KR19990022718A - 정확한 접힘 및 이황화 결합을 이용한 ｉｇｆ－ｉ 및 ｉｇｆｂｐ－３의 제조 방법 - Google Patents
정확한 접힘 및 이황화 결합을 이용한 ｉｇｆ－ｉ 및 ｉｇｆｂｐ－３의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)과 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3 (IGFBP-3)을 다시 접는 신규한 방법을 제공한다. 이 방법은 IGF-I 과 IGFBP-3 을 함께 공동접힘 반응액중에서 혼합하는 것을 포함한다. 본 발명의 공동접힘 방법은 실질적으로 두가지 분자에 대하여 정확하게 접혀진 단백질의 높은 수율을 유발하며, 재접힘의 역학을 변경시킨다. 본 발명의 방법은 정확하게 접혀진 IGF-I, IGFBP-3, 및/또는 IGF-I/IGFBP-3 복합체의 제조를 포함한다.
Description
성장 인자들은 규정된 집단의 표적 세포에서 광범위한 생물학적 반응 (예컨대 DNA 합성, 세포 분할, 특정 유전자의 발현, 등)을 자극하는 폴리펩티드들이다. 형질전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판에서 유도된 성장 인자 (PDGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I) 및 IGF-II 를 포함하여 다양한 성정 인자들이 이미 확인되었다.
IGF-I 과 IGF-II 는 아미노산 서열과 구조에서 관련되어 있으며, 각각의 폴리펩티드는 대략 7.5 킬로달톤 (Kd)의 분자량을 가지고 있다. IGF-I 은 성장 호르몬의 주요 효과를 조정하며, 그러므로 출생 후 성장의 일차적인 조정자이다. IGF-I 은 또한, 다양한 다른 성장 인자들로 세포를 처리하면 IGF-I 의 생성이 증가되는 것으로 보아 다양한 성장 인자들의 작용에 관여한다. 대조적으로, IGF-II 는 태아 성장에 주된 역할을 하는 것으로 여겨진다. IGF-I 과 IGF-II 는 둘다 인슐린과 유사한 활성을 가지고 있으며 (그러므로 이것들의 이름이 유래됨), 신경 조직, 근육, 재생 조직, 골격 조직 및 다양한 다른 조직의 세포들에 대하여 세포분열을 촉진한다 (세포 분할을 자극한다).
대부분의 성장 인자들과는 달리, IGF 들은 순환계에 실질적인 양 (대부분의 양)이 존재하며, 단지 아주 소량의 IGF 만이 순환계에서 또는 다른 체액에서 자유롭다. 대부분의 순환하는 IGF 는 IGF-결합 단백질-3 (IGFBP-3)에 결합되어 있다. IGF-I 은 비정상적인 성장-관련 질환들, 예를 들면 하수체 거대증, 선단비대증, 소인증 및 다양한 성장 호르몬 결핍증을 진단하기 위하여 혈청내에서 측정될 수 있다. 비록 IGF-I 이 많은 조직에서 생성되기는 하지만, 대부분의 순환하는 IGF-I 은 간에서 합성되는 것으로 여겨진다.
거의 모든 IGF 는 IGF-I 또는 IGF-II, IGFBP-3, 산 가변성 하위단위체(ALS)로 불려진 보다 큰 단백질 하위단위체로 구성되는 비-공유결합된 3원 복합체의 형태로 순환한다. 이 3원 복합체는 각각 등몰량의 세가지 성분으로 구성된다. ALS 는 직접적으로는 IGF-결합 활성을 가지고 있지 않으며, 단지 IGF/IGFBP-3 2원 복합체에만 결합하는 것으로 나타난다. IGF + IGFBP-3 + ALS 의 3원 복합체는 대략 150 Kd 의 분자량을 가지고 있다. 이 3원 복합체는 순환계에서 유리 IGF 의 농도의 급격한 변화를 방지하는 IGF-I 과 IGF-II 에 대한 저장소 및 완충제로서 작용하는 것으로 여겨진다 (Blum et al. (1991) 임상적 지시자로서의 혈장내 IGFBP-3 수준 in MODERN CONCEPTS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS, pp. 381-393, (E.M. Spencer, ed., Elsevier, New York)).
대부분의 순환하는 IGF-I, IGF-II 및 IGFBP-3 은 복합체의 형태이고, 따라서 검출가능한 유리 IGF 는 거의 없다. 더욱이, 혈액내에 유리 IGF 가 높은 수준으로 있는 것은 바람직하지 않다. 유리 IGF 의 높은 혈액내 수준은 IGF 의 인슐린-유사 활성으로 인한 심각한 저혈당증을 유발시킨다. IGF 및 IGFBP-3 과는 대조적으로, 순환계에 들어가는 모든 IGF/IGFBP-3 복합체가 즉시 3원 복합체를 형성하는 것을 확실하게 보장하는 유리 ALS 의 실질적인 푸울이 혈장내에 있다.
IGFBP-3 이 순환계내의 가장 흔한 IGF 결합 단백질인 반면, 최소한 다섯 개의 다른 구별되는 IGF 결합 단백질들 (IGFBPs)이 다양한 조직 및 체액에서 확인되었다. 그러나 이들 단백질들이 IGF 와 결합하긴 하지만, 이것들은 각각 별도의 유전자로부터 기원하며 구별되는 아미노산 서열을 가지고 있다. 그러므로, 결합 단백질들은 단순하게 공통 전구체의 유사체 또는 유도체가 아니다. IGFBP-3 과는 달리 다른 순환하는 IGFBPs 는 IGF 들로 포화되지 않는다. IGFBP-3 이외의 어떤 IGFBP 도 150 Kd 의 3원 복합체를 형성할 수는 없다.
IGF-I 및 IGFBP-3 은 천연 공급원으로부터 정제되거나 또는 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 사람 혈청으로부터 IGF-I 을 정제하는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Rinderknecht et al., (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73:2365-2369). 재조합 방법에 의하여 IGF-I 을 제조하는 것은 1984년 12월에 공고된 유럽 특허 제 0,128,733 호에 나타나 있다. IGFBP-3 은 박스터 등에 의해 제시된 것과 같은 방법을 사용하여 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다 ((1986) 사람 혈장으로부터 얻어지는 성장 호르몬-의존성 인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 결합 단백질은 다른 사람 IGF 결합 단백질들과 구별된다, Biochem. Biophys. Res. Comm. 139:1256-1261). IGFBP-3 은 좀머 등에 의해 논의되는 바와 같이 재조합 유기체에 의하여 합성될 수 있다 (supra, pp. 715-728). 재조합 IGFBP -3 은 1:1 몰비로 IGF-I 에 결합한다.
쥐와 돼지의 상처에 IGF-I/IGFBP-3 복합체를 국소 투여하는 것은 IGF-I 을 단독으로 투여하는 것보다 상당히 더 효과적이다 (Sommer et al., supra). 하수체가 절제되어 있는 쥐, 난소가 절제되어 있는 쥐, 그리고 정상적인 쥐에게 IGF-I/IGFBP-3 복합체를 피하 투여하는 것과, 또 게잡이 원숭이에게 정맥내 투여하는 것은 실질적으로 단독으로 투여된 IGF-I 의 저혈당증 효과를 방지해준다.
IGF-I 과 IGFBP-3 은 둘다 개별적으로 측정되었을 때 이황화 이소머라제 활성을 가지고 있다. 그러나, 두가지 단백질의 혼합물은 실질적으로 이 활성을 억제한다 (Koedam and Leo van den Brande (1994) 인슐린-유사 성장 인자들 (IGFs) 및 IGF 결합 단백질-3 은 이황화 이소머라제 활성을 나타낸다, Biochem. Biophys. Res. Comm. 198:1225-1231).
유전 공학으로 인하여 재조합 발현 시스템에 의하여, 특히 대장균 (Escherichia coli)과 같은 원핵생물에서의 발현에 의하여 클론된 DNA 에 의해 코드화된 폴리펩티드를 다량으로 제조하는 것이 가능해졌다. 그렇게 재조합되지 않는다면 숙주 세포에 의해 전혀 생성되지 않거나 또는 단지 제한된 양으로 생성된 발현된 이종성 펩티드는 숙주 세포의 총 세포성 폴리펩티드의 상당한 비율을 차지할 것이다.
클론된 DNA 들이 고수준으로 재조합 발현 시스템에서 발현될 때에 여러 가지 문제점들이 자주 발생한다. 숙주 세포의 세포질에서 과잉 발현된 폴리펩티드들은 때로 불용성 봉입체 또는 굴절체 (refractile bodies) 로서 축적되며, 특히 박테리아가 숙주 세포로서 활용될 때 그러하다 (Williams et al. (1982) Science 215:687-689; Schoner et al. (1985) Biotechnology 3:151-154). 그러나, 봉입체 형성은 박테리아 발현 시스템에만 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 초파리 (Drosophila)의 크뤼펠 유전자 생성은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성될 때 봉입체를 형성할 수 있다. 봉입체 또는 굴절체의 형태로 축적된 폴리펩티드들은 생물학적 또는 생화학적 검정에 대해서는 상대적으로 유용성이 없다. 이런 불용성 물질이 활성의 가용성 폴리펩티드로 전환되기 위해서는 느리고 어려운 가용화 및 재접힘 프로토콜이 필요하며, 이런 프로토콜들은 폴리펩티드의 제조 비용을 증가시키고 때로는 생물학적으로 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전체 수율을 크게 감소시킨다.
이종성 폴리펩티드들이 가용성 형태로 숙주 세포의 세포질에서 발현되는 때조차도, 폴리펩티드들은 부정확한 접힘 때문에 생물학적으로 활성을 나타내지 못할 수 있다. 부정확한 접힘은 숙주 세포의 세포질에서 또는 단리 과정중에 발생할 수 있다.
생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 재조합 발현 시스템으로부터 얻을 때 나타나는 고유의 어려움은 폴리펩티드가 시스테인 잔기를 함유하고 있을 때, 예를 들면 IGF-I 가 있을 때 증가된다. IGF-I 은 6 개의 시스테인 잔기를 함유하고 있는데, 이것들은 모두 분자간 이황화 결합을 형성하며, 이런 결합들은 단백질의 활성 형태를 안정화시키는 것으로 여겨진다. IGF-I 내에 있는 시스테인 잔기들은 부정확한 이황화 결합을 형성할 수 있다. 즉, 시스테인 잔기들 사이에 형성된 이황화 결합은 천연 IGF-I 에서는 발견되지 않는다. 부정확한 이황화 결합을 함유하고 있는 IGF-I 분자들은 생물학적 활성이 감소되어 있다 (Raschdorf, et al. (1988) Biomed. Env. Mass Spectros. 16:3-8).
가용성 폴리펩티드의 양은 발효 온도가 30 ℃ 이하로 낮아지는 경우 대장균 재조합 발현시 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 과정은 봉입체로부터 폴리펩티드들이 복원되기 위한 대체 방법으로서 유용하지만, 효과적으로 30 ℃ 이하에서 작동하는 발현 시스템을 필요로 한다. 발표온도의 감소가 기간을 장기화시켜서 발효 비용이 증가하는 동시에 배양물이 오염될 위혐도 증가하기 때문에 이 과정은 상업적으로는 실현가능하지 않다.
단백질을 다시 접는 (refolding) 방법은 당해 기술 분야에 많이 알려져 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 4,511,502 호, 4,511,503 호 및 4,512,922 호에는 봉입체로부터 회수된 단백질의 재접힘에 대하여 단지 약간 변형시키면서 보편적으로 적용될 수 있는 것으로 간주되는 방법들이 설명되어 있다. 이들 방법에서는 일반적으로 적절하지 못하게 접혀진 단백질들의 구조를 파괴하기 위하여 찾아낸 다음에, 약한 분자간 힘들, 즉 수소 결합, 소수성 상호작용, 및 이온 결합이 단백질을 그것의 적절한 형태로 접을 수 있게 한 후, 산화에 의하여 정확한 이황화 결합이 형성되도록 한다.
그러한 한 가지 방법에서, 다시 접혀질 단백질은 단백질의 시스테인 부분이 전 정제 과정을 통해서 환원제의 포함에 의하여 유리 술프히드릴기로 유지되는 조건하에서 정제된다. 이 방법으로, 정확하지 못한 분자간 이황화 결합이 없을 때 정제 과정 동안에 단백질이 다시 접히는 것이 가능해진다. 그런 다음 환원제가 희석되어 다시접혀진 단백질이 공기 또는 약간의 다른 산화제의 존재하에 이황화 결합을 형성하는 것이 가능해진다. 이 방법은 대부분의 정제 방법에 쉽게 혼용될 수 있으며, 상대적으로 복잡하지 않은 3 차 구조를 가지고 있는 재조합 단백질에 대해 가장 적절하게 사용된다.
다른 접근법은 술프히드릴 화합물의 환원 형태 (R-SH) 및 산화 형태 (R-S-S-R) 두가지가 모두 있을 때 단백질을 다시 접는 것이다. 이 방법으로는 이황화 결합이 전 정제 과정을 통해서 형성되고, 파괴되고, 다시 형성되는 것이 가능하다. 술프히드릴 화합물의 환원 및 산화 형태는 재접힘 과정중에 단백질의 모든 중간 형태가 가용성인 상태로 유지되는 변성력을 충분하게 가지고 있는 완충액 상태로 제공된다. 우레아가 적당한 변성제로서 제안되는데, 왜냐하면 우레아가 단백질이 정확한 형태를 취할 수 있고 또한 접힘 중간체의 용해도를 유지하는 것을 가능하게 해주는 중간 변성력을 가지고 있기 때문이다. 이 접근법은 다시 접혀져야 하는 단백질이 상대적으로 복잡하지 않은 접힘 패턴을 가지고 있는 경우에 가장 효과적이다.
보다 어려운 재접힘 상황에 대해 사용될 수 있는 다른 접근법은 단백질이 합성되는 동안 또는 단리되는 동안 형성될 수 있는 모든 이황화 결합을 파괴하고, 그런 다음 단백질의 유리 술프히드릴 기를 유도하는 것이다. 유리 술프히드릴은 술폰화에 의하여 유도되는데, 이것은 이황화 결합의 형성을 차단한다. 그런 다음 단백질은 약한 변성제중에서 다시 접혀지고, 그런 다음 탈술폰화는데, 이것은 정확한 이황화 결합이 형성되는 것을 가능하게 한다. 탈술폰화는 술프히드릴 화합물이 있을 때 일어난다. 화합물의 상응하는 산화 형태가 소량으로 존재하는 것은 적당한 이황화 결합이 무상으로 남아있음을 확증해줄 것이다. pH 는 술프히드릴 화합물이 최소한 부분적으로 이온화되어 술포네이트의 친핵성 치환을 증가시킬 수 있을 정도의 값으로 변경된다, 즉 증가된다.
이들 재접힘 방법들은 보편적인 응용성면에서 실제적인 한편으로, IGF-I 을 사용했을 때 특별히 효과적인 것으로 보이지는 않으며, 수행하기가 어렵거나 또는 귀찮을 수도 있다.
재접힘 방법들은 IGF-I 에 특이적인 것으로 발표되어 있다. PCT 공보 WO 91/02807, WO 93/11240 및 WO 93/19084 에는 각각 재조합적으로 발현된 IGF-I 단백질의 재접힘 방법이 개시되어 있다.
WO 91/02807 에는 IGF-I 융합 단백질이 개시되어 있는데, 이 단백질에서는 양성 전하의 아미노산 서열이 IGF-I 의 아미노-말단에 융합되어 있다. 아미노-말단 첨가는 재접힘을 도와주고, 그 결과 정확하게 접혀진 단백질의 수율이 약 50 % 로 얻어진다. 이 접근법은 천연 IGF-I 을 얻기 위하여 아미노-말단 융합 펩티드를 절단하고 정제하는 별도의 단계를 필요로 한다.
WO 93/11240 에는 화학주성제 (chaotropic agent), 유기 용매, 및 알칼리 pH 의 환원제를 함유하고 있는 단일 용액중에서 IGF-I 단백질을 다시 접는 방법이 개시되어 있으며, 이 방법으로 정확하게 접혀진 단백질이 85 % 정도나 많이 얻어진다.
WO 93/19084 에는 재조합적으로 제조된 IGF-I 을 세 단계의 재접힘 프로토콜을 활용하여 다시 접는 방법이 개시되어 있다. 부적절하게 접혀진 met-IGF-I, 즉 아미노-말단에 메티오닌이 있는 IGF-I (이 메티오닌 잔기는 성숙한 IGF-I 을 얻기 위해서 제거되어야 한다)은 변성 용액에 용해된다. 그런 다음 산화제가 첨가되어 산화환원 용액이 형성된다. 추가로 환원제가 첨가되어 이황화 교환이 증가되고 용액은 밤새 인큐베이트된다. 이 방법의 결과 약 30 % 까지 정확하게 접혀진 단백질이 얻어진다. 이 단백질은 아미노-말단 메티오닌 잔기를 제거하기 위하여 추가로 처리되어야 한다.
최근에 이르러, 호버 등은 천연 IGFBP-1 을 첨가하는 것을 이용하는 IGF-I 의 재접힘 방법을 발표하였다 ((1994) 인슐린-유사 성장 인자의 접힘은 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질에 의하여 열역학적으로 조절된다 Biochemistry 33:6758-6761). 천연 IGFBP-1 을 환원된 IGF-I 폴리펩티드에 산화환원 조건하에 첨가하면 그 결과 천연 IGF-I 이 89 % 까지 생성된다. 이 방법에서는 IGFBP-3 의 사용은 언급되지 않았고, 또 펼쳐진 IGFBP 들의 사용에 대해서도 언급되지 않았다.
당해 기술분야에 알려져 있는 재접힘 방법들은 모두 정확하게 접혀진 단백질의 수율을 100 % 보다 훨씬 더 적게 만든다. 그런 다음 이들 방법으로부터 제조된 이종성 혼합물은 추가로 정제되어야 하며, 그 과정은 시간 소모적일 수 있고 및/또는 비용이 많이 든다.
그러므로 당해 기술분야에는 정확한 이황화 결합을 가지는 정확한 형태로 IGF 와 IGFBP-3 을 다시 접는 간단하고, 신속하며, 매우 효과적인 방법에 대한 필요가 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 두 개의 폴리펩티드를 함께 접음으로써 그 결과 적절하게 접혀진 단백질들이 매우 많이 얻어지는, IGF-I 과 IGFBP-3 을 다시 접기 위한 신속하고 매우 효과적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 천연 IGF 및 IGFBP-3 의 정제된 복합체를 제조하는 간단하고 매우 효과적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 전 명세를 통해 인용된 특허, 특허 출원 및 공보는 참조용이다.
본 발명의 개요
본 발명의 한 측면으로, IGF-I 및 IGFBP-3 을 다시 접는 신속하고 매우 효과적인 방법이 제공되며, 또한 천연 IGF-I/IGFBP-3 을 얻기 위한 효과적인 방법이 제공된다. 본 발명은 추가로 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체로부터 천연 IGF-I 과 천연 IGFBP-3 을 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면으로, IGF-I 을 다시 접고, 그로써 매우 높은 수율로 천연 IGF-I이 얻어지는 신속하고 매우 효과적인 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 IGFBP-3 을 다시 접고, 그 결과 천연 IGFBP-3 을 증가된 수율로 얻을 수 있는 신속하고 매우 효과적인 방법을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 적절하게 접혀진 활성 단백질의 제조 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I) 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-3 (IGFBP-3) 폴리펩티드의 재접힘 (refolding)에 관한 것이다.
도 1 은 사람 IGF-I 의 아미노산 서열을 도시한다.
도 2 는 사람 IGF-I 을 코드하는 누클레오티드 서열을 도시한다.
도 3 및 4 는 IGFBP-3 에 대한 2 개의 다른 아미노산 서열을 도시한다.
도 5, 6 및 7 은 사람 IGFBP-3 을 코드하는 3 개의 다른 누클레오티드 서열을 도시한다.
도 8 은 효모의 유비퀴틴 가수분해 효소 (YUH)를 코드하는 누클레오티드 서열을 도시한다.
도 9 및 10 은 IGF-I 과 IGFBP-3 의 공동접힘의 결과를 도시한다. 검은 색 다이아몬드는 각각 IGF-I 또는 IGFBP-3 단독의 재접힘을 나타내고, 하얀색 다이아몬드는 공동접힘의 결과를 나타낸다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 목적으로 한다. 실시예들은 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 없다.
발명의 개시
재조합 발현 시스템에서 높은 수준으로 발현된 단백질들은 부적절한 접힘 및 부정확한 이황화 결합 형성 때문에 자주 낮거나 또는 검출할 수 없는 생물학적 활성을 나타낸다. 본 발명은 매우 높은 효율성으로 재조합적으로 제조된 IGF-I 및 IGFBP-3 을 신속하게 다시 접고, 그 결과 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 이 얻어지는 신규한 방법을 제공한다. 놀라울만한 결과로, 본 발명자들은 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물의 산화, 즉 공동접힘 [변성 및 환원 조건하에서 펼쳐진 또는 적절하지 못하게 접혀진 IGFBP-3 과 펼쳐진 또는 적절하지 못하게 접혀진 IGF-I 과의 조합, 그런 다음의 산화]은 두가지 단백질에 대한 재접힘 효율의 상조적 증가를 유발하였고, 그 결과 거의 100 % 의 천연 IGF-I 과 매우 높은 백분율의 천연 IGFBP-3 이 얻어졌음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 예상외로 재접힘의 역학이 특히 IGFBP-3 의 접힘과 관련하여 실질적으로 변경되었고, 그 결과 재접힘에 필요한 시간이 상당히 감소되었음을 발견하였다. 이들 결과는 IGF-I 의 이황화 이소메라제 활성 (이황화 결합을 파괴하고 재형성하는 것을 포함하고 단백질 재접힘을 보조할 수 있는 효소적 활성)이 등몰량의 IGFBP-3 의 첨가에 의해 억제되는 것으로 알려져 있기 때문에 (Koedam and Leo van den Brande, supra), 특히 놀라운 것이었다.
본 발명은 또한 재조합 발현 시스템으로부터 정제된 천연 IGF, 천연 IGFBP-3 및 천연 IGF/IGFBP-3 복합체를 제조하기 위한 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명에 따르는 IGF-I 과 IGFBP-3 의 공동접힘은 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체의 형성을 유발한다. 이들 복합체들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 간단한 방법을 사용하여 접힘 반응의 모든 부적절하게 접혀진 단백질로부터 쉽게 단리될 수 있다. 필요에 따라 IGF-I 과 IGFBP-3 은 각각 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들에 의해 쉽게 추가로 단리되고 정제될 수 있다.
정의
인슐린-유사 성장 인자 또는 IGF 는 그것에 한정되는 것은 아니지만 IGF-I 및 IGF-II 를 포함하는 인자들의 패밀리를 포함한다. IGF 는 약 7.5 Kd 의 분자량을 가지는 폴리펩티드이다. IGF 는 자연적으로 발생하는 IGF-I 또는 IGF-II, 그것들의 유사체 또는 변이체, 및 IGF-I 또는 IGF-II 와 다른 아미노산 서열 사이의 융합물을 포함한다. IGF 는 천연 공급원으로부터 얻어지거나 또는 재조합 수단에 의하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-3 또는 IGFBP-3 은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, 및 IGFBP-6 을 포함하는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질의 패밀리의 일원이다. IGFBP-3 은 천연 공급원으로부터 얻어지거나 또는 재조합 수단에 의하여 제조될 수 있다. IGFBP-3 은 IGF 및 ALS 로서 알려져 있는 세 번째 분자와 복합체를 형성한다.
본원에서 사용되는 천연 IGF-I 은 적절하게 접혀져 있고 정확한 이황화 결합만을 함유하는 천연 발생 IGF-I, 그것의 유사체 및 변이체를 포함하는 IGF-I 로서 규정된다. 정확한 이황화 결합은 아미노산 잔기 C6-C48, C47-C52, 및 C18-C61 사이에서, 또는 IGF-I 의 유사체 및 변이체에서 상기 아미노산 잔기들의 동족체 사이에서 형성된다. 천연 IGF-I 은 생물학적으로 활성이다.
불용성 IGF-I 은 숙주 세포내에 포함되거나 또는 그렇지 않으면 숙주 세포와 관련된 침전된 또는 응집된 IGF-I 을 말하며, 부정확한 또는 형성되지 않은 이황화 결합을 가지고 있는 생물학적으로 비활성인 형태로 추정된다. 불용성 IGF-I 은 봉입체 또는 굴절체에 함유될 수 있다, 즉 상 대비 현미경하에서 보일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
부적절하게 접혀진 IGF-I 은 부정확한 또는 형성되지 않은 이황화 결합을 가지고 있는 생물학적으로 비활성인 형태의 IGF-I 을 말한다. 부적절하게 접혀진 IGF-I 은 그러나 반드시 불용성이지는 않을 것이다.
불용성 IGFBP-3 은 숙주 세포내에 포함되거나 또는 그렇지 않으면 숙주 세포와 관련된 침전된 또는 응집된 IGFBP-3 을 말하며, 부정확한 또는 형성되지 않은 이황화 결합을 가지고 있는 생물학적으로 비활성인 형태로 추정된다. 불용성 IGFBP- 3 은 봉입체 또는 굴절체에 함유될 수 있다, 즉 상 대비 현미경하에서 보일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
부적절하게 접혀진 IGFBP-3 은 부정확한 또는 형성되지 않은 이황화 결합을 가지고 있는 생물학적으로 비활성인 형태의 IGBP-3 을 말한다. 부적절하게 접혀진 IGFBP-3 은 그러나 반드시 불용성이지는 않을 것이다.
본원에서 사용된 천연 IGFBP-3 은 적절하게 접혀지고 정확한 이황화 결합만을 함유하는 자연 발생 IGFBP-3, 그것의 유사체 및 변이체를 포함한다. 천연 IGFBP-3 은 생물학적으로 활성이다.
본원에서 사용되는 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체 는 천연 IGF-I 과 천연 IGFBP-3 의 비-공유적으로 결합된 복합체로서 규정된다.
본원에서 사용되는 환원제는 술프히드릴기를 환원 상태로 유지하고 분자간 또는 분자내 이황화 결합을 환원시키는 모든 화합물 또는 물질로서 규정된다. 허용되는 환원제로는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온이 있으며, 이것들에만 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 산화제 는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 모든 화합물 또는 물질로서 규정된다. 허용되는 산화제로는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨, 및 산소가 있으며, 이것들에만 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 변성 시약 또는 변성제 는 단백질의 가역적인 펼쳐짐을 유발할 모든 화합물 또는 물질로서 규정된다. 변성 시약 또는 변성제의 강도는 특정 변성 시약 또는 변성제의 성질 및 농도 두가지에 의하여 측정될 것이다. 허용되는 변성 시약 또는 변성제로는 케이오트로프 (chaotropes), 계면활성제, 유기물, 물과 혼화될 수 있는 용매, 인지질, 또는 이러한 제제들의 둘 또는 그 이상의 조합을 들 수 있다. 허용되는 케이오트로프로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 우레아, 구아니딘 및 티오시안산 나트륨이 있다. 유용한 계면활성제로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 소디움 도데실 술페이트, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 트윈 또는 트리톤 계면활성제)와 같은 강한 계면활성제, 순한 비-이온성 계면활성제 (예컨대 디기토닌), N-[2,3-(디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄과 같은 순한 양이온성 계면활성제, 순한 이온성 계면활성제 (예컨대 소디움 콜레이트 또는 소디움 데옥시콜레이트) 또는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 술포베타인 (양성이온), 3-(3-클로르아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 술페이트 (CHAPS), 및 3-(3-클로르아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 술포네이트 (CHAPSO)를 포함한 양성 이온성 계면활성제가 있다. 유기물, 물과 혼화될 수 있는 용매, 예컨대 아세토니트릴, 저급 알칸올 (특히 C2-C4알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올 (특히 C2-C4알칸디올, 예컨대 에틸렌-글리콜)도 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 자연 발생 인지질, 예를 들면 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체, 예를 들면 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본원에서 사용되는 재접힘 은 폴리펩티드의 적절하지 못하게 접혀진 또는 펼쳐져 있는 상태로부터 그것의 천연의 적절하게 접혀진 형태로 폴리펩티드를 전환시키기 위해 고안된 모든 과정 또는 방법을 말한다.
본원에서 사용되는 공동접힘 은 특히 상호간에 상호작용하는 최소한 두 개의 폴리펩티드를 사용하고 결과적으로 펼쳐 있는 또는 부적절하게 접혀진 폴리펩티드들을 천연의 적절하게 접혀진 폴리펩티드들로 전환시키는 재접힘 과정, 반응, 또는 방법을 말한다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 IGF-I 과 IGFBP-3 을 함께 접어서, 그 결과 두 개의 단백질의 신속하고 매우 효과적인 재접힘을 유발함으로써 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 을 제조하는 데 있으며, 나아가 천연 IGF-I, IGFBP-3 및 IGF-I/IGFBP-3 복합체를 정제하는 간편화된 방법을 포함한다. 본 발명은 다음과 같이 수행될 수 있다 :
a) IGF-I 과 IGFBP-3 이 약 1:3 내지 3:1 의 몰비로 조합된 후, 변성제 및 환원제를 사용하여 변성되고 환원되거나, 또는 IGF-I 과 IGFBP-3 이 개별적으로 변성되고 환원된 후 약 1:3 내지 3:1 의 몰비로 조합되어 IGF-I/IGFBP-3 복합체가 형성된다;
b) 그런 다음 산화제가 단계 (a) 의 IGF-I/IGFBP-3 혼합물에 첨가된다;
c) 임의로 IGF-I/IGFBP-3 복합체가 IGF-I/IGFBP-3 공동접힘 혼합물로부터 정제될 수 있다;
d) 임의로 IGF-I 과 IGFBP-3 이 개별적으로 복합체로부터 정제될 수 있다.
본 발명에 따라 함께 접혀지기 위한 IGF-I 과 IGFBP-3 은 다양한 고발현 시스템에서 다양한 숙주 세포, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 박테리아, 효모, 곤충 및 포유류 셀라인을 활용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, IGF-I 과 IGFBP-3 은 박테리아 숙주 세포에서 제조된다. 보다 바람직한 것은 IGF-I 과 IGFBP-3 이 대장균 숙주 세포, 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니지만 대장균 스트레인 W3110DE3 에서 제조되는 것이다.
숙주 세포들은 IGF-I 또는 IGFBP-3 을 코드하는 DNA 를 함유하고 있는 발현 벡터로 형질전환된다. 숙주 세포들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 기법들, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 박테리아나 효모 숙주 세포에 대해서는 CaCl2, 곤충 또는 포유류 숙주 세포에 대해서는 CaPO4, 또는 모든 숙주 세포 유형에 대해서 일렉트로포레이션 기법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 숙주 세포에 대한 형질전환 방법들은 샘브룩 등과 오스벨의 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Sambrook et al., (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor; Ausubel (1987) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley ＆ Sons, New York).
IGF-I 또는 IGFBP-3 을 코드하는 DNA 를 함유하고 있는 발현 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 방법에 의하여 구성될 수 있다. IGF-I 또는 IGFBP-3 을 코드하는 DNA 는 천연 공급원, 예컨대 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 나아가, IGF-I 또는 IGFBP-3 의 변이체들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법, 예컨대 부위-특정 돌연변이 생성법에 의하여 제조될 수 있다. 변이체들의 제조 방법은 샘브룩과 오스벨의 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Sambrook, supra and Ausubel, supra].
형질전환된 미생물 숙주 스트레인들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 탄소, 질소, 및 무기 염들의 동화될 수 있는 공급원을 함유하고 있는 액체 배지중에서 배양된다. 형질전환된 곤충 또는 포유류 세포들은 탄소, 질소, 및 무기염의 동화될 수 있는 공급원을 함유하고 있고, 또 임의로 비타민, 아미노산, 성장 인자, 및 당해 기술분야에 알려져 있는 다른 단백성 배양 보충물을 함유하고 있는 액체 배지중에서 배양된다. 숙주 세포들의 배양을 위한 액체 배지에는 임의로 그것에 한정되는 것은 아니지만 발현 벡터를 함유하고 있는 숙주 세포를 선택하기 위한 항생물질을 포함하여 바람직하지 못한 미생물 및/또는 화합물의 성장을 방지하기 위한 항생물질 또는 항진균제가 함유될 수 있다.
IGF-I 및 IGFBP-3 은 당해기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법들에 의하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 정상적으로, 박테리아 숙주 세포에서 생성된 IGF-I 또는 IGFBP-3 은 (봉입체의 형태로) 거의 녹지 않거나 불용성이다. 불용성 단백질인 경우에, 단백질은 원심분리에 의하여 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있다. 거의 녹지 않는 단백질인 경우에는, 그것에만 한정되는 것은 아니지만 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 같은 화합물들이 부분적으로 가용성인 단백질의 침전을 유도하기 위하여 첨가될 수 있다. 그런 다음 침전된 단백질은 원심분리에 의하여 편리하게 수집될 수 있다.
다음 단계로 불용성의 또는 침전된 IGF-I 또는 IGFBP-3 이 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 많은 제제들중 어느 것을 사용하여 용해될 수 있다. 바람직하게는 IGF-I 또는 IGFBP-3 은 우레아 또는 구아니딘 염산염을 이용하여 용해된다.
IGF-I 또는 IGFBP-3 이 융합 단백질로서 제조되는 경우에, 융합 서열은 임의로 제거될 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의하여, 바람직하게는 효소적 절단에 의하여 이루어질 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 이루어질 수 있다. 융합 서열의 제거를 위해 사용되는 효소의 선택은 융합의 주체성에 의해 결정될 것이고, 그 때의 반응 조건은 당업자에게 분명하듯이 선택되는 효소에 의해 특정될 것이다. 절단된 IGF-I 또는 IGFBP-3 은 계속해서 잘 알려져 있는 방법들에 의하여 절단된 융합 서열로부터 정제될 수 있다. 그러한 방법들은 당업자에게 드러나는 바대로 융합 서열의 주체 및 성질에 의하여 결정될 것이다. 정제 방법으로는 그것들에만 한정되는 것은 아니지만, 크기-축출 크로마토그래피, 소수성 반응 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 또는 투석이 있다.
IGF-I 또는 IGFBP-3 은 바람직하게는 단백질 용액으로부터 DNA 를 제거하기 위하여 추가로 정제된다. DNA 는 당해 기술분야에 알려져 있는 여러 가지 방법들 중 어느 하나에 의하여, 예컨대 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 제거될 수 있으며, 바람직하게는 프로타민 술페이트를 이용한 침전법에 의하여 제거된다. IGF-I 또는 IGFBP-3 은 원심분리 또는 여과법과 같은 방법들을 사용하여 침전된 DNA 로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 따라 함께 접혀지기 위한 IGF-I 또는 IGFBP-3 은 직접 DNA 를 제거한 후에 사용될 수 있거나, 또는 추가로 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 정제 및/또는 농축될 수 있다. 상대적으로 불순한 (미정제) IGF-I 및 IGFBP-3 의 공동접힘은 수율을 증가시키고 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체의 정제를 간편하게 만든다는 장점을 가지고 있다. 함께 접혀진 복합체의 정제는 단지 하나의 프로토콜만을 필요로 하고 (두개의 폴리펩티드가 별도로 정제된 후 함께 접혀지는 경우 필요한 두 개의 프로토콜과는 대조적이다), 정제 프로토콜이 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체의 성질을 활용하는 것을 가능하게 한다.
필요하다면 IGF-I 및 IGFBP-3 은 추가로 정제될 수 있다. IGF-I 및 IGFBP-3 의 정제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 기법들, 예를 들면 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 축출 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 사용하여 이루어질 수 있다. 추가의 정제는 또한 정제된 단백질의 건조 또는 침전 단계를 포함한다. IGF-I 및 IGFBP-3 이 건조되거나 또는 침전되는 경우에, 단백질들은 변성제중에 재용해되기 전에 조합되거나, 또는 개별적으로 재용해된 후 조합되어 함께 접혀질 수 있다.
IGF-I 및 IGFBP-3 의 변성은 다양한 변성제, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 우레아 또는 구아니딘을 사용하여 이루어질 수 있다. 바람직한 변성제는 우레아이다. 변성은 한 단계 과정으로 이루어질 수 있는데, 이 방법에서 IGF-I 및 IGFBP-3 은 공동접힘에 사용된 농도의 변성제 용액으로 변성된다. 또는 변성은 두 단계 과정으로 이루어질 수 있는데, 이 방법에서 IGF-I 및 IGFBP-3 은 고농도의 변성제로 변성된 후 희석되어 공동접힘 과정에 유용한 변성제의 농도를 함유하고 있는 용액이 된다. 일 단계 변성 과정에서, 변성제가 우레아인 경우에 변성제의 농도는 바람직하게는 약 1 내지 2 몰이다. 두 단계 변성 과정에서, 변성제가 우레아인 경우에 변성제의 농도는 바람직하게는 약 5 내지 7 몰이며, 이것은 공동접힘 과정을 위해 바람직하게는 약 1 내지 2 몰로 희석된다.
IGF-I 및 IGFBP-3 의 환원은 변성과 동시에 이루어지거나 또는 임의로 변성 후에 이루어질 수도 있다. IGF-I 및 IGFBP-3 의 환원은 다양한 제제, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올), 또는 환원된 글루타티온을 이용하여 이루어질 수 있다. 바람직한 환원제는 DTT 이다. 변성에 대하여 논의된 바와 같이, IGF-I 및 IGFBP-3 의 환원은 폴리펩티드들이 공동접힘 과정에 유용한 환원제의 농도를 사용하여 환원되는 공정으로, 또는 폴리펩티드들이 고농도의 환원제로 환원된 후, 공동접힘 과정에 유용한 농도로 희석되는 두 단계 공정중 하나로 이루어질 수 있다. 환원제가 DTT 인 경우, 고농도의 환원제는 바람직하게는 약 30 내지 50 밀리몰 (mM) 이고, 공동접힘에 유용한 농도는 바람직하게는 약 5 내지 15 mM 이다.
변성되고 환원된 IGF-I 및 IGFBP-3 의 용액은 그런 다음 산화되어 이황화 결합을 형성한다. 허용되는 산화제로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면 글루타티온, 시스틴, 및 시스타민이 있다. 바람직한 산화제는 시스타민이다.
공동접힘 반응은 무기한으로 계속될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 IGF-I 및 IGFBP-3 의 공동접힘이 재접힘의 역학을 실질적으로 가속시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 반응은 상당히 더 짧은 기간동안, 예컨대 1 내지 2 시간 정도로 짧은 기간동안 계속될 수 있다. 바람직하게는 공동접힘 반응은 4 시간 까지 계속되며, 보다 바람직하게는 약 1 내지 3 시간동안 계속된다.
공동접힘 반응이 완료된 후, 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체는 정제될 수 있다. 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체는 다양한 방법들, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 크기 축출, 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다. 바람직한 것은 천연 IGF-I/IGFBP-3 복합체는 술포프로필-유도된 칼럼 크로마토그래피 매트릭스 (예컨대 SP-세파덱스, Pharmacia, Uppsala, Sweden) 를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제된다. 임의로, 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법을 사용하여 복합체로부터 추가로 정제될 수 있다. 바람직한 것은 IGF-I 및 IGFBP-3 은 바람직하게는 산성 조건하에 복합체가 분해된 후 크기 축출 크로마토그래피에 의하여 복합체로부터 정제되는 것이다. 정제된 복합체 또는 IGF-I 또는 IGFBP-3 은 상이한 완충액중으로 교환될 수 있고 및/또는 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법들 중 하나에 의하여 농축될 수 있다.
실시예 1. IGF-I 및 IGFBP-3 의 제조에 사용하기 위한 IGF-I 및 IGFBP-3 서열을 함유하고 있는 발현 벡터
IGF-I 과 IGFBP-3 을 제조하기 위하여 사용한 발현 구성물은 번역 커플러의 아래쪽에 삽입된 유전자들이 유비퀴틴-IGF (pER10088) 과 IGFBP-3 (pDJ12833)인 점을 제외하고는 pJU1002 및 pJU1003 과 유사하다 [Squires et al., (supra) J. Biol. Chem., 263:16297-16302]. 또한, pER10088 과 pDJ12833 은 이것들이 그 플라스미드안의 tet 유전자의 5' 단부에서 16 bp 의 합성 어댑터 서열을 함유하지 않는다는 점에서 pJU1003 과 다르다; 그러나 pER10088 과 pDJ12833 은 pBR322-유도된 골격의 유일한 PvuII 부위에 DNA 삽입물을 함유하고 있다: pER10088 은 그 위치에 링커 5'...CCTCGAGG...3' 을 함유하고 있고; pDJ12833 은 pSC101 의 par 유전자좌를 포함하고 있는 385 bp 의 단편을 함유하고 있다 [Meacock and Cohen (1980) Cell, 20:529-542].
pER10088 은 (5' 에서 3' 쪽으로) ATG 트리플렛 (개시), 효모 유비퀴틴의 76 코돈, 성숙한 사람 인슐린 성장 인자 I 의 70 합성 코돈, 및 종결 코돈을 포함하고있는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유하고 있다.
pDJ12833 은 ATG 트리플렛과 이어서 264 코돈의 성숙한 사람 IGFBP-3 을 포함하는 ORF 를 함유하고 있다. 아미노-말단의 95 코돈은 합성된 것이다; 그 나머지는 이 유전자에 대한 천연 CDNA 로부터 유도된 것이었다.
각각의 경우에, ORF 는 섬유아세포 성장 인자에 대하여 Squires et al. (1988)에 의해 설명된 바와 같이 정확하게 번역 커플러에 관련하여 위치한다.
실시예 2. IGF-I 의 재조합적 제조
IGF-I 은 실시예 1 에서 설명된 것과 같은 발현 벡터 구성물을 사용하여 제조할 수 있다. IGF-I 융합 단백질을 제조하기 위한 발현 구성물 (pER10088)을 염화 칼슘 번역법 [Sambrook, supra]을 사용하여 대장균 스트레인 W3110DE3 안에 도입시켰다.
W3110DE3/PER10088 을 100 리터의 액체 배양액중에서 600 nm 에서의 배양액의 광학 밀도 (OD600)가 최소한 약 25 에 도달할 때까지 37 ℃ 에서 배양하였다. IGF-I 의 발현은 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG)를 0.4 mM 의 농도로 첨가함으로써 유도하였다. 유도된 박테리아를 추가로 배양한 후, 원심분리에 의하여 수집하였다. 펠릿화된 세포를 에틸렌 디아민 테트라아세테이트 (EDTA)를 함유하고 있는 아세트산 나트륨 완충액 (50 mM, pH 5.5)중에 재현탁하였다. 박테리아를 MicrofluidizerR(model M-210-EH, Microfluidics Corp.)로 용해시켰다. 이들 숙주 세포에서 생성된 모든 IGF-I 융합 단백질이 불용성이지는 않으므로, 폴리에틸렌이민 (PEI)을 0.1 % 의 농도로 첨가하여 가용성 및 부분적으로 가용성인 IGF-I 융합 단백질을 침전시켰다.
불용성 및 침전된 IGF-I 융합 단백질을 원심분리에 의하여 수집한 후, 2 M 우레아, 50 mM 인산 칼륨, 2 mM DTT, pH 5.8-5.9 로 한 번 세척하고, 원심분리에 의하여 재수집하였다. 그런 다음 IGF-I 펠릿을 6 M 우레아, 20 mM 트리스, 30 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8.0 으로 용해시켰다. 이 용액에 프로타민 술페이트를 최종 농도 0.14 % 로 첨가함으로써 DNA 를 용액으로부터 침전시켰다. 침전된 DNA 를 원심분리에 의하여 제거하고, IGF-I 융합 단백질을 함유하고 있는 상층액을 추가로 Q-세파로스상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. IGF-I 융합 단백질을, 효모 유비퀴틴 가수분해효소 (효모 유비퀴틴 가수분해효소를 코드화하는 서열은 도 8 에 도시한다)를 코드화하고 있는 발현 벡터인 pER1011 (pER1011 은 PvuII 부위에 5'...CCTCGAGG...3' 링커가 존재하는 것을 제외하고는 pJU1002 와 유사하다)의 발현에 의하여 대장균으로부터 얻어진 유비퀴틴 가수분해효소로 소화시킨 후, 리우 등의 방법에 따라 정제하여 [Liu et al., (1989) J. Biol. Chem., 264:20331-20338] 성숙한 IGF-I 을 얻는다.
그런 다음 IGF-I 을 변성시키고, 2 M 우레아, 10 밀리몰의 DTT 및 20 % 의 에탄올 중에서 10 밀리몰의 시스타민의 존재하에 다시 접히도록 하였다. IGF-I 을 SP-세파로스상에서의 양이온 교환 크로마토그래피 및 C18칼럼 (Vydac) 상에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의하여 추가로 정제하였다.
실시예 3. IGFBP-3 의 재조합 제조
IGFBP-3 을 실시예 1 에서 나타낸 것과 같은 발현 벡터 구성물을 사용하여 제조하였다. IGFBP-3 의 제조를 위한 발현 구성물인 pDJ12833 을 대장균 스트레인 W3110DE3 안에 도입시키고, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들 (Sambrook 과 Ausubel 의 참고문헌에서 설명된 것과 같은 방법들)을 사용하여 생성된 클론들을 단리하였다.
클론 W3110DE3/pDJ12833 을 100 L 의 액체 배양액중에서, 배양액의 600 nm 에서의 광학 밀도 (OD600)가 25 에 도달할 때까지 37 ℃ 에서 배양하였다. IGFBP-3 의 발현은 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG)를 0.4 mM 의 농도로 첨가함으로써 유도되었다. 유도된 박테리아를 추가로 배양한 후, 원심분리에 의하여 수집하였다. 펠릿화된 세포를 에틸렌 디아민 테트라아세테이트 (EDTA)가 첨가되어 있는 아세트산 나트륨 완충액 (50 mM, pH 5.5)중에 재현탁하였다. 그런 다음 박테리아를 MicrofluidizerR(model M-210-EH, Microfluidics Corp.)로 용해시켰다.
불용성 IGFBP-3 을 원심분리에 의하여 수집한 후, 2 M 우레아, 50 mM 인산 칼륨, 2 mM DTT, pH 5.8-5.9 로 한 번 세척하고, 원심분리에 의하여 재수집하였다. 그런 다음 IGFBP-3 펠릿을 6 M 구아니디움 HCl, 100 mM 트리스, 25 mM DTT, 5 mM EDTA, pH 8.0 으로 용해시킨 후, IGFBP-3-함유 용액을 1 부피의 100 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH8 로 희석하였다. 이 용액에 프로타민 술페이트를 최종 농도 0.14 % 로 첨가함으로써 DNA 를 용액으로부터 침전시켰다. 침전된 DNA 를 원심분리에 의하여 제거하고, IGFBP-3 을 함유하고 있는 상층액을 추가로 50 mM 트리스, pH 10.6 으로 희석하였다. 시스타민을 6 mM 의 최종 농도로 첨가한 후에 밤새 IGFBP-3 가 다시 접히도록 하였다.
IGFBP-3 용액을 한외여과에 의하여 농축한 후, 2 M 우레아, 20 mM 트리스, pH 7 에 대하여 다이아필트레이션 (diafiltration)함으로써 용매를 교환하였다. IGFBP-3 을 Q-세파로스상에서 및 이어서 SP-세파로오스상에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. IGFBP-3 을 추가로 C18칼럼 (Vydac) 을 사용한 RP-HPLC 에 의하여 정제하였다.
실시예 4. IGF-I 과 IGFBP-3 의 공동접힘
재조합적으로 제조된 IGF-I 과 IGFBP-3 을 등몰비로 혼합한 후, 동결건조에 의하여 건조시켰다. 건조된 단백질 혼합물을 변성/환원 완충액 (80 mM 트리스, pH 8.3, 1.5 M 우레아, 1 mM EDTA, 10 mM DTT)중에 최종 단백질 농도가 1 mg/ml 이 되도록 용해시켰다. 시스타민 염산염을 시스타민의 최종 농도가 10 mM 이 되도록 첨가하였다. 대조표준은 IGF-I 이 단독으로 재접혀진 것과 IGFBP-3 이 단독으로 재접혀진 것이었다. 공동접힘 및 재접힘 반응액을 5 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 샘플을 시스타민 첨가 직전 (0 시간), 첨가후 1 시간, 2 시간, 3 시간 및 4 시간 후에 취하여 RP-HPLC 로 분석하였다. 0 시간점에서의 RP-HPLC 분석은 IGF-I 과 IGFBP-3 둘다 완전히 환원된 것으로 나타났다. RP-HPLC 를 Poros R2/H 칼럼 (4.6 mm 직경, 100 mm 길이)상에서 워터스 626-1 HPLC 기기를 사용하여 13.5 % 내지 54 % 아세토니트릴로 작동하는 아세토니트릴의 선형 구배 (0.1 % 트리플루오로아세트산 포함)를 이용하여 수행하였다.
단독으로 재접혀진 IGF-I 및 IGFBP-3 은 빈약한 수율의 천연 단백질을 초래하였다. 단독으로 재접혀진 IGF-I 은 단지 13% 의 수율을 나타냈고, 단독으로 재접혀진 IGFBP-3 은 45.1 % 의 천연 단백질을 나타냈다. 대조적으로, 공동으로 접혀졌을 때 거의 모든 (99.6 %) IGF-I 과 대부분 (83 %)의 IGFBP-3 이 정확하게 접혀졌다. 이들 결과는 IGF-I 과 IGFBP-3 의 공동접힘이 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 의 수율을 상조적으로 증가시키는 결과를 유발함을 보여준다.
공동접힘 반응의 추가의 분석은, 천연 단백질의 수율을 증가시키는 것 외에, 공동접힘은 또한 재접힘의 역학을 변경시킨다는 것이다. 도 9 및 도 10 은 IGF-I 및 IGFBP-3 이 단독으로 재접힐 때 또는 공동접힘 반응일 때의 시간 경과를 나타낸다. 공동접힘 방법은 재접힘의 수율 뿐만 아니라 재접힘의 초기 속도 및 재접힘의 최대 속도를 증가시킨다.
실시예 5. 함께 접혀진 IGF-I 및 IGFBP-3 의 생체내활성에 대한 검정
이 실시예는 본 발명에 따라 다시 접혀진 IGF-I, IGFBP-3 및 IGF-I/IGFBP-3 복합체가 생체내 활성을 가지고 있는 지를 보여준다.
사람 골육종 MG63 세포 (5×105세포)를 T-175 플라스크에 놓고 세포 배양 배지 (10 % 의 우태아혈청, 50 유니트/ml 의 페니실린, 50 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 비필수 아미노산 및 2 mM 의 L-글루타민이 첨가된 RPMI 배지)중에서 배양하였다. 플라스크를 37 ℃ 에서 가습된 5 % CO2/95 % 공기 대기중에서 2 내지 3 일 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양액이 집밀해지기 전에 세포를 트립신/EDTA 용액중에서 인큐베이션함으로써 플라스크로부터 세포를 떼어냈다. 트립신 작용을 중단시키기 위하여 6 ml 의 세포 배양 배지를 첨가하고 그것을 원심분리 튜브안에 넣었다. 세포를 800×g 에서 5 내지 10 분동안 원심분리한 후, 펠릿을 10 ml 의 검정 배지 (50 유니트/ml 의 페니실린, 50 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 2 mM 의 L-글루타민, 2.5 ㎍/ml 의 소 피브로넥틴, 5 ㎍/ml 의 사람 트란스페린, 75 ㎍/ml 의 오브알부민, 및 3 μM 의 덱사메타손이 첨가된 RPMI 배지)중에 재현탁하였다.
IGF-I 참조 표준과 함께 접혀진 IGF-I 및 IGFBP-3 의 샘플을 96-웰 플레이트에서 연속적으로 검정 배지를 사용하여 희석하였다. 재접힘 방법에 의하여 재접혀진 IGF-I/IGFBP-3 복합체, IGF-I, 및 IGFBP-3 을 각각 시험하였다. 각각의 웰은 50 ㎕ 의 표준 또는 시험 샘플을 함유하였다. IGF-I 참조 표준의 농도 범위는 0.244 내지 500 ng/ml 이다.
검정 배지중에서 제조한 MG63 사람 골육종 세포를 50 ㎕/웰의 부피로 5000 세포/웰 농도로 플레이트하였다. 각 웰의 총 부피는 100 ㎕ 이다. 플레이트들을 가습된 5 % CO2/95 % 공기 대기중에서 4 일 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 기간이 끝나는 시점에서, 세포 성장을 산 포스파타제 활성을 측정함으로써 검정하였고, 그 결과 산 포스파타제 활성은 골육종 세포의 수에 비례하는 것으로 나타났다. 플레이트들을 인큐베이터로부터 꺼내고 배양 배지를 웰들로부터 빨아내었다. 그런 다음 각 웰을 200 ㎕ 의 포스페이트-완충된 식염수로 세정하였다. 100 ㎕ 의 10 mM p-니트로페닐 포스페이트, 100 mM 의 아세트산 나트륨, 1 % 의 트리톤 X-100, pH 5.5 를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37 ℃ 에서 2 시간동안 인큐베이션하였다. 산 포스파타제에 의한 p-니트로페닐 포스페이트의 가수분해는 각 웰에 10 ㎕ 의 1.0 N 수산화 나트륨을 첨가함으로써 중단시켰다. 플레이트를 실온에서 최소 10 분동안 인큐베이션하였다. 405 nm 에서의 흡광도를 측정하고, 490 nm 에서의 흡광도와 비교하였다.
바탕 흡광도를 각 웰의 흡광도 값으로부터 뺐다. 그 결과 평균 흡광도를 IGF-I 의 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 흡광도 값이 최대 흡광도의 절반이 되는 IGF-I 의 농도인 ED50을 각 샘플 및 참조 표준에 대하여 용량-반응 도표로부터 계산하였다. 각 샘플의 활성은 IGF-I 참조 표준과 샘플의 ED50의 비로서 나타낸다.
본 발명을 직접적인 설명 및 실시예에 의하여 상세하게 설명하였다. 본 발명의 동등물 및 변형도 당업자에게 나타날 것이며, 그것들도 본 발명의 범주내에 포함된다.
Claims (13)
- IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물을 변성시키는 단계;IGF-I 과 IGFBP-3 의 상기 혼합물을 환원시켜서 그로써 환원되고 변성된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 용액을 형성하는 단계;상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계; 그리고천연 IGF-I 및 IGFBP-3 의 복합체를 형성하는 단계로 이루어지는 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 의 복합체를 제조하는 방법.
- IGF-I 을 변성시키는 단계;상기 IGF-I 을 환원시켜서 변성되고 환원된 IGF-I 을 제조하는 단계;IGFBP-3 을 변성시키는 단계;상기 IGFBP-3 을 환원시켜서 변성되고 환원된 IGFBP-3 을 제조하는 단계;상기 변성되고 환원된 IGF-I 을 상기 변성되고 환원된 IGFBP-3 과 혼합함으로써 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물을 형성하는 단계;상기 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계; 그리고천연 IGF-I 및 IGFBP-3 의 복합체를 형성하는 단계로 이루어지는 천연 IGF-I 및 IGFBP-3 의 복합체를 제조하는 방법.
- IGF-I 을 변성시킴으로써 변성된 IGF-I 을 형성하는 단계;IGFBP-3 을 변성시킴으로서 변성된 IGFBP-3 을 형성하는 단계;상기 변성된 IGF-I 과 상기 변성된 IGFBP-3 을 혼합함으로써 변성된 IGF-I 과 변성된 IGFBP-3 의 혼합물을 형성하는 단계;상기 변성된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물을 환원시킴으로써 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물을 형성하는 단계;상기 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계; 그리고천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 형성하는 단계로 이루어지는 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 제조하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물로부터 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 상기 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체로부터 천연 IGF-I 을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체로부터 천연 IGFBP-3 을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 산화제를 첨가하기 전에 상기 변성되고 환원된 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물을 희석하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 약 1:3 내지 3:1 의 몰비인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 약 1.5:1 내지 1:1.5 의 몰비인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 우레아 또는 구아니딘으로 변성되고, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민, 또는 환원된 글루타티온으로 환원되며, 상기 산화제는 시스틴, 시스타민, 산소, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 디티오에리트리톨, 또는 산화된 글루타티온인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 약 1 내지 2 몰의 농도의 우레아로 변성되고, 상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물이 약 5 내지 15 밀리몰의 농도의 디티오트레이톨로 환원되며, 상기 산화제는 약 5 내지 15 밀리몰 농도의 시스타민인 것을 특징으로 하는 방법.
- IGF-I 을 변성시키는 단계;상기 IGF-I 을 환원시키는 단계;천연 IGFBP-3 을 첨가함으로써 IGFBP-3 과 변성되고 환원된 IGF-I 의 용액을 형성하는 단계;상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계; 그리고천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 형성하는 단계로 이루어지는 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 제조하는 방법.
- IGFBP-3 을 변성시키는 단계;상기 IGFBP-3 을 환원시키는 단계;천연 IGF-I 을 첨가함으로써 IGF-I 과 변성되고 환원된 IGFBP-3 의 용액을 형성하는 단계;상기 IGF-I 과 IGFBP-3 의 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계; 그리고천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 형성하는 단계로 이루어지는 천연 IGF-I 과 IGFBP-3 의 복합체를 제조하는 방법.
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