发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种提取方法科学、提取物中异长春花苷内酰含量高的胆木提取物。本发明还提供了上述胆木提取物的制剂。本发明还提供了上述胆木提取物的医药用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种胆木提取物,其特点是,其提取步骤如下,一种胆木提取物,其特征在于,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至8~4,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至8~4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入2~4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入3~5倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入1~5倍量PH为8~3的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%~35%醇水混合溶液梯度洗脱,再以40%~70%乙醇洗脱,收集40%~70%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,在步骤(1)、(2)中所述的醇水混合液为乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇与水混合而成的溶液;步骤(1)中所述的有机溶剂为丙酮、正丁醇、乙醇或者甲醇;所述的提取方式为回流提取、浸渍提取或者超声提取或者渗漉提取;所述的碱性溶液为0.1mol/L~5mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液;所述的酸性溶液为0.01mol/L~5mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液;
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,步骤(2)中所述的大孔树脂为弱极性或者中等极性的大孔树脂,优选的树脂有HPD100、HPD200、AB-8、D101、D201;步骤(2)中所述5%~35%醇水混合溶液梯度洗脱为,每隔5%~15%为一个浓度梯度,以2~4个梯度浓度进行洗脱。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,步骤(3)中所述的有机溶剂为丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种或者两种的混合液,所述的醇水混合物为乙醇与水混合溶液或者丙二醇与水的混合溶液。
以下是本发明的另一个优选技术方案。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制,
(1)取干燥胆木提取物,以有机溶剂溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(2)取步骤(1)所得干燥物上层析柱,层析柱采用湿法装柱,层析时采用混合有机相梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(1)、(2)、(3)或者重复步骤(3),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
在上述技术方案的步骤(4)中,“重复步骤(1)、(2)、(3)”是指:取步骤(3)所得的胆木提取物,以有机溶剂溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;所得干燥物上层析柱,层析柱采用湿法装柱,层析时采用混合有机相梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物。“重复步骤(3)”是指:取步骤(3)所得的胆木提取物以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取步骤(3)所得的胆木提取物以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取步骤(3)所得的胆木提取物以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,步骤(1)中所述的有机溶剂为甲醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或者丙二醇;步骤(3)中所述的有机溶剂为丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种或者两种的混合液,所述的醇水混合物为乙醇与水混合溶液或者丙二醇与水的混合溶液。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,步骤(2)中所述的湿法装柱为氯仿湿法装柱或者二氯甲烷湿法装柱;所述的混合有机相梯度洗脱时所使用的混合有机相为:氯仿、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液,或者正己烷、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液,或者二氯甲烷、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液,所述的剃度洗脱是通过调整混合溶液中的不同有机试剂的比例,使混合溶液中的极性成梯度提高。洗脱时,采用2~6个梯度进行洗脱。
以下是本发明是另一种优选技术方案。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木提取物,其特点是,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用40%~85%乙醇回流提取2~4次,提取液每次用量6~12倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到3~20倍量1mol/L~4mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用1mol/L~5mol/L的HCL调节PH至8~4,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至8~4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取2~3次,每次水用量6~12倍,或者0.1mol/L~5mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取2~3次,每次碱性水溶液用量6~12倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,1mol/L~5mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.1~1.35,取浓缩液加入2~4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.1~1.35,得浓缩液A;取浓缩液A加入3~5倍乙醇再醇沉1~2次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入2~3倍量PH为8~5的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以AB-8大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%~35%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为5~15个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以40%~70%乙醇洗脱,洗脱体积为8~20个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%~30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以5%~30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9~5∶1~5)梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5~7∶0.5~3)梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9~7∶1~3)或者乙酸乙酯-丙酮(7~5∶3~5)或者二氯甲烷-丙酮(5~0.5∶5~9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%~30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以5%~30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
在上述技术方案中,步骤(1)中所述碱性溶液优选0.1mol/L~5mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液;所述的酸性溶液优选0.01mol/L~5mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液。步骤(2)中所述5%~35%乙醇梯度洗脱优选为,每隔5%~15%为一个浓度梯度,以2~4个梯度浓度进行洗脱。步骤(3)、(7)中所述醇水混合溶液优选乙醇与水混合溶液或者丙二醇与水的混合溶液。步骤(6)所述的剃度洗脱优选为通过调整混合溶液中的不同有机试剂的比例,使混合溶液中的极性成梯度提高;洗脱时,采用2~6个梯度进行洗脱。步骤(8)中所述的“重复步骤(5)、(6)、(7)”是指:取步骤(7)所得胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9~5∶1~5)梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5~7∶0.5~3)梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9~7∶1~3)或者乙酸乙酯-丙酮(7~5∶3~5)或者二氯甲烷-丙酮(5~0.5∶5~9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%~30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以5%~30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物。“重复步骤(7)”是指:取步骤(7)所得胆木提取物以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取步骤(7)所得胆木提取物以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%~30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取步骤(7)所得胆木提取物以5%~30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种胆木提取物制剂,其特点是,它取上述任何一技术方案中所述的胆木提取物,加入药学上可以接受的药物载体,制成临床上可接受的任何一种剂型的药剂。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了一种胆木提取物制剂,其特点是,取以上任何一项技术方案所述的胆木提取物加入药学上可以接受的药物载体,制成临床上可接受的任何一种剂型的药剂。包括片剂、颗粒剂、胶囊、软胶囊、注射剂、口服液等。优选注射剂,制备胆木提取物注射剂时,所用的助溶剂为碱性物质或者醇类物质,选自氢氧化钠、氢氧化钾、精氨酸、赖氨酸、葡甲胺、尿素、乙酰胺、硫脲、苯甲酰胺、乙醇、丙二醇或者甘露醇。
本发明中所述的胆木提取物作为有效成份可以用来制备抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热的药物。本发明中所述胆木提取物制剂具有抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热作用。
以下是发明人所做的本发明胆木提取物的药理毒理研究的试验资料。
(一)药效学研究
1、体外抗菌作用
精密定量称取胆木提取物(含异长春花苷内酰胺95.3%,以下简称IVL),用无菌水配制成50mg/ml的溶液。然后将配制的药液分别用适量无菌水进行倍比稀释,使各药液成一系列浓度梯度,依次是:50,25,12.5,6.25,3.13,1.57,0.79,0.40,0.20,0.10(mg/ml)。然后取各梯度药液2ml,分别加入到无菌平皿(平皿直径9cm)中,再加入已灭菌融化的保温于55℃水浴中的MH培养基18ml,立即充分混匀,冷凝后待用。这样,各含药平板中药物的最终浓度依次为:5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.157,0.079,0.04,0.02,0.01(mg/ml)。同时设空白对照,只加入20ml的琼脂培养基。将已预先活化的各试验菌株分别接种到2ml培养液中,37℃培养过夜,再用相应的培养液作适当的稀释,使菌液浓度约为:107~108(CFU/ml)(控制菌液浓度方法:用分光光度计测定培养液的光密度,然后作适当的稀释)。然后用多点接种仪点种各试验菌于各含药的MH培养基平板上,空白对照同时进行。每点含菌量约为:104~105(CFU)。37℃,培养24小时,观察并记录各菌的最低抑菌浓度MIC值,并计算MIC50和MIC90。体外抗菌试验结果表明:IVL对各试验菌株(除绿脓杆菌外)均具有一定的抗菌活性。结果见表1。
表1IVL体外对致病性细菌的MIC值的测定(MIC:mg/ml)
2.体内抗菌作用
2.1对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用
菌液制备:取临床分离金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤培养基中,置37℃孵箱培养18h。取出,划线于血平板上(10%羊红细胞营养琼脂平板),37℃孵箱培养20h。取出,用6ml 5%的胃膜素(PH 7.2)洗脱菌落,并用4ml生理盐水溶液将血平板冲洗干净,合并后吹打,使菌落分散并分别用生理盐水配成0.33ml/ml、0.20ml/ml、0.11ml/ml、0.06ml/ml浓度菌液备用。选择合适的菌液浓度:取ICR小鼠40只,♀♂各半,体重18~22g。随机分组,每组1个浓度,腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液,每鼠0.5ml,观察感染小鼠死亡数,结果感染小鼠死亡率分别为100%、100%、90%、40%。故实验选用0.11ml/ml浓度菌液。
正式试验:取18~22g ICR小鼠133只,随机分组,每组19只,♀♂兼用。
(1)正常对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;3)双黄连组:10ml/kg;(4)林可霉素组:0.3g/kg;(5)IVL I组:0.075g/kg;(6)IVL II组0.15g/kg;(7)IVLIII组0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,给药容量10ml/kg,1次/天×5天。第3天给药后1h,除空白对照组以外,其余各组均腹腔注射金黄色葡萄球菌培养液0.5ml/鼠(菌液浓度0.11ml/ml)。然后继续给药2天。观察各组动物7日内死亡情况。实验结果显示:IVL对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。见表2。
表2IVL对金黄色葡萄球菌感染小数死亡的保护作用
##p<0.01与正常对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
2.2对肺炎双球菌感染小鼠的保护作用
菌液制备:取临床分离肺炎双球菌接种入营养肉汤培养基中,置37℃孵箱培养18h。取出,划线于血平板上(1%羊红细胞营养琼脂平板),37℃孵箱培养24h,取出。用6ml 5%的胃膜素(PH 7.2)洗脱菌落,并用4ml生理盐水溶液将血平板冲洗干净,合并后吹打,使菌落分散。用生理盐水配成1ml/ml、0.5ml/ml、0.33ml/ml、0.25ml/ml浓度菌液备用。选择合适的菌液浓度:取ICR小鼠40只,♀
各半,体重18~22g随机分组,每组1个浓度,腹腔注射肺炎双球菌菌液0.5ml/鼠,观察感染小鼠死亡数,结果感染小鼠死亡率分别为100.0%,100.0%,60.0%,30.0%。故实验选用0.45ml/ml浓度菌液(小鼠死亡率估计80~90%之间)。
取18~22g ICR小鼠133只随机分组,每组19只,♀
兼用。(1)正常对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;3)双黄连组:10ml/kg;(4)林可霉素组:0.3g/kg;(5)IVL I组:0.075g/kg;(6)IVL II组0.15g/kg;(7)IVLIII组0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,给药容量10ml/kg,1次/天×5天。第3天给药1小时后,除正常对照组外,其余各组均腹腔注射肺炎双球菌培养液0.5ml/鼠(菌液浓度0.45ml/ml)。然后继续给药2天。观察各组动物7日内死亡情况。实验结果显示:IVL对肺炎双球菌感染小鼠具有保护作用。见表3。
表3IVL对肺炎双球菌感染小鼠死亡的保护作用
##p<0.01与正常对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
3、体外抗病毒作用
IVL对甲型流感病毒和乙型流感病毒致细胞病变的抑制作用
在长成单层细胞的MDCK培养板中,每孔感染甲型流感病毒或乙型流感病毒100TCID50。吸附1h后倾去病毒液,分别加入不同浓度的IVL药液,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞病变。同时设细胞对照组,利巴韦林组(10mg/ml)和病毒对照组。实验结果显示:IVL能够抑制甲型流感病毒对MDCK细胞的毒性作用;也能够抑制乙型流感病毒对MDCK细胞的毒性作用。表明IVL具有体外抗甲型和乙型流感病毒的作用。见表4-5。
表4IVL对甲型流感病毒的抑制作用
注:-无细胞病变;+25%细胞病变;++50%细胞病变;+++75%细胞病变;++++100%细胞病变。
表5IVL对乙型流感病毒的抑制作用
注:-无细胞病变;+25%细胞病变;++50%细胞病变;+++75%细胞病变;++++100%细胞病变。
4、体内抗病毒作用
4.1对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
取ICR小鼠114只,体重13~16g,
♀各半,随机分为6组,每组19只。
(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)利巴韦林组:0.5g/kg;(4)IVL I组:0.075g/kg;(5)IVL II组:0.15g/kg;(6)IVLIII组:0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,给药容量10ml/kg,1次/天×5天。给药1h后除空白对照组外,其余各组在乙醚浅麻醉下,以血凝试验640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染,每鼠30μl(20个LD50致死量),观察14天内动物感染后发病及死亡情况。实验结果显示:IVL可明显延长甲型流感病毒感染小鼠的存活天数,显著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡数。表明IVL对甲型流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。见表6。
表6IVL对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
##p<0.01与空白对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
4.2对甲型流感病毒感染小鼠肺病变的影响
取ICR小鼠114只,体重13~16g,♂♀兼用。随机分6组,每组19只。
(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)利巴韦林组:0.5g/kg;(4)IVL I组:0.075g/kg;(5)IVL II组:0.15g/kg;(6)IVLIII组:0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,给药容量10ml/kg,1次/天×5天。除空白对照组外,其余各组于给药第1天,在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠,每鼠30μl(15个LD50攻击量)。然后继续给药4天。末次给药后将小鼠禁食(不禁水),次日进行下列实验:取肺,用1%甲醛溶液固定后,常规取材,脱水,石蜡包埋,制片,HE染色后作病理组织学检查,观察肺部病变程度。实验结果如下见表7。
表7对甲型流感病毒感染小鼠肺病变的影响
##p<0.01与空白对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
注:1.病变积分根据病变程度不同,依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。“-”为无明显改变,记为0分;“+”为轻度病变改变,记为1分;“++”为中度病理改变,记为2分;“+++”为重度病理改变,记为3分;“++++”为极重度病理改变,记为4分。积分值越高,表示病变程度越重。2.统计采用秩和检验。
上述结果显示:IVL能减轻甲型流感病毒所致小鼠的肺部感染,具有抗甲型流感病毒的作用。
4.3对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
取ICR小鼠114只,体重13~16g,
♀兼用,随机分为6组,每组19只。
(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)利巴韦林组:0.5g/kg;(4)IVL I组:0.075g/kg;(5)IVL II组:0.15g/kg;(6)IVLIII组:0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,给药容量10ml/kg,1次/天×5天。给药1h后除空白对照组外,其余各组在乙醚浅麻醉下,以血凝试验640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染,每鼠40μl(20个LD50致死量),观察14天内动物感染后发病及死亡情况。实验结果显示IVL可明显延长乙型流感病毒感染小鼠的存活天数,也可降低甲型流感病毒感染小鼠死亡数。表明IVL对甲型流感病毒感染小鼠具有一定的保护作用。见表8。
表8IVL对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
##p<0.01与正常对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
4.4对乙型流感病毒感染小鼠肺病变的影响
取ICR小鼠72只,体重13~16g,
♀各半。随机分6组,每组12只。(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)利巴韦林组:0.5g/kg;(4)IVL I组:0.075g/kg;(5)IVL II组:0.15g/kg;(6)IVLIII组:0.3g/kg。以上各组小鼠均灌胃给药,1次/天×5天。除空白对照组外,其余各组于给药第1天,在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠,每鼠30μl(20个LD
50攻击量)。然后继续给药4天。末次给药后将小鼠禁食(不禁水),次日进行下列实验:取肺,用1%甲醛溶液固定后,常规取材,脱水,石蜡包埋,制片,HE染色后作病理组织学检查,观察肺部病变程度。实验结果如下见表9。
表9对乙型流感病毒感染小鼠肺病变的影响
#p<0.01与正常对照组比较;*p<0.05 **p<0.01与模型组比较
注:1.病变积分根据病变程度不同,依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。“-”为无明显改变,记为0分;“+”为轻度病变改变,记为1分;“++”为中度病理改变,记为2分;“+++”为重度病理改变,记为3分;“++++”为极重度病理改变,记为4分。积分值越高,表示病变程度越重。2.统计采用秩和检验。
上述结果显示:IVL能减轻乙型流感病毒所致小鼠的肺部感染,具有抗乙型流感病毒的作用。
5、抗炎镇痛作用
5.1对小鼠耳廓肿胀的影响
取正常ICR小鼠50只,体重25~30g,雄性。随机分为5组,每组10只小鼠,即正常对照组、乙酰水杨酸组(0.11g/kg)和IVL低、中、高剂量组(0.075g/kg、0.15g/kg、0.3g/kg),分别灌胃给予相应药物(正常对照组灌胃给予等容积蒸馏水),每日一次,连续5日。第5日给药40min后,用2%巴豆油0.05ml涂于小鼠左耳前后两面,在致炎4h后处死小鼠,沿耳廓基线剪下左右两耳,用打孔器(直径9mm)分别在同一部位取下圆耳片,电子天平称重,以小鼠左右耳壳重量之差值作为耳壳肿胀度,并计算肿胀百分率。
IVL高剂量组能减轻巴豆油致小鼠耳肿胀度,降低肿胀率,与正常对照组相比有显著性差异(p<0.05,p<0.01)。表明IVL具有抗炎作用,结果见表10。
表10IVL对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(X±S)
注:与正常对照组相比,*p<0.05,**p<0.01。
5.2对乙酸腹腔刺激致小鼠疼痛反应的影响
取正常ICR小鼠100,体重25~30g。随机分为5组,每组20只小鼠,即正常对照组、乙酰水杨酸组(0.11g/kg)和IVL低、中、高剂量组(0.038mg/kg、0.075mg/kg、0.15g/kg),分别灌胃给予相应药物(正常对照组灌胃给予等容积蒸馏水),每日一次,连续5日。在最后一次给药后0.5h,各组小鼠腹腔注射0.6%乙酸0.2ml/只,观察注射乙酸后15min内各组小鼠出现的扭体反应动物数和扭体反应次数。IVL各剂量组均能减少小鼠扭体次数,与正常对照组相比有显著性差异(p<0.05,p<0.01)。表明IVL具有镇痛作用,结果见表11。
表11IVL对乙酸腹腔刺激致小鼠疼痛反应的影响(X±S)
注:与正常对照组相比,*p<0.05,**p<0.01。
6、抗过敏作用
分组给药:取SD大鼠50只,体重150~200g,随机分5组,每组10只。即正常对照组、扑尔敏组(2mg/kg)和IVL低、中、高剂量组(0.038mg/kg、0.075mg/kg、0.15g/kg)。分别灌胃给予相应药物(正常对照组灌胃给予等容积蒸馏水),每日一次,连续7日。
抗血清制备:另取取SD大鼠6只,体重200~220g,腹腔注射百日咳混合疫菌1ml/只,再将卵蛋白生理盐水溶液按10mg/kg肌内注射后腿两侧,隔日致敏一次,共4次。末次致敏12天后,腹腔注射0.2%戊巴比妥钠(20mg/kg)浅麻醉后,固定。分离颈动脉取血,分离血清于-20℃保存备用。
正式实验:以上各组大鼠在给药第5日,均在背中线两侧,距脊柱1.5cm处剪毛,每侧2点间隔2cm,分别取抗血清用生理盐水按照1∶10稀释,皮内注射剪毛各点,每点注射0.1ml,致敏48h后尾静脉注射0.5%伊文思兰溶液1ml,内含卵蛋白1mg。20min后断头处死动物,剪下背部皮肤,检查注射各点的蓝色反应斑直径,比较各组间的差异。IVL中、高剂量组均能降低蓝斑直径,与正常对照组相比有显著性差异(p<0.01)。表明IVL具有抗过敏作用,结果见表12。
表12IVL对大鼠被动皮肤过敏蓝斑直径的影响(X±S)
注:与正常对照组相比,**p<0.01。
综上所述,IVL灌胃给药具有一定的抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、抗过敏等药理作用。
具体实施方式
实施例1。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至8,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至8,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入2倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入3倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入1倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、30%醇水混合溶液梯度洗脱,再以40%乙醇洗脱,收集40%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例2。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入5倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入5倍量PH为3的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以15%、20%、30%醇水混合溶液梯度洗脱,再以70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例3。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入3倍量PH为5的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以20%、35%醇水混合溶液梯度洗脱,再以55%乙醇洗脱,收集55%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例4。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至8,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至8,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入2倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入3倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入1倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、10%、20%、30%醇水混合溶液梯度洗脱,再以40%乙醇洗脱,收集40%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量;当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制,
(5)取干燥胆木提取物,以有机溶剂溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用湿法装柱,层析时采用混合有机相梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取步骤(6)所得黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例5。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用醇水混合溶液或者有机溶剂提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收醇水混合溶液或者有机溶剂;然后加至水或者碱性溶液中,搅拌,静置,再以酸性溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者碱性水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以酸性溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入5倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入5倍量PH为3的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以15%、30%醇水混合溶液梯度洗脱,再以70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量;当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以有机溶剂溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用湿法装柱,层析时采用混合有机相梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取步骤(6)所得的黄色固体物质以有机溶剂溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以有机溶剂溶解,再加入醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以醇水混合物溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例6。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用乙醇水溶液回流提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇水溶液;然后加至水中,搅拌,静置,再以0.01mol/L的盐酸溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至0.1mol/L的氧氧化钠溶液中,搅拌溶解,静置,再以0.01mol/L的盐酸溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取,提取液冷藏过夜,滤过,以0.01mol/L的盐酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入2倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入3倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入1倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、25%醇水混合溶液梯度洗脱,再以40%乙醇洗脱,收集40%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以丙酮溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮溶解,再加入乙醇水溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇水溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例7。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用甲醇水溶液浸渍提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收甲醇水溶液;然后加至0.1mol/L氢氧化钠溶液中,搅拌,静置,再以0.05mol/L硫酸溶液调节PH至5,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至0.5mol/L氢氧化钙溶液中,搅拌溶解,静置,再以0.05mol/L硫酸溶液调节PH至5,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用0.1mol/L氢氧化钠溶液浸渍提取,提取液冷藏过夜,滤过,以0.05mol/L硫酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入5倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入5倍量PH为3的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、30%甲醇水溶液梯度洗脱,再以70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以正丁醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以正丁醇溶解,再加入丙二醇水溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙二醇水溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例8。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用丙二醇水溶液渗漉提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收丙二醇水溶液;然后加至1.0mol/L氧氧化钙溶液或氨水溶液中,搅拌,静置,再以0.1mol/L的醋酸溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至1.0mol/L~的氨水溶液或乙二胺溶液中,搅拌溶解,静置,再以0.1mol/L的醋酸溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用0.5mol/L的氢氧化钙溶液或氨水溶液渗漉提取,提取液冷藏过夜,滤过,以0.1mol/L醋酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入2倍量PH为4的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、35%甘露醇溶液梯度洗脱,再以50%乙醇洗脱,收集50%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙酸乙酯溶解,再加入乙醇溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例9。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用丙酮或正丁醇提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收丙酮或正丁醇;然后加至水或者5mol/L的氢氧化钙溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌,静置,再以5mol/L的磷酸溶液或者柠檬酸溶液)调节PH至8,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至5mol/L的乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌溶解,静置,再以5mol/L的磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至8,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用5mol/L的乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以5mol/L的磷酸溶液或者柠檬酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入3倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以10%、20%、30%丙二醇溶液梯度洗脱,再以60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,再加入丙二醇溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙二醇溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得。
实施例10。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇与水混合而成的溶液回流提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇与水混合而成的溶液;然后加至水中,搅拌,静置,再以1mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至7,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至1mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌溶解,静置,再以1mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至7,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取,提取液冷藏过夜,滤过,以1mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入4倍量PH为6的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、25%、35%的乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇梯度洗脱,再以45%乙醇洗脱,收集45%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中的一种溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,再加入乙醇与水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇与水混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得;当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以甲醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或者丙二醇溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用氯仿湿法装柱,层析时采用氯仿、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取步骤(6)所得黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,再加入丙二醇与水的混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙二醇与水的混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例11。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用丙酮、正丁醇、乙醇或者甲醇渗漉提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回丙酮、正丁醇、乙醇或者甲醇;然后加至2mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌,静置,再以2mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至2mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌溶解,静置,再以2mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用2mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以2mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入5倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入1倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以浓度为20%、35%的乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇梯度洗脱,再以55%乙醇洗脱,收集55%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,再加入乙醇与水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇与水混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得;当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以甲醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或者丙二醇溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱,层析时采用正己烷、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取步骤(6)所得黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中任意两种的混合液溶解,再加入丙二醇与水的混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙二醇与水的混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例12。一种胆木提取物,其提取步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇与水混合而成的溶液提取,合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇与水混合而成的溶液;然后加至水或者4mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌,静置,再以4mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液)调节PH至7,冷藏,静置,过滤,滤液另置,取沉淀再加至4mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液中,搅拌溶解,静置,再以4mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与前另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水或者4mol/L的氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙二胺溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、氢氧化钾溶液或者其它不为树脂吸附的碱性物质的水溶液提取,提取液冷藏过夜,滤过,以4mol/L盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液或者柠檬酸溶液调PH至中性,过滤,滤液浓缩,加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液A;浓缩液A加入3倍乙醇再醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入5倍量PH为4的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以浓度为20%、25%乙醇、甲醇、丙二醇或者甘露醇梯度洗脱,再以40%乙醇洗脱,收集40%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,再加入丙二醇与水的混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙二醇与水的混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,即得;当检测胆木提取物中异长春花苷内酰胺的含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以甲醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或者丙二醇溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用湿法装柱,层析时采用二氯甲烷、甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的两种或者三种有机试剂的混合溶液梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取步骤(6)所得黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中一种溶解,再加入乙醇与水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇与水混合溶液溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例13。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用40%乙醇回流提取4次,提取液每次用量12倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到3倍量4mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用1mol/L的HCL调节PH至4,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至4,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取2次,每次水用量12倍,或者0.1mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取2次,每次碱性水溶液用量12倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,1mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.1,取浓缩液加入2倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.1,得浓缩液A;取浓缩液A加入3倍乙醇再醇沉1次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入2倍量PH为8的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以AB-8大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、15%、30%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为5个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以40%乙醇洗脱,洗脱体积为8个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以5%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9∶1)、(8∶2)、(7.5∶2.5)3个梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5∶0.5)、(7∶3)两个梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9∶1)、(7∶3或者乙酸乙酯-丙酮(7∶3)、(5∶5)或者二氯甲烷-丙酮(5∶5)、(0.5∶9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入5%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以5%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例14。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用85%乙醇回流提取2次,提取液每次用量6倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到20倍量1mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用5mol/L的HCL调节PH至7,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至7,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取3次,每次水用量6倍,或者5mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取3次,每次碱性水溶液用量6倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,5mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.35,取浓缩液加入4倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.35,得浓缩液A;取浓缩液A加入5倍乙醇再醇沉2次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入3倍量PH为5的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以HPD100大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以25%、30%醇水混合溶液乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为15个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以70%乙醇洗脱,洗脱体积为20个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9∶1)、(8∶2)、(7∶3)、(5∶5)梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5∶0.5)、(7∶3)梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9∶1)、(8∶2)或者乙酸乙酯-丙酮(7∶3)、(5∶5)或者二氯甲烷-丙酮(5∶5)、(4.5∶5.5)、(4∶6)、(3.5∶6.5)、(3∶7)、(0.5∶9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入30%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以30%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例15。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用60%乙醇回流提取3次,提取液每次用量8倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到10倍量2mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用2mol/L的HCL调节PH至5,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至5,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取2次,每次水用量8倍,或者2mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取2次,每次碱性水溶液用量8倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,2mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.2,取浓缩液加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.1~1.35,得浓缩液A;取浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉1次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入2倍量PH为6的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以HPD200大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、20%、30%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为10个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以60%乙醇洗脱,洗脱体积为15个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入20%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以20%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9∶1)、(7∶3)、(5∶5)梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5∶0.5)、(9∶1)、(8.5∶1.5)、(8∶2)、(7∶3)梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9∶1)、(8∶2)、(7∶3)或者乙酸乙酯-丙酮(7∶3)、(5∶5)或者二氯甲烷-丙酮(5∶5)、(4∶6)、(2∶8)、(0.5∶9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入20%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以20%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例16。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用70%乙醇回流提取3次,提取液每次用量10倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到15倍量3mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用3mol/L的HCL调节PH至6,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取3次,每次水用量102倍,或者3mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取3次,每次碱性水溶液用量10倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,3mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.15,取浓缩液加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.15,得浓缩液A;取浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉2次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入3倍量PH为7的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以D101大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、10%、20%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为10个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以55%乙醇洗脱,洗脱体积为10个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入10%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以10%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9∶1)、(8∶2)、(7∶3)、(5∶5)梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5∶0.5)、(7∶3)梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9∶1)、(8∶2)、(7∶3)或者乙酸乙酯-丙酮(7∶3)(5∶5)或者二氯甲烷-丙酮(5∶5)、(4∶6)、(3.5∶6.5)、(1.5∶8.5)、(0.5∶9.5)梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入10%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以10%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例17。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用45%乙醇回流提取2次,提取液每次用量9倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到5倍量2mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用4mol/L的HCL调节PH至6,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液中,搅拌溶解,静置,再以酸性溶液调节PH至6,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取2次,每次水用量9倍,或者1mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取2次,每次碱性水溶液用量9倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,4mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.25,取浓缩液加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.25,得浓缩液A;取浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉1次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入3倍量PH为6的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以D201大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以5%、10%、15%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为15个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以40%乙醇洗脱,洗脱体积为10个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入25%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以25%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9~5∶1~5)分3个梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5~7∶0.5~3)分3个梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9~7∶1~3)分3个梯度或者乙酸乙酯-丙酮(7~5∶3~5)分2个梯度或者二氯甲烷-丙酮(5~0.5∶5~9.5)分3个梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入25%醇水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以25%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例18。一种胆木提取物,其步骤如下,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用55%乙醇回流提取3次,提取液每次用量7倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,回收乙醇;然后加入到8倍量1.5mol/L的氢氧化钠溶液中,搅拌,冷藏,用2.5mol/L的HCL调节PH至5,冷藏,过滤,滤液另置,取沉淀再加至碱性溶液氢氧化钠溶液中,搅拌溶解,静置,再以HCL溶液调节PH至5,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,滤液与另置滤液合并;即得粗提取物溶液;
或者,
(1)取茜草科乌檀属胆木片状心材、枝、干、皮或者叶,干燥,粉碎,用水回流提取2次,每次水用量7倍,或者0.5mol/L氢氧化钙水溶液回流提取或者浸渍提取2次,每次碱性水溶液用量7倍;合并提取液,冷藏过夜,滤过,1.5mol/L的HCL调节PH至中性,过滤,滤液浓缩至相对密度1.20,取浓缩液加入3倍乙醇进行醇沉,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩至相对密度1.20,得浓缩液A;取浓缩液A加入4倍乙醇再醇沉1次,混匀,静置冷藏,过滤,回收乙醇,浓缩,得浓缩液B;取浓缩液A或浓缩液B,加入2倍量PH为5的水溶液,混匀,冷藏,静置,过滤,弃去滤渣,即得粗提取物溶液;
(2)取粗提取物溶液以HPD100大孔树脂吸附,弃流出液,再以水洗脱,再以20%、30%乙醇梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为5个大孔树脂柱/床体积,弃去洗脱液;再以70%乙醇洗脱,洗脱体积为20个大孔树脂柱/床体积,收集洗脱液,浓缩,干燥,得黄色固体物质;
(3)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入15%丙二醇与水或者乙醇与水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以15%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(4)取步骤(3)所得的胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,按照以下步骤进行精制;
(5)取干燥胆木提取物,以无水乙醇或者丙酮溶解,过滤,取滤液浓缩,加入硅胶,拌匀,低温干燥;
(6)取步骤(5)所得干燥物上层析柱,层析柱采用二氯甲烷湿法装柱;层析时先采用二氯甲烷-丙酮(9~5∶1~5)分4个梯度洗脱,或者乙酸乙酯-丙酮(9.5~7∶0.5~3)分4个梯度洗脱,再采用二氯甲烷-甲醇(9~7∶1~3)分3个梯度或者乙酸乙酯-丙酮(7~5∶3~5)分4个梯度或者二氯甲烷-丙酮(5~0.5:5~9.5)分3个梯度洗脱,分次收集洗脱液,采用薄层色谱检测,合并主斑点为异长春花苷内酰胺的洗脱液,回收洗脱液,得黄色固体物质;
(7)取黄色固体物质以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或者乙醇溶解,浓缩,静置,冷藏,重结晶,即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以乙醇或者丙酮溶解,再加入15%丙二醇与水或者乙醇与水混合溶液,浓缩,过滤,静置,得析出物,干燥即得胆木提取物;或者取黄色固体物质以15%乙醇溶解,过滤,浓缩,过滤至滤液澄清,滤液静置放冷,收集析出物,干燥即得胆木提取物;
(8)取步骤(7)所得胆木提取物,检测异长春花苷内酰胺含量,当异长春花苷内酰胺含量低于90.0%时,重复步骤(5)、(6)、(7)或者重复步骤(7),直到胆木提取物中异长春花苷内酰胺含量高于90.0%,即可。
实施例19。一种胆木提取物制剂,取实施例1所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成片剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例20。一种胆木提取物制剂,取实施例2所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成颗粒剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例21。一种胆木提取物制剂,取实施例3所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成胶囊剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例22。一种胆木提取物制剂,取实施例4所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成丸剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例23。一种胆木提取物制剂,取实施例5所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成滴丸剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例24。一种胆木提取物制剂,取实施例6所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成软胶囊剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例25。一种胆木提取物制剂,取实施例7所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成大输液,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例26。一种胆木提取物制剂,取实施例8所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成输液剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例27。一种胆木提取物制剂,取实施例9所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成口服液,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例28。一种胆木提取物制剂,取实施例10所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成注射剂,制备时,所用的助溶剂为氢氧化钠、氢氧化钾、精氨酸、赖氨酸、葡甲胺、尿素、乙酰胺、硫脲、苯甲酰胺、乙醇、丙二醇或者甘露醇,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例29。一种胆木提取物制剂,取实施例11所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成合剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例30。一种胆木提取物制剂,取实施例12所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成混悬剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例31。一种胆木提取物制剂,取实施例13所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成靶向制剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例32。一种胆木提取物制剂,取实施例14所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成缓释制剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例33。一种胆木提取物制剂,取实施例15所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成控释制剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例34。一种胆木提取物制剂,取实施例16所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成注射液,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例35。一种胆木提取物制剂,取实施例17所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成颗粒剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。
实施例36。一种胆木提取物制剂,取实施例18所制得的胆木提取物,加入药物载体,制成冻干粉针剂,用于抗菌、抗病毒、消炎或者抗高热治疗。