹脂を持つイオン交換クロマトグラフのカラムに段
階（１）で得られた生成物の装填； ３）０から３ＭまでのＫＣｌの増加したイオン強度を有
している、アルカリ性ｐＨ溶液で汚染タンパク質とＦＳ
Ｈ又はＬＨを選択的に溶離する、不活性支持体上のアン
トラキノン誘導体より成っている配位子を有している親
和力クロマトグラフのカラムに、ＬＨ又はＦＳＨを含ん
でいる段階（２）で得られた溶出液の装填； ４）アルカリ性ｐＨで増加したイオン強度を持つ、０−
４００ｍＭＮａＣｌ溶液で汚染タンパク質とＦＳＨを選
択的に溶離する、第４級アンモニウム類を含んでいる、
強塩基性陰イオン樹脂を持つイオン交換クロマトグラフ
のカラムに段階（３）で得られたＦＳＨホルモンの選択
的装填。
て、高い純度と比活性を持つこれらホルモンの獲得を可
能にしているＦＳＨとＬＨの分離と精製工程が本発明の
目的である。前記工程は以下の段階より成っている： １）８０−９０容量％エタノール水溶液中で前記粗製Ｈ
ＭＧのウイルス荷の選択的排出； ２）ｐＨ７．０から８．０までイオン強度を増加した０
−７０ｍＭＮａＣｌを含んでいる、１０−５０ｍＭ燐酸
塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール水溶液で選択的
にＬＨとＦＳＨを溶離する、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イ
オン樹脂を持つイオン交換クロマトグラフのカラムに段
階（１）で得られた生成物の装填； ３）０から３ＭまでのＫＣｌの増加したイオン強度を有
している、アルカリ性ｐＨ溶液で汚染タンパク質とＦＳ
Ｈ又はＬＨを選択的に溶離する、不活性支持体上のアン
トラキノン誘導体より成っている配位子を有している親
和力クロマトグラフのカラムに、ＬＨ又はＦＳＨを含ん
でいる段階（２）で得られた溶出液の装填； ４）アルカリ性ｐＨで増加したイオン強度を持つ、０−
４００ｍＭＮａＣｌ溶液で汚染タンパク質とＦＳＨを選
択的に溶離する、第４級アンモニウム類を含んでいる、
強塩基性陰イオン樹脂を持つイオン交換クロマトグラフ
のカラムに段階（３）で得られたＦＳＨホルモンの選択
的装填。
【００１１】それに加えて、上述の段階（３）と（４）
で得られた、ＦＳＨとＬＨホルモンは脱発熱物質処理及
び凍結乾燥又は凍結させられる。
で得られた、ＦＳＨとＬＨホルモンは脱発熱物質処理及
び凍結乾燥又は凍結させられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明に従う工程の特徴と利点は
以下の詳細記述でよりよく知らされるであろう。
以下の詳細記述でよりよく知らされるであろう。
【００１３】イオン交換と親和性樹脂での簡単な抽出と
容易な生成段階により、本発明の工程は高い比活性と高
い純度を有しているＦＳＨとＬＨの獲得を可能とし、そ
こでそれ以上の生成処理の必要なく治療の目的で人への
投与を可能にしている。この工程は特に簡単で経済的で
あり、そしてそれは水を主にして行われるので、それは
極限られた量の有機溶媒を使用する利点も持つ。
容易な生成段階により、本発明の工程は高い比活性と高
い純度を有しているＦＳＨとＬＨの獲得を可能とし、そ
こでそれ以上の生成処理の必要なく治療の目的で人への
投与を可能にしている。この工程は特に簡単で経済的で
あり、そしてそれは水を主にして行われるので、それは
極限られた量の有機溶媒を使用する利点も持つ。
【００１４】出発する粗製ＨＭＧはなるべくなら閉経期
又は閉経期後の女性の尿から得られる尿濃縮物製であ
る;本発明の実現の好ましい形に従って、前記出発ＨＭ
Ｇは１０ＩＵ（国際単位）／ｍｇ以下、よりなるべくな
ら２から１０ＩＵ／ｍｇの範囲のＦＳＨの比活性、及び
０．５から５ＩＵ／ｍｇの範囲のＬＨの比活性を持つ。
又は閉経期後の女性の尿から得られる尿濃縮物製であ
る;本発明の実現の好ましい形に従って、前記出発ＨＭ
Ｇは１０ＩＵ（国際単位）／ｍｇ以下、よりなるべくな
ら２から１０ＩＵ／ｍｇの範囲のＦＳＨの比活性、及び
０．５から５ＩＵ／ｍｇの範囲のＬＨの比活性を持つ。
【００１５】発明工程の段階（１）では、前記粗製ＨＭ
Ｇは１から４時間の間、なるべくなら−２０℃と５℃の
間にある温度で、８０−９０容量％のエタノール水溶液
中に懸濁させられる。
Ｇは１から４時間の間、なるべくなら−２０℃と５℃の
間にある温度で、８０−９０容量％のエタノール水溶液
中に懸濁させられる。
【００１６】この処理は粗製ＨＭＧのウイルス荷の排出
を得る目的で行われ、これは精製後の薬学分野でのどん
な用途にも不可欠である。
を得る目的で行われ、これは精製後の薬学分野でのどん
な用途にも不可欠である。
【００１７】発明工程の段階（２）では、そのウイルス
荷が段階（１）で選択的に排出された固型残渣は、０℃
から８℃迄の温度範囲且つなるべくなら０℃から６℃ま
でで、ｐＨが７．３から７．６までの範囲で、なるべく
なら１０−３０ｍＭの燐酸ナトリウムを含んでいる、５
−５０ｍＭ燐酸塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール
水溶液に溶解させられる。
荷が段階（１）で選択的に排出された固型残渣は、０℃
から８℃迄の温度範囲且つなるべくなら０℃から６℃ま
でで、ｐＨが７．３から７．６までの範囲で、なるべく
なら１０−３０ｍＭの燐酸ナトリウムを含んでいる、５
−５０ｍＭ燐酸塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール
水溶液に溶解させられる。
【００１８】斯くして得られた溶液は７．３−７．６の
ｐＨで、なるべくなら１０−３０ｍＭの燐酸ナトリウム
を含んでいる、５−５０ｍＭ燐酸塩緩衝液を含んでいる
５−１５容量％エタノール水溶液より成っている条件付
け緩衝液をなるべくなら使用して、なるべくなら０℃か
ら８℃の温度範囲で、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン樹
脂を持つイオン交換クロマトグラフのカラムに装填され
る。前記陰イオン樹脂はセルロース基質上に、そして尚
なるべくならそれがＤＥＡＥセルロース（例えばＤＥ５
２ Ｗｈａｔｍａｎ）である、選択的に第４級アンモニ
ウム類の存在する、第３級アミン類をなるべくなら含
む。
ｐＨで、なるべくなら１０−３０ｍＭの燐酸ナトリウム
を含んでいる、５−５０ｍＭ燐酸塩緩衝液を含んでいる
５−１５容量％エタノール水溶液より成っている条件付
け緩衝液をなるべくなら使用して、なるべくなら０℃か
ら８℃の温度範囲で、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン樹
脂を持つイオン交換クロマトグラフのカラムに装填され
る。前記陰イオン樹脂はセルロース基質上に、そして尚
なるべくならそれがＤＥＡＥセルロース（例えばＤＥ５
２ Ｗｈａｔｍａｎ）である、選択的に第４級アンモニ
ウム類の存在する、第３級アミン類をなるべくなら含
む。
【００１９】好ましい流速は、カラムの直径／長さの比
が０．３から０．６の範囲で、且つ樹脂の全タンパク質
負荷が２０から５０ｍｇ／ｍｌの範囲で、１０から３０
ｍｌ／ｃｍ2・ｈである。
が０．３から０．６の範囲で、且つ樹脂の全タンパク質
負荷が２０から５０ｍｇ／ｍｌの範囲で、１０から３０
ｍｌ／ｃｍ2・ｈである。
【００２０】樹脂に吸着されたＬＨホルモンはなるべく
なら、７．３から７．６のｐＨで、なるべくなら１０−
３０ｍＭの燐酸ナトリウムを含んでいる、１０−５０ｍ
Ｍ燐酸塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール水溶液に
より溶離される。それが結果としてＬＨだけの回収につ
ながる、前記溶離はなるべくなら０−８℃の間の温度で
行われる。
なら、７．３から７．６のｐＨで、なるべくなら１０−
３０ｍＭの燐酸ナトリウムを含んでいる、１０−５０ｍ
Ｍ燐酸塩緩衝液中の５−１５容量％エタノール水溶液に
より溶離される。それが結果としてＬＨだけの回収につ
ながる、前記溶離はなるべくなら０−８℃の間の温度で
行われる。
【００２１】樹脂に吸着されたＦＳＨホルモンは、３０
から５０ｍＭの濃度範囲でＮａＣｌを含んでいて、７．
３−７．６のｐＨで、なるべくなら１０−３０ｍＭの燐
酸ナトリウムを含んでいる、１０−５０ｍＭ燐酸塩緩衝
液中の５−１５容量％エタノール水溶液により続いて溶
離される。前記溶離はなるべくなら０−８℃の間の温度
で行われる。
から５０ｍＭの濃度範囲でＮａＣｌを含んでいて、７．
３−７．６のｐＨで、なるべくなら１０−３０ｍＭの燐
酸ナトリウムを含んでいる、１０−５０ｍＭ燐酸塩緩衝
液中の５−１５容量％エタノール水溶液により続いて溶
離される。前記溶離はなるべくなら０−８℃の間の温度
で行われる。
【００２２】溶離する緩衝溶液中のエタノールの存在は
この段階において決定的な役割を演じる、何故ならばそ
れは二つのホルモンの回収においてより高い収量だけで
なく、よりよいＬＨとＦＳＨの分離を可能にするからで
ある。
この段階において決定的な役割を演じる、何故ならばそ
れは二つのホルモンの回収においてより高い収量だけで
なく、よりよいＬＨとＦＳＨの分離を可能にするからで
ある。
【００２３】発明工程の段階（３）では、段階（２）か
ら得られたＬＨとＦＳＨを含んでいる溶出物は、不活性
支持体なるべくならアガロース、それはアガロースブル
ーより成っている親和力クロマトグラフのカラムになる
べくなら使用される、に共有結合している配位子なるべ
くならチバクロンブルーとしてアントラキノン誘導体を
含んでいる、親和力クロマトグラフィーにより別々に更
なる精製処理手順を受ける。
ら得られたＬＨとＦＳＨを含んでいる溶出物は、不活性
支持体なるべくならアガロース、それはアガロースブル
ーより成っている親和力クロマトグラフのカラムになる
べくなら使用される、に共有結合している配位子なるべ
くならチバクロンブルーとしてアントラキノン誘導体を
含んでいる、親和力クロマトグラフィーにより別々に更
なる精製処理手順を受ける。
【００２４】前記溶出物はなるべくなら５．５から７．
５のｐＨ迄酸性化され且つ０から８℃の温度範囲、５．
５から７．５のｐＨで、なるべくなら酢酸ナトリウムを
含んでいる１０−３０ｍＭ酢酸塩緩衝液で予め条件付け
された、前述のカラム上に装填される。
５のｐＨ迄酸性化され且つ０から８℃の温度範囲、５．
５から７．５のｐＨで、なるべくなら酢酸ナトリウムを
含んでいる１０−３０ｍＭ酢酸塩緩衝液で予め条件付け
された、前述のカラム上に装填される。
【００２５】好ましい流速は、カラムの直径／長さの比
が０．５から０．９の範囲で、樹脂の全タンパク質負荷
が５から１５ｍｇ／ｍｌの範囲で、７から１４ｍｌ／ｃ
ｍ2・ｈである。
が０．５から０．９の範囲で、樹脂の全タンパク質負荷
が５から１５ｍｇ／ｍｌの範囲で、７から１４ｍｌ／ｃ
ｍ2・ｈである。
【００２６】カラムに吸着されたＦＳＨとＬＦＨホルモ
ンはそこで、ｐＨを８．５から１１まで変えながら、増
加成長するイオン強度の選択的に０から３Ｍ迄の濃度範
囲でＫＣｌを含んでいる、一つ又はそれ以上の４０−６
０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液により汚染タンパク質
から選択的に溶離される。
ンはそこで、ｐＨを８．５から１１まで変えながら、増
加成長するイオン強度の選択的に０から３Ｍ迄の濃度範
囲でＫＣｌを含んでいる、一つ又はそれ以上の４０−６
０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液により汚染タンパク質
から選択的に溶離される。
【００２７】斯くして得られたホルモン類は当業技術の
既知の手順で、続く凍結又は凍結乾燥のために濃縮して
脱塩される。
既知の手順で、続く凍結又は凍結乾燥のために濃縮して
脱塩される。
【００２８】本発明の工程の実現の好ましい形に従っ
て、脱塩されたＬＨホルモンは凍結乾燥されて又続いて
当業技術の既知の手順で、脱発熱物質処理を受ける。
て、脱塩されたＬＨホルモンは凍結乾燥されて又続いて
当業技術の既知の手順で、脱発熱物質処理を受ける。
【００２９】段階（４）に従って、一度脱塩された、段
階（３）で得られたＦＳＨホルモンは強塩基性陰イオン
樹脂上のイオン交換クロマトグラフィーにより行われる
更なる精製段階を受ける；この樹脂はセルロース基質、
又それはなるべくならＤＥ５３ Ｗｈａｔｍａｎ、の上
に選択的に第３級アミン類と共同で、第４級アンモニウ
ム類を含む。
階（３）で得られたＦＳＨホルモンは強塩基性陰イオン
樹脂上のイオン交換クロマトグラフィーにより行われる
更なる精製段階を受ける；この樹脂はセルロース基質、
又それはなるべくならＤＥ５３ Ｗｈａｔｍａｎ、の上
に選択的に第３級アミン類と共同で、第４級アンモニウ
ム類を含む。
【００３０】ＦＳＨはなるべくならｐＨ９．０−９．
５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液での透析によ
り平衡をとられて、同じ緩衝液で条件付けされて前記カ
ラムに装填される。
５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液での透析によ
り平衡をとられて、同じ緩衝液で条件付けされて前記カ
ラムに装填される。
【００３１】好ましい流速は、カラムの直径／長さの比
が０．０８から０．３の範囲で、且つ樹脂の全タンパク
質負荷が０．５から１０ｍｇ／ｍｌの範囲で、２０から
４０ｍｌ／ｃｍ2・ｈである。
が０．０８から０．３の範囲で、且つ樹脂の全タンパク
質負荷が０．５から１０ｍｇ／ｍｌの範囲で、２０から
４０ｍｌ／ｃｍ2・ｈである。
【００３２】最初にカラムは、なるべくなら４０から８
０ｍＭの濃度範囲でＮａＣｌを含んでいる、ｐＨ９．０
−９．５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で溶離
され、そこで汚染タンパク質の溶離を得る。
０ｍＭの濃度範囲でＮａＣｌを含んでいる、ｐＨ９．０
−９．５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で溶離
され、そこで汚染タンパク質の溶離を得る。
【００３３】樹脂に結合したＦＳＨホルモンは続いて、
ｐＨ９．０−９．５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液中で、なるべくなら７０−１００ｍＭから１４０−
４００ｍＭまでの範囲の、ＮａＣｌの線形濃度勾配を利
用して溶離される。
ｐＨ９．０−９．５、１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液中で、なるべくなら７０−１００ｍＭから１４０−
４００ｍＭまでの範囲の、ＮａＣｌの線形濃度勾配を利
用して溶離される。
【００３４】斯くして得られた精製ＦＳＨホルモンはそ
こで限外濾過により脱塩され、当業技術の既知の手順で
凍結乾燥され且つ脱発熱物質処理される。
こで限外濾過により脱塩され、当業技術の既知の手順で
凍結乾燥され且つ脱発熱物質処理される。
【００３５】本発明の好ましい実施例によれば、段階
（３）又は（４）で得られたＦＳＨとＬＨの脱発熱物質
処理工程は次の通り行われる、凍結乾燥された粉末形態
の精製ホルモンが−１５℃と０℃の間にある温度で、５
−１５重量％の酢酸アンモニウムを含んでいる、３０−
５０容量％エタノール水溶液に溶解させられる。
（３）又は（４）で得られたＦＳＨとＬＨの脱発熱物質
処理工程は次の通り行われる、凍結乾燥された粉末形態
の精製ホルモンが−１５℃と０℃の間にある温度で、５
−１５重量％の酢酸アンモニウムを含んでいる、３０−
５０容量％エタノール水溶液に溶解させられる。
【００３６】そこでこの溶液に３−８ｍＭの三塩基燐酸
ナトリウムと３−８ｍＭの酢酸カルシウムが添加され；
そしてｐＨは水酸化ナトリウムにより８から１０までの
範囲の値まで上げられる。遠心分離後に得られた上澄み
液に、各上澄み液の容量に対して１．５−２．５倍の容
量の無水エタノールが−２０℃と０℃の間の温度範囲で
添加される。更に遠心分離を行った後、得られた沈殿物
は当業技術で知られた方法に従って、再び水に溶解され
て透析される。
ナトリウムと３−８ｍＭの酢酸カルシウムが添加され；
そしてｐＨは水酸化ナトリウムにより８から１０までの
範囲の値まで上げられる。遠心分離後に得られた上澄み
液に、各上澄み液の容量に対して１．５−２．５倍の容
量の無水エタノールが−２０℃と０℃の間の温度範囲で
添加される。更に遠心分離を行った後、得られた沈殿物
は当業技術で知られた方法に従って、再び水に溶解され
て透析される。
【００３７】最後に、精製されたＬＨ又はＦＳＨを含ん
でいる溶液はそのまま凍結させられるか又は当業技術で
知られた方法に従って凍結乾燥され、従って長期間の保
存で変化しないホルモン活性を保持する。
でいる溶液はそのまま凍結させられるか又は当業技術で
知られた方法に従って凍結乾燥され、従って長期間の保
存で変化しないホルモン活性を保持する。
【００３８】本発明の工程は非常な高純度のＦＳＨとＬ
Ｈの達成を可能にし、又夫々ＦＳＨはＬＨに関係なく
６，０００ＩＵ／ｍｇを超える比活性を有しており、又
ＬＨは５００ＩＵ／ｍｇを超える比活性を有している。
Ｈの達成を可能にし、又夫々ＦＳＨはＬＨに関係なく
６，０００ＩＵ／ｍｇを超える比活性を有しており、又
ＬＨは５００ＩＵ／ｍｇを超える比活性を有している。
【００３９】本発明の以下の実施例は例証のために公表
するものであるが目的を制限するものではない。
するものであるが目的を制限するものではない。
【００４０】実施例１：粗製尿のＨＭＧからのＦＳＨ精
製 １．１ エタノール水溶液中の粗製ＨＭＧのウイルス荷
の排出 これ以後に記述されるすべての操作は、特に明記された
のを除いて、０から６℃までの温度範囲で行われた。
製 １．１ エタノール水溶液中の粗製ＨＭＧのウイルス荷
の排出 これ以後に記述されるすべての操作は、特に明記された
のを除いて、０から６℃までの温度範囲で行われた。
【００４１】閉経期又は閉経期後の女性の尿から得られ
た２００ｇの粗製ＨＭＧが−１０℃の温度で１０リット
ルのエタノール／水混合液（容積比８５：１５）中に懸
濁させられた；斯くして得られた懸濁液は−１０℃の温
度で３時間攪拌されながら維持され、Ｓｏｒｖａｌｌ社
のＧＳ３回転機を用いて、２０分間７，０００ｒｐｍで
遠心分離に掛けられた；上澄み液の除去後、沈殿物が回
収された。
た２００ｇの粗製ＨＭＧが−１０℃の温度で１０リット
ルのエタノール／水混合液（容積比８５：１５）中に懸
濁させられた；斯くして得られた懸濁液は−１０℃の温
度で３時間攪拌されながら維持され、Ｓｏｒｖａｌｌ社
のＧＳ３回転機を用いて、２０分間７，０００ｒｐｍで
遠心分離に掛けられた；上澄み液の除去後、沈殿物が回
収された。
【００４２】１．２ ＤＥ５２上でのイオン交換クロマ
トグラフィー 段階１．１で得られた沈殿物はｐＨ７．３を持つ２０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウムを含んでいる、２リットルの１０％エ
タノール溶液に溶解された。斯くして得られた溶液はＳ
ｏｒｖａｌｌ社のＧＳ３回転機を用いて、３０分間７，
０００ｒｐｍで遠心分離に掛けられた、そして得られた
上澄み液は１０容量％のエタノールを含んでいて、ｐＨ
７．３で、２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液で平衡をとら
れた、１４ｃｍの直径と３６ｃｍの高さを持っているジ
エチルアミノエチルセルロースを基剤にした、ＤＥ５２
Ｗｈａｔｍａｎイオン交換カラム（１９９５年、カタ
ログ参照番号４０５７９１０）に装填された。クロマト
グラフィーの間に、カラムは３リットル／時間の流速で
溶離されたそして溶出物は約７００ｍｌの分画に捕集さ
れた。
トグラフィー 段階１．１で得られた沈殿物はｐＨ７．３を持つ２０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウムを含んでいる、２リットルの１０％エ
タノール溶液に溶解された。斯くして得られた溶液はＳ
ｏｒｖａｌｌ社のＧＳ３回転機を用いて、３０分間７，
０００ｒｐｍで遠心分離に掛けられた、そして得られた
上澄み液は１０容量％のエタノールを含んでいて、ｐＨ
７．３で、２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液で平衡をとら
れた、１４ｃｍの直径と３６ｃｍの高さを持っているジ
エチルアミノエチルセルロースを基剤にした、ＤＥ５２
Ｗｈａｔｍａｎイオン交換カラム（１９９５年、カタ
ログ参照番号４０５７９１０）に装填された。クロマト
グラフィーの間に、カラムは３リットル／時間の流速で
溶離されたそして溶出物は約７００ｍｌの分画に捕集さ
れた。
【００４３】試料が装填された後、カラムは次の順序で
溶離された： （ａ）ｐＨ＝７．３、２０ｍＭ燐酸ナトリウムを含んで
いる、１０リットルの１０容量％エタノール； （ｂ）ｐＨ＝７．３、２０ｍＭ燐酸ナトリウムと４０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含んでいる、４０リットルの１０容
量％エタノール。
溶離された： （ａ）ｐＨ＝７．３、２０ｍＭ燐酸ナトリウムを含んで
いる、１０リットルの１０容量％エタノール； （ｂ）ｐＨ＝７．３、２０ｍＭ燐酸ナトリウムと４０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含んでいる、４０リットルの１０容
量％エタノール。
【００４４】クロマトグラフィーの後、ＬＨとＦＳＨの
活性に加えて、２８０ｎｍでの光学的濃度（ＯＤ２８
０）が各溶出物分画について決定された。図１は得られ
たクロマトグラムを示す、そこではＬＨとＦＳＨの比活
性（ＩＵ／ｍｌ）及び溶出物分画の光学的濃度が報告さ
れている。
活性に加えて、２８０ｎｍでの光学的濃度（ＯＤ２８
０）が各溶出物分画について決定された。図１は得られ
たクロマトグラムを示す、そこではＬＨとＦＳＨの比活
性（ＩＵ／ｍｌ）及び溶出物分画の光学的濃度が報告さ
れている。
【００４５】このクロマトグラムはＬＨが緩衝溶液
（ａ）により溶離され、一方ＦＳＨは４０ｍＭＮａＣｌ
を含んだ緩衝溶液（ｂ）により溶離されたことを示して
いる。特に、ＬＨを含んでいる６から２０までの分画は
捕集されて、実施例２で記述されるように更に精製され
た；ＦＳＨを含んでいる２８から４１までの分画は捕集
されて以下に述べるように精製された。
（ａ）により溶離され、一方ＦＳＨは４０ｍＭＮａＣｌ
を含んだ緩衝溶液（ｂ）により溶離されたことを示して
いる。特に、ＬＨを含んでいる６から２０までの分画は
捕集されて、実施例２で記述されるように更に精製され
た；ＦＳＨを含んでいる２８から４１までの分画は捕集
されて以下に述べるように精製された。
【００４６】１．３ アガロースブルー上の親和力クロ
マトグラフィーによるＦＳＨ精製 アガロースブルー３ＧＡ親和力樹脂（シグマケミカル
社、セントルイス、ミズリー州、１９９５年、カタログ
参照番号Ｃ１４１０）が使用された；この樹脂はクロマ
トグラフのカラムに詰められる前に、以下の試薬で洗浄
された： ０．５％Ｎａ2ＣＯ3中の２．５ＭＫＣｌ溶液１０リット
ルで１時間； ０．５％Ｎａ2ＣＯ3溶液１０リットルで３０分間； ６Ｍの尿素溶液１０リットルで２時間； Ｈ2Ｏ１０リットルで３０分間； ０．５％Ｎａ2ＣＯ3溶液１０リットルで３０分間； Ｈ2Ｏ１０リットルで３０分間； ｐＨ＝６．５、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１０リッ
トルで３０分間； ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１０リッ
トルで３０分間。
マトグラフィーによるＦＳＨ精製 アガロースブルー３ＧＡ親和力樹脂（シグマケミカル
社、セントルイス、ミズリー州、１９９５年、カタログ
参照番号Ｃ１４１０）が使用された；この樹脂はクロマ
トグラフのカラムに詰められる前に、以下の試薬で洗浄
された： ０．５％Ｎａ2ＣＯ3中の２．５ＭＫＣｌ溶液１０リット
ルで１時間； ０．５％Ｎａ2ＣＯ3溶液１０リットルで３０分間； ６Ｍの尿素溶液１０リットルで２時間； Ｈ2Ｏ１０リットルで３０分間； ０．５％Ｎａ2ＣＯ3溶液１０リットルで３０分間； Ｈ2Ｏ１０リットルで３０分間； ｐＨ＝６．５、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１０リッ
トルで３０分間； ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１０リッ
トルで３０分間。
【００４７】ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液中で条件付けされた樹脂は１１ｃｍの直径と１６ｃ
ｍの高さを持つ樹脂床を得るためクロマトグラフのカラ
ムに詰められた。
衝液中で条件付けされた樹脂は１１ｃｍの直径と１６ｃ
ｍの高さを持つ樹脂床を得るためクロマトグラフのカラ
ムに詰められた。
【００４８】段階１．２で得られたＦＳＨを含んでいる
試料のｐＨは１．７Ｍ酢酸により６．５に変えられてカ
ラムの中に装填された。
試料のｐＨは１．７Ｍ酢酸により６．５に変えられてカ
ラムの中に装填された。
【００４９】カラムの中の試料装填とその更なる溶離は
１リットル／時間の流速で行われた。カラムの中に試料
の装填中に回収された溶出物は単一の分画で捕集された
が、更に約７００ｍｌの分画が続いて捕集された。
１リットル／時間の流速で行われた。カラムの中に試料
の装填中に回収された溶出物は単一の分画で捕集された
が、更に約７００ｍｌの分画が続いて捕集された。
【００５０】試料が装填された後、カラムは先ず以下の
順序で溶離された： ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１リット
ル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液５リッ
トル； ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、０．２ＭＫＣ
ｌ緩衝液３リットル； そしてグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中のＫＣｌ線形勾配に
より、次のように調製された： チャンバー１）ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液中０．３ＭＫＣｌ９リットル； チャンバー２）ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液中２．５ＭＫＣｌ９リットル。
順序で溶離された： ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１リット
ル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液５リッ
トル； ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、０．２ＭＫＣ
ｌ緩衝液３リットル； そしてグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中のＫＣｌ線形勾配に
より、次のように調製された： チャンバー１）ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液中０．３ＭＫＣｌ９リットル； チャンバー２）ｐＨ＝９、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液中２．５ＭＫＣｌ９リットル。
【００５１】クロマトグラフィーの後、ＦＳＨの比活性
（ＩＵ／ｍｌ）だけでなく、各溶出物分画の２８０ｎｍ
での光学的濃度（ＯＤ２８０）が決定された。図２は得
られたクロマトグラムを示す。
（ＩＵ／ｍｌ）だけでなく、各溶出物分画の２８０ｎｍ
での光学的濃度（ＯＤ２８０）が決定された。図２は得
られたクロマトグラムを示す。
【００５２】試料が装填されている間（グラフには書か
れていない）、ＦＳＨがカラムに保持されていた間に汚
染タンパク質の最大の部分が溶出物中に見出された。樹
脂によって保持された多くの汚染タンパク質は第一洗浄
及び０．３ＭＫＣｌを含んでいる緩衝液により溶離され
たが、一方ＦＳＨの溶離はこれらの条件下では観察され
なかった。
れていない）、ＦＳＨがカラムに保持されていた間に汚
染タンパク質の最大の部分が溶出物中に見出された。樹
脂によって保持された多くの汚染タンパク質は第一洗浄
及び０．３ＭＫＣｌを含んでいる緩衝液により溶離され
たが、一方ＦＳＨの溶離はこれらの条件下では観察され
なかった。
【００５３】ＫＣｌ勾配による引続いた溶離（分画１４
から始まっている）は先ず結果としてその他の汚染タン
パク質の排除に帰着した（近似的に分画１５から分画２
０まで）；ＦＳＨの溶離はより高いＫＣｌ濃度で対称的
なピークで起った（分画２２から２９まで）。
から始まっている）は先ず結果としてその他の汚染タン
パク質の排除に帰着した（近似的に分画１５から分画２
０まで）；ＦＳＨの溶離はより高いＫＣｌ濃度で対称的
なピークで起った（分画２２から２９まで）。
【００５４】その後、２３から２８までの分画が一緒に
集められた；得られた生成物のｐＨは１．７Ｍ酢酸で
７．５まで上げられた；そこで生成物それ自身は濃縮さ
れてアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＰＭ１０膜を備えたアミ
コンセルを用いて限外濾過により脱塩された。
集められた；得られた生成物のｐＨは１．７Ｍ酢酸で
７．５まで上げられた；そこで生成物それ自身は濃縮さ
れてアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＰＭ１０膜を備えたアミ
コンセルを用いて限外濾過により脱塩された。
【００５５】１．４ ＤＥ５３上のイオン交換クロマト
グラフィー 段階１．３で述べたように前もって濃縮されて脱塩され
たＦＳＨ試料は、ｐＨ＝９．３、５リットルの２５ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液に対して１８時間透析された；そ
の後、試料はｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液で平衡をとられた、２ｃｍの直径と１８ｃｍの高さ
を持っている、ＤＥ５３ Ｗｈａｔｍａｎイオン交換ク
ロマトグラフのカラム（１９９５年カタログ参照番号４
０５８９１０）上に装填された。カラムは１００ｍｌ／
時間の流速で溶離されたそして溶出物は約１８ｍｌの分
画に捕集された。
グラフィー 段階１．３で述べたように前もって濃縮されて脱塩され
たＦＳＨ試料は、ｐＨ＝９．３、５リットルの２５ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液に対して１８時間透析された；そ
の後、試料はｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液で平衡をとられた、２ｃｍの直径と１８ｃｍの高さ
を持っている、ＤＥ５３ Ｗｈａｔｍａｎイオン交換ク
ロマトグラフのカラム（１９９５年カタログ参照番号４
０５８９１０）上に装填された。カラムは１００ｍｌ／
時間の流速で溶離されたそして溶出物は約１８ｍｌの分
画に捕集された。
【００５６】試料装填後、カラムは先ず８０ｍＭＮａＣ
ｌを含んでいる、ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液の４５０ｍｌで溶離された、そしてＮａＣｌ線
形勾配により次の通り調製された： チャンバー１）ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液中９０ｍＭＮａＣｌ ６００ｍｌ； チャンバー２）ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液中１６０ｍＭＮａＣｌ ６００ｍｌ。
ｌを含んでいる、ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液の４５０ｍｌで溶離された、そしてＮａＣｌ線
形勾配により次の通り調製された： チャンバー１）ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液中９０ｍＭＮａＣｌ ６００ｍｌ； チャンバー２）ｐＨ＝９．３、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
緩衝液中１６０ｍＭＮａＣｌ ６００ｍｌ。
【００５７】図３は得られたクロマトグラムを示す、そ
こでは各溶出物分画についてのＦＳＨ比活性（ＩＵ／ｍ
ｌ）だけでなく、２８０ｎｍでの光学的濃度（ＯＤ２８
０）が記されている。
こでは各溶出物分画についてのＦＳＨ比活性（ＩＵ／ｍ
ｌ）だけでなく、２８０ｎｍでの光学的濃度（ＯＤ２８
０）が記されている。
【００５８】クロマトグラムははっきりと、８０ｍＭＮ
ａＣｌを含んでいる最初の溶離溶液による洗浄が幾らか
の汚染タンパク質の除去を結果するが、一方ＦＳＨは未
だカラムに保持されていることを示している。反対に、
ＦＳＨは分画３０から使用されたＮａＣｌ勾配によって
汚染タンパク質から選択的に溶離される。３１から４０
までの分画は一緒に集められ、濃縮されて、アミコンＰ
Ｍ１０で装備されたアミコンセルを用いて脱塩され、そ
して最後には凍結乾燥された。
ａＣｌを含んでいる最初の溶離溶液による洗浄が幾らか
の汚染タンパク質の除去を結果するが、一方ＦＳＨは未
だカラムに保持されていることを示している。反対に、
ＦＳＨは分画３０から使用されたＮａＣｌ勾配によって
汚染タンパク質から選択的に溶離される。３１から４０
までの分画は一緒に集められ、濃縮されて、アミコンＰ
Ｍ１０で装備されたアミコンセルを用いて脱塩され、そ
して最後には凍結乾燥された。
【００５９】１．５ ＦＳＨの脱発熱物質処理 全段階で得られた１０９ｍｇの凍結乾燥ＦＳＨは４０容
量％のエタノール中への１０重量％酢酸アンモニウムの
冷溶液５５ｍｌに溶解させられた。氷と塩浴により約−
１０℃の温度に磁気攪拌下で維持された溶液に、以下の
成分が添加された： 三塩基燐酸ナトリウム１２水和物の７．６％水溶液１．
２ｍｌ； 酢酸カルシウムの４．９％水溶液１．４ｍｌ。
量％のエタノール中への１０重量％酢酸アンモニウムの
冷溶液５５ｍｌに溶解させられた。氷と塩浴により約−
１０℃の温度に磁気攪拌下で維持された溶液に、以下の
成分が添加された： 三塩基燐酸ナトリウム１２水和物の７．６％水溶液１．
２ｍｌ； 酢酸カルシウムの４．９％水溶液１．４ｍｌ。
【００６０】２０重量％ＮａＯＨにより約８．５までｐ
Ｈを上げられた後、溶液は３０分間の攪拌下で未だ約−
１０℃の温度に維持されて、それから３０分間Ｓｏｒｖ
ａｌｌ ＳＳ３４回転機で８，０００ｒｐｍの遠心分離
に掛けられた。沈殿物は除去されたが、一方集められた
上澄み液（５７ｍｌ）は攪拌されて氷と塩浴で約−１０
℃まで冷却された。
Ｈを上げられた後、溶液は３０分間の攪拌下で未だ約−
１０℃の温度に維持されて、それから３０分間Ｓｏｒｖ
ａｌｌ ＳＳ３４回転機で８，０００ｒｐｍの遠心分離
に掛けられた。沈殿物は除去されたが、一方集められた
上澄み液（５７ｍｌ）は攪拌されて氷と塩浴で約−１０
℃まで冷却された。
【００６１】予め−２０℃に冷却された１１４ｍｌの９
５容量％エタノールの添加後、溶液は約３０分間攪拌下
で維持されて、それから−２０℃の温度で１２時間静置
された。
５容量％エタノールの添加後、溶液は約３０分間攪拌下
で維持されて、それから−２０℃の温度で１２時間静置
された。
【００６２】０−４℃冷却遠心分離機中の８，０００ｒ
ｐｍで３０分の遠心分離の後、上澄み液は除去されて沈
殿物は無発熱源水（８０ｍｌ）に再び溶解された。斯く
して得られた溶液は１０リットルの無発熱源水に対して
１８時間透析されそこで凍結乾燥された。
ｐｍで３０分の遠心分離の後、上澄み液は除去されて沈
殿物は無発熱源水（８０ｍｌ）に再び溶解された。斯く
して得られた溶液は１０リットルの無発熱源水に対して
１８時間透析されそこで凍結乾燥された。
【００６３】図４は上記の工程に従って精製された１．
１ｍｇ／ｍｌのＦＳＨを含んでいる溶液の吸収スペクト
ルを示している。タンパク質の６．８７０ＩＵ／ｍｇに
対応しているこの精製ＦＳＨの活性は、Ｓｅｒｏｎｏ
ＦＳＨ Ｍａｉｃｌｏｎｅキット（カタログ参照番号１
３１０１）を使用して、免疫放射分析法で決定された。
精製ＦＳＨ中のタンパク質濃度は１ｍｇ／ｍｌのＦＳＨ
を含んでいる水溶液が１ｃｍの光路長を持つ水晶のクベ
ットで、２７７ｎｍで０．６２の光学的濃度を示すこと
を考慮して計算された。この係数は、予め凍結乾燥され
た無塩ホルモンの増量を含んでいる溶液における２７７
ｎｍでの吸収を決定しながら、調製中に実験的に決定さ
れた。この係数は４，０００から１０，０００ＩＵ／ｍ
ｇまでのＦＳＨの比活性範囲を持つ精製ホルモンの試料
におけるその他のタンパク質決定方法よりもより信頼性
があることを証明した。より低い純度の分画（例えば段
階１．２で得られたもの）のタンパク質濃度は、標準と
して牛の血清アルブミンを用いて、ＢＣＡタンパク質分
析Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ参照番号２３２
２３及び２３２２４）により決定された。
１ｍｇ／ｍｌのＦＳＨを含んでいる溶液の吸収スペクト
ルを示している。タンパク質の６．８７０ＩＵ／ｍｇに
対応しているこの精製ＦＳＨの活性は、Ｓｅｒｏｎｏ
ＦＳＨ Ｍａｉｃｌｏｎｅキット（カタログ参照番号１
３１０１）を使用して、免疫放射分析法で決定された。
精製ＦＳＨ中のタンパク質濃度は１ｍｇ／ｍｌのＦＳＨ
を含んでいる水溶液が１ｃｍの光路長を持つ水晶のクベ
ットで、２７７ｎｍで０．６２の光学的濃度を示すこと
を考慮して計算された。この係数は、予め凍結乾燥され
た無塩ホルモンの増量を含んでいる溶液における２７７
ｎｍでの吸収を決定しながら、調製中に実験的に決定さ
れた。この係数は４，０００から１０，０００ＩＵ／ｍ
ｇまでのＦＳＨの比活性範囲を持つ精製ホルモンの試料
におけるその他のタンパク質決定方法よりもより信頼性
があることを証明した。より低い純度の分画（例えば段
階１．２で得られたもの）のタンパク質濃度は、標準と
して牛の血清アルブミンを用いて、ＢＣＡタンパク質分
析Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ参照番号２３２
２３及び２３２２４）により決定された。
【００６４】段階１．１−１．５で述べたように行われ
たＦＳＨ精製に関するデータは表１に示される。
たＦＳＨ精製に関するデータは表１に示される。
【００６５】
【表１】
【００６６】表２は実施例１に記述された方法に従って
行われた、更なるＦＳＨ精製試験で到達した結果を示
す。
行われた、更なるＦＳＨ精製試験で到達した結果を示
す。
【００６７】
【表２】
【００６８】実施例２：粗製尿のＨＭＧからのＬＨ精製 エタノール水溶液における粗製ＨＭＧウイルス荷の排出
及びＤＥ５２上のイオン交換クロマトグラフィーに関す
る段階２．１と２．２はＦＳＨとＬＨについて両者共通
であり、そして実施例１の項目１．１と１．２で述べた
ように行われた。
及びＤＥ５２上のイオン交換クロマトグラフィーに関す
る段階２．１と２．２はＦＳＨとＬＨについて両者共通
であり、そして実施例１の項目１．１と１．２で述べた
ように行われた。
【００６９】２．３ アガロースブルー上の親和力クロ
マトグラフィーによるＬＨ精製 アガロースブルー３ＧＡ親和力樹脂は項目１．３で記述
されたように調製された。それはｐＨ＝６．５、２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡をとられ、そして１１ｃ
ｍの直径と１６ｃｍの高さを持つ樹脂床を得るためクロ
マトグラフのカラムに詰められた。
マトグラフィーによるＬＨ精製 アガロースブルー３ＧＡ親和力樹脂は項目１．３で記述
されたように調製された。それはｐＨ＝６．５、２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡をとられ、そして１１ｃ
ｍの直径と１６ｃｍの高さを持つ樹脂床を得るためクロ
マトグラフのカラムに詰められた。
【００７０】項目１．２で述べられたように得られたＬ
Ｈを含んでいる試料のｐＨは１．７Ｍ酢酸によって６．
５まで変えられた、そして前記試料は１リットル／時間
の流速でカラムの中に装填された。カラムの中に試料の
装填中に得られた溶出物は単一の分画で捕集されたが、
更に約６００ｍｌの分画が続いて捕集された。
Ｈを含んでいる試料のｐＨは１．７Ｍ酢酸によって６．
５まで変えられた、そして前記試料は１リットル／時間
の流速でカラムの中に装填された。カラムの中に試料の
装填中に得られた溶出物は単一の分画で捕集されたが、
更に約６００ｍｌの分画が続いて捕集された。
【００７１】試料装填後、カラムは先ず以下の順序で溶
離された： ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１リット
ル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液５リッ
トル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、０．１５Ｍ
ＫＣｌ緩衝液２リットル； そしてグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中のＫＣｌ線形勾配に
より、次のように調製された： チャンバー１）ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液中０．１５ＭＫＣｌ ８リットル； チャンバー２）ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液中１．７ＭＫＣｌ ８リットル。
離された： ｐＨ＝６．５、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１リット
ル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液５リッ
トル； ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、０．１５Ｍ
ＫＣｌ緩衝液２リットル； そしてグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中のＫＣｌ線形勾配に
より、次のように調製された： チャンバー１）ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液中０．１５ＭＫＣｌ ８リットル； チャンバー２）ｐＨ＝１０、５０ｍＭグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液中１．７ＭＫＣｌ ８リットル。
【００７２】クロマトグラフィーの後、各分画について
ＬＨ比活性（ＩＵ／ｍｌ）だけでなく、２８０ｎｍでの
光学的濃度（ＯＤ２８０）も決定された。図５は上記の
如くして得られた溶離クロマトグラムの結果を示してい
る。
ＬＨ比活性（ＩＵ／ｍｌ）だけでなく、２８０ｎｍでの
光学的濃度（ＯＤ２８０）も決定された。図５は上記の
如くして得られた溶離クロマトグラムの結果を示してい
る。
【００７３】試料がカラムに装填されている間、ＬＨは
カラムの中に保持されていたが、一方汚染タンパク質の
最大の部分は溶出物中に見出された（グラフには記され
ていない）。樹脂によって保持された多くの汚染タンパ
ク質は勾配溶離の前に、ｐＨ１０での二つの緩衝液によ
り行われた洗浄によって溶離された。
カラムの中に保持されていたが、一方汚染タンパク質の
最大の部分は溶出物中に見出された（グラフには記され
ていない）。樹脂によって保持された多くの汚染タンパ
ク質は勾配溶離の前に、ｐＨ１０での二つの緩衝液によ
り行われた洗浄によって溶離された。
【００７４】ＬＨはＫＣｌ勾配によって溶離された：低
いＫＣｌ濃度は汚染蛋白質の一層の溶離を生じさせた
が、一方ＬＨの溶離はより高い濃度で起った。
いＫＣｌ濃度は汚染蛋白質の一層の溶離を生じさせた
が、一方ＬＨの溶離はより高い濃度で起った。
【００７５】そこで１７から２５までの分画が一緒に集
められてｐＨ値が１．７Ｍ酢酸により７．５に変えられ
た。そこで溶液は濃縮され、アミコンＰＭ１０膜上の限
外濾過により脱塩されそして最後に凍結乾燥された。
められてｐＨ値が１．７Ｍ酢酸により７．５に変えられ
た。そこで溶液は濃縮され、アミコンＰＭ１０膜上の限
外濾過により脱塩されそして最後に凍結乾燥された。
【００７６】２．４ ＬＨ脱発熱物質処理 前段階で得られた２０５ｍｇの凍結乾燥されたＬＨは４
０容量％エタノールと１０重量％酢酸アンモニウムを含
んでいる１０２ｍｌの溶液に溶解された。氷と塩浴によ
り約−１０℃の温度に磁気攪拌下で維持された溶液に、
以下の成分が添加された： 三塩基燐酸ナトリウム１２水和物の７．６％水溶液２．
２５ｍｌ； 酢酸カルシウムの４．９％水溶液２．７ｍｌ。
０容量％エタノールと１０重量％酢酸アンモニウムを含
んでいる１０２ｍｌの溶液に溶解された。氷と塩浴によ
り約−１０℃の温度に磁気攪拌下で維持された溶液に、
以下の成分が添加された： 三塩基燐酸ナトリウム１２水和物の７．６％水溶液２．
２５ｍｌ； 酢酸カルシウムの４．９％水溶液２．７ｍｌ。
【００７７】２０重量％ＮａＯＨにより約８．５までｐ
Ｈを上げられた後、溶液は３０分間の攪拌下で約−１０
℃の温度に維持された、それから３０分間Ｓｏｒｖａｌ
ｌＳＳ３４回転機で８，０００ｒｐｍの遠心分離に掛け
られた。沈殿物は除去されたが、一方集められた上澄み
液（１０７ｍｌ）は、氷と塩浴で約−１０℃の温度を維
持しながら攪拌された。
Ｈを上げられた後、溶液は３０分間の攪拌下で約−１０
℃の温度に維持された、それから３０分間Ｓｏｒｖａｌ
ｌＳＳ３４回転機で８，０００ｒｐｍの遠心分離に掛け
られた。沈殿物は除去されたが、一方集められた上澄み
液（１０７ｍｌ）は、氷と塩浴で約−１０℃の温度を維
持しながら攪拌された。
【００７８】予め−２０℃に冷却された２１４ｍｌの９
５容量％エタノールの添加後、溶液は約３０分間攪拌下
で維持されて、それから−２０℃の温度で１２時間静置
された。
５容量％エタノールの添加後、溶液は約３０分間攪拌下
で維持されて、それから−２０℃の温度で１２時間静置
された。
【００７９】０−４℃冷却遠心分離機中の８，０００ｒ
ｐｍで３０分の遠心分離の後、上澄み液は除去されて沈
殿物は無発熱源水（１２５ｍｌ）に再び溶解された。斯
くして得られた溶液は１０リットルの無発熱源水に対し
て１８時間透析されそこで凍結乾燥された。
ｐｍで３０分の遠心分離の後、上澄み液は除去されて沈
殿物は無発熱源水（１２５ｍｌ）に再び溶解された。斯
くして得られた溶液は１０リットルの無発熱源水に対し
て１８時間透析されそこで凍結乾燥された。
【００８０】図６は上記の工程に従って精製された２．
８ｍｇ／ｍｌのＬＨを含んでいる水溶液の紫外線スペク
トルを示している。タンパク質の５２１ＩＵ／ｍｇに対
応している精製ＬＨの比活性は、Ｓｅｒｏｎｏ ＬＨ
Ｍａｉｃｌｏｎｅキット（カタログ参照番号１３２０
１）を使用して、免疫放射分析法で決定された。タンパ
ク質濃度は標準として牛の血清アルブミンを用いて、Ｂ
ＣＡタンパク質分析Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅカタロ
グ参照番号２３２２３及び２３２２４）により決定され
た。
８ｍｇ／ｍｌのＬＨを含んでいる水溶液の紫外線スペク
トルを示している。タンパク質の５２１ＩＵ／ｍｇに対
応している精製ＬＨの比活性は、Ｓｅｒｏｎｏ ＬＨ
Ｍａｉｃｌｏｎｅキット（カタログ参照番号１３２０
１）を使用して、免疫放射分析法で決定された。タンパ
ク質濃度は標準として牛の血清アルブミンを用いて、Ｂ
ＣＡタンパク質分析Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅカタロ
グ参照番号２３２２３及び２３２２４）により決定され
た。
【００８１】上述の段階に従って行われた、ＬＨ精製に
対応するデータは表３に示されている。
対応するデータは表３に示されている。
【００８２】
【表３】
【００８３】表４は実施例２に記述された方法に従って
行われた、更なるＬＨ精製試験で到達した結果を示す。
行われた、更なるＬＨ精製試験で到達した結果を示す。
【００８４】
【表４】
【図１】クロマトグラムの結果を、各溶出物分画のＬＨ
とＦＳＨの比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光
学的濃度（ＯＤ２８０）で示す。
とＦＳＨの比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光
学的濃度（ＯＤ２８０）で示す。
【図２】クロマトグラムの結果を、各溶出物分画のＦＳ
Ｈ比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
Ｈ比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
【図３】クロマトグラムの結果を、各溶出物分画のＦＳ
Ｈ比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
Ｈ比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
【図４】ＦＳＨを含んでいる水溶液の紫外線吸収スペク
トルを示す。
トルを示す。
【図５】クロマトグラムの結果を、各溶出物分画のＬＨ
比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
比活性（ＩＵ／ｍｌ）及び２８０ｎｍでの光学的濃度
（ＯＤ２８０）で示す。
【図６】ＬＨを含んでいる水溶液の紫外線吸収スペクト
ルを示す。
ルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/24 Ａ６１Ｐ 15/08 Ａ６１Ｐ 15/08 Ａ６１Ｋ 37/38 (72)発明者 イリナ ラパポルト スイス国、6821 ロヴィオ、ヴィア アイ ロンチ（無番地) Ｆターム(参考） 4C084 AA02 CA39 DB09 DB10 NA14 ZC032 4C087 AA04 AA05 BB62 CA06 NA14 ZC03 4H045 AA20 CA44 DA30 GA01 GA05 GA10 GA15 GA23 GA26
Claims (15)
- 【請求項１】 粗製ＨＭＧ（ヒト閉経期尿性ゴナドトロ
ピン）から出発する、ＦＳＨとＬＨの分離と精製の工程
において： １）８０−９０容量％のエタノール水溶液中での前記粗
製ＨＭＧウイルス荷の選択的排出； ２）ｐＨ７．０−８．０でイオン強度を増加した０−７
０ｍＭＮａＣｌを含んでいる、１０−５０ｍＭ燐酸塩緩
衝液中の５−１５容量％エタノール水溶液で選択的にＬ
ＨとＦＳＨを溶離する、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチ
ル）型の弱塩基性陰イオン樹脂を持つイオン交換クロマ
トグラフのカラムに段階（１）で得られた生成物の装
填； ３）０から３ＭまでのＫＣｌの増加したイオン強度を有
している、アルカリ性ｐＨ溶液で汚染タンパク質とＦＳ
Ｈ又はＬＨを選択的に溶離する、配位子としてアントラ
キノン誘導体を有している親和力クロマトグラフのカラ
ムに、ＬＨ又はＦＳＨを含んでいる段階（２）で得られ
た溶出液の装填； ４）アルカリ性ｐＨで増加したイオン強度を持つ、０−
４００ｍＭＮａＣｌ溶液で汚染タンパク質とＦＳＨを選
択的に溶離する、強塩基性陰イオン樹脂を持つイオン交
換クロマトグラフのカラムに段階（３）で得られたＦＳ
Ｈの選択的装填；の諸段階より成っている上記工程。 - 【請求項２】 前記粗製ＨＭＧが閉経期又は閉経期後の
女性の尿から得られることを特徴とする、請求項１に記
載の工程。 - 【請求項３】 段階（１）において、前記粗製ＨＭＧが
１から４時間の間、２０℃から５℃の温度範囲で前記エ
タノール水溶液で処理されることを特徴とする、請求項
１に記載の工程。 - 【請求項４】 段階（２）において、前記弱塩基性陰イ
オン樹脂がＤＥＡＥセルロースであることを特徴とす
る、請求項１に記載の工程。 - 【請求項５】 段階（２）において、前記イオン交換ク
ロマトグラフのカラムが０℃から８℃迄の温度範囲で、
７．３−７．６のｐＨ値で、５−５０ｍＭ燐酸塩緩衝液
中の５−１５容量％エタノール水溶液で予め条件付けさ
れることを特徴とする、請求項１又は４に記載の工程。 - 【請求項６】 段階（２）において、前記ＬＨが０℃か
ら８℃迄の温度範囲で、ｐＨ７．３−７．６で、１０−
３０ｍＭ燐酸ナトリウムを含んでいる５−１５容量％エ
タノール水溶液を持つ前記カラムにより溶離されること
を特徴とする、請求項１、４及び／又は５に記載の工
程。 - 【請求項７】 段階（２）において、前記ＦＳＨが０℃
から８℃迄の温度範囲で、ｐＨ７．３−７．６で、１０
−３０ｍＭ燐酸ナトリウムと３０−５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含んでいる５−１５容量％エタノール水溶液を持
つ前記カラムにより溶離されることを特徴とする、請求
項１、４及び／又は５に記載の工程。 - 【請求項８】 段階（３）において、前記アントラキノ
ン誘導体がチバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌ
ｕｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の工
程。 - 【請求項９】 段階（３）において、前記親和力クロマ
トグラフのカラムがアガロースブルーであることを特徴
とする、請求項１と８に記載の工程。 - 【請求項１０】 段階（３）において、前記親和力クロ
マトグラフのカラムが５．５−７．５のｐＨで、１０−
３０ｍＭ酢酸塩緩衝液で予め条件付けされることを特徴
とする、請求項１、８及び／又は９に記載の工程。 - 【請求項１１】 段階（３）において、前記ＬＨ又はＦ
ＳＨが８．５から１１にｐＨ値を変えて、０から３Ｍま
での濃度範囲のＫＣｌを含んでいる、一つ又はそれ以上
の４０−６０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液で選択的に
溶離されることを特徴とする、請求項１、８、９及び／
又は１０に記載の工程。 - 【請求項１２】 段階（４）において、前記強塩基性陰
イオン樹脂がセルロース基質上に第４級アンモニウム類
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の工程。 - 【請求項１３】 段階（４）において、前記イオン交換
クロマトグラフのカラムが９．０−９．５のｐＨで、１
０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で予め条件付けされ
ることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の工程。 - 【請求項１４】 段階（４）において、前記汚染タンパ
ク質が９．０−９．５のｐＨで、４０−８０ｍＭのＮａ
Ｃｌを含んでいる１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
により溶離され且つ前記ＦＳＨがｐＨ９．０−９．５、
１０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中で、７０から４
００ｍＭ迄の濃度範囲のＮａＣｌ勾配を持つ汚染タンパ
ク質から選択的に溶離されることを特徴とする、請求項
１、１２及び／又は１３に記載の工程。 - 【請求項１５】 段階（３）又は（４）で得られたＦＳ
Ｈ又はＬＨが続いて凍結乾燥又は凍結され、且つ脱発熱
物質処理されることを特徴とする、請求項１から１４ま
での一つに記載の工程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000144417A JP2001323000A (ja) | 2000-05-17 | 2000-05-17 | Ｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）とｌｈ（黄体化ホルモン）の分離と精製工程 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000144417A JP2001323000A (ja) | 2000-05-17 | 2000-05-17 | Ｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）とｌｈ（黄体化ホルモン）の分離と精製工程 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001323000A true JP2001323000A (ja) | 2001-11-20 |
Family
ID=18651079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000144417A Pending JP2001323000A (ja) | 2000-05-17 | 2000-05-17 | Ｆｓｈ（卵胞刺激ホルモン）とｌｈ（黄体化ホルモン）の分離と精製工程 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001323000A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119727A1 (en) | 2008-05-16 | 2009-11-18 | JCR Pharmaceuticals CO., LTD. | Method for production of recombinant human FSH |
| WO2010111845A1 (zh) * | 2009-04-02 | 2010-10-07 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| CN102659853A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-12 | 济南圣泉唐和唐生物科技有限公司 | 一种利用层析柱纯化物质的方法 |
| US10537723B2 (en) | 2014-09-11 | 2020-01-21 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Microneedle device |
| US10632065B2 (en) | 2014-10-27 | 2020-04-28 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Microneedle device containing recombinant follicle stimulating hormone |
| CN111647586A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-09-11 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法 |
-
2000
- 2000-05-17 JP JP2000144417A patent/JP2001323000A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119727A1 (en) | 2008-05-16 | 2009-11-18 | JCR Pharmaceuticals CO., LTD. | Method for production of recombinant human FSH |
| US7939296B2 (en) | 2008-05-16 | 2011-05-10 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of recombinant human FSH |
| WO2010111845A1 (zh) * | 2009-04-02 | 2010-10-07 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| CN102659853A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-12 | 济南圣泉唐和唐生物科技有限公司 | 一种利用层析柱纯化物质的方法 |
| CN102659853B (zh) * | 2012-05-08 | 2014-10-08 | 济南圣泉唐和唐生物科技有限公司 | 一种利用层析柱纯化物质的方法 |
| US10537723B2 (en) | 2014-09-11 | 2020-01-21 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Microneedle device |
| US10632065B2 (en) | 2014-10-27 | 2020-04-28 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Microneedle device containing recombinant follicle stimulating hormone |
| CN111647586A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-09-11 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法 |
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