CZ394397A3 - Způsob produkce IGF-1 a IGFBP-3 s řádným svinutím a disulfidovou vazbou - Google Patents
Způsob produkce IGF-1 a IGFBP-3 s řádným svinutím a disulfidovou vazbou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ394397A3 CZ394397A3 CZ973943A CZ394397A CZ394397A3 CZ 394397 A3 CZ394397 A3 CZ 394397A3 CZ 973943 A CZ973943 A CZ 973943A CZ 394397 A CZ394397 A CZ 394397A CZ 394397 A3 CZ394397 A3 CZ 394397A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- igf
- igfbp
- denatured
- native
- mixture
- Prior art date
Links
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 title claims abstract description 195
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 title claims abstract description 195
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 83
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims abstract 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 15
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 15
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 11
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical group CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 claims description 8
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 4
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 3
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N (4S,5S)-1,2-dithiane-4,5-diol Chemical compound O[C@@H]1CSSC[C@H]1O YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims 3
- YPGMOWHXEQDBBV-ZXZARUISSA-N cis-1,2-dithiane-4,5-diol Chemical compound O[C@H]1CSSC[C@H]1O YPGMOWHXEQDBBV-ZXZARUISSA-N 0.000 claims 1
- 230000003297 denaturating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 181
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 180
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 10
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 10
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 10
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 8
- -1 thiol compound Chemical class 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001553 co-assembly Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004375 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 108090000957 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 3
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BBCZJRSZHIFFAB-UHFFFAOYSA-N 1-(dimethylamino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(O)C(N(C)C)S(O)(=O)=O BBCZJRSZHIFFAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethyldisulfanyl)ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCSSCCN NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 101001027553 Bos taurus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010018265 Gigantism Diseases 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001044927 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004371 Insulin-like growth factor binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000961 Insulin-like growth factor binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004883 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001014 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000015875 Pituitary gigantism Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 101100533529 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SIL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101001076308 Xenopus laevis Insulin-like growth factor III Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000006326 desulfonation Effects 0.000 description 1
- 238000005869 desulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004578 fetal growth Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000057148 human IGFBP3 Human genes 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150118377 tet gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se obecně týká oblasti produkce aktivních, řádně složených proteinů a zejména se týká složení polypeptidu inzulínu podobného růstového faktoru 1 (IGF-1) a vazebného proteinu-3 pro inzulínu podobný růstový faktor (IGFBP-3).
Dosavadní stav techniky
Růstové faktory jsou polypeptidy, které stimulují velkou šíři biologických odpovědí (např syntézu DNA, buněčné dělení, expresi specifických genů, atd.) v definované populaci cílových buněk. Bylo identifikováno mnoho růstových faktorů, včetně transformujícího růstového faktoru βΐ (TGF-βΙ), TGF-32, TGF-03, TGF-04, TGF-βδ, epidermálního růstového faktoru (EGF), od destiček odvozeného růstového faktoru (PDGF), fibroblastového růstového faktoru (FGF), inzulínu podobného růstového faktoru 1 (IGF-1) a IGF-2.
IGF-1 a IGF-2 jsou příbuzné v aminokyselinové sekvenci a struktuře, kde každý polypeptid má molekulovou hmotnost asi 7,5 kilodaltonů (kDa). IGF-1 zprostředkuje hlavní účinky růstového hormonu a tak je to primární mediátor růstu po narození. IGF-1 se také účastní účinku různých jiných růstových faktorů, protože ošetření buněk takovými faktory vede ke zvýšené produkci IGF-1. Oproti tomu, o IGF-2 se soudí, že má hlavní roli ve fetálním růstu. Jak IGF-1, tak IGF-2 mají inzulínu podobné aktivity (odtud jejich jména), a
jsou mitogenní (stimulují buněčné dělení) pro buňky v nervové tkáni, svalech, reprodukční tkáni, skeletální tkáni a mnoha jiných tkání.
Oproti většině růstových faktorů jsou IGF přítomny ve významném množství v cirkulaci, ale pouze velmi malá frakce tohoto IGF je volná v cirkulaci nebo v jiných tělesných tekutinách. Většina cirkulujícího IGF je navázána na IGF vazebný protein - 3 (IGFBP-3). IGF-1 může být měřen v séru pro diagnostiku abnormálních růstových stavů, např. pituitárního gigantismu, akromegalie, trpaslictví nebo různých deficiencí růstového hormonu. Ačkoliv je IGF-1 produkován v mnoha tkáních, soudí se, že většina cirkulujícího IGF-1 je Syntetizována v játrech.
Téměř všechen IGF cirkuluje v nekovalentně asociovaném trojitém komplexu složeném z IGF-1 nebo IGF-2, IGFBP-3 a větší proteinové podjednotky nazývané podjednotka labilní vůči kyselinám (ALS). Tento trojitý komplex je složen z ekvimolárních množství každé ze tří složek. ALS nemá žádnou přímou IGF-vazebnou aktivitu a zdá se, že váže pouze binární komplex IGF/IGFBP-3. Trojitý komplex IGF+IGFBP-3+ALS má molekulovou hmotnost asi 150 kDa. O tomto trojitém komplexu se soudí, že v cirkulaci účinkuje jako rezervoár a pufr pro IGF-1 a IGF-2, který brání rychlým změnám v koncentraci volného IGF (Blum et al., (1991), Plasma IGFBP-3 Levels as Clinical Indicators v Modern Concepts of Inzulin-Like Growth Factors, str. 381 - 393, (E.M. Spencer, vyd., Elsevier, New York).
Většina cirkulujícího IGF-1, IGF-2 a IGFBP-3 je ve formě komplexu a v souladu s tím je velmi malé množství volného IGF detegovatelné. Kromě toho, vysoká hladina volného IGF v krvi je nežádoucí. Vysoké hladiny volného IGF v krvi vedou k závažné hypoglykemii vzhledem k inzulínu podobným aktivitám IGF. Oproti IGF a IGFBP-3 existuje významný pool volného ALS v plasmě, což zajišťuje to, že jakýkoliv IGF/IGFBP-3 komplex, který vstoupí do cirkulace, tvoří ihned trojitý komplex.
Zatímco IGFBP-3 je nejhojnější vazebný protein pro IGF v cirkulaci, v různých tkáních a tělesných tekutinách bylo identifikováno alespoň pět jiných vazebných proteinů pro IGF (IGFBP). Ačkoliv tyto proteiny váží IGF, každý z nich pochází z různých genů a má různou aminokyselinovou sekvenci. Tak tyto vazebné proteiny nejsou pouze analoga a deriváty společného prekurzoru. Oproti IGFBP-3 nejsou ostatní cirkulující IGFBP saturovány IGF. Kromě IGFBP-3 nemůže žádný z IGFBP tvořit trojitý komplex o molekulové hmotnosti 150 kDa.
IGF-1 a IGFBP-3 mohou být purifikovány z přirozených zdrojů nebo mohou být produkovány rekombinantními prostředky. Například, purifikace IGF-1 z lidského séra je v oboru dobře známá (Rinderknecht et al., (1976), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 73: 2365 - 2369). Produkce IGF-1 rekombinantními procesy je ukázána v EP 0.128.733, publikovaném v prosinci 1984. IGFBP-3 může být purifikován z přirozených zdrojů za použití procesu jako je ten, který je ukázán v Baxter et al., (1986), Growth Hormone-Dependent Inzulin-Like Growth Factors (IGF) Binding Protein from Human Plasma Differs from Other IGF Binding Proteins, Biochem.
Biophys. Res. Comm. 139: 1256 - 1261). IGFBP-3 může být syntetizován rekombinantními organismy jak popisuje Sommer et al., (výše, str. 715 - 728). Rekombinantní IGFBP-3 se váže na IGF-1 v molárním poměru 1:1.
Topické podání IGF-1/IGFBP-3 komplexu do ran krys a prasat je signifikantně více účinné než podání IGF-1 samotného (Sommer et al., výše). Podkožní podání komplexu IGF-l/IGFBP-3 hypofyzektomovaným, ovarektomovaným a normálním krysám, stejně jako intravenozní podání cynomolgous opicím, v podstatě zabraňuje hypoglykemickým účinkům IGF-1 podaného samostatně.
Jak IGF-1, tak IGFBP-3 mají disulfidovou isomerasovou aktivitu, když jsou měřeny samostatně. Nicméně, smísení těchto dvou proteinů v podstatě inhibuje tuto aktivitu (Koedam and Leo van den Brande (1994) Inzuline-Like Growth Factors (IGFs) and IGF Binding Protein-3 Display Disulfide Isomerase Activity Biochem. Biophys. Res. Comm. 198: 1225 1231).
Genetické inženýrství také umožnilo produkovat velká množství polypeptidu kódovaných klonovanou DNA prostřednictvím rekombinantních expresních systémů, zejména prostřednictvím exprese v prokaryontech jako je Escherichia coli. Exprivovaný heterologní polyeptid, který by jinak nebyl vůbec produkován hostitelskými buňkami nebo by byl produkován pouze v omezeném množství, může vytvářet významnou část celkových buněčných polypeptidu hostitelské buňky.
Vážné problémy se často vyskytují, pokud jsou klonované DNA exprivovány ve vysokých úrovních v rekombinantních expresních systémech. Polypeptidy, které jsou nadměrně exprivovány v cytoplasmě hostitelské buňky jsou často akumulovány jako nerozpustná inkluzní tělíska nebo refraktilní tělíska, zejména pokud jsou jako hostitelské buňky použity bakterie (Williams et al., (1982), Science 215: 687 - 689; Schoner et al., (1985), Biotechnology 3: 151 - 154). Nicméně, tvorba inkluzí není omezena na bateriální expresní systémy. Například, produkt Kruppel genu u Drosophilli může tvořit inkluzní tělíska, když je produkován ve hmyzích buňkách za použití bakulovirového expresního systému. Polypeptidy akumulované ve formě inkluzních tělísek nebo refrakti lnich tělísek jsou relativně nepoužitelné pro biologické a biochemické testy. Konverze tohoto nerozpustného materiálu na aktivní, rozpustné polypeptidy vyžaduje pomalou a obtížnou solubilizaci a protokol znovu skládání, což zvyšuje náklady na produkci polypeptidů a často to znatelně redukuje výtěžek aktivního polypeptidů.
I když jsou heterologní polypeptidy exprivovány v cytoplazmě hostitelských buněk v rozpustné formě, nemusí být biologicky aktivní díky nesprávné skladbě. Nesprávné složení může proběhnout v cytoplazmě hostitelské buňky nebo během postupu izolace.
Obtíže, které jsou součástí získání biologicky aktivních rekombinantních proteinů a rekombinantních expresních systémů jsou zvýšeny u polypeptidů obsahujících cysteinové zbytky, jako je IGF-1. IGF-1 obsahuje šest cysteinových zbytků, každý z nich tvoří intramolekulární disulfidovou vazbu o které se soudí, že stabilizuje aktivní konformaci proteinu. Cysteinové zbytky v IGF-1 mohou tvořit nesprávné disulfidové vazby, t.j. disulfidové vazby tvořené mezi cysteinovými zbytky, které nejsou nacházeny v nativním IGF-1. Molekuly IGF-1 obsahující nesprávné disulfidové vazby mají redukovanou biologickou aktivitu (Raschdorf et al., (1988) (Biomed. Env. Mass Spectros. 16: 3-8).
Bylo zjištěno, že množství rozpustného polypeptidu může být zvýšeno v E. coli rekombinantní expresi, pokud je fermentační teplota snížena pod 30 °C. Tento postup je použitelný jako alternativa k renaturaci polypeptidů z inkluzních tělísek, ale vyžaduje expresní systém, který účinně operuje pod 30 aC. Tento postup nicméně nemusí být komerčně vyhovující, protože redukce fermentační teploty zvyšuje trvání, a proto i nákladnost, fermentace s průvodním zvýšením rizika kontaminace kultury.
V oboru je známo mnoho metod pro znovusložení proteinů. Například U.S: patenty č. 4511502, 4511503 a 4512922 popisují metody, které jsou považovány za univerzálně aplikovatelné, s pouze drobnými modifikacemi, pro znovu složení proteinů získaných z inkluzních tělísek. Tyto metody se obecně snaží o narušení struktury nesprávně složených proteinů, potom o umožnění slabých intramolekulárních sil, t.j. vodíkových můstků, hydrofobních interakcí a iontových vazeb, pro složení proteinu do jeho správné konformace a potom následueje oxidace za vytvoření řádných disulfidových vazeb.
V jedné takové metodě je protein, který má být znovu složen, purifikován za podmínek, které uchovávají cysteinové skupiny proteinu jako volné sulfhydry 1ové skupiny inkluzí redukčního činidla během procesu purifikace. Toto umožňuje znovusložení proteinu během procesu purifikace za absence nesprávných intramolekulárních disulfidových vazeb. Redukční činidlo je potom ředěno pro umožnění toho, aby znovusložený protein tvořil disulfidové můstky za přítomnosti vzduchu nebo nějakého jiného oxidačního činidla. Tato metoda může být snadno inkorporována do většiny purifikačních procesů a optimálně funguje pro rekombinantní proteiny mající relativně nekomplikované terciární struktury.
Jiným přístupem je znovusložení proteinu za přítomnosti jak redukované (R-SH), tak oxidované (R-S-S-R) formy thiolové sloučeniny. Toto umožňuje tvorbu, porušení a znovu tvorbu di sulfidových vazeb během procesu purifikace. Redukované a oxidované formy thiolové sloučeniny jsou poskytnuty v pufru majícím dostatečnou denaturující sílu pro to, aby všechny meziproduktové formy proteinu zůstávaly solubilní během, procesu solubi1 izace. Močovina se považuje za vhodný denaturant vzhledem ke své denaturační síle pro meziprodukty, která umožňuje proteinu dosáhnout jeho správné konformace a také udržuje rozpustnost meziproduktů skládání. Tento přístup je nejúčinnější, pokud má protein, který má být složen, relativně nekomplikovaný charakter skladby.
Alternativním přístupem, který může být použit pro složitější situace skladby, je rozrušení jakýchkoliv disulfidových vazeb, které mohou být tvořeny během syntézy nebo izolace proteinu, potom derivatizování volných thiolových skupin proteinu. Volné thiolové skupiny jsou derivatizovány sulfonací, která blokuje tvorbu disulfidových vazeb. Protein je potom znovu složen ve slabém denaturantu, potom desulfonován, což umožní řádnou tvorbu disulfidových vazeb. Desulfonace probíhá za přítomnosti sulfhydrylové sloučeniny. Malé množství sloučenin korespondujících oxidované formě bude zajišťovat, aby vhodné disulfidové vazby zůstávaly intaktní. pH je změněno, t.j. zvýšeno, na hodnotu takovou, aby thiolová sloučenina byla alespoň částečně ionizována, což zvyšuje nukleofilní odstranění sulf onátu.
Tyto metody pro opětovné složení, ačkoliv jsou praktické pro své univerzální použití, nebyly významně účinné pro IGF-1 a jejich provedení je obtížné.
Byly popsány metody pro znovus1 ožení, které jsou specifické pro IGF-1. PCT přihlášky WO 91/02807, WO 93/11240 a WO 93/19084 každá popisují metody pro znovusložení rekombinantně exprivovaného IGF-1 proteinu.
WO 91/02807 popisuje IGF-1 fúzní proteiny, ve kterých je na amino-konec IGF-1 fúzována pozitivně nabitá aminokyselinová sekvence. Aminoterminální adice se uplatňuje ve znovusložení, takže je dosažen přibližně 50% výnos řádně složeného proteinu. Tento přístup vyžaduje zvláštní krok štěpení amino-terminálního fúzního peptidu a purifikace pro získání nativního IGF-1.
WO 93/11240 popisuje způsob pro znovusložení IGF-1 proteinu v jednom roztoku obsahujícím chaotropické činidlo, organické rozpouštědlo a redukční činidlo při alkalickém pH, • ·
takže je dosaženo více než 85% řádně složeného proteinu.
WO 93/19084 popisuje způsob pro znovusložení rekombinantně produkovaného IGF-1 za použití protokolu pro znovusložení o třech krocích. Nesprávně složený met-IGF-1, t.j. IGF-1 s amino-terminálním methioninem (tento methioninový zbytek musí být odstraněn pro získání zralého IGF-1) je solubi1 izován v denaturačním roztoku. Potom je přidáno oxidační agens pro vytvoření redukčního roztoku. Je přidáno další redukční činidlo pro zvýšení disulfidové výměny a roztok je inkubován přes noc. Tato metoda vede k zisku asi 30 % řádně složeného proteinu. Tento protein musí být dále zpracován pro odstranění aminoterminálního methioninového zbytku.
Nedávno poppsal Hober et al., ((1994) Folding of Inzulin-Like Growth Factor Binding Protein, Biochemistry 33: 6758 - 6761) způsob pro znovusložení IGF-1, využívající přidání nativního IGFBP-1. Přidání nativního IGFBP-1 k redukovanému IGF-1 polypeptidu za redukčních podmínek vede k zisku nativního IGF-1 vyššímu než 89 %. Použití IGFBP-3 nebylo popsáno, ani nebylo popsáno použití IGFBP.
Všechny v oboru známé metody pro znovusložení vedou k zisku řádně složeného proteinu, který je signifikantně nižší než 100 %. Heterologní směs vzniklá z těchto metod musí být dále purifi kována, kterýžto proces může být časově náročný a/nebo nákladný.
Existuje potřeba pro jednoduchou, rychlou a vysoce účinnou metodu pro znovusložení IGF a IGFBP-3 do řádné
konformace se správnými disulfidovými vazbami.
V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout rychlou, vysoce účinnou metodu pro znovusložení IGF-1 a IGFBP-3 společným složením dvou polypeptidů, což vede k vysokému výnosu řádně složených proteinů. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout jednoduchou, vysoce účinnou metodu pro produkci purifikovaných komplexů nativního IGF a IGFBP-3.
Patenty, patentové přihlášky a publikace citované v této přihlášce jsou zde uvedeny jako odkazy ve svém celku.
V jednom aspektu vynález poskytuje rychlou, vysoce účinnou metodu pro znovusložení IGF-1 a IGFBP-3 a dále poskytuje účinnou metodu pro získání nativních komplexů IGF-l/IGFBP-3. Vynález dále poskytuje metodu pro purifikaci nativního IGF-1 a nativního IGFBP-3 z nativních komplexů IGF-l/IGFBP-3.
V jiném aspektu vynález poskytuje rychlou, vysoce účinnou metodu pro znovusložení IGF-1, která vede k velmi vysokému výnosu nativního IGF-1.
V ještě jiném aspektu vynález poskytuje rychlou, vysoce účinnou metodu pro znovusložení IGFBP-3, která vede ke zvýšenému výnosu nativního IGFBP-3.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidského
IGF-1.
Obrázek 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci kódující lidský IGF-1.
Obrázek 3 a obrázek 4 ukazují dvě alternativní aminokyselinové sekvence IGFBP-3.
Obrázky 5, 6 a 7 ukazují tři alternativní nukleotidové sekvence kódující IGFBP-3.
Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou sekvenci kódující kvasinkovou ubiquitinovou hydrolasu (YUH).
Obrázky 9 a 10 ukazují výsledky ko-skládání IGF-1 a IGFBP-3. Plné čtverečky ukazují znovusk1ádání IGF-1 a IGFBP-3 samostatně, v příslušném pořadí, zatímco prázdné čtverečky reprezentují výsledky ze společného skládání.
Podstata vynálezu
Proteiny exprivované ve vysokých hladinách v rekombinantních expresních systémech často vykazují nízkou nebo nedetegovatelnou biologickou aktivitu díky chybnému složení a nesprávné tvorbě disulfidových vazeb. Předkládaný vynález poskytuje novou metodu pro rychlé znovusložení rekombinantně produkovaných IGF-1 a IGFBP-3 s extremně vysokou účinností, za zisku nativního IGF-1 a IGFBP-3. V překvapujícím výsledku vynálezci zjistili, že oxidace směsi denaturovaných a redukovaných IGF-1 a IGFBP-3, t.j., společné skládání, (kombinace nesložených nebo nesprávně • 0
0000·· 00 ·0
0 0 0 · ·
00 0· Φ·· ·· složených IGF-1 s nesloženými nebo nesprávně složenými IGFBP-3 za denaturačních a redukčních podmínek, následovaná oxidací), vede k synergnímu zvýšení účinosti skládání pro oba proteiny, za zisku téměř 100% nativního IGF-1 a velmi vysokého procenta nativního IGFBP-3. Vynálezci také neočekávaně zjistili, že kinetiky skládání byly významně pozměněny, zejména s ohledem na skládání IGFBP-3, což vede k významnému zkrácení času nutného pro skládání. Tyto výsledky byly zejména překvapivé, protože je známo, že disulfidová isomerasová aktivita (enzymatická aktivita, která vyžaduje rozrušení a novotvorbu disulfidových vazeb a která může asistovat ve znovuskládání proteinu) IGF-1 je inhibována přidáním ekvimolárního množství IGFBP-3 (Koedam and Leo van den Brande,'výše).
Vynález také poskytuje účinné metody pro pro produkci purifikovaného nativního IGF, nativního IGFBP-3 a nativního komplexu IGF/IGFBP-3 z rekombinantních expresních systémů. Společné skládání IGF-1 a IGFBP-3 podle předkládaného vynálezu vede ke tvorbě nativních komplexů IGF-l/IGFBP-3. Tyto komplexy mohou být snadno izolovány od jakéhokoliv nesprávně složeného proteinu v reakci skládání za použití jednoduchých metod v oboru dobře známých. Pokud je to žádoucí, mohou být IGF-1 a IGFBP-3 snadno dále izolovány a purifikovány metodami v oboru dobře známými.
Def inice
Inzulínu podobný růstový faktor nebo IGF zahrnuje rodinu faktorů, včetně, ale nejenom, IGF-1 a IGF-2. IGF je polypeptid s molekulovou hmotností okolo 7,5 kDa. IGF
zahrnuje přirozené IGF-1 nebo IGF-2, jejich analoga a varianty a fúse mezi IGF-1 nebo IGF-2 a jinými aminokyselinovými sekvencemi. IGF může být získán z přirozených zdrojů nebo může být připraven rekombinantními prostředky.
Vazebný protein-3 pro inzulínu podobný růstový faktor nebo IGFBP-3 jak je zde použito je člen rodiny vazebných proteinů pro inzulínu podobný růstový faktor, která obsahuje, ale není omezena na, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, a IGFBP-6. IGFBP-3 může být získán z přirozených zdrojů nebo může být připraven rekombinantními prostředky. IGFBP-3 tvoří komplex s IGF a třetí molekulou známou jako ALS.
Nativní IGF-1, jak je zde použito, je definován jako IGF-1, včetně přirozeně se vyskytujícího IGF-1, jeho analog a variant, který je správně složen a obsahuje pouze správné disulfidové vazby. Správné disulfidové vazby jsou tvořeny mezi aminokyselinovými zbytky C6-C48, C47-52, a C18-C61, nebo homology těchto aminokyselinových zbytků v analogách a variantách IGF-1. Nativní IGF-1 je biologicky aktivní.
Nerozpustný IGF-1 označuje precipitovaný nebo agregovaný IGF-1, který je obsažen v hostitelské buňce, neb je jinak s hostitelskou buňkou asociován, a má biologicky inaktivní konformaci s nesprávnými nebo s nevytvořenými disufidovými vazbami. Nerozpustný IGF-1 může být obsažen v inkluzních tělískách nebo refrakti lnich tělískách, t.j. může nebo nemusí být viditelný v mikroskopu s fázovým kontrastem.
Nesprávně složený IGF-1 označuje IGF-1, který je v biologicky inaktivní konformaci s nesprávnými nebo s nevytvořenými disulfidovými vazbami. Nesprávně složený IGF-1 může být, ale nemusí být, nerozpustný.
Nerozpustný IGFBP-3 označuje přec ipitovaný nebo agregovaný IGFBP-3, který je obsažen v hostitelské buňce, nebo je jinak s hostitelskou buňkou asociován, a má biologicky inaktivní konformaci s nesprávnými nebo s nevytvořenými disufidovými vazbami. Nerozpustný IGFBP-3 může být obsažen v inkluzních tělískách nebo refrakti lnich tělískách, t.j. může nebo nemusí být viditelný v mikroskopu s fázovým kontrastem.
Nesprávně složený IGFBP-3 označuje IGFBP-3, který je v biologicky inaktivní konformaci s nesprávnými nebo s nevytvořenými disulfidovými vazbami. Nesprávně složený IGFBP-3 může být, ale nemusí být, nerozpustný.
Nativní IGFBP-3, jak je zde použito, je definován jako IGFBP-3, včetně přirozeně se vyskytujícího IGFBP-3, jeho analog a variant, který je správně složen a obsahuje pouze správné disulfidové vazby. Nativní IGFBP-3 je biologicky akt ivní.
Nativní IGF-1/IGFBP-3 komplex jak je zde použito, je definován jako nekovalentně vázaný komplex nativního IGF-1 a nativního IGFBP-3.
Redukční činidlo jak je zde použito, je definováno jako jakákoliv sloučenina nebo materiál, který udržuje
·· · · sulfhydrylové skupiny v redukovaném stavu a redukuje intranebo intermolekulární disulfidové vazby. Přijatelná redukující činidla zahrnují, ale nejsou omezena na, dithiothreitol (DTT), 2-merkaptoethanol, dithioerythritol, cystein, cysteamin (2-aminoethanethiol), a redukovaný glutathion.
Oxidační činidlo jak je zde použito, je definováno jako jakákoliv sloučenina nebo materiál, který je schopen odstranění elektronu ze sloučeniny, která má být oxidována. Přijatelná oxidační činidla zahrnují, ale nejsou omezena na, oxidovaný glutathion, cystin, cystamin, oxidovaný dithiothreitol, oxidovaný erythreitol a kyslík.
Denaturační činidlo nebo denaturant jak je zde použito, je definováno jako jakákoliv sloučenina nebo materiál, který může způsobovat reverzibilní nesložení proteinu. Síla denaturačního činidla nebo denaturantu bude určena vlastnostmi a koncentrací jednotlivého denaturačního činidla nebo denaturantu. Přijatelná denaturační činidla nebo denaturanty mohou být chaotropy, detergenty, organická s vodou mísitelná rozpouštědla, fosfolipidy nebo kombinace dvou nebo více takových činidel. Přijatelné chaotropy zahrnují, ale nejsou tak omezeny, močovinu, guanidin a thiokyanát sodný. Vhodné detergenty mohou zahrnovat, ale nejsou tak omezeny, silné detergenty jako je dodecy1 sulfát sodný, nebo polyoxyethy1enethery (např. Tween nebo Triton detergenty), mírné neiontové detergenty (např. digitonin), mírné kationtové detergenty jako je N-[2,3-(dioleyoxy)-propy1]-N,N,N-trimethy1amonium, mírné iontové detergenty (např. cholát sodný nebo deoxycholát • ♦> ·* * «· · · ··· • 1β· · ·· «····· * · · · ·· ··· »· ·· ··· •· · · •· ·· • ·· · ·· • ·· «· ·· sodný) nebo zwitteriontové detergenty, zahrnující, ale takto neomezené, sulfobetainy (Zwittergent), 3-(3-cholamidopropy1)dimethylamonio-l-propan-sulfát (CHAPS) a 3-(3-cholamidopropy1)dimethylamonio-2-hydroxy-l-propansulfonát (CHAPSO). Jako denaturanty mohou být použita s vodou mísitelná organická rozpouštědla jako je acetonitril, nižší alkanoly (zejména C2-C4 alkanoly jako je ethanol nebo isopropano), nižší alkandioly (zejména C2-C4-alkandioly jako je ethylenglykol). Fosfolipidy vhodné v předloženém vynálezu mohou být přirozeně se vyskytující fosfolipidy jako je fosfatidylethanolamin, fosfatidylcholin, fosfatidy1 serin a fosfatidylinositol nebo syntetické fosfolipidové deriváty nebo varianty jako je dihexanoylfosfatidylcholin nebo d iheptanoy1f osfat idy1cho1in.
Znovusložení jak je zde použito popisuje jakýkoliv proces nebo způsob, který je vyvinut pro transformaci polypeptidu z jeho nesprávně složeného nebo nesloženého stavu do jeho nativní, správně složené konformace.
Společné složení jak je zde použito, označuje určité procesy, reakce nebo způsoby znovusložení, které využívají alespoň dvou polyeptidů, které interagují jeden s druhým a vedou k transformaci nesprávně složených nebo nesložených polypeptidů na nativní, správně složené polypeptidy.
Popis výhodných provedení
Předkládaný vynález spočívá v společném skládání IGF-1 a IGFBP-3, což vede k rychlému, vysoce účinnému znovusložení dvou proteinů, za zisku nativního IGF-1 a IGFBP-3, a dále • ·
obsahuje zjednodušené metody pro purifikaci nativního IGF-1, IGFBP-3 a IGF-l/IGFBP-3 komplexu. Vynález může být proveden následujícím způsobem:
a) IGF-1 a IGFBP-3 jsou kombinovány v molárním poměru 1:3 až 3:1, potom jsou denaturovány a redukovány denaturačními a redukčními činidly, nebo alternativně, IGF-1 a IGFBP-3 jsou denaturovány a redukovány jednotlivě, potom kombinovány v molárním poměru 1:3 až 3:1 za tvorby IGF-l/IGFBP-3 komplexu;
b) potom je přidáno oxidační činidlo do směsi IGF-l/IGFBP-3 podle kroku (a);
c) popřípadě, IGF-l/IGFBP-3 komplex může být purifikován z IGF-l/IGFBP-3 směsi pro společné skládání; a
d) popřípadě, IGF-1 a IGFBP-3 mohou být jednotlivě purifikovány z komplexu.
IGF-1 a IGFBP-3 pro společné skládání podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány v mnoha vysoce expresních systémech, za použití mnoha hostitelských buněk, včetně, ale nejenom, bakterií, kvasinek, hmyzích a savčích buněčných linií. Preferovaně jsou IGF-1 a IGFBP-3 produkovány v bakteriálních hostitelských buňkách. Lépe jsou IGF-1 a IGFBP-3 produkovány v E. coli hostitelských buňkách, včetně, ale nejenom, E. coli kmene W3110DE3.
Hostitelské buňky jsou transformovány expresními vektory obsahujícími DNA kódující IGF-1 nebo IGFBP-3. Hostitelské buňky mohou být transformovány mnoha technikami dobře v
oboru známými, jako je například, ale bez omezení, CaCl2 pro bakteriální nebo kvasinkové hostitelské buňky, CaPCU pro hmyzí nebo savčí hostitelské buňky, nebo elektroporace, která může být použita pro jakýkoliv typ hostitelských buněk. Metody pro transformaci hostitelských buněk mohou být nalezeny v Sambrook etal., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) a Ausubel (1987) Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, New York).
Expresní vektory obsahující DNA kódující IGF-1 nebo IGFBP-3 mohou být konstruovány standartními metodami dobře v oboru známými. DNA kódující IGF-1 nebo IGFBP-3 může být získána z přirozených zdrojů, jako jsou genomové nebo cDNA knihovny, nebo může být chemicky syntetizována. Dále, varianty IGF-1 nebo IGFBP-3 mohou být produkovány různými metodami dobře v oboru známými, včetně místně řízené mutagenese. Metody pro produkci variant mohou být nalezeny v Sambrook et al., výše a Ausubel et al . , výše.
Transformované mikrobiální hostitelské kmeny jsou kultivovány v kapalném mediu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí, za použití metod, které jsou v oboru dobře známé. Transformované hmyzí nebo savčí buňky jsou kultivovány v kapalném mediu obsahujícím asimi1 ováte1 né zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí, a volitelně, obsahující vitaminy, aminokyseliny, růstové faktory a proteinové doplňky kultivace známé v oboru. Kapalné medium pro kultivaci hostitelských buněk muže volitelně obsahovat antibiotika nebo antimykotika pro zabránění růstu nežádoucích mikroorganismů a/nebo sloučeniny obsahující, ale ne omezené na, antibiotika pro selekci hostitelských buněk obsahujících expresní vektor.
IGF-1 a IGFBP-3 mohou být purifikovány z hostitelských buněk mnoha metodami v oboru známými. Normálně je IGF-1 nebo IGFBP-3 produkovaný v bakteriálních hostitelských buňkách slabě rozpustný nebo nerozpustný (ve formě inkluzních tělísek). V případě nerozpustného proteinu může být protein odebrán z lyzátu hostitelských buněk centrifugací. V případě slabě rozpustného proteinu mohou být přidány sloučeniny zahrnující, ale ne omezené na, polyethylenimin (PEI) pro vyvolání precipitace částečně rozpustného proteinu. Přec ipitováný protein může být potom běžně odebrán centrifugací.
Nerozpustný nebo přecipitovaný IGF-1 nebo IGFBP-3 mohou být potom solubi1 izovány kterýmkoliv z mnoha činidel v oboru známých. Preferovaně jsou IGF-1 nebo IGFBP-3 solubi1 izovány močovinou nebo guanidinhydrochlorid.
Pokud jsou IGF-1 nebo IGFBP-3 produkovány jako fúzní proteiny, pak může být fúzní sekvence volitelně odstraněna. Odstranění fúzní sekvence může být provedeno enzymatickým nebo chemickým štěpením, preferovaně enzymatickým štěpením. Enzymatické odstranění fúzní sekvence může být provedeno za použití metod v oboru dobře známých. Volba enzymu pro odstranění fúzní sekvence bude určena identitou fúze a reakční podmínky budou určeny volbou enzymu, jak bude odborníkům jasné. Štěpený IGF-1 nebo IGFBP-3 může být dále purifikován ze štěpené fúzní sekvence dobře známými metodami. Takové metody budou určeny identitou a charakterem fúzní sekvence jak je odborníkům jasné. Metody pro purifikaci mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na, vylučovací chromatografií podle velikosti, hydrofobní interakční chromatografií, iontovýměnnou chromatografií nebo dialýzu.
IGF-1 nebo IGFBP-3 je preferovaně dále purifikován pro odstranění DNA z proteinového roztoku. DNA může být odstraněna jakoukoliv z mnoha metod v oboru známých, jako je precipitace nebo iontová výměnná chromatografie, ale preferovaně je odstraněna precipitací s protaminsulfátem. IGF-1 nebo IGFBP-3 mohou být separovány od precipitované DNA za použití metod jako je centrifugace nebo filtrace.
IGF-1 nebo IGFBP-3 pro společné skládání podle předkládaného vynálezu mohou být použity přímo po odstranění DNA, nebo mohou být dále purifikovány a/nebo koncentrovány za použití metod v oboru dobře známých. Společné skládání relativně nečištěného (surového) IGF-1 a IGFBP-3 má výhodu zvýšeného výnosu a zjednodušené purifikace nativního komplexu IGF-1/IGFBP-3. Purifikace společně složeného komplexu vyžaduje pouze jeden purifikační protokol (oproti dvěma, pokud jsou dva polypeptidy purifikovány samostatně před společným skládáním), a umožňuje purifikačnímu protokolu využít vlastnosti nativního komplexu IGF-1/IGFBP-3.
Pokud je to žádoucí, mohou být IGF-1 a IGFBP-3 dále purifikovány. Purifikace IGF-1 a IGFBP-3 může být provedena za použití mnoha technik dobře v oboru známých, včetně hydrofobní interakční chromatografie, chromatografie s vylučováním podle velikosti, iontové výměnné chromatografie, kapalinové chromatografie s reverzní fází s vysokou rozlišovací schopností, afinitní chromatografie a podobně. Další purifikace může také obsahovat krok sušení nebo precipitace purifi kovaného proteinu. Pokud jsou IGF-1 nebo IGFBP-3 sušeny nebo přecipitovány, pak mohou být proteiny kombinovány před znovurozpuštěním v denaturantu, nebo mohou být znovu rozpuštěny jednotlivě a kombinovány pro společné skládání.
Denaturace IGF-1 a IGFBP-3 může být provedena za použití mnoha denaturačních činidel, jako je například, ale nejenom, močovina nebo guanidin. Preferovaně je denaturantem močovina. Denaturace může být provedena v procesu o jednom kroku, kde jsou IGF-1 a IGFBP-3 denaturovány s roztokem denaturantu, který je v koncentraci použité pro společné skládání, nebo v procesu o dvou krocích, ve kterém jsou IGF-1 a IGFBP-3 denaturovány s vysokou koncentrací denaturantu, po čemž následuje ředění, což vede ke vzniku roztoku obsahujícího koncentraci denaturantu použitelnou pro proces spoluskládání. V jednokrokovém procesu denaturace je koncentrace denaturantu, kterým je močovina, preferovaně 1 až 2 molární. Ve dvoukrokovém procesu denaturace je koncentrace denaturantu, kterým je močovina, preferovaně 5 až 7 molární, kde tato koncentrace je preferovaně ředěna na asi 1 až 2 molární pro proces spoluskládání.
Redukce IGF-1 a IGFBP-3 může být provedena ve stejnou dobu jako denaturace, nebo, volitelně, může být provedena po denaturaci. Redukce IGF-1 a IGFBP-3 může být provedena za použití mnoha činidel, jako je například, ale nejenom, dithiothreitol (DTT), 2-merkaptoethanol, cystein, cysteamin (2-aminoethanethiol), nebo redukovaný glutathion. Preferovaně je redukčním agens DTT. Jak již bylo uvedeno pro denaturaci, redukce IGF-1 a IGFBP-3 může proces o jednom nebo o dvou krocích, kde jsou polypeptidy redukovány za použití koncentrace • »
β · « · redukčního agens použitelné pro proces spoluskládání nebo ve kterém jsou polypeptidy redukovány za použití vyšší koncentrace redukčního činidla, po čemž následuje ředění na koncentrace použitelné v procesu spoluskládání. Pokud je redukčním činidlem DTT, pak je vysoká koncentrace redukčního činidla preferovaně okolo 30 až 50 milimolární (mM) a koncentrace použitelná pro spoluskládání je preferovaně okolo 5 až 15 mM.
Roztok denaturovaného a redukovaného IGF-1 a IGFBP-3 je potom oxidován pro vytvoření disulfidových vazeb. Přijatelná oxidační činidla zahrnují, ale nejsou omezeny na, glutathion, cystin a cystamin. Preferovaným oxidačním činidlem je cystamin.
Reakce společného skládání může pokračovat do nekonečna. Nicméně, vynálezci zjistili, že společné skládání IGF-1 a IGFBP-3 významně zrychluje kinetiku společného skládání. V souladu s tím, reakce může probíhat po významně kratší dobu, asi okolo 1 až 2 hodin. Preferovaně probíhá reakce společného skládání okolo 1 až 3 hodin.
Po dokončení reakce společného skládání může být purifikován nativní komplex IGF-1/IGFBP-3. Nativní komplex IGF-1/IGFBP-3 může být purifikován za použití mnoha metod, jako je například, ale nejenom, vylučování podle velikosti, iontovýměnná chromatografie a hydrofobní interakční chromatografie. Preferovaně je nativní komplex IGF-1/IGFBP-3 purifikován za použití kat iontovýměnné chromatografie za použití su1fopropy1-derivat izované kolonové chromatografické matrice (např. SP-Sephadex, Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Popřípadě, nativní IGF-1 a IGFBP-3 mohou být dále purifikovány z komplexu za použití mnoha metod v oboru známých. Preferovaně jsou IGF-1 w · a IGFBP-3 purifikovány z komplexu disociací komplexu, preferovaně za acidických podmínek, po čemž následuje chromatografie s vylučováním podle velikosti. Purifikovaný komplex nebo IGF-1 nebo IGFBP-3 mohou být vyloučeny do různých pufrů a/nebo mohou být koncentrovány kteroukoliv z mnoha metod v oboru známých.
Následující příklady jsou míněny jako ilustrace předkládaného vynálezu. Příklady nejsou míněny jako omezení předkládaného vynálezu jakýmkoliv způsobem.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Expresní vektory obsahující IGF-1 a IGFBP-3 sekvence pro použití v produkci IGF-1 a IGFBP-3.
Expresní konstrukty použité pro produkci IGF-1 a IGFBP-3 jsou stejné jako pJU1002 a pJU1003 (Squires et al., výše, J. Biol. Chem., 263: 16297 - 16302) kromě toho, že geny insertované downstream od translačního spojovníku jsou ubiquitin-IGF (pER10088) a IGFBP-3 (pDJ12833). Kromě toho, pER10088 a pDJ12833 se liší od pJU1003 v tom, že neobsahují syntetickou 16 bp adaptorovou sekvenci na 5' konci tet genu v tomto plasmidu; ale obsahují DNA inserce v jedinečném PvuII místě v od pBR322 odvozené kostře: pER10088 obsahuje linker 5'...CCTCGAGG...3' v tomto umístění; pDJ12833 obsahuje 385 bp fragment nesoucí par lokus pSCIOl (Meacock and Cohen (1980), Cell 20: 529 - 542).
PER10088 obsahuje otevřený čtecí rámeček (ORF) obsahují (ve směru 5' ..3') ATG triplet (iniciace), 76 kodonů kvasinkového ubiquitinu, 70 syntetických kodonů zralého lidského inzulínu •» · · · · · · · · · ···· « · * · · · · ·· ♦ · « · · 4 4 4 4 4 4 podobného faktoru 1, a terminační kodon.
pDJ12833 obsahuje ORF obsahující ATG triplet následovaný 264 kodony zralého lidského IGFBP-3. Aminoterminálních 95 kodonů je syntetických; zbytek byl odvozen od přirozené cDNA pro tento gen.
V každém případě, ORF je umístěn ve vztahu k translačnímu spojovníku přesně tak, jak popisuje Squires et al., (1988) pro fibroblastový růstový faktor.
Příklad 2 - Rekombinantní produkce IGF-1
IGF-1 může být produkován za použití konstruktů expresních vektorů jako jsou ty, které jsou popsány v příkladu 1. Expresní konstrukt pro produkci IGF-1 fúzního proteinu (PER10088) byl zaveden do E. coli kmene W3110DE3 za použití transfekce chloridem vápenatým (Sambrook, výše).
W3110DE3/PER10088 byly kultivovány ve 100 litrech kapalné kultury při 37 °C dokud kultura nedosáhla optické hustoty alespoň 25 při 600 nm (ODeoo). Exprese IGF-1 byla indukována přidáním isopropy1thiogalaktos idu (IPTG) v koncentraci 0,4 mM. Indukované bakterie byly dále kultivovány a potom shromážděny centr ifugací. Peletované buňky byly resuspendovány v pufru octanu sodného (50 mM. pH 5,5) s ethylendiamintetraacetátem (EDTA). Bakterie byly lyžovány za použití Microf1uidizeruR (model M-210-EH, Microfluidics Corp.). Protože ne všechen IGF-1 fúsní protein produkovaný v těchto hostitelských buňkách je nerozpustný, byl přidán po 1yethy1eneimiη (PEI) v koncentraci 0,1% pro precipitaci solubilního a částečně solubilního IGF-1 fúsního proteinu.
• · «« · ♦· • · 9 Λ ·· • · <· · ·· • · · «· • · · · ·· 9
Nerozpustný a přecipitovaný IGF-1 fúzní protein byl odebrán centrifugací, potom promyt jedenkrát 2 M močoviny, 50 mM fosforečnanem sodným, 2 mM DTT, pH 5,8 - 5,9 a znovu oddělen centrifugací. IGF-1 peleta byla potom solubi1 izována 6 M močoviny, 20 mM Tris, 30 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0. DNA byla precipitována z roztoku přidáním protaminsulfátu v konečné koncentraci 0,14 %. Precipitovaná DNA byla odstraněna centrifugací a supernatant obsahující IGF-1 fúzní protein byl dále purifikován iontovýměnnou chromatografií na Q-Sepharose. IGF-1 fúzní protein byl tráven ubiquitin hydrolasou (která byla získána z E. coli expresí pERlOll, expresního vektoru, kódujícího kvasinkovou ubiquitin hydrolasu (sekvence kódující kvasinkovou ubiquitin hydrolasu je ukázána na obrázku 8), po čemž· následovala purifikace podle Liu et al., ((1989), J. Biol. Chem., 264: 20331 - 20338) (PERlOll je analogem pJU1002 kromě přítomnosti 5'...CCTCGAGG...3'1 inkeru v PvuII místě), za zisku zralého IGF-1.
IGF-1 byl potom denaturován a znovu složen v 2M močovině, milimolárním DTT a 20% ethanolu za přítomnosti 10 mi 1imolárního cystaminu. IGF-1 byl dáele purifikován kationtovou výměnnou chromatografií na SP-Sepharose a kapalinové chromatografie s reverzní fází s vysokou rozlišovací schopností (RP-HPCL) na Cie koloně (Vydac).
Příklad 3 - Rekombinantní produkce IGFBP-3
IGFBP-3 může být produkován za použití konstruktů expresních vektorů jako jsou ty, které jsou popsány v příkladu 1. Expresní konstrukt pro produkci IGFBP-3 PDJ12833 byl zaveden do E. coli kmene W3110DE3 a klony byly izolovány, za • · « · použití metod v oboru dobře známých (jako jsou ty, které jsou popsány v Sambrook, výše, nebo Ausubel, výše).
Klon W3110DE3/PER10088 byl kultivován ve 100 litrech kapalné kultury při 37 °C dokud kultura nedosáhla optické hustoty alespoň 25 při 600 nm (ODeoo). Exprese IGFBP-3 byla indukována přidáním isopropylthiogalaktosidu (IPTG) v koncentraci 0,4 mM. Indukované bakterie byly dále kultivovány a potom shromážděny centrifugací. Peletované buňky byly resuspendovány v pufru octanu sodného (50 mM. pH 5,5) s ethylendiamintetraacetátem (EDTA). Bakterie byly lyžovány za použití MicrofluidizeruR (model M-210-EH, Microfluidics Corp.).
Nerozpustný IGFBP-3. byl odebrán centr ifugací, potom promyt jedenkrát 2 M močoviny, 50 mM fosforečnanem sodným, 2 mM DTT, pH
5,8 - 5,9 a znovu oddělen centr ifugací. IGFBP-3 peleta byla potom solubi1 izována 6 M guanidinum.HC1, 100 mM Tris, 25 mM DTT, 5 mM EDTA, pH 8,0, a potom byl roztok obsahující IGFBP-3 ředěn 1 objemem 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0. DNA byla precipitována z roztoku přidáním protaminsulfátu v konečné koncentraci 0,14 %. Precipitovaná DNA byla odstraněna centrifugací a supernatant obsahující IGFBP-3 byl dále ředěn 50 mM Tris, pH 10,6. IGFBP-3 byl znovu skládán přes noc po přidání cystaminu v konečné koncentraci 6 mM.
Roztok IGFBP-3 byl koncentrován ultrafi 1trací, potom bylo rozpouštědlo odděleno diafiltrací proti 2M močovině, 20 mM Tris, pH 7. IGFBP-3 byl purifikován iontovou výměnnou chromatografií na Q-Sepharose následované SP-Sepharosou. IGFBP-3 byl dále purifikován RP-HPCL za použití Cis kolony (Vydac).
Příklad 4 - Společné skládání IGF-1 a IGFBP-3
v sušený ch a IGFBP-3 byly smíseny lyof i 1 i zac í. Směs denaturačním/redukčním pufru (80 mM Tris, pH 8,3, 1,5 M močovina, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) na
Rekombinantně produkované IGF 1 ekvimolárním poměru a potom sušeny proteinů byla potom rozpuštěna v (80 mM Tris, pH 8,3, 1,5 M močovi konečnou koncentraci proteinu 1 mg/ml. Byl přidán hydrochlorid cystaminu v konečné koncentraci 10 mM cystaminu. Kontrolami byli IGF-1 skládaný samostatně a IGFBP-3 skládaný samostatně. Reakce společného skládání a znovuskládání byly inkubovány při 5 °C. Vzorky byly odebírány ihned před (0 hodin), a 1, 2, 3 a 4 hodiny po přidání cystaminu a byly analyzovány RP-HPLC. RP-HPLC analýza v hodinu O ukázala, že oba IGF-1 a IGFBP-3 byly plně redukovány. RP-HPLC byla provedena na Waters 626-1 HPLC přístroji na Poros R2-/H koloně (průměr 4,6 mm, délka 100 mm) za použití lineárního gradientu acetonitrilu (s 0,1% kyselinou trifluoroctovou) probíhajícím od 13,5% do 54% acetonitrilu.
IGF-1 a IGFBP-3 skládané samostatně dávaly chabý výnos nativního proteinu. IGF-1 skládaný samostatně dával výnos pouze 13% a IGFBP-3 skládaný samostatně dával výnos 45,1% nativního proteinu. Oproti tomu, při společném skládání, v podstatě všechen (99,6%) IGF-1 a většina IGFBP-3 (83%) byly řádně složeny. Tyto výsledky ukazují, že společné skládání IGF-1 a IGFBP-3 vede k synergnímu zvýšení výnosu nativních IGF-1 a IGFBP-3.
Další analýzy reakcí společného skládání ukázaly, že kromě zvýšení výnosu nativních proteinů mění společné skládání také kinetiku opětovného skládání. Obrázky 9 a 10 ukazují časový průběh znovuskládání IGF-1 a IGFBP-3 bud samostatně, nebo v • ·
,.,4 - Proces společného skládáni zvyšuje reakci společného sklad stupeň počáteční stupen znovu znovuskládám.
znovuskládání, stejne jako celkový , Hinaktivitu společně
Příklad 5 - Testy na bxoaktivi
IGFBP-3 složených IGF-1 a Tento příklad ukazuje, že IGF 1 IGF-1/IGFBP-3 znovu složené podle
IGFBP-3 a komplex předkládaného vynálezu mají biologickou aktivitu.
MG63 buňky lidského osteosarkomu (5 χ 105 buněk) jsou umístěny do T-175 nádob a jsou kultivovány v buněčném kultivačním mediu (RPMI medium doplněné 10% fetálním hovězím sérem, 50 jednotek/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomyci nu, neesenciální aminokyseliny a 2 mM L-glutaminu). Nádoba je inkubována při 37 °C ve zvlhčované atmosféře 5 % CO2/95 % vzduchu po 2 až 3 dny. Před tím, než se kultura buněk stane konfluentní, jsou buňky odděleny z nádob inkubací buněk v roztoku trypsin/EDTA. Buněčné kultivační medium (6 ml) je přidáno pro ukončení trypsinu a buňky jsou transferovány do centr ifugační trubice. Buňky jsou centrifugovány při 800 x g po 5 - 10 minut a jsou resuspendovány v 10 ml testovacího media (RPMI medium doplněné 50 jednotkami/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomyci nu, neesenciálními aminokyselinami, 2 mM L-glutaminu, 2,5 pg/ml hovězího fibronektinu, 5 pg/ml lidského transferinu, 75 pg/ml ovalbuminu a 3 pM dexamethasonu).
Vzorky IGF-1 referenčního standardu a společně skládaných IGF-1 a IGFBP-3 jsou sériově ředěny v testovacím mediu v 96-jamkových plotnách. Komplex IGF-1/IGFBP-3, IGF-1 a IGFBP-3
znovusložené metodou společného skládání jsou testovány každý. Každá jamka obsahuje 50 μΐ standardu nebo testovaného vzorku. Rozsah koncentrace pro IGF-1 referenční standard je 0,244 - 500 ng/ml.
MG63 buňky lidského osteosarkomu, které byly připraveny v testovacím mediu, jsou umístěny v počtu 5000 buněk/jamku, v objemech 50 μΐ/jamku. Celkový objem v každé jamce je 100 μΐ. Plotny jsou potom inkubovány v humidifikované atmosféře 5 % C02/95 % vzduch po 4 dny při 37 °C.
V konci inkubační periody je buněčný růst testován měřením aktivity kyselé fosfatasy, která je úměrná počtu osteosarkomových buněk. Plotny jsou vyndány z inkubátoru a kultivační medium je aspirováno z jamek. Každá jamka je propláchnuta 200 μΐ fosfátem pufrovaného salinického roztoku. Do každé jamky je přidáno 100 μΐ 10 mM p-nitrofenyl fosfátu, 100 mM octanu sodného, 1 % Tritonu X-100, pH 5,5 a plotna je inkubována při 37 °C po 2 hodiny. Hydrolýza p-nitrofenyl fosfátu kyselými fosfatasami je ukončena přidáním 10 μΐ 1,ON hydroxidu sodného do každé jamky. Plotny jsou inkubovány při pokojové teplotě po dobu minimálně 10 minut. Je měřena absorbance při 405 nm, zatímco referenční absorbance je při 490 nm.
Absorbance pozadí je odečtena od absorbance každé jamky. Průměrná absorbance je zakreslena jako funkce koncentrace IGF-1. ED50, koncentrace IGF-1 při které je hodnota absorbance polovinou maximální absorbance, je kalkulována pro každý vzorek a referenční standart z grafu dávka - odpověd. Aktivita každého vzorku je vyjádřena jako poměr ED50 IGF-1 referenčního
standardu a vzorku.
Předkládaný vynález byl upřesněn jak přímým popisem, tak příklady. Ekvialenty a modifikace předkládaného vynálezu budou odborníkům zřejmé, a spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob produkce komplexu nativního IGF-1 a IGFBP-3 vyznačující se tím, že zahrnuje:denaturaci směsi IGF-1 a IGFBP-3;redukci uvedené směsi IGF-1 a IGFBP-3, což vytvoří roztok redukovaného, denaturovaného IGF-1 a IGFBP-3;přidání oxidačního činidla do uvedené směsi IGF-1 aIGFBP-3; a tvorbu komplexu nativního IGF-1 a IGFBP-3.
- 2. Způsob produkce komplexu nativního IGF-1 a IGFBP-3 vyznačující se tím, že zahrnuje:denaturaci IGF-1;redukci uvedeného IGF-1, což vede k produkci denaturovaného, redukovaného IGF-1;denaturaci IGFBP-3;redukci uvedeného IGFBP-3, což vede k produkci denaturovaného, redukovaného IGFBP-3;smísení uvedeného denaturovaného, redukovaného IGF-1 a uvedeným denaturovaným, redukovaným IGFBP-3, což vede ke tvorbě směsi denaturovaných, redukovaných IGF-1 a IGFBP-3;přidání oxidačního činidla k uvedené směsi denaturovaných, redukovaných IGF-1 a IGFBP-3; a tvorbu komplexu nativního IGF-1 a IGFBP-3.• · ·· · • ··IGFBP-3
- 3. Způsob produkce komplexu nativních IGF-1 a c í se t í m, že zahrnuje:IGF-1 za vytvoření denaturovaného IGF-1;IGFBP-3 za vytvoření denaturovaného IGFBP-3;uvedenýho denaturovaného IGF-1 a uvedeným IGFBP-3 za vytvoření směsi denaturovaných IGF-1 a vyznačuj denaturac i denaturac i smísení denaturovanýmIGFBP-3;redukci uvedené směsi denaturovaných IGF-1 a IGFBP-3 vytvoření denaturované, redukované směsi IGF-1 a IGFBP-3; přidání oxidačního činidla k uvedené denaturované, redukované směsi IGF-1 a IGFBP-3; a tvorbu komplexu nativního IGF-1 a IGFBP-3.za
- 4. Způsob podle nároku 1 v y z n a č u j že dále zahrnuje izolaci uvedeného komplexu IGFBP-3 z uvedené směsi IGF-1 a IGFBP-3.ící se t í nativního IGF-1
- 5. Způsob podle nároku lvyznačuj že dále zahrnuje izolaci nativního IGF-1 z uvedeného nativního IGF-1 a IGFBP-3.ící s m, m, komp1exu
- 6. Způsob podle nároku lvyznačuj že dále zahrnuje izolaci nativního IGFBP-3 nativního IGF-1 a IGFBP-3.ící s z uvedeného t í m, komplexu
- 7. Způsob podle nároku lvyznačuj že dále zahrnuje krok ředění uvedené směsi denaturovaných, redukovaných IGF-1 a IGFBP-3 před přidáním uvedeného oxidačního činidla.ící se
- 8. Způsob podle nároku lvyznačující se tím,
že uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je v molárním poměru asi 1:3 až 3:1. 9. Způsob podle nároku 1 v y z n a č u j í c í s e tím, že uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je v molárním poměru as i 1,5:1 až 1:1,5.10. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je denaturována močovinou nebo guanidinem, uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je redukována dithiothreitolem, 2-merkaptoethanolem, dithioerythritolem, cysteinem, cysteaminem, nebo redukovaným glutathionem, a uvedeným oxidačním činidlem je cystin, cysteamin, kyslík, oxidovaný dithiothreitol, oxidovaný dithioerythri to 1 nebo oxidovaný glutathion.11. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je denaturována močovinou v koncentraci asi 1 až 2 molární, uvedená směs IGF-1 a IGFBP-3 je redukována dithiothreitolem v koncentraci asi 5 až 15 milimolární a uvedené oxidační činidlo je cystamin v koncentraci asi 5 až 15 milimolární.12. Způsob produkce komplexu nativních IGF-1 a IGFBP-3 vyznačující se tím, že obsahuje:denaturaci IGF-1;redukci uvedeného IGF-1;přidání nativního IGFBP-3 za vytvoření roztoku IGFBP-3 a redukovaného, denaturovaného IGF-1;přidání oxidačního činidla do uvedené směsi IGF-1 aIGFBP-3; a vytvoření komplexu nativních IGF-1 a IGFBP-3.13. Způsob produkce komplexu nativních IGF-1 a IGFBP-3 vyznačující se tím, že obsahuje:denaturaci IGFBP-3;redukci uvedeného IGFBP-3;přidání nativního IGF-1 za vytvoření roztoku IGF-1 a redukovaného, denaturovaného IGFBP-3;přidání oxidačního činidla do uvedené směsi IGF-1 a IGFBP-3; a vytvoření komplexu nativních IGF-1 a IGFBP-3... · ·· ·· ·· ··. ·· · ·· · • · 2 · ···♦ ••••i t ·»··..· ·..· ··♦ ·♦ ··1/10GPETLCGAELTGIVDECCFRVDALQFVCGD RGFYFNKPTG YGSSSRRAPQ 40SCDLRRLEMY CAPLKPAKSAObrázek 12/10GASSAGLGPV VRCEPCDARA LAQCAPPPAV CAELVREPGC 40 GCCLTCALSE GQPCGIYTER CGSGLRCQPS PDEARPLQAL 80 LDGRGLCVNA SAVSRLRAYL LPAPPAPGNA SESEEDRSAG 120 SVESPSVSST HRVSDPKFHP LHSKIIIIKK GHAKDSQRYK 160 VDYESQSTDT QNFSSESKRE TEYGPCRREM EDTLNHLKFL 200 NVLSPRGVHI PNCDKKGFYK KKQCRPSKGR KRGFCWCVDK 240 YGQPLPGYTT KGKEDVHCYS MQSK 264 Obrázek 23/10GASSGGLGPV VRCEPCDARA LAQCAPPPAV CAELVREPGC 40 GCCLTCALSE GQPCGIYTER CGSGLRCQPS PDEARPLQAL 80 LDGRGLCVNA SAVSRLRAYL LPAPPAPGNA SESEEDRSAG 120 SVESPSVSST HRVSDPKFHP LHSKIIIIKK GHAKDSQRYK 160 VDYESQSTDT QNFSSESKRE TEYGPCRREM EDTLNHLKFL 200 NVLSPRGVHI PNCDKKGFYK KKQCRPSKGR KRGFCWCVDK 240 YGQPLPGYTT KGKEDVHCYS MQSK 264 Obrázek 34/10ATGCAGATTT TCGTCAAGAC TTTGACCGGT AAAACCATAA 40 CATTGGAAGT TGAATCTTCC GATACCATCG ACAACGTTAA 80 GTCGAAAATT CAAGACAAGG AAGGTATCCC TCCAGATCAA 120 CAAAGATTGA TCTTTGCCGG TAAGCAGCTA GAAGACGGTA 160 GAACGCTGTC TGATTACAAC ATTCAGAAGG AGTCCACCTT 200 ACATCTTGTG CTAAGGCTCC GCGGTGGTGG TCCGGAAACC 240 CTGTGCGGTG CTGAACTGGT TGACGCTCTG CAGTTCGTTT 280 GCGGTGACCG TGGTTTCTAC TTCAACAAAC CGACCGGTTA 320 CGGTTCCTCC TCCCGTCGTG CTCCGCAGAC CGGTATCGTT 360 GACGAATGCT GCTTCCGGTC CTGCGACCTG CGTCGTCTGG 400 AAATGTACTG CGCTCCGCTG AAACCGGCTA AATCCGCTTA 440 A 441 Obrázek 4·. ί5/10ATGGGTGCAT CTTCTGCAGG TTTAGGTCCA GTTGTTCNTT 40 GTGAACCATG TGATGCTCGT GCTCTTGCTC AATGTGCTCC 80 ACCACCAGCT GTTTGTGCTG AACTTGTTCG TGAACCGGGT 120 TGTGGTTGTT GTCTGACTTG TGCTCTTTCT GAAGGTCAAC 160 CATGTGGTAT TTATACTGAA CGTTGTGGTT CTGGTCTGCG 200 TTGTCAACCA TCTCCAGATG AAGCTCGTCC TCTGCAGGCT 240 CTGCTGGACG GTCGTGGTCT GTGCGTTAAC GCTTCCGCTG 280 TTTCCCGTCT GCGCGCCTAC CTGCTGCCAG CGCCGCCAGC 320 TCCAGGAAAT GCTAGTGAGT CGGAGGAAGA CCGCAGCGCC 360 GGCAGTGTGG AGAGCCCGTC CGTCTCCAGC ACGCACCGGG 400 TGTCTGATCC CAAGTTCCAC CCCCTCCATT CAAAGATAAT 440 CATCATCAAG AAAGGGCATG CTAAAGACAG CCAGCGCTAC 480 AAAGTTGACT ACGAGTCTCA GAGCACAGAT ACCCAGAACT 520 TCTCCTCCGA GTCCAAGCGG GAGACAGAAT ATGGTCCCTG 560 CCGTAGAGAA ATGGAAGACA CACTGAATCA CCTGAAGTTC 600 CTCAATGTGC TGAGTCCCAG GGGTGTACAC ATTCCCAACT 640 GTGACAAGAA GGGATTŤTAT AAGAAAAAGC AGTGTCGCCC 680 TTCCAAAGGC AGGAAGGGGG GCTTCTGCTG GTGTGTGGAT 720 AAGTATGGGC AGCCTCTCCC AGGCTACACC ACCAAGGGGA 760 AGGAGGACGT GCACTGCTAC AGCATGCAGA GCAAGTAG 798 Obrázek 5 • · φ ··6/10GGTGCTTCTT CTGCTGGTCT TGGACCAGTT GTTCGTTGTG 40 AACCATGTGA TGCACGAGCT TTAGCTCAAT GTGCTCCACC 80 ACCAGCTGTT TGTGCTGAAT TAGTTCGAGA ACCAGGTTGT 120 GGTTGTTGTT TAACTTGTGC TTTATCTGAA GGTCAACCAT 160 GTGGTATTTA TACTGAACGT TGCGGTAGTG GTTTGCGTTG 200 TCAACCAAGC CCAGATGAAG CTAGGCCTTT ACAAGCATTA 24 0 TTAGATGGTC GAGGTCTGTG TGTTAATGCG TCCGCTGTTT 280 CTCGATTGCG CGCTTATTTA TTACCTGCCC CACCGGCACC 320 GGGTAACGCC TCCGAAAGCG AAGAGGATCG TTCTGCGGGT 360 TCCGTTGAAT CTCCAAGTGT GAGTTCTACC CATCGAGTTA 400 GCGACCCGAA ATTTCATCCG TTGCACTCTA AAATCATTAT 440 TATTAAAAAG GGTCACGCAA AGGATTCTCA ACGTTATAAG 480 GTGGATTATG AAAGCCAATC TACCGACACT CAAAATTTTA 520 GTAGTGAAAG TAAACGTGAA ACCGAGTACG GCCCGTGTCG 560 ACGTGAGATG GAGGATACCT TAAACCATTT AAAATTTTTG 600 AACGTTTTAT CCCCGCGTGG CGTTCATATC CCGAATTGCG 640 ATAAAAAAGG CTTCTACAAA AAGAAACAAT GCCGTCCGAG 680 TAAGGGTCGT AAACGAGGTT TTTGTTGGTG CGTTGACAAA 720 TACGGTCAAC CGTTGCCGGG TTATACTACT AAAGGCAAAG 760 AAGATGTTCA TTGTTATTCT ATGCAATCTA AATAATGCAT 800 CTCGAGAATT C 811 Obrázek 67/10ATGCAGCGGG CGCGACCCAC GCTCTGGGCC GCTGCGCTGA 40 CTCTGCTGGT GCTGCTCCGC GGGCCGCCGG TGGCGCGGGC 80 TGGCGCGAGC TCGGCGGGCT TGGGTCCCGT GGTGCGCTGC 120 GAGCCGTGCG ACGCGCGTGC ACTGGCCCAG TGCGCGCCTC 160 CGCCCGCCGT GTGCGCGGAG CTGGTGCGCG AGCCGGGCTG 200 CGGCTGCTGC CTGACGTGCG CACTGAGCGA GGGCCAGCCG 240 TGCGGCATCT ACACCGAGCG CTGTGGCTCC GGCCTTCGCT 280 GCCAGCCGTC GCCCGACGAG GCGCGACCGC TGCAGGCGCT 320 GCTGGACGGC CGCGGGCTCT GCGTCAACGC TAGTGCCGTC 360 AGCCGCCTGC GCGCCTACCT GCTGCCAGCG CCGCCAGCTC 400 CAGGAAATGC TAGTGAGTCG GAGGAAGACC GCAGCGCCGG 440 CAGTGTGGAG AGCCCGTCCG TCTCCAGCAC GCACCGGGTG 480 TCTGATCCCA AGTTCCACCC CCTCCATTCA AAGATAATCA 520 TCATCAAGAA AGGGCATGCT AAAGACAGCC AGCGCTACAA 560 AGTTGACTAC GAGTCTCAGA GCACAGATAC CCAGAACTTC 600 TCCTCCGAGT CCAAGCGGGA GACAGAATAT GGTCCCTGCC 640 GTAGAGAAAT GGAAGACACA CTGAATCACC TGAAGTTCCT 680 CAATGTGCTG AGTCCCAGGG GTGTACACAT TCCCAACTGT 720 GACAAGAAGG GATTTTATAA GAAAAAGCAG TGTCGCCCTT 760 CCAAAGGCAG GAAGCGGGGC TTCTGCTGGT GTGTGGATAA 800 GTATGGGCAG CCTCTCCCAG GCTACACCAC CAAGGGGAAG 840 GAGGACGTGC ACTGCTACAG CATGCAGAGC AAGTAG 876 Obrázek 78/10ATGAGCGGAG AAAATCGTGC TGTGGTGCCG ATTGAATCAA 40 ACCCTGAAGT TTTTACAAAT TTTGCACATA AATTAGGTTT 80 AAAAAATGAA TGGGCGTATT TCGATATCTA TAGCTTAACA 120 GAGCCAGAGT TACTAGCATT CTTACCAAGG CCAGTGAAGG 160 CCATTGTGCT GCTATTTCCG ATAAACGAGG ATAGAAAATC 200 GAGTACCAGT CAACAAATTA CAAGTTCTTA TGATGTTATA 240 TGGTTTAAGC AATCAGTCAA AAATGCGTGC GGATTGTATG 280 CAATTCTTCA TTCTTTGAGC AATAACCAGT CATTGTTGGA 320 GCCCGGCTCC GACTTGGACA ΑΊΊΤΊΤΤΑΑΑ ATCTCAAAGT 360 GATACTTCAA GCTCGAAGAA TAGGTTTGAT GATGTTACTA 400 CCGACCAATT CGTCTTGAAT GTAATAAAAG AGAATGTACA 440 AACATTTTCT ACTGGCCAGT CAGAAGCACC AGAAGCAACT 480 GCAGATACTA ATCTACACTA TATCACATAT GTGGAAGAGA 520 ACGGAGGGAT ATTTGAACTG GATGGAAGGA ATTTGAGCGG 560 ACCCCTCTAT TTGGGAAAGA GTGACCCAAC TGCCACCGAT 600 TTGATTGAAC AGGAATTAGT TAGAGTGAGA GTCGCCTCAT 640 ATATGGAAAA TGCAAATGAA GAAGATGTAT TAAACTTTGC 680 TATGCTAGGA TTGGGCCCTA ATTGGGAATA A 711 Obrázek β - 9/10Procento řádně složených |Qp.| společněIGF-I sámObrázek 9
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/482,271 US5789547A (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Method of producing insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) with correct folding and disulfide bonding |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ394397A3 true CZ394397A3 (cs) | 1998-09-16 |
Family
ID=23915418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ973943A CZ394397A3 (cs) | 1995-06-07 | 1996-05-30 | Způsob produkce IGF-1 a IGFBP-3 s řádným svinutím a disulfidovou vazbou |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5789547A (cs) |
| EP (1) | EP0832098B1 (cs) |
| JP (1) | JPH11507037A (cs) |
| KR (1) | KR19990022718A (cs) |
| CN (1) | CN1214689A (cs) |
| AT (1) | ATE223926T1 (cs) |
| AU (1) | AU703489B2 (cs) |
| CA (1) | CA2223495A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ394397A3 (cs) |
| DE (1) | DE69623620T2 (cs) |
| DK (1) | DK0832098T3 (cs) |
| ES (1) | ES2179943T3 (cs) |
| NO (1) | NO975749L (cs) |
| PL (1) | PL323731A1 (cs) |
| WO (1) | WO1996040736A1 (cs) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6514937B1 (en) | 1997-02-25 | 2003-02-04 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating psychological and metabolic disorders using IGF or IGF/IGFBP-3 |
| US6015786A (en) * | 1997-02-25 | 2000-01-18 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for increasing sex steroid levels using IGF or IGF/IGFBP-3 |
| US6025368A (en) * | 1997-02-25 | 2000-02-15 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating the symptoms of chronic stress-related disorders using IGF |
| US5914390A (en) * | 1997-05-12 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing yields of recombinant proteins |
| US6653098B1 (en) | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
| US6436897B2 (en) | 1998-06-01 | 2002-08-20 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical formulations for IGF/IGFBP |
| US6417330B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-09 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Insulin-like growth factor binding protein variants |
| US20030120042A1 (en) * | 2000-03-30 | 2003-06-26 | Takao Yamada | Process for producing recombinant protein |
| US20050033035A1 (en) * | 2001-06-07 | 2005-02-10 | Hans-Georg Beisel | Mutants of igf binding proteins and methods of production of antagonists thereof |
| ATE459637T1 (de) * | 2004-12-24 | 2010-03-15 | Insmed Inc | Gereinigte rhigf-i/rhigfbp-3-komplexe und herstellungsverfahren dafür |
| US8518877B2 (en) | 2007-04-18 | 2013-08-27 | Premacure Ab | Method and product for treatment and/or prevention of complications of prematurity |
| CN109180802A (zh) * | 2011-12-15 | 2019-01-11 | 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 | 具有降血糖作用的化合物、组合物及其用途 |
| KR20200097679A (ko) | 2017-09-11 | 2020-08-19 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 만성 폐 질환 치료를 위한 방법 및 조성물 |
| CN107991492A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-05-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3的定量检测试剂盒及其非诊断目的的检测方法 |
| CN111876490B (zh) * | 2020-07-03 | 2022-07-15 | 扬州大学 | 一种提高猪生长速度的连锁分子标记、其检测方法及应用 |
| ES3005966T3 (en) | 2020-10-19 | 2025-03-17 | Oak Hill Bio Ltd | Compositions suitable for use in neonates |
| JP2025502349A (ja) | 2022-01-19 | 2025-01-24 | オーク ヒル バイオ リミテッド | Ｉｇｆ－１／ｉｇｆｂｐの酸化を低減するための組成物および方法 |
| WO2023139250A1 (en) * | 2022-01-24 | 2023-07-27 | Oak Hill Bio Limited | Lot release assays for igf‐1/igfbp complexes |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
| US5158875A (en) * | 1989-08-25 | 1992-10-27 | Amgen Inc. | Production of biologically active insulin-like growth factor i from high expression host cell systems |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| AU3812993A (en) * | 1992-03-24 | 1993-10-21 | Synergen, Inc. | Refolding and purification of insulin-like growth factor I |
| SE9303784D0 (sv) * | 1993-11-16 | 1993-11-16 | Kabi Pharmacia Ab | Igf |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/482,271 patent/US5789547A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-30 CN CN96195432A patent/CN1214689A/zh active Pending
- 1996-05-30 DE DE69623620T patent/DE69623620T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-30 DK DK96916829T patent/DK0832098T3/da active
- 1996-05-30 WO PCT/US1996/008113 patent/WO1996040736A1/en not_active Ceased
- 1996-05-30 KR KR1019970709160A patent/KR19990022718A/ko not_active Withdrawn
- 1996-05-30 JP JP9500881A patent/JPH11507037A/ja not_active Ceased
- 1996-05-30 EP EP96916829A patent/EP0832098B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-30 CA CA002223495A patent/CA2223495A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-30 AU AU59576/96A patent/AU703489B2/en not_active Ceased
- 1996-05-30 AT AT96916829T patent/ATE223926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-30 PL PL96323731A patent/PL323731A1/xx unknown
- 1996-05-30 CZ CZ973943A patent/CZ394397A3/cs unknown
- 1996-05-30 ES ES96916829T patent/ES2179943T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-05 NO NO975749A patent/NO975749L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996040736A1 (en) | 1996-12-19 |
| AU703489B2 (en) | 1999-03-25 |
| PL323731A1 (en) | 1998-04-14 |
| CA2223495A1 (en) | 1996-12-19 |
| NO975749L (no) | 1998-01-27 |
| KR19990022718A (ko) | 1999-03-25 |
| AU5957696A (en) | 1996-12-30 |
| ES2179943T3 (es) | 2003-02-01 |
| DK0832098T3 (da) | 2002-12-16 |
| DE69623620D1 (de) | 2002-10-17 |
| EP0832098B1 (en) | 2002-09-11 |
| NO975749D0 (no) | 1997-12-05 |
| CN1214689A (zh) | 1999-04-21 |
| EP0832098A4 (en) | 1999-09-15 |
| ATE223926T1 (de) | 2002-09-15 |
| JPH11507037A (ja) | 1999-06-22 |
| US5789547A (en) | 1998-08-04 |
| EP0832098A1 (en) | 1998-04-01 |
| DE69623620T2 (de) | 2003-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU703489B2 (en) | Method of producing IGF-I and IGFBP-3 with correct folding and disulfide bonding | |
| CA2122837C (en) | Method for refolding igf-1 to active conformation | |
| US6727346B2 (en) | Process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges | |
| EP0518587B1 (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| JPH0720993B2 (ja) | 生長因子 | |
| JPH08301899A (ja) | Ｉｇｆ−１スーパーアゴニスト | |
| AU761630B2 (en) | Insulin-like growth factor binding protein-3 variants | |
| Milner et al. | Mutations in the B-domain of insulin-like growth factor-I influence the oxidative folding to yield products with modified biological properties | |
| KR20080106449A (ko) | 단백질 폴딩 | |
| EP0952981B1 (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein | |
| Seddon et al. | Refolding and characterization of human recombinant heparin-binding neurite-promoting factor | |
| AU2003236080A1 (en) | A method for producing a modified peptide | |
| US7189811B2 (en) | Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body | |
| EP0482124B1 (en) | Somatotropin analogs | |
| HK1019150A (en) | Method of producing igf-1 and igfbp-3 with correct folding and disulfide bonding | |
| US5663305A (en) | Somatotropin analogs | |
| EP0736040B1 (en) | Use of igf-bp for refolding of igf | |
| US5973115A (en) | Method for potentiating and inhibiting insulin-like growth factor activity | |
| HK1023781B (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein | |
| Nishimura et al. | A novel system for the preparation of orphan receptor ligand peptides 1 | |
| Zhang | Syntheses of insulins: From in vivo to in vitro to in vivo | |
| HK1128295A (en) | Protein folding |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |