KR19990057119A

KR19990057119A - 사람 인슐린 전구체의 제조방법

Info

Publication number: KR19990057119A
Application number: KR1019970077163A
Authority: KR
Inventors: 홍청일; 김정우; 이왕식; 김창규; 김용인; 부제니; 신정우; 오성진
Original assignee: 김충환; 주식회사 종근당
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1997-12-29
Publication date: 1999-07-15
Also published as: CN1163600C; EP1042479A1; BR9814526A; RU2203949C2; KR100253916B1; CA2315750A1; US5952461A; JP2002500013A; AU735480B2; WO1999033988A1; CN1290299A; AU1694199A

Abstract

본 발명은 인슐린 전구체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인슐린 전구체의 제조방법은 봉입체 형태로 발현된 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 대장균을 완충용액에 용해시켜 파쇄하고 봉입체를 수득하는 공정; 전기에서 수득한 봉입체를 변성제를 함유한 완충용액에 용해시키는 동시에, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트로 설포네이션시켜, 프로인슐린 S-설포네이트의 용합단백질을 수득하는 공정; 전기에서 수득한 프로인슐린 S-설포네이트의 융합 단백질을 원심분리하여 얻은 침전물을 개미산에 용해하고, 시아노겐 브로마이드를 처리하여 프로인슐린 S-설포네이트 서열을 융합부위로부터 분리시키고 감압건조하는 공정; 전기에서 감압건조시킨 프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 음이온 교환 크로마토그래피로 용출시키는 공정; 전기에서 수득한 프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 완충용액에 희석하고 질소가스를 주입하여 산소를 탈기하고, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 완충용액과 혼합한 다음, 저장 용기에서 교반하여 프로인슐린을 포함하는 재접힘 반응혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기에서 수득한 재접힘 반응 혼합물을 극성 메타크릴레이트계 수지에 흡착시키고 수성 용출제로 용출시켜 활성형 프로인슐린을 수득하는 공정을 포함한다. 본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법을 이용하면, 용해와 설포네이션의 공정 및 정제, 농축, 탈염의 공정을 단순화시키고 재접힘 반응의 수율향상 및 규모증가시의 재현성을 확보하여, 효율적인 사람 인슐린 전구체의 산업적 생산이 가능하다.

Description

사람 인슐린 전구체의 제조방법

본 발명은 인슐린 전구체의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 1의 인슐린 전구체의 제조방법에 관한 것이다.

상기 화학식 1에서, R은 수소, 화학적 또는 효소적으로 분해가능한 아미노산 잔기 또는 펩타이드이고; 및, A-1에서 A-21까지의 부분은 인슐린 A쇄이고, B-1에서 B-30까지의 부분은 인슐린 B쇄라 할때, X는 A-1의 아미노 그룹에서 인슐린 A쇄와 B-30 카르복실 그룹의 인슐린 B쇄에 연결된 부위로서, A쇄 혹은 B쇄로부터 효소적 또는 화학적으로 분리될 수 있다. 상기 인슐린 전구체에는 A쇄, B쇄가 함유하는 6개의 시스테인 잔기로부터 형성된 3개의 디설파이드 결합(A-6와 A-11, A-7과 B-7, 및 A-20과 B-19)이 존재한다.

일반적으로, 이와 같은 인슐린 전구체(프로인슐린)는 이에 해당하는 유전자를 대장균의 플라스미드 DNA에 삽입함으로써, 목적하는 인슐린을 생산하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되어 왔다(참조: 도 1).

도 1에서 보듯이, 프로인슐린(proinsulin)을 포함한 융합단백질은 대장균 세포내에서 봉입체의 형태로 발현되며, 세포파쇄 후 원심분리하여 얻어진 봉입체는 비이온성 또는 이온성 계면활성제, 혹은 저농도의 변성제(denaturant)에 의해 세척된다. 이러한 처리는 원심분리와 함께 반복된 처리로서 목적 단백질의 순도를 증가시키게 된다(참조: Mukhopadhyay, A. et al., Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 56, 61-108, 1997). 세척된 봉입체는 분자간 소수성 작용(intermolecular hydrophobic interaction)과 잘못된 디설파이드 결합의 형성을 최소화하기 위하여, 디티오트레이톨(DTT: dithiothreitol) 또는 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 등의 환원제가 포함된 요소 또는 염산 구아니딘(guanidineㆍHCl)용액 등의 변성제를 사용해서 용해시키거나, NaOH를 이용하여 알카리 용해를 시키기도 한다(참조: Fischer et al., Biotechnology & Bioengineering, 41, 3-13, 1993). 용해된 봉입체는 높은 회전수로 원심분리하고, 상층액을 냉각수(cold water)로 희석하여 침전물로 회수한다(참조: EP 0 055 945 A2). 회수된 봉입체는 프로인슐린과 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 등의 이종단백질이 메티오닌 잔기를 가교로 하여 융합상태로 존재하며, 융합부위를 시아노겐 브로마이드(CNBr)로 절단하고, 프로인슐린에 존재하는 6개의 -SH 기를 -S-SO₃ ^-로 치환시킴으로써 프로인슐린을 프로인슐린 S-설포네이트(proinsulin S-sulfonate)로 전환하여, 인슐린 전구체의 안정성을 증가시키고, 후속공정인 재접힘(refolding) 반응의 효율성을 증가시킨다(참조: EP 0 055 945 A2). 설포네이션된 프로인슐린은 자연구조(native conformation)을 갖도록 2-메르캅토에탄올, DTT 등의 환원제 또는 산화·환원 글루타티온(glutathione)과 같은 산화환원 체계(redox system)를 이용하여 재접힘된다(참조: Fischer et al., Biotechnology & Bioengineering, 41, 3-13, 1993). 이렇게 해서 얻어진 자연상태의 활성형 프로인슐린(native proinsulin)은 트립신(trypsin)과 카르복시펩티데이즈 B(carboxypeptidase B)를 사용해서 A쇄와 B쇄를 연결하고 있는 X(또는, C쇄)를 제거함으로써 활성형 인슐린으로 전환된다(참조: Kemmler W., et al., J.B.C., 246, 6786∼6790, 1971). 인슐린은 역상 고성능 크로마토그래피(RP-HPLC) 등을 거쳐 정제하며(참조: Kroeff, E. P., et al., J. Chromatogr, 461, 45∼61, 1989), 최종단계에서 아연-결정화(Zn-crystallization)에 의해 결정화된다(참조: Mirsky, et al., J. Clinical Investigation, 42, 1869-1872, 1963; Brader M.L., TIBS, 16, 341∼345, 1991).

한편, 이러한 종래의 기술은 용해와 설포네이션의 과정과 정제, 농축 및 탈염의 과정이 복잡하고, 재접힘 반응의 효율이 떨어져 산업적 생산에 있어서 프로인슐린의 수율 향상을 기대할 수 없었다. 따라서, 당업계에서는 보다 간단한 공정에 의해 생물학적 활성이 우수한 활성형 인슐린 전구체의 제조방법이 절실히 필요로 하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 이러한 종래의 사람 인슐린 전구체의 제조방법의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 용해와 설포네이션의 공정 및 정제, 농축, 탈염의 공정을 단순화시키고 재접힘 반응의 수율향상 및 규모증가시의 재현성을 확보할 수 있는 사람 인슐린 전구체의 제조방법을 확립하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 단순한 공정과 재접힘 반응의 수율을 높일 수 있는 사람 인슐린 전구체의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 종래의 재조합 대장균에서 발현된 프로인슐린 융합 단백질로부터 사람 인슐린을 제조하는 방법을 나타낸 공정도,

도 2는 본 발명의 재조합 대장균에서 발현된 프로인슐린 융합 단백질로부터 사람 인슐린을 제조하는 방법을 나타낸 공정도,

도 3은 본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법에 있어서, 재접힘을 위한 장치의 모식도.

본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법에 의하면, 봉입체 형태로 발현된 인슐린 전구체를 요소용액 또는 염산 구아니딘용액으로 용해시키는 과정 중에 소디움 테트라티오네이트(Na₂S₄O₆)와 소디움 설파이트(Na₂SO₃)를 동시에 처리함으로써, 봉입체 정제시 인슐린 전구체의 시스테인 잔기의 -SH 기를 S-SO₃ ^-로 치환하여 다음 화학식 2로 표시되는 프로인슐린 S-설포네이트를 수득하며, 전기 프로인슐린 S-설포네이트를 수용성 매질내에서 2-메르캅토에탄올과 혼합반응시켜 전기 화학식 1의 인슐린 전구체로 전환시킨다.

상기 화학식 2에서, R 및 X는 상기 화학식 1에서와 같다.

이하에서는, 본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법을 도 2를 참조하여, 공정별로 더욱 상세히 설명한다:

제 1공정:봉입체의 정제

본 발명자들은 재조합 사람 인슐린을 제조하기 위하여, 변형된 갈락토시다아제(modified β-galactosidase)와 융합된 프로인슐린 융합단백질을 발현시킬 수 있는 대장균을 사용하였다(참조: 대한민국 특허공고 제 94-1855호). 봉입체 형태로 발현된 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 대장균을 세포 함수 중량의 5배 내지 10배 정도의 완충용액에 용해시켜 약 9,000psi의 압력으로 파쇄하고, Triton X-100과 증류수를 이용하여 봉입체를 정제하였다.

제 2공정:용해 및 설포네이션

정제된 봉입체는 함수 중량의 10 내지 20배, 보다 바람직하게는 5 내지 10배 정도의 6 내지 8M의 요소용액 또는 염산 구아니딘용액을 함유하는 20 mM 내지 0.1M 트리스 완충용액(pH 8 ∼10)에 용해시켰다. 이때, 0.1 내지 0.6M, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.5M의 소디움 설파이트(sodium sulfite, Na₂SO₃)와 0.01 내지 0.001M, 보다 바람직하게는 50∼100mM의 소디움 테트라티오네이트(sodium tetrathionate, Na₂S₄O₄)를 동시에 첨가하고 교반하여 줌으로써, 설포네이션(sulfonation) 반응을 유도하여 목적하는 인슐린 전구체의 -SH 기를 -S-SO₃ ^-로 치환하였다. 이때의 pH는 7.0 내지 9.5 부근으로 유지하였으며, 반응 온도는 4℃ 내지 8℃ 정도로 유지하였다.

제 3공정:시아노겐 브로마이드 절단

프로인슐린(proinsulin) 서열내의 시스테인 잔기를 아황산화(-S-SO₃ ^-)시켜 얻어진 설포네이션된 프로인슐린, 즉 프로인슐린 S-설포네이트의 융합단백질(sulfonated proinsulin fusion protein)을 얻었다. 즉, 설포네이션된 프로인슐린 융합단백질 함유 분획을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 얻어진 상등액에 5배에서 20배 정도의 냉각수를 첨가한 후 pH를 5 내지 6정도로 조정함으로써 침전물을 얻었다. 침전된 단백질을 10∼30mg/ml의 농도가 되도록 70% 개미산(formic acid)에 용해하고, 단백질의 양에 대해 100 몰(mole)비가 되도록 시아노겐 브로마이드를 처리하여, 프로인슐린 서열을 융합부위로부터 분리시킨 다음, 감압 건조를 수행하였다.

제 4공정:이온 크로마토그래피

프로인슐린 S-설포네이트를 1mM EDTA와 7M 요소가 포함된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 30mg/ml 되도록 용해시킨 다음, 동일한 완충용액으로 평형화된 DEAE-세파셀(Sephacel) 수지에 용적하여, 0∼1M NaCl 농도 구배로 프로인슐린 S-설포네이트를 용출시킨 결과, 0.3∼0.5M NaCl 농도 구간에서 용출됨을 확인하였다.

제 5공정:재접힘

정제된 프로인슐린 S-설포네이트는 탈염화 과정 또는 전처리없이 용출액을 단백질 농도가 0.1 내지 10mg/ml 되도록 0.1 내지 2M, 보다 바람직하게는 1M의 요소를 함유하는 50mM 글리신(glycine) 완충용액(pH 10.6)으로 희석하고 질소가스를 주입하여 산소를 탈기한 다음, 잘 막아 주고 다른 용기에 전기와 동일한 글리신 완충용액(pH 10.6)에 2-메르캅토에탄올을 프로인슐린 S-설포네이트의 -SSO₃ ^-잔기당 1 내지 3 당량비로 첨가하였다. 그런 다음, 단백질 용액과 2-메르캅토에탄올이 첨가된 완충용액을 부피가 0.1 내지 100ml인 셀(혼합용기, mixing chamber)에 연결하여 빠르게 1:1(부피비)로 혼합하고, 저장용기에서 서서히 교반하였다(참조: 도 3). 이러한 재접힘 공정에 의해, 프로인슐린 S-설포네이트의 80%까지 자연상태의 프로인슐린으로 전환시킬 수 있었다.

제 6공정:흡착 크로마토그래피

활성형 프로인슐린을 함유한 재접힘 반응 혼합물을 흡착시킬 때에는 반응 혼합액의 pH를 약 3 내지 4로 조정하고, 극성 메타크릴레이트계 수지인 HP-2MG에 활성형 프로인슐린을 함유한 혼합 단백질의 양을 수지 1리터당 8g으로 조절하여 접촉시킨다. 이 때, 용적하는 시료의 단백질 농도는 프로인슐린 재접힘 반응조건에 따라 0.1mg/ml 내지 5mg/ml로 다양할 수 있다. 흡착단계가 완료되면, pH 약 3 내지 4인 아세트산 완충용액으로 세척하고, 수성 용출제를 사용하여 탈염 및 농축된 활성형 인슐린 전구체를 회수 정제한다. 이때, 흡착된 프로인슐린의 용출에 사용된 수성 용출제는 pH 3 내지 4의 아세톤 약 15% 내지 약 50%를 함유하는 아세트산 완충용액, 바람직하게는 20% 내지 50%의 아세톤을 함유하는 아세트산 완충용액(pH 3∼4)을 사용한다.

본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법은 종래의 제조방법에 비하여 다음과 같은 장점이 있다: 첫째, 용해와 설포네이션을 동시에 수행함으로써 생산공정을 단순화할 수 있다. 둘째, 용해시 고농도의 시료가 분자간의 중합화(polymerization)로 인해 생기는 정제 과정상의 겔화 현상과 같은 변성을 막을 수 있다. 셋째, 용해시 분자간의 잘못된 디설파이트 결합으로 인한 시료의 용해도의 감소를 근본적으로 해결할 수 있다. 이는 때때로 2-메르캅토에탄올 또는 DTT 등의 환원제 처리에 의해 해결할 수 있지만, 이 때 생기는 -SH 보다는 설파이트와 테트라티오네이트에 의해 -S-SO₃ ^-로 치환되는 것이 안정하고 용해도면에서도 더 바람직하다. 넷째, 시아노겐 브로마이드 반응 전단계에서 시스테인기의 -SH 기를 -S-SO₃ ^-로 치환함으로써, 용해와 이후 공정에서 발생할 수 있는 시스테인기의 비가역적(irreversibile) 변성, 예를 들면, 시스테인(cystein)이 시스테인산(cysteic acid)으로 변성되는 등의 현상을 막을 수 있어 수율 향상을 기할 수 있다(참조: 미합중국특허 제 4,451,396호). 다섯째, 시아노겐 브로마이드 반응 후 감압건조(evaporation)한 다음 탈염(desalting) 등의 어떠한 전처리없이 이온교환 크로마토그래피 또는 흡착 크로마토그래피를 수행함으로써 공정의 연속성을 부여하는 장점을 가진다.

본 발명의 또 하나의 특징은 인슐린을 산업적으로 생산하는 데 있어 중요한 단계 중 하나인 재접힘 반응을 효율적으로 행하는데 있다. 특히, 혼합용기(mixing chamber)를 이용하여 연속적으로 반응시킴으로써, 수율향상 및 규모증가(scale-up)시의 재현성을 확보하였다(참조: Terashima M., et al., Process Biochemistry, 31, 341∼345, 1996). 또한, 재접힘 반응 이후 공업용 흡착수지를 이용하여 자연상태의 활성형 프로인슐린을 반응 혼합물로부터 정제, 농축 및 탈염(desalting)을 동시에 수행할 수 있다.

종래에는, 재접힘 반응이 필연적으로 수반되는 이와 같은 인슐린 전구체를 제조하는데 있어서, 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는 시스테인 잔기를 설포네이션시켜 프로인슐린 S-설포네이트를 형성한 다음, 수용성 매질 ml당 약 10mg 까지의 프로인슐린 S-설포네이트 농도에서 pH 7 내지 11.5 조건하에 각 -SSO₃ ^-잔기당 1 내지 5 당량의 2-메르캅토에탄올과 반응시키는 방법을 이용하였다(참조: 미합중국 특허 제 4,430,266). 전기에 제시된 반응조건은 뱃치(batch)식으로 이 조건하에서 재접힘 수율이 약 60% 정도로 나타났으며, 추가적인 수율 향상을 위하여 재접힘 반응 후 pH를 4 내지 6으로 재조정하여 재접힘이 잘못된 중간물질을 응집체(aggregate) 형태로 획득, 이를 다시 설포네이션시키고 재접힘하는 재순환체계(recycling system)를 도입하여 두 번의 공정을 수행함으로써, 약 80%의 수율을 얻었다(참조: 미합중국 제 4,801,684호). 그러나, 본 발명의 반응공정은 단 한번의 재접힘 반응에서 프로인슐린 S-설포네이트 의 80%까지 자연 상태의 프로인슐린으로 전환할 수 있게 되어, 공정의 단축 및 수율 향상을 동시에 이룰 수 있었다.

이제까지의 재접힘 반응에 대한 많은 연구 결과, 단백질의 재접힘 수율을 떨어뜨리는 주된 원인은, 재접힘 반응시 중간 물질들 사이에 노출된 소수성 부위들 간의 비공유성 결합에 의한 응집체 형성으로 밝혀지고 있다. 또한, 이러한 응집체 형성에는 단백질 농도, 반응 부피, 온도 및 pH 등의 요인이 크게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 중에서도 단백질 농도는 수율에 큰 영향을 미치므로, 수율을 고려하여 낮은 단백질 농도에서 재접힘 반응을 행할 경우, 산업적 생산의 경제성을 크게 악화시키므로 재조합 단백질을 적절한 농도에서 재접힘시키려는 여러가지 효율적인 방안들이 제시되었다. 그 예로서, 아미노산인 아르기닌(arginine) 등의 응집저해제 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 계면 활성제 및 요소 등의 변성제를 첨가하는 방법 등이 제시되었다. 또한, 반응내의 단백질 농도를 단계적으로 증가시키는 방법 등도 제시되었다.

그럼에도 불구하고, 인슐린을 산업적 규모로 생산하기 위해서는 재접힘 반응시 일정 규모 이상의 반응 부피가 필요하게 되며, 이때 프로인슐린 S-설포네이트와 2-메르캅토에탄올 등 각 반응액내의 구성요소들의 균일한 혼합이 신속하게 이루어지기가 어려워 응집현상이 가속화되어 재접힘 수율이 낮아지게 된다. 이에, 본 발명자들은 프로인슐린 S-설포네이트와 2-메르캅토에탄올을 혼합할 때 평형에 도달하는데 걸리는 시간을 최소화하기 위하여, 각각을 작은 부피의 혼합 용기에서 연속 혼합하면서 재접힘 반응을 유도한 결과, 높은 농도의 프로인슐린 S-설포네이트를 이용하면서도 높은 수율로 프로인슐린을 제조할 수 있었다.

일반적으로, 재조합 비활성형 프로인슐린의 재접힘 반응 후 활성형 프로인슐린을 정제하기 위해 세파덱스 G-50 등의 겔 여과(gel filtration) 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피 등이 수행되며, 이를 위해선 먼저 반응액의 완충용액이 바뀌어야 하며 염들을 제거하는 탈염화과정이 수반되었다(참조: 미합중국 특허 제 4,430,266). 탈염화를 위하여 널리 사용되고 있는 방법에는, 겔 여과법, 투석 및 한외여과법(ultrafiltration)이 있다. 이중, 겔 여과법은 세파덱스 G-25 등의 폴리덱스트란 겔을 사용한 크로마토그래피 방법으로, 물질의 분자량 또는 구조에 따라 겔의 일정 구멍을 통과하는데 걸리는 시간의 차이를 이용한다. 한편, 투석법은 겔대신 투석막(dialysis membrane)을 이용하며, 한외 여과법은 중공섬유(hollow fiber)나 카세트(cassette) 등의 카트리지(cartridge)와 디스크 막(disc membrane)을 이용한다.

그러나, 위와 같은 방법은 다음과 같은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 예를 들면, 겔 여과 법의 시료처리 용량은 시료의 양 또는 농도보다 칼럼에 충진된 겔의 부피에 의존하므로(처리용량: 겔 부피의 10% 내지 25% 이내), 시료의 농도가 희석되면 될수록 칼럼의 크기가 증가된다. 또한, 용출된 시료의 농도가 희석되므로 부피가 증가되어 후속공정에 문제를 야기시킬 수 있다. 투석법은 투석막에 시료의 비특이적 결합으로 인한 시료손실과 처리용량 제한 등이 문제되며, 한외 여과법은 처리용량의 증가 및 농축의 효과를 갖고 있지만 시설을 갖추어야 되고, 비특이적 결합, 파울링(fouling) 및 프러깅(plugging) 등으로 시료 손실과 유속 감소가 발생한다.

본 발명은 종래의 이러한 방법의 원리와 달리 활성형 프로인슐린과 공업용 수지와의 흡착을 이용하여 탈염화를 함으로써, 상기 열거한 방법들의 문제점, 즉, 처리 용량의 제한, 용출시료의 희석, 비선택적 결합 및 경제적 부담을 해결하였다. 예를 들면, 활성형 프로인슐린을 포함한 재접힘 반응액을 pH 약 3 내지 약 11로 조정하여, 극성 메타크릴레이트계 수지에 적용시키고, 아세톤 약 15% 내지 약 50%를 함유하는 pH 약 3 내지 4의 수성 용출제를 사용하여 활성형 프로인슐린이 거의 완전히 회수되도록 하였다. 이때, 사용되는 극성 메타크릴레이트계 수지는 HP-2MG란 상표로 미쯔비시사가 시판하고 있으며, 비교적 극성이 높은 유기물의 흡착에 적당하다.

본 발명의 공정에 있어서 흡착 및 탈착공정이 필수적이며, 바람직하게는 중간세척 단계가 포함될 수 있다. 더욱이, 탈염, 농축 및 정제 효율을 위하여 공정을 칼럼조건하에서 수행하는 것이 훨씬 바람직하지만, 뱃치법 또는 칼럼법으로 사용할 수 있다. 본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법에서, 전 공정은 약 4℃에서 수행할 수 있으나, 편리를 위하여 상온에서 수행할 수도 있다.

본 발명의 사람 인슐린 전구체의 제조방법에 의하며, 활성형 프로인슐린의 회수율이 90% 이상이며, 흡착단계에서 용적하는 단백질의 농도에 따라 몇 배에서 몇십배의 농축효과를 가진다. 또한, 중간 산물인 활성형 프로인슐린을 경제적으로 탈염, 농축 및 정제 할 수 있고, 용출액 자체를 후속공정에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:봉입체의 정제

봉입체 형태로 발현된 프로인슐린 융합단백질(참조: 대한민국 특허공고 제 94-1855호)을 함유하는 대장균을 함수 중량 약 5배 부피의 용균용 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.9, 50mM EDTA, 10% 슈크로오스, 0.1mM PMSF 함유)에 용해시켜 9,000psi의 압력으로 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 5,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 침전물을 얻은 다음, 얻어진 침전물의 함수 중량 300g의 봉입체를 10배 부피에 해당하는 2% 트리톤 X-100과 증류수로 세척하고 원심분리하여 정제된 봉입체를 얻었다.

실시예 2:알카리 용해의 영향

실시예 1의 방법에 의해 얻어진 봉입체를 함수 중량의 20배 부피의 증류수로 균일하게 현탁하고, 1M NaOH로 pH 12.5로 조정하여 용해하였다. 그런 다음, 3시간동안 교반하고, 12,000rpm에서 30분동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상등액을 1M 염산으로 pH 5.5로 조정하고, 5,000rpm에서 30분동안 원심분리하여 침전물을 수거하였으며, 침전된 단백질을 10mg/ml이 되도록 70% 개미산으로 용해시키고, 단백질 양에 대해 100몰비에 해당하는 시아노겐 브로마이드를 첨가하여 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어, 감압증류하여 완전하게 건조하고 7M 요소가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시킨 후, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트가 최종 각각 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하고 6시간 동안 교반하였다. 그런 다음, HPLC로 분석하여 설포네이션된 프로인슐린을 정량하였다(참조: 표 1).

실시예 3:염산 구아니딘 용해 및 환원제의 영향

실시예 1의 방법에 의해 얻어진 봉입체를 함수 중량의 10배 부피의 다음과 같은 각 변성제를 포함하는 완충용액에 첨가하였다: 첫째, 6∼7M 염산 구아니딘 과 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시켰다; 둘째, 6∼7M 염산 구아니딘과 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시키고 1mM 2-메르캅토에탄올이 첨가하였다; 셋째, 6∼7M 염산 구아니딘과 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시키고, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트를 각각 최종 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하였다. 그런 다음, 전기 세가지 용액을 각각 4℃에서 12시간 동안 교반하고, 반응액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 이어, 상등액에 약 10배 부피의 냉각수를 첨가하고, 5,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 수거하였다. 이 침전된 단백질을 10mg/ml되도록 70% 개미산으로 용해시키고, 단백질양에 대해 100몰비에 해당하는 시아노겐 브로마이드를 첨가하여 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어, 감압증류하여 완전하게 건조하고 7M 요소가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시켜 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트가 최종 각각 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하고, 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 그런 다음, HPLC로 분석하여 설포네이션된 프로인슐린을 정량하였다(참조: 표 1).

실시예 4:요소 용해 및 환원제의 영향

실시예 1의 방법에 의해 얻어진 봉입체를 함수 중량의 10배 부피의 다음과 같은 각 변성제를 포함하는 완충용액에 첨가하였다: 첫째, 7∼8M 요소와 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시켰다; 둘째, 7∼8M 요소와 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시키고, 1mM 2-메르캅토에탄올을 첨가하였다; 셋째, 7∼8M 요소와 1mM EDTA가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시키고, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트를 각각 최종 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하였다. 그런 다음, 전기 세가지 용액을 각각 4℃에서 12시간 동안 교반하고, 반응액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 이어, 상등액에 약 10배 부피의 냉각수를 첨가하여, 5,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 침전물을 수거하였다. 이 침전된 단백질을 10mg/ml 되도록 70% 개미산으로 용해시키고, 단백질양에 100몰비에 해당하는 시아노겐 브로마이드를 첨가하여 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어, 감압증류하여 완전하게 건조하고 7M 요소가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 9.5)으로 용해시킨 후, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트가 최종 각각 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하고 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 그런 다음, HPLC로 분석하여 설포네이션된 프로인슐린을 정량하였다(참조: 표 1).

실시예 2 내지 4에 따른 각 용해방법이 설포네이션에 미치는 영향^*

처 리 군	용해후 단백질 양(g)	설표네이션수율(%)(설포네이션된 프로인슐린 g/단백질)
대 조 군	10.2	28.6
알카리 용해	7	6.7
염산 구아니딘 용해	-	-
염산 구아니딘 용해+ 1mM 2-메르캅토에탄올	7.1	24
염산 구아니딘 용해+ 설파이트 + 테트라티오네이트	6.3	48
요소 용해	7.0	31.5
요소 용해+ 1mM 2-메르캅토에탄올	7.1	28
요소 용해+ 설파이트+ 테트라티오네이트	6.2	45.2

* 각 군의 시료는 Triton X-100과 냉각한 증류수로 세척한 봉입체로 30g(wet wt.)을 사용하였으며, 대조군은 용해공정을 거치지 않은 무처리군으로, Triton X-100과 증류수

로 세척된 봉입체를 바로 시아노겐 브로마이드로 처리하였음.

표 1에 나타난 바와 같이, 요소 또는 염산 구아니딘에 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트 처리시 무처리군에 비해 1.5배 내지 2배 정도의 정제되는 효과를 보였다. 한편, 환원제가 첨가되지 않은 염산 구아니딘만을 가지고 용해시킨 경우에는, 70% 개미산 첨가시 겔화 현상이 나타났으므로, 용해 후 단백질의 양이나 설포네이션 수율을 측정할 수 없었다. 이는, 분자 상호간의 소수성 작용 또는 디설파이드 결합형성에 의한 중합현상으로 추정되었다. 또한, 2-메르캅토에탄올 첨가는 상당한 수율의 손실을 보였으며, 이 역시 같은 원인으로 추정되었다. 설포네이션된 프로인슐린 융합단백질의 경우, -S-SO₃ ^-치환에 의해 분자의 전체적인 전하(charge)가 마이너스를 띠므로, 분자상호간의 상호작용을 막아 주는 것으로 사료되었으며, 알카리 용해의 경우는 단백질의 안전성에 영향을 주므로, 단백질을 변성시키는 것으로 사료되었다. 또한, 산업적인 이용면에서 설파이트와 테트라티오네이트를 첨가한 요소와 염산 구아니딘의 결과가 별 차이가 없는 것으로 보아, 요소의 용해는 상당한 비용절감 효과가 있는 것으로 사료된다.

아울러, 설포네이션 반응이 포함된 용해 과정을 거쳐 시아노겐 브로마이드 처리후 7M 요소가 포함된 20mM 트리스 완충용액으로 용해시킨 시료를 HPLC로 분석하여 정량한 결과, 설파이트와 테트라티오네이트를 첨가하지 않아도 동일한 양의 설포네이션된 프로인슐린이 확인되었다.

실시예 5:요소용해 및 설포네이션

실시예 2 내지 4의 결과에 기초하여, 봉입체를 요소용액에 용해하고, 설포네이션 공정을 수행하였다. 즉, 함수중량 110g의 정제된 봉입체를 함수 중량의 10배 부피의 8M 요소와 1mM EDTA가 포함된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.5)으로 용해시킨 다음, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트를 각각 최종 0.3M, 0.1M 되도록 첨가하고 4℃에서 12시간동안 교반하였다. 그런 다음, 반응액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액에 약 10배 부피의 냉각수를 첨가하였다. 이어, 2N 염산용액을 이용하여 pH를 5.5 부근으로 조정한 다음, 5,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 수거하였다. 이때의 함수중량은 250g이었고, 단백질 정량 결과 약 40g의 단백질이 확인되었다.

실시예 6:시아노겐 브로마이드 처리

침전된 단백질을 2ℓ의 70% 개미산(formic acid)으로 용해시키고, 단백질 양에 대해 100 몰비에 해당하는 시아노겐 브로마이드(CNBr)를 첨가하여 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 감압증류하여 완전하게 건조하고 2ℓ의 7M 요소가 첨가된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 용해시켜 HPLC로 분석하였다.

실시예 7:음이온교환 크로마토그래피

DEAE-Sephacel을 시간당 1.5 칼럼부피의 유속으로 2.5 X 30cm 칼럼에 충진하고, 1mM EDTA와 7M 요소가 포함된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 평형시켰다. 평형이 완료된 후 실시예 6의 시료를 수지 1m당20mg씩 용적하고, 1 칼럼부피의 평형 완충용액으로 세척하였다. 0∼1M NaCl이 포함된 평형 완충용액으로 농도 구배에 의해 용출하였으며, 0.35∼0.45M NaCl 농도 구간의 용출액을 모아 HPLC로 분석한 결과, 순도는 80% 이상이었으며 회수율은 91%이었다.

실시예 8:프로인슐린 S-설포네이트의 재접힘

역상 크로마토그래피에 의해 정제된 활성형 재조합 프로인슐린을 역으로 설포네이션하여 얻은 프로인슐린 S-설포네이트 1g을 500ml의 50mM 글리신 완충용액(pH 10.6)으로 용해시키고 질소가스를 주입하여 탈기하고 잘 밀봉한 용액과, 다른 용기에 있는 500ml의 50mM 글리신 완충용액(pH 10.6)에 104㎕의 2-메르캅토에탄올을 첨가하고 질소가스를 주입하여 탈기하고 잘 밀봉한 용액을 같은 유속(50ml/hr)으로 부피 1ml의 셀(mixing chamber)내로 유입시켜 교반하면서 1:1(부피비)로 혼합하였다. 혼합된 재접힘 반응용액을 시간당 100ml 유속으로 질소가스로 탈기된 반응용기(reservoir)에 보내고, 서서히 교반하여서 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료되면, 2M 염산을 사용하여 pH 2.9±0.1로 산성화한 후, HPLC에 의해 분석한 결과, 재접힘 수율은 55%이었다.

실시예 9:재접힘에 대한 단백질 농도의 효과

단백질 농도를 제외하고는, 실시예 8과 동일한 반응조건으로 동시에 수행되는 일련의 반응에서 프로인슐린 S-설포네이트로부터 프로인슐린으로의 전환수율에 단백질 농도가 미치는 효과를 조사하였다(참조: 표 2).

단백질 농도에 따른 프로인슐린 S-설포네이트로부터 프로인슐린의 전환수율

단백질 농도 (mg/ml)	수율(%)	단백질농도 (mg/ml)	수율(%)
0.1	95	1	53
0.2	90	2	20
0.5	83	4	8

실시예 10:재접힘에 대한 -SH : -SSO₃ ^-비율의 효과

-SH : -SSO₃ ^-비율을 제외하고는, 실시예 8과 동일한 동시에 수행되는 일련의 반응에서 프로인슐린 S-설포네이트로부터 프로인슐린으로의 전환 수율에 미치는 -SH : -SSO₃ ^-비율의 효과를 조사하였다(참조: 표 3).

-SH : -SSO₃ ^-비율에 따른 프로인슐린 S-설포네이트로부터 프로인슐린에의 전환수율

-SH : -SSO ₃ ^- 비율	수율(%)	-SH : -SSO ₃ ^- 비율	수율(%)
1	41	2	54
1.5	59	3	30

실시예 11:재접힘에 대한 요소 농도의 효과

요소 농도를 제외하고는, 실시예 8과 동일한 반응조건으로 동시에 수행되는 일련의 반응에서 프로인슐린 S-설포네이트로부터 프로인슐린으로의 전환 수율에 미치는 요소 농도의 효과를 조사하였다(참조: 표 3).

요소 농도 (M)	수율 (%)	요소 농도 (M)	수율 (%)
0	52	0.5	79
0.25	67	1.0	83

실시예 12:음이온교환 크로마토그래피로부터 정제된 프로인슐린 S-설포네이트의 재접힘

실시예 7에서 얻어진 10g의 프로인슐린 S-설포네이트를 포함한 용출액을 최종 5ℓ가 되도록 1M 요소가 첨가된 50mM 글리신 완충용액으로 희석하고 5M NaOH로 pH를 10.6으로 조정한 다음, 질소가스를 주입하여 탈기하고 잘 밀봉하였다. 다른 용기에 있는 5ℓ의 1M 요소가 첨가된 50mM 글리신 완충액에 781㎕의 2-메르캅토에탄올을 첨가하고 질소가스를 주입하여 탈기한 다음, 잘 밀봉하고 두 용액을 같은 유속(500ml/hr)으로 부피 10ml의 셀(mixing chamber)내로 유입시켜 교반하면서 1:1(부피비)로 혼합하였다. 혼합된 재접힘 용액을 시간당 1ℓ 유속으로 질소가스로 탈기된 반응용기(reservoir)에 보낸 다음, 서서히 교반하면서 4℃에서 18시간 동안 반응시키고, 반응이 종료되면 2M 염산을 사용하여 pH 2.9±0.1로 산성화시켰다. HPLC에 의해 분석한 결과, 재접힘 수율은 81%이었다.

실시예 13:재조합 활성형 인체 프로인슐린의 흡착 크로마토그래피에 의한 정제

극성 메타크릴레이트계 수지인 HP-2MG 수지(미쓰비시화학, 일본국)를 상온에서 6시간 동안 수지 1g당 5ml의 아세톤으로 습윤화시키고, 수지를 차례로 0.1N NaOH, 물, 0.1N HCl, 물 및 20mM 아세트산(pH 3.2±0.2)으로 충분히 세척하고 칼럼에 충진하였다. 그런 다음, 칼럼 부피 3배의 평형 완충용액(20mM 아세트산 pH 3.2±0.2)을 시간당 칼럼 부피의 1배의 유속으로 통과시켜 평형화하였다. 이어, 실시예 12에서 얻어진 활성형 프로인슐린을 함유한 반응액을 수지 1ℓ당 단백질 8g이 되도록 용적하였다. 그런 다음, 20mM 아세트산 완충용액을 1 칼럼부피 용적하여 세척한 후, 활성형 프로인슐린을 30% 아세톤이 함유된 20mM 아세트산으로 용출하였다. 그 결과, 활성형 프로인슐린의 92% 이상이 회수되었으며, 글리신, 요소등의 불순물들이 제거되었다. 또한, 약 10배의 농축효과와 약 1.3배 이상의 단백질 순도 증가를 HPLC 및 단백질 정량으로 확인하였다. 한편, 상기 활성형 프로인슐린을 함유하는 용출액을 감압에 의해 아세톤을 제거하고 동결건조하거나, 용출액의 pH를 1N NaOH로 pH 5.4로 맞추고 염화아연을 최종 0.04%되도록 첨가하여 활성형 프로인슐린을 회수하였으며, 이때의 회수율은 95%이었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사람 인슐린 전구체의 제조방법에 있어서, 용해와 설포네이션의 공정 및 정제, 농축, 탈염의 공정을 단순화시키고 재접힘 반응의 수율향상 및 규모증가시의 재현성을 확보하여, 효율적인 사람 인슐린의 산업적 제조방법을 제공한다.

Claims

(ⅰ) 봉입체 형태로 발현된 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 대장균을 완충용액에 용해시켜 파쇄하고 봉입체를 수득하는 공정;

(ⅱ) 전기에서 수득한 봉입체를 변성제를 함유한 완충용액에 용해시키는 동시에, 소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트로 설포네이션시켜, 하기 화학식 2의 프로인슐린 S-설포네이트의 용합단백질을 수득하는 공정;

(ⅲ) 전기에서 수득한 프로인슐린 S-설포네이트의 융합 단백질을 원심분리하여 얻은 침전물을 개미산에 용해하고, 시아노겐 브로마이드를 처리하여 프로인슐린 S-설포네이트 서열을 융합부위로부터 분리시키고 감압건조하는 공정;

(ⅳ) 전기에서 감압건조시킨 프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 음이온 교환 크로마토그래피로 용출시키는 공정;

(ⅴ) 전기에서 수득한 프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 완충용액에 희석하고 질소가스를 주입하여 산소를 탈기하고, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 완충용액과 혼합한 다음, 저장 용기에서 교반하여 화학식 1의 프로인슐린을 포함하는 재접힘 반응혼합물을 수득하는 공정; 및,

(ⅵ) 전기에서 수득한 재접힘 반응 혼합물을 극성 메타크릴레이트계 수지에 흡착시키고 수성 용출제로 용출시켜 활성형 프로인슐린을 수득하는 공정을 포함하는 사람 인슐린 전구체의 제조방법.

화학식 1

화학식 2
졔 1항에서 있어서,

변성제는 요소용액 또는 염산 구아니딘용액인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

변성제의 농도는 6 내지 8M인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

봉입체의 변성제를 함유한 완충용액에 용해시, 20mM 내지 0.1M 트리스 완충용액 pH 8 내지 10을 사용하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

소디움 설파이트와 소디움 테트라티오네이트의 농도가 각각 0.1 내지 0.6M, 0.01 내지 0.001M인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

봉입체의 변성제를 함유한 완충용액에 용해시, 변성제의 부피가 단백질 함수중량의 10 내지 20배인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

봉입체의 변성제를 함유한 완충용액에 용해시, 반응온도가 4℃ 내지 8℃인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

감압건조된 시료를 7M 요소를 함유하는 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)에 용해시키고, 이 완충용액으로 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 완충용액에 희석시, 단백질 농도가 0.1 내지 10mg/ml가 되도록 1M 요소를 함유하는 글리신 완충용액에 희석하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

2-메르캅토에탄올을 프로인슐린 S-설포네이트의 SS0₃ ^-잔기당 1 내지 3 당량의 비로 완충용액에 첨가하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

프로인슐린 S-설포네이트 함유 분획을 희석한 완충용액과 2-메르캅토에탄올이 첨가된 완충용액은 1:1(부피비)로 혼합하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서,

완충용액은 50mM 글리신 완충용액(pH 10.6)인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 11항에 있어서,

혼합은 부피가 0.1 내지 100ml인 셀(혼합용기)에서 행하여지는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

극성 메타크릴레이트계 수지는 HP-2MG인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

재접힘 반응 혼합물을 pH 3 내지 11에서 극성 메타크릴레이트계 수지에 흡착시키는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

활성형 프로인슐린을 흡착된 극성 메타크릴레이트계 수지로부터 용출시키기 전에 수지를 pH 약 3 내지 4의 아세트산으로 세척하는 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

수성 용출제는 pH 3 내지 4의 아세톤 20% 내지 50%을 함유하는 아세트산 완충용액인 것을 특징으로 하는

사람 인슐린 전구체의 제조방법.