CN102659853B - 一种利用层析柱纯化物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用层析柱纯化物质技术领域，特别涉及一种利用层析柱纯化物质的方法，将洗脱液按照密度梯度进行洗脱。将岩藻糖苷化合物粗品使用密度为0.65的异己烷洗脱，将杂质1洗去；将洗脱液的密度从0.65开始增加，根据TLC点板情况调节密度，每次增加0.002，杂质点2由小变大，再由大至消失，将洗脱液密度变为0.678，根据TLC点板情况调节密度，每次增加0.002，直至产物点由小变大至消失，结束洗脱。过柱子过程中使用的洗脱液密度梯度很小，更精确，通过一次过柱子就可以得到纯的产物；方便配制洗脱液；并且对于回收的洗脱液，通过密度计测量的方法，回用即准确又方便简单；通过利用回收洗脱液，也减少了一笔开支。

Description

一种利用层析柱纯化物质的方法

技术领域

本发明涉及利用层析柱纯化物质技术领域，特别涉及一种利用层析柱纯化物质的方法。

背景技术

柱层析原理：柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。

硅胶柱层析流动相：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来。

在以往的时候，利用层析柱进行提纯某种产物，都是利用不同的溶剂按比例进行配合的混合溶剂，例如：提纯某种产品，使用乙酸乙酯与异己烷的混合溶剂，一般情况下先除去极性最小的杂质，首先利用乙酸乙酯：异己烷体积比为1:50，等到杂质出来，改用密度比为1:20，等到产物出来改用1:5，这样进行配比，不但会损失很多溶剂而且把1:50的配成1:20的混合溶剂时不仅计算麻烦而且往往不准确，通过配比得到的混合溶剂极性梯度的变化也比较大；并且由于溶剂的挥发造成的比例改变是不可预测的，导致溶剂的极性大小也不准确影响提纯的效果，而且采用溶剂比例配比过柱子的方法，一是大量溶剂配比时不精确，二是溶剂比例梯度相对来说较大，一般需要三次过柱子才能分离出较纯的产物。

发明内容

为了解决以上层析柱纯化物质中溶剂使用量大、纯化效率不高、产生的废混合溶剂不易处理的问题，本发明提供了一种利用混合溶剂的密度作为控制指标利用层析柱纯化物质的方法。

本发明是通过以下方式实现的：

一种利用层析柱纯化物质的方法，将洗脱液按照密度梯度进行洗脱。

一种利用层析柱纯化岩藻糖苷化合物的方法，包括以下步骤

（1）将岩藻糖苷化合物粗品溶液加入层析柱中，使用密度为0.65的异己烷洗脱，将杂质1洗去；

（2）将洗脱液的密度从0.65开始增加，每次增加0.002，密度改变后，如果TLC板上点板情况无变化，再次增大极性直到TLC点板有变化，使用此密度的洗脱液过柱，此时洗脱液的密度小于0.678，杂质点2由小变大，再由大至消失；

（3）杂质点2消失后，将洗脱液密度变为0.678，如果TLC板上点板情况无变化，再次增大极性直到TLC点板有变化，使用此密度的洗脱液过柱，每次增加0.002，直至产物点由小变大至消失，结束洗脱。

所述岩藻糖苷化合物为苄基化硫代吡喃岩藻糖苷，是通过以下步骤得到的：

a、将岩藻糖通过乙酰化方法合成制备出乙酰化岩藻糖；

b、乙酰化岩藻糖与溴化氢醋酸溶液反应，生产溴代乙酰化岩藻糖；

c、溴代乙酰化岩藻糖与硫脲反应，生成S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖；

d、S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖与溴乙烷、三乙胺反应得到硫代岩藻糖苷化合物；

e、硫代岩藻糖苷化合物在甲醇溶液中，加入甲醇钠脱保护得乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷；

f、乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷通过苄基化反应得到最终产物苄基化硫代吡喃岩藻糖苷。

本发明的提纯产方法，步骤是在产物过层析柱时，直接根据洗脱液密度大小来调节过柱子过程中使用的混合洗脱液溶剂极性大小，不同溶剂比例对应的密度也可以通过绘制出来的曲线很精确的找到，此测量方法更精确，而且每次回用的洗脱液也可以通过密度计再次调节密度重新使用。以往每次使用通过体积比来调节极性的方法误差较大，而且对于回用的洗脱液也很难知道精确的极性大小，因此无法回用，而且在过柱子时由于两次使用洗脱液的极性差距较小时通过体积比很难调节，因此通过此法过柱很难得到纯度高、产量多的产物，对于离产物点较近的杂质点很难分开，而且通常需要多次过柱才能得到较纯的产物。采用密度法能够非常精确的调节洗脱液很小极性的变化，可以精确到小数点后三位，对于较难分离的产物经过一次过柱子就可以分离出很纯的产物，此方法能够快速有效的分离产物。

本发明的有益效果：

（1）本方法利用密度的方法，过柱子过程中使用的洗脱液密度梯度很小，更精确，通过一次过柱子就可以得到纯的产物；

（2）每次过柱子只要测量洗脱液的密度就可大体知道洗脱液的组成，方便配制洗脱液；并且对于回收的洗脱液，通过密度计测量的方法，也可以通过加入其中一种溶剂调配成想要用到的一定极性的洗脱液，回用即准确又方便简单；

（3）通过利用回收洗脱液，也减少了一笔开支。

附图说明

附图1为岩藻糖苷类化合物粗产物的TLC点板，

附图2为不同比例混合的异己烷与乙酸乙酯混合溶剂的密度曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下面两种过柱子方法均以一种岩藻糖苷类化合物为例子来阐述具体的操作过程。

岩藻糖苷类化合物是通过如下步骤得到的：

1、将岩藻糖通过乙酰化方法合成制备出乙酰化岩藻糖；

2、乙酰化岩藻糖与溴化氢醋酸溶液反应，生产溴代乙酰化岩藻糖；

3、溴代乙酰化岩藻糖与硫脲反应，生成S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖；

4、S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖与溴乙烷、三乙胺反应得到硫代岩藻糖苷化合物；

5、硫代岩藻糖苷化合物在甲醇溶液中，加入甲醇钠脱保护得乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷；

6、乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷通过苄基化反应得到最终产物苄基化硫代吡喃岩藻糖苷。

前五步反应都不需要过柱子，只对最终粗产物进行过柱纯化，所以最终产物含有三个杂质点，本实施例即将除产物之外的其余三个杂质点通过过柱子的方法分离出去，最终得到纯的产物点。最终粗产物的TLC点板情况如图1所示。

实施例1

取200g岩藻糖苷最终粗产物，测其纯度为40%，进行层析柱提纯，采用改变洗脱液的密度来改变极性的大小，进行洗脱。

（1）刚开始使用密度为0.65的洗脱液来除去最上面的杂质1（图1中的杂质点1），得到杂质1质量为22g；

（2）接着稍微增加洗脱液的极性，呈梯度的大小增加，密度从0.65-0.678慢慢的增大极性，每次增加0.002，调整根据每次改变密度后，柱子流出物TLC点板情况来确定。如果调整极性后，TLC板上点板情况无变化，再次增大密度；如果调整密度后TLC点板与之前有变化，那么使用此密度的洗脱液过柱，每次极性变化都是根据TLC点板情况来决定的，整个过程中密度不能超过0.68，每次使用密度计测量；根据TLC点板时杂质点2的大小情况确定目前过柱的情况，不能很快的增加洗脱液的极性，等到杂质点2慢慢有小变大，再由大至消失后，此时可以将洗脱液密度变为0.678，杂质点2基本完全消失，而且此时也没有产物点出来的，即使有产物点也很模糊，可以忽略均认为是纯的杂质点2；约得到25g；

（3）杂质点2消失后，开始出产物，同样的从密度0.678-0.682成梯度的增大洗脱液的密度，不要立刻将溶剂极性增大至0.682，如果这样会导致极性变化较大，下杂质点很快就会出来，将洗脱液密度变为0.678，如果TLC板上点板情况无变化，再次增大极性直到TLC点板有变化，使用此密度的洗脱液过柱，每次增加0.002，直至产物点由小变大至消失，结束洗脱。

通过密度改变洗脱液极性的方法，产物更纯而且分离效果好，最终分离出较纯的产物约为80g，纯度92%。使用的洗脱液总量70kg，但是通过密度计测量后可以再继续回用。

对比实施例1

通过配制不同比例的溶剂来过柱分离一种糖化合物岩藻糖苷，取纯度为40%的 200g岩藻糖苷产物进行层析柱提纯。

1、 刚开始为了除去极性最小的杂质点1，使用50:1的异己烷与乙酸乙酯混合溶剂来过柱子，一般情况下由于杂质点1与产物点的极性差距较大，很容易分离开，分出纯的杂质点1，质量为23g；

2、 然后再使用30:1的异己烷与乙酸乙酯混合溶剂来分离杂质点2，刚开始不会有产物点出来，大约30min后，杂质点2还很浓，通过TLC点板就可以看到有产物点出来，慢慢的产物点变浓，杂质点2变淡，最后消失，此过程得到杂质点2质量为18g；

3、 第2步骤之后开始出纯的产物点，改用20:1的混合溶剂，一段时间后开始有下杂质出现，得到纯的产物点30g，HPLC测试产物纯度为90%；

下杂质点浓度较大时改用比例为15:1的混合溶剂，产物点消失后改用10:1或更高极性的溶剂将柱子过完。因为每次比例相差较小时很难控制精确，所以所用洗脱液会较多，洗脱液总量约为100kg左右。

通过上述过柱子的情况我们可以看出，实际得到30g较纯的产物，但是分离出的量不是很高，虽然溶剂的配比变化较小，但是溶剂的极性变化梯度还是较大，导致产物纯点与杂质点一起出来，使很多产物纯度不合格，需要将两种有杂质的混合物再次过层析柱分离产物。总计经过三次层析柱纯化后，共得到纯产物71g，纯度分别是90%-91%。

与对比实施例一相比，实施例一不仅方法简单易控，并且通过使极性梯度变密的方法使产物纯度提高，并且产物得率也提高了，洗脱液的使用量也减少了，以分离200g粗产物为例，采用对比实施例一的方法需要多次过柱才能分离出产物，每次需要的溶剂量约100kg，因此总用量约为100*3kg，以三次全部过出纯产物为例；采用实施例1的方法，通过使用密度梯度过柱的方法，一次就可以过出较纯的产物，而且溶剂也可以很溶剂的回收利用，大约需要的溶剂量为70kg，降低了成本和能耗。

Claims (2)

1.一种利用层析柱纯化岩藻糖苷化合物的方法，其特征是包括以下步骤

（1）将岩藻糖苷化合物粗品溶液加入层析柱中，使用密度为0.65的异己烷洗脱，将杂质1洗去；

（2）将洗脱液的密度从0.65开始增加，每次增加0.002，密度改变后，如果TLC板上点板情况无变化，再次增大极性直到TLC点板有变化，使用此密度的洗脱液过柱，此时洗脱液的密度小于0.678，杂质点2由小变大，再由大至消失；

（3）杂质点2消失后，将洗脱液密度变为0.678，如果TLC板上点板情况无变化，再次增大极性直到TLC点板有变化，使用此密度的洗脱液过柱，每次增加0.002，直至产物点由小变大至消失，结束洗脱；

所述步骤（2）、（3）中的洗脱液为异己烷与乙酸乙酯的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述岩藻糖苷化合物为苄基化硫代吡喃岩藻糖苷，是通过以下步骤得到的：

a、将岩藻糖通过乙酰化方法合成制备出乙酰化岩藻糖；

b、乙酰化岩藻糖与溴化氢醋酸溶液反应，生产溴代乙酰化岩藻糖；

c、溴代乙酰化岩藻糖与硫脲反应，生成S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖；

d、S-糖基异硫脲溴代乙酰化岩藻糖与溴乙烷、三乙胺反应得到硫代岩藻糖苷化合物；

e、硫代岩藻糖苷化合物在甲醇溶液中，加入甲醇钠脱保护得乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷；

f、乙酰化硫代吡喃岩藻糖苷通过苄基化反应得到最终产物苄基化硫代吡喃岩藻糖苷。