JPH04501514A - 高度の発現性を持つ宿主細胞系からの、生物学的活性の高いインシュリン様成長因子ｉの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高度の発現性を持つ宿主細胞系からの、生物学的近年のＤＮＡ組換え技術の進歩 により、宿主細胞の中で、目的の異種蛋白を相当量生産することが可能になった 。組換え蛋白を宿主細胞組織に生産させるには、目的の蛋白をコードするＤ　Ｎ 　Ａで宿主細胞を感染させ、次に、宿主細胞がこの新しい組換え蛋白を発現する のに都合のよい条件下で、この感染した宿主細胞を成育させる。目的の組換え蛋 白が、ある特定の宿主細胞系で高度に発現される場合、この外来蛋白は、通常、 封入体として宿主細胞内に沈澱する。このように組換え蛋白が高度に発現され、 次いで、封入体という形で沈澱するのは、原核宿主細胞を用いた場合の方が起こ りやすい。

高度の発現性を持つ系として、通常、原核生物の大腸菌が選ばれるが、これは、 一つには、大腸菌宿主細胞が、莫大量の組換え蛋白の生産により適しているから である。低発現性宿主細胞系としては、通常、真核宿主細胞、酵母宿主細胞が挙 げられるが、高発現性の宿主細胞系で生産されるような大量の組換え蛋白は生産 できない。しかしながら、発現は比較的低量であるけれども、これら低発現性宿 主細胞から得られる組換え蛋白は、生物学的に活性の高い形で回収されることが 多い。これは、発現性の低い宿主細胞は、外来組換え蛋白を、高密度の封入体中 に沈澱させるのではなく、むしろ宿主細胞を取りまく培養液中に分泌する傾向が 強いからである。

高発現性系の得失としては、組換え産物については高収量を得られる代わりに、 組換え蛋白を封入体から単離しなければならない、ということになる。この場合 、生物学的活性の高い製品を作るために、通常、変性した蛋白の再生（ｒｅｍｏ ｌｄｉｎｇ）が必要となる。組換え蛋白を再生するのに伴う困難、成功の度合は 、生産するその特定の蛋白によって非常に異なる。

組換えＤＮＡ技術の最近の進展の中で特に興味を引く組換え蛋白として、インシ ュリン様成長因子１　（ＩＧＦ−１）という名前の成長因子がある。ＩＧＦ−１ は、７０個のアミノ酸から構成されていることが知られている。すなわち、次の 配列の通りである。

Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｐｈｅ−Ｖ ａ　ｌ　−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｙ　ｒ　 −Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｒ＋−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−’Ｉ’ｙｒ−Ｇｌｙ− ５ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐ　ｒｏ−Ｇｉｎ−Ｔｈ　 ｒ−Ｇｌｙ−Ｘ　ｌ　ｅ　−Ｖａ　１−Ａｓ　ｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ ｈｅ−Ａｒ　ｇ−５ｅ　ｒ　−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｑ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｕ−ＭｅセーＴｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−９ｅｒ−ＡｌａＩＧＦ４ｔ、再生した形でのみ、生物学的 に活性を持つ。

Ｉ　ＧＦ−１分子は、６個のシスティン残基を含むが、それらはいずれもジスル フィド結合を形成し、その結合が、当該分子を、生物学的に活性な再生形に保持 する。

高発現性宿主細胞系から生物学的活性を持つ組換え蛋白を得るにあたって、本来 的にともなう困難があるが、その困難は、ｒ　ＧＦ−１の場合特に著しい。とい うのは、ＩＧＦＩ分子が、安定ではあるが、不正なジスルフィド結合を形成する 傾向を持つからで、この不正な結合は、不活性な、あるいは、部分的に活性なだ けの配座異性体を生む。さらに、通常のＩＧＦ−１再生法では、このような配座 異性体の混合物が得られる場合があリ、そうなると、分離がきわめて困難である 。したがって、従来、原核宿主は、活性の高い組換えＩＧＦ−Ｉ　（ｒ　ＩＧＦ −Ｉ）を相当量（例えば、ダラム量）生産できないと見なされてきた。

これは、Ｉ　ＧＦ−１を再生するさいの困難、分離にともなう困難のためであっ た。

しかしながら、組換え蛋白一般においては、組換え変性蛋白を、活性型に変形す るのに、再生法が用いられてきた。例えば、アメリカ特許第４．５１１．５０３ 号及び第４．５１８．２５６号には、三つの再生法が書かれているが、これらは 、若干の修正を施せば、封入体から、生物学的に活性な組換え蛋白を回収するの に広く用いることができるとされている。この方法では、蛋白の三次元構造、す なわち再生構造は、蛋白のアミノ酸半量体間の水素結合、疎水性相互作用、およ び、イオン結合で安定化されると考える。ジスルフィド結合がある場合には、三 次元構造を所定の位置に「ロック」するのは、システィン部分の間をつなぐジス ルフィド結合である。したがって、この方法では、組換え蛋白を生物学的に活性 の高い配座にする前に、別の安定化のための力を働かせて、ランダムなジスルフ ィド結合を取り除こうとする。

あるやり方では、還元性の条件下で、目的の変性蛋白をさらに精製した。すなわ ち、全精製過程を通して還元剤を供給することによって、当該蛋白のシスティン 部分が、遊離スルフヒドリル基として保持されるようにする。これにより、目的 の蛋白は、精製条件下で、不正なジスルフィド結合を形成することなく、自発的 に再生し得る。次にこの還元剤を水溶液に希釈すれば、再生蛋白は、空気または その他の何かの酸化剤の存在下に、適切なジスルフィド結合を形成することがで きる。これにより再生を、精製の全体工程のなかに簡単に組み込むことができる 。

この方法は、生物学的に活性な形が、比較的簡単な三次元構造を持つ組換え蛋白 には最適である。

もう一つ別のやり方として、組換え蛋白の再生を、スルフヒドリル化合物の還元 型（Ｒ−３１１）と酸化型（Ｒ−３−３−Ｒ）の混在下に実行するものがある。

これによって、全精製過程を通じて遊離スルフヒドリルとジスルフィドが常に形 成、再形成されることが可能である。このスルフヒドリル化合物の還元型・酸化 型は、十分な変性能力を持つバッファーに溶解して与えられるので、当該蛋白の 中間形成体はすべて、変性・再生の過程を通じて、溶解状態にある。適当なバッ ファー媒質として尿素が指摘されているが、これは、尿素が、次のいずれの作用 も持つと考えられるからである。すなわち、（１）その変性作用が、蛋白に適正 な配座を取らせることができるぐらいには弱＜、（２＋　その変性作用が、再生 する中間体に溶解性を保たせることができるぐらいには強いこと、である。この 方法も、目的の封入体組換え蛋白の折りたたみパターンが比較的複雑でないばあ いには最適である。

もう一つ別のやり方は、再生がより困難な場合に用いられるのであるが、これは 、先ず、封入体の単離過程で、不正に形成され得るジスルフィド結合をすべて破 壊し、次に、得られる遊離スルフヒドリル基を誘導体にするものである。これは 、その蛋白をスルホネイト化し、蛋白−８−８Ｏ３結合を形成させることによっ て実行される。次に、この蛋白−８−スルホン酸溶液を水溶液に希釈すると、不 正なジスルフィド結合が形成されることもなく、適正な再生が見られる。次に、 スルフヒドリル化合物（Ｒ−Ｓ　Ｈ）と少ない％の、対応する酸化型（Ｒ−３− ３−Ｒ）を含む系を上記水溶液に加える。ｐＨは、スルフヒドリル化合物（Ｒ− Ｓ　Ｈ）の少なくとも一部はイオン型（Ｒ−３−）となるような値に調節する（ 上昇させる）。これによって、スルホン酸の核性置換が促進される。スルフヒド リル化合物は、蛋白−８−スルホン酸を適当なジスルフィド結合のパートナ−に 変換させるのに十分な能力を持ってはいるものの、適切なジスルフィド結合をそ のままで保持するには、酸化型の存在が必要となる。

上記の再生法は、これまでの所、ｒｌＧＦ−１では効率的でなく、かつ／または 、実行するのに負担がかかったり、高価だったりした。

さらに、ＩＧＦ−１を融合蛋白として調製する方法も提案された。例えば、ヨー ロッパ特許出願第２１９．１１１４号は、「保護ペプチド」と融合されたＩ　Ｇ Ｆ−１の調製法を開示している。しかしながら、この、融合蛋白を用いる方法は 、一般に、比較的長い先導配列を必要とし、かつ、変性組換え蛋白の再生を助け るのではなく、封入体蛋白の発現を助けることを意図したものであった。

したがって、本発明の目的は、高発現性の宿主細胞系から生物学的活性を持つｒ ｌＧＦ−１を分離・精製する方法を与えることである。

発明の概要 本発明は、還元Ｉ　ＧＦ−Ｉを再生する新しい方法を提供する。

本発明の方法は、これも新しい融合蛋白中間体を利用する。この融合蛋白は、先 導配列を含んでおり、これが、ＩＧＦ−１分子のアミノ基末端、すなわちｎｅｔ −末端にさらに正電荷を与える。驚くべきことに、ＩＧＦ−Ｉ分子のｍｅｔ−末 端に付は加えられたこの正電荷によって、可溶化された封入体蛋白を、ただ２− １６時間、または、−晩撹拌しているだけで、ｒｌＧＦ−■の再生が可能になる 。その結果、はぼ３０−５０％の所期のＩＧＦ−Ｉ配座異性体の収量を得ること ができる。

図の簡単な説明 第１図は、大腸菌で生産されるＩ　ＧＦ−１と各種配座異性体の逆相クロマトグ ラフィーによる分離図であって、ここでは、本発明にしたがって、リジン先導配 列と、Ｍｅｔ−Ｌ７ｓ−ＩＧＦ−１融合蛋白中間体を用いている。

第２図は、大腸菌で生産されるＩＮｅｔ−ＩＧＦ−Ｔと各種配座異性体の逆相ク ロマトグラフィーによる分離図であって、ここでは、電荷を持つ先導配列という 利点のないＩＧＦ−１コ一ド配列を用いた。

発明の詳細な説明 本発明は、大腸菌やその他の高度の発現性を持つ宿主細胞系から、生物学的活性 を持つ、相当量のｒＩＧＦ−１を回収する新方法を与えるものである。本発明の 方法は、ｒＩＧＦ−Ｉのアミノ基末端に正に帯電した先導配列を含む、新規の融 合蛋白中間体を用いることによって、達成される。正に帯電した先導配列は、こ のｒｌＧＦ−１分子のアミノ基末端、すなわち、−ｅ＋−末端に正の電荷をさら につけ加える。しかし、もともと、このｎｅｔ−末端は、蛋白のすべてのアミノ 基末端同様、生物学的９Ｈ以下で、すでに正に帯電しているのである。驚くべき ことに、アミノ基末端に正に帯電した先導配列が加わると、再生の効率が上がり 、可溶化封入体ｒＩＧＦ−１が再生して、疑似配座異性体および・または集合体 に変移する傾向が最小限にとどまることが判明した。この方法は、所期の、生物 学的に活性の高い配座異性体を生ずるために同じシスティン結合パターンを要求 するＩＧＦ−Ｔ類似体にたいしても同様に有効である。

この所期の、生物学的に活性の高い配座異性体とは再生したｒＴＧＦ−Ｔ配座異 性体であり、これは、インビトロ受容体結合アッセイで、自然に見られるＩＧＦ と実質的に同様の活性を示す。できれば、先導配列は、精製前に除去することが 好ましい。

本発明の方法は、次の諸工程を経て行なわれる。

（１）本発明の先導配列を含むＩＧＦ−１またはそれの類似体の遺伝子をクロー ンし、次に、高度の発現性を持つ宿主細胞で発現させる。

いて、収穫・回収する。

（３）ｒｌＧＦ−１融合蛋白を活性型に再生する。

（４）ｒＩＧＦ−１融合蛋白をさらに精製してもよく、できれば均一なものとし てもよい。

さらに好ましくは、本発明の方法を次のように実行するのがよい。

（１）本発明の先導配列を含むＩＧＦ−Ｉまたはそれの類似体の遺伝子をクロー ンし、次に、高度の発現性を持つ宿主細胞で発現させる。

（２）発現された融合蛋白を、当業者にとって標準的な技法を用いて、収穫・回 収する。

（３１ｒｌＧＦ−１融合蛋白を活性型に再生する。

（４）本発明の先導配列を、ｒｌＧＦ−Ｉ融合蛋白から除去する。

（５）生じたｒｌＧＦ−１融合蛋白をさらに精製してもよく、できれば均一なも のとしてもよい。

本発明の方法において用いた新しい先導配列は、少なくとも１アミノ酸残基の長 さを持つ。できれば、先導配列は、１から１０アミノ酸残基の長さをであること が好ましく、さらにできれば、１から３アミノ酸残基の長さであることが好まし い。１アミノ酸先導配列が好ましいが、もつとも、３アミノ酸残基の長さの先導 配列でも、再生過程を促進するという点では、好ましてはいる。１アミノ酸長は 、単純で、取扱が簡単なので好ましい。

本発明の先導配列は、正に帯電したアミノ酸残基から（すなわち、先導配列のア ミノ基末端から）始まる。できれば、この正に帯電したアミノ酸残基は、リジン 、アルギニン、ヒスチジンから成るグループから選ぶことが好ましい。さらに好 ましくは、正に帯電したアミノ酸はリジンであることが望ましい。また、この先 導配列を、そのカルボキシル基末端またはアミノ基末端のいずれかから延長させ て、他のアミノ酸残基と結合させてもよい。できれば、これらの、他のアミノ酸 残基も正に帯電していることが好ましい。一番好ましいのは、これらの、他のア ミノ酸残基配列がリジン残基であることである。先導配列に付は加えられるアミ ノ酸残基の厳密な配列は、再生後先導配列除去のために任意に採用される方法に よって一部決まるが、これは、下記に論する指示事項に照らせば、当業者であれ ば明らかであろう。

できれば、先導配列は、先導配列を含む融合蛋白が再生した後で、除去するのが 好ましい。できれば、先導配列は、酵素を用いて除去するのが好ましい。先導配 列を除去するのに、酵素を用いる場合には、できれば、酸素による切断を阻害す る側鎖・を持つアミノ酸を先導配列に加えるのは避けた方がよい。さらに好まし くは、酵素は、ジアミノペプチダーゼである。先導配列を除去するのにジアミノ ペプチダーゼを用いる場合には、できれば、先導配列に、奇数個のアミノ酸を用 いることが好ましい。また、このような場合、さらに好ましくは、先導配列を延 長するのに、プロリンの使用は避けた方がよい。

もっと具体的に言うと、本発明の方法は、先ず、上記のような、本発明の先導配 列とともにＩ　ＧＦ−１あるいはＩ　ＧＦ−１類似体をクローンすることによっ て達成される。クローンするには、いくつかの既知の方法のどれを用いてもよい 。特定の宿主細胞系を用いた場合の最適法は、当業者には明らかであろう。

前述のように、ジアミノペプチダーゼを先導配列除去に用いる場合には、先導配 列に奇数個のアミノ酸を用いるのが好ましい。

こうすると、外来Ｉ　ＧＦ−１分子のアミノ酸末端に原核宿主細胞によって付加 されたメチオニン残基が、先導配列と同時に除去されるからである。ジアミノペ プチダーゼ、例えばカテプシンＣは、先導配列を除去する手段として特に好まし い。なぜなら、この酵素は、プロリン残基以降は切断しないからである。

したがって、先導配列の最後の２個のアミノ酸残基、例えば、リジン残基を先導 配列に使用した場合のＭｅｔ−Ｌ７ｓ−＋ＩＧＦ−１のリジン及びメチオニン残 基以降を切断した後では、カテプシンＣは、自動的に切断をストップする。この 特徴があるために、カテプシンＣを先導配列除去の手段として用いると、調節が 簡単である。

クローン後、Ｍｅｔ−先導−Ｉ　ＧＦ−Ｉを含む封入体は、可溶化され、回収さ れる。ここでも、この分野で既知の技術を用いる。本発明になる、正に帯電した 先導配列により、それほど厳しい条件でなくとも、ｐＨ１塩、尿素条件調節下で 撹拌することで、再生が可能になり、疑似配座異性体、ＩＧＦ−１集合体の形成 は大きく抑制される。再生中、ｐＨは、約８から約１１に保持することが好まし く、塩濃度は、約０から約ＩＭであることが好ましい。

先導配列は、精製前に、Ｔｏ＋−先導−Ｉ　ＧＦ−Ｉ分子から除去することが望 ましい。できれば、先導配列は、酵素的に除去するのが好ましい。酵素の選択、 除去の条件は、一つには、正に帯電した先導配列の選択によって決まるが、この ことは、当業者には明らかであろう。既知の精製法を使用できる。

下記の実施例は、本発明の理解を助けるために挙げるものであって、本発明の本 当の範囲は、付属の請求項に記載される。

ここに述べた操作について、本発明の骨子から外れることがなければ修正するこ とも可能である。

実施例１ リジン先導配列の付いたＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニング下記の合成Ｉ　ＧＦ− Ｉ遺伝子は、大腸菌宿主において高収量として直接発現するよう設計され、ｍｐ ２Ｇバクテリオファージにクローンされ、既知の技法を用いて、正確なりＮＡ配 列を確認した。次に、ＩＧＦ遺伝子ＤＮＡを、ＢｘｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ制限フラ グメントにたいするＸｂｒｌとしてｐｃＦＭ１１５６発現ベクターにクローンし た。

Ｘｂａ工　ＭｅｔＧｌｙＰｒｏＧｌｕＴｈｒＬｅｕＣｙｓＧｌｙＡｌａＧｌｕｌ ｏ　３０　５０ ＬｅｕＶａｌＡｓｐＡｌａＬｅｕＧｌ　ｎＰｈｅＶａｌｃｙｓＧｌｙＡｓｐＡｒ ｇＧｌｙＰｈｅＴｙｒ　ＰｈｅＡｓ　ｎＬｙｓＰｒｏＴｈｒＧｌｙＴｙｒＧｌｙ ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇＡｒｇＡｌａＰｒｏＧｌｎ↑ｈｒＧｌｙ工１ｅＶａ　 ｌＡｓｐＧｌｕｃｙｇｃｙｓＰｈｅＡｒ　ｇ　Ｓｅ　ｒ　ＣｙｓＡｓｐＬｅｕＡ ｒ　ｇＡｒｇＬｅｕＧ　ｌｕＭｅ　ｔＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＡＴＧ’ｌ’ＴＧ ＣＴＴＴＣＧＴＴＣ’ｌ’ＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴ買ＡＣＡＭＴＧ−？ ｙｒＣｙｓＡｌａＰｒｏＬｅｕｌ、ｙｓＰｒｏＡｌａｌ、ｙｓＳｅｒＡｌａ２ｎ ｄＥｎｄＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＡＡＧＴＣＴＧＣ ＴＴＭＴＡＧプラスミドｐｃＦＭ１１５６ＰＬは、記載されたｐＣＦＭ８３６か ら以下のように得ることができる。（アメリカ特許第４．７１０．４７３号参照 。

ここに引用することによってこの文献を本内容に取り込んだこととする）２個の 内在性Ｎｄｅｌ制限部位を破壊し、末端をＴ４ポリメラーゼ酵素で充填し、平滑 末端を結合させ、独特のプロモーター間のＤＮＡ配列を、ＰＬプロモーター（ア メリカ特許第４．７１０．４７３号参照）を含むｐｃｐｖ６３６から得た同様の フラグメントで置換し、独特の、ＣＩ＊ｌ制限部位と　Ｋｐｎｌの制限部位の間 の僅かなりＮＡ配列を、下記のオリゴヌクレオチドで置換する。

挿入されるＰＬプロモーターのＤＮＡ配列は下記の通りである。

ａｔｌＩ ジアミノペプチダーゼ酵素と共に使用されるＬｙｓ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を構築す るために、下記の配列の合成りＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。

Ｎｄｅニ ーＡＡＴＴＣＧＴＡＧＴＧ　３’ ５ｔＥＩ１ 、　次に、この配列を、ｐｃＦＭ１１５６−ＩＪ＋１ｌ−ＩＧＦ−１プラスミド に挿入した。これは、独特の制限部位Ｎｄｅ　ＩとＢｔｔＥｌｌとの間のＩ　Ｇ Ｆ−１遺伝子のアミノ末端のＤＮＡを置換して行なった。

ここに新しい構築体ｐｃＦＭ１１５６−Ｌｙ＋−ＩＧＦ−１はｍｅｌ−１７＋− ｇ１７−ｐｒｏ−、、、アミノ酸末端を持つ蛋白質を生産する。この配列は、ジ アミノペプチダーゼ酵素の典型的な基質であって、これによって生じた蛋白質加 水分解によって、自然界で見られるは乳類Ｉ　ＧＦ−Ｉのものと同じ　ｇ１７− ｐｒｏアミノ末端が得られる。

Ｎｌ２−Ｎｅｔ−Ｌ７ｓ−ＧＩ７−Ｐ＋ｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈ＋−Ｌｃｎ−↓ Ｇ１７−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈ＋−Ｌｅｕ−Ｍｃｔ−Ｌ７ｓ−ｒｌＧＦ−１を含 む封入体を大腸菌から分離した。収穫したベーストを、Ｇ１υｆｉｎホモジェナ イザーで破砕し、封入体を、遠心分離によって回収した。次に、封入体を、１％ デオキシコール酸で１度、水で１度洗浄した。

次に、洗浄した封入体を、８Ｍ尿素ｌＧ容量と共に、ｐＨ３，５で１時間撹拌し 、溶解させた。この低ｐＨによる可溶化によって、可溶化中のスルフヒドリル・ グループの自然酸化が抑制される。これは、最適な回収を得るにあたって重要で ある。

実施例３ 実施例２で述べた可溶化にしたがって、８Ｍ尿素溶液を１０倍に希釈し、最終的 に、［１，ｌ１Ｍ尿素中に０゜Ｉ−Ｑ、Ｓ　ｍｇ／ｍｌ　Ｍｅｔ−Ｌｙ＋−ｒｌ ＧＦ−１融合蛋白の濃度が得られるようにした。また、０．５ＭＮ５Ｃｌに調節 した。溶液のｐＨは、１０５に調節し、室温で数時間撹拌した。ｐＨと塩濃度の この結合が、最適な再生には不可欠である。というのは、ｐ）！　９．５であっ ても、塩がないと、適正な配座への折りたたみ効率は、５０倍低下するからであ る。

２時間の撹拌後、再生と酸化を、溶液のｐＨを５．２に調節することによって停 止させた。次に、溶液を、遠心またはろ過によって不溶物を除去した。不溶物を 除去した溶液の分液を、第１図に示したように、逆相クロマトグラフィーによっ て分析した。第１図から、所期の　＋ＩＧＦ−Ｉ再生産物、すなわち、ピーク２ Ｃが、ビーク１．２Ｂに代表される、著明な配座異性体よりもかなり上回ってい ることが明かである。所期の産物と混在している配座体の相対的量を下記の第１ 表に示す。

第１表 ２　ピーク１　２０．３１７　１５２７１００　２０．２０３　ピーク　２Ｂ　 ２１．８７５　２８２２６９　３．７３４　ピーク　２Ｃ２３，６２５３６８１ ５２０４８，６９次に、不溶物を除去した溶液は濃縮し、ＰＨ５，４，１０ｎｉ ｌ酢酸ナトリウム液で３０００　Ｍｙカットオフ膜により、ろ過した。

実施例４ カテプシンＣによるＭｅｔ−Ｌ４＋先導配列の除去実施例３の不溶物を除去し、 濃縮されたＭｅｔ−Ｌ７ｓ−ｒｌＧＦ−１融合蛋白溶液は、２０　ｍＭ酢酸ナト リウムバッファーｐＨ５，４を用いて、０．５−２　ｍｇ／ｍＬの間に調節した 。約１００／ｍＬの活性を含む、ジアミノベプンダーゼ牛膵臓カテプシンＣ（Ｅ Ｃ＃　３．４．１４．１）を、１０　ｍＭシステアミンに溶解して溶液とし、室 温で１５分インキュベートした。次に、この酵素溶液を、未精製のＭｅｌ−ＬＨ −ｒｌＧＦ−１融合蛋白溶液に加え、最終的に、０．０２５　Ｕ／ｍｌの活性の 溶液を得た。この反応を、室温で１晩（１２−１６時間）進行させた。

反応の度合は、高速イオン交換クロマトグラフィーによってモニターした。これ は、ＭｅｉＬＨ−ｒｌＧＦ−１融合蛋白にある余分の正電荷に基づいて、ｒｌＧ Ｆ−１切断産物から、Ｍｅｔ−Ｌ７ｔ−ｒｌＧＦ−１を分離する。Ｍｅｔ−Ｌ２ ｓ−ｒｌＧＦ−１融合蛋白の９０％以上のものが酵素的に切断され、天然の配列 のＩ　ＧＦ−１になった。

実施例５ 大腸菌蛋白、Ｉ　ＧＦ−１の疑似配座異性体、残留Ｍｒｔ−Ｌ７ｓ−ＩＧＦ−１ を除去する精製工程 切断混合物を、０．４５μ膜ろ過により不溶物を除去した後、Ｃ４誘導体シリカ をパックした標準クロマトグラフィー・カラム中にポンプで注入した。典型的に は、カラムは、精製に用いる大腸菌ペースト１ｋｇ当り　５００ｇのＣ４シリカ を含んでいた。

次に、ロードしたカラムを、カラムの２倍容量の２６％エタノール、１２．５　 ｍＭ　ＨＣＩ　ｔ’洗浄し、カラム０１０倍容量（７）　２６−３１％エタノー ル、１２．５　ｍＭ　）ＩＣＩ勾配で溶出した。

残留Ｍｅｔ−Ｌ７ｓ−ｒｌＧＦ−１融合蛋白を除去するために、イオン交換クロ マトグラフィーを実施した。所期の生物学的活性を持っｒＩＧＦ−１の配座異性 体を含む逆相カラムの分画を、Ｓ−セファ０−ス（商標）　（Ｐｈ暑ｒｍｘｃｉ ＊、　Ｕｐｐｓｇｌｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにアプライした。カラムには、３ ００１１Ｌの樹脂にっき１−の細胞ベースト産物をロードする。次に、このロー ドしたカラムを、８カラム容量の、５［１ｍＭ　Ｎ＊Ｃｌ含有２０　ｍＭ酢酸ナ トリウムΦバッフｙ−（ｐＨ５，４１テ洗浄した。次に、ｐＨ５，４（７）、２ ０　ｍＭ酢酸ナトリウム・バッファーに溶解した５０−２００　ｍＭ　Ｎ５Ｃｌ 勾配で溶出した。正の帯電量が多いので、Ｍｅｔ−Ｌ７ｓ−＋ＩＧＦ−１融合蛋 白は、天然配列のｒｌＧＦ−Ｔよりもしっかりと樹脂に結合し、所期のｒｌＧＦ −１産物からは取り除かれる。

Ｍｅｉ＋ＩＧＦ−１は、実施例１．２．３及び５に従って、大腸菌宿主細胞中で 生産された。ただし、ｌｌ１ｅｌｌ−ＩＧＦに先導配列を付加することはしなか った。この時の再生効率は極端に低かった。

そのため、さらに精製を行なうことをしなかった。次に、正に帯電した先導配列 なしに生産された、同じＭｅｔ−＋ＩＧＦ−１を、発明の背景で挙げたアメリカ 特許第４．５１１．５０３号および第４、５１８．２５６号に記載しであるもの と同様のスルフォン化法を用いて、再生させた。クロマトグラフィーによる分離 結果を第２図に示す。第２図から、ピーク１．２Ｂ及び３によって表わされる、 もっとも著明な配座異性体群の存在量は、本発明の先導配列を用いた場合の再生 配座異性体溶液の場合よりも大きいことが明らかである。所期のｒｌＧＦ−Ｉ再 生産物、すなわち、２Ｃの量はずっと少ない。所期の産物と混在して゛いる配座 体の相対量を、下の第■表に示す。

７　ピーク　１　２０．４９４　６０８３３０６　１４．９４９　ピーク２８　 ２３．５５９　４１９８８３６　１０．３１１０　ピーク　２Ｃ２４，５３９６ ９９９９８９１７，１９１３ピーク　３　２１７９３　６２２４４１２　１５． ２８５ＬＩＯＡ　、、ＯＬ　Ｘ 国際調査報告 Ｓ他＾、ＯＬ　Ｘ ａｔｔａｃｈｍ＠ｎｔ　ｔｏ　ＰＣＴ／ＬＩＳ９の／の４７３９ＩＯＦ１．ｆＧ Ｆｌ、ｚｎｓｕｌｘｎ−１ｚｋｅ（２ＶＩＤＯｒ１１．＊ｏｍａｔｏｍｅｃｎｎ Ｃ。

ｍｕ上ｚａｔｚｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｃｌ　ｇｅｎｅｓ、　５ｅｑｕｅｎｃＬ　 ｐｒ＠ＩｐｒＯ１，Ｐｒ曹、　ｐｒ６＊　ｍｃｔｔｖｅ。

ｍｅｔλ”ｔｙｒ　ｆｏｌｄ？、ａ口ｎｆｏｒｍ？、ｒｅｃｏｎｓｔｔ、ｂ工ｏ Ｌｏｇ７　ｓｅｔ工ｖ？、１ｅａｄｅｒ＋ＣｈａｒＱｅ＃ｇ　ｋｌｌｌ＃ＬＣ１ ｐｒ６ｔ＠Ｌｎ＃ｇ　ｐｏｌＩＬｔｌＶ？　ｃｈａｒｇｅ＃、ｔａｒ論１ｒｌａ 上ｇ　ｔＩＰｒｍｌｎ浮高■ ｐｕｒｉｆＬ　Ｌｎｇｕ上ｚｎ、ｆｏ工ｄ？、　ＤＡＰ、ｄｚａｍｚｎｏｐｅｐ ｔｉｄａｓｉｅ、Ｂｒａｖｅｒ、Ｓｔ＊ｐｈｅｎ。

Ｓａｇｓｅｎｆｅｉｄ、１４？。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の諸過程から成る、高発現性宿主細胞からのインシュリン様成長因子Ｉ 、または、その類似体の製法であって、上記インシュリン様成長因子Ｉはたはそ の類似体の遺伝子が、正に帯電した先導配列を含む方法。 （ａ）上記インシュリン様成長因子Ｉ、または、その類似体の遺伝子を高い発現 性を持つ宿主細胞にクローンする。 （ｂ）生じた組換えインシュリン様成長因子Ｉを、上記高発現性宿主細胞から収 集する。 （ｃ）上記組換えインシュリン様成長因子Ｉを生物学的活性を持つ配座に再生す る。
2. ２．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端のアミノ酸残基が、リジン、ア ルギニン、ヒスチジンから成るグループから選ばれる請求項１の方法。
3. ３．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端のアミノ酸残基がリジンである 請求項２の方法。
4. ４．上記の正に帯電した先導配列が、１から３アミノ酸残基の長さを持つ請求項 １の方法。
5. ５．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リジ ン、アルギニン、ヒスチジンから成るグループから選ばれる請求項４の方法。
6. ６．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リジ ンである請求項５の方法。
7. ７．上記の正に帯電した先導配列が、奇数個のアミノ酸残基から成る請求項１の 方法。
8. ８．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リジ ン、アルギニン、ヒスチジンから成るグループから選ばれる請求項７の方法。
9. ９．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リジ ンである請求項８の方法。
10. １０．上記の正に帯電した先導配列が、１個のアミノ酸残基と３個のアミノ酸残 基とから成るグループから選ばれるある個数のアミノ酸残基を含む請求項９の方 法。
11. １１．上記の正に帯電した先導配列がリジン残基を含む請求項１０の方法。
12. １２．上記の正に帯電した先導配列が１個のリジン残基から成る請求項１１の方 法。
13. １３．上記組換えインシュリン様成長因子Ｉ産物が精製される請求項１２の方法 。
14. １４．上記先導配列が、上記組換えインシュリン様成長因子Ｉから除去される請 求項１の方法。
15. １５．上記先導配列が、上記組換えインシュリン様成長因子Ｉから酵素によって 除去される請求項１４の方法。
16. １６．上記酵素がジアミノペプチダーゼである請求項１５の方法。
17. １７．インシュリン様成長因子またはその類似体、および正に帯電した先導配列 を含む融合蛋白。
18. １８．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リ ジン、アルギニンから成るグループから選ばれる請求項１７の融合蛋白。
19. １９．上記の正に帯電した先導配列のｍｅｔ−末端におけるアミノ酸残基が、リ ジンである請求項１８の融合蛋白。
20. ２０．上記の正に帯電した先導配列が、１−３アミノ酸残基の長さを持つ請求項 １９の融合蛋白。
21. ２１．上記の正に帯電した先導配列が、１アミノ酸残基の長さを持つ請求項２０ の融合蛋白。