KR20080106449A - 단백질 폴딩 - Google Patents

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KR20080106449A
KR20080106449A KR1020087023404A KR20087023404A KR20080106449A KR 20080106449 A KR20080106449 A KR 20080106449A KR 1020087023404 A KR1020087023404 A KR 1020087023404A KR 20087023404 A KR20087023404 A KR 20087023404A KR 20080106449 A KR20080106449 A KR 20080106449A
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마크 윌리엄 제임스 퍼거슨
필립 멜러스
휴 제라드 래버티
닉 옥클레스톤
샤론 오케인
시몬 히긴바톰
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리노보 리미티드
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Abstract

본 발명은 전환성장인자 베타, 또는 그것의 기능적 유사체 (functional analogue)를 이합체성, 생물학적 활성 형태로 폴딩하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 용해화된, 폴드되지 않은 단량체성 성장인자를, 2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰산 (CHES) 또는 그것의 기능적 유사체 및 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계를 포함하는 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 용액은 다음에 이합체성 생물학적 활성성장인자가 생성되기에 적당한 조건하에서 인큐베이팅된다.

Description

단백질 폴딩 {PROTEIN FOLDING}
본 발명은 단백질을 활성 형태로 폴딩, 또는 리폴딩하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 전환성장인자 베타 상과의 일원의 폴딩에 관한 것이다.
전환 성장인자 베타 (TGF-베타)는 세포외 단백질의 증식, 이동, 아폽토시스, 유착, 분화, 염증, 면역억제 및 발현을 포함하는 수많은 세포 과정의 조절에서 수반되는 성장인자의 상과(superfamily)의 일원이다. TGF-베타 상과는 다음을 포함한다: TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 뼈 형태형성 단백질 (BMPs 1-16) 성장 및 분화 인자 (GDFs 1-16), 및 액티빈/인히빈.
TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3로 칭하는 세 가지의 TGF-β의 포유동물 이형체가 있다. TGF-베타는 사실상 모든 세포 타입 (상피, 내피, 혈액, 신경 및 결합조직 세포)에 의해 생성된다. TGF-베타들은 100-kDa 잠복성 비활성 전구체 분자 (LTGF-베타)로서 분비된다. LTGF-베타 분자는 하기로 이루어진다: (a) C-말단 25 kDa 이합체 신호 펩티드 (활성 단편); 및 (b) 잠복성-관련 펩티드(LAP). LTGF-베타는 퓨린, 플라스민 및 트롬빈과 같은 엔도펩티다제 및 세포주위 공간의 산성화에 의해 활성 단편으로부터 LAP의 분리에 의해 활성화된다. 유리된 활성 TGF-베타 이합체 단편은 소수성 상호작용 및 서브유닛간 이황화 브릿지에 의해 안정화된다. 또한, 각 단량체는 4개의 내부-이황화 결합 중 3개에 의해 맞물린 수개의 연장된 베타 가닥을 포함하며, "시스테인 매듭(knot)"으로서 공지된 단단한 구조를 형성한다.
TGF-베타 과 단백질들은 수많은 의학적 목적을 위해 제안되어왔다. 이들은 다양한 부위에서 흉터 형성의 감소, 상처치유의 촉진 및 손상되거나 병적인 조직의 대치의 자극을 포함한다. 이들 부위는 피부, 뼈, 연골, 신경 조직, 결합 조직 (예를 들어, 힘줄 및 인대), 안구 조직, 간 및 혈관 등을 포함한다. TGF-베타 1 및 TGF-베타 2는 동물 모델 실험에서 상처치유를 촉진함과 동시에 그들의 억제는 이후 흉터 형성을 감소시킴을 보여주어 왔다. TGF-베타 3 또한 동물 모델 및 인간 모두에서 흉터 형성을 상당히 감소시키며, 2006년에는 약제로서의 사용을 위한 조절 승인을 얻기에 가장 근접한 상과의 일원 중 하나를 나타낸다.
TGF-베타 상과의 일원의 이러한 임상적 사용은 상당한 양의 활성 성장인자를 생성하기 위한 효과적인 방법을 사용할 수 있을 필요가 있음을 인식하게 될 것이다.
TGF-베타 상과의 일원은 여러 해 동안 재조합 수단에 의해 분리되거나 생성되어왔다. 예로써 1980년 대 동안 TGF-베타 3는 원래 인간 혈소판, 인간 태반 및 소 신장으로부터 분리되었다. TGF-베타 3의 치료상의 잠재성을 고려하여, 재조합 방법에 의해 이 단백질을 제조하기 위한 수많은 시도가 있어왔다. 천연 생물학적 활성 TGF-베타 분자 (8개의 사슬간 이황화 결합 및 1개의 사슬내 이황화 결합을 지닌 동종이합체 단백질)의 복잡성으로 인해, 이들은 본래 진핵 유기체에서 발현된다 (예를 들어, EP0200341B1을 참조). 그러나, 진핵 발현은 상대적으로 낮은 발현 수준이라는 결과를 낳았고 높은 비용이 관련되었다.
따라서 원핵 숙주가 연구되었다. 그러나, 미생물 숙주는 성장인자가 활성 형태로 폴드되는데 필요한 다중 이황화 결합을 정확하게 형성할 수 없다는 점이 발견되었다. 잘못 폴드된 단백질은 숙주 세포 내에서 용해되지 않는 봉입체 (inclusion bodies)로서 형성되며 이들 보디들은 단백질이 그것의 천연 생물학적 활성 형태로 리폴드되도록 용해화되고 재생될 필요가 있다.
원핵 숙주로부터 활성 성장인자의 형성과 관련한 문제를 해결하기 위해 많은 시도가 있어왔다. 예를 들면, 미국특허 제5,922,846호, 미국특허 제5,650,494호 및 EP-B-0433 225호는 봉입체로부터 TGF-베타 과 단백질을 재생하기 위한 방법을 제안한다. 그러나, 어느 방법도 임상적 정도의 성장인자의 제조를 위한 빠르고도 효율적인 방법을 제공하지 않는다. 이를 테면 본 발명자들은 상기 환자들에서 계획된 많은 이전의 리폴딩 방법이 비효율적임을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 심지어 가장 바람직한 종전 기술 리폴딩 조건 (예를 들어, 2-8 ℃에서 0.05M 트리스, 1M NDSB-201, 20%(v/v) DMSO, 2%(w/v) CHAPS, 1M NaCl, l%(w/v) GSH, 0.2mg/mL TGF-베타 3, pH 9.3)으로도 성장인자를 리폴드하는데 약 7일이 소요됨을 발견하였다. 이 폴딩 시간은 cGMP 제조에서는 허용될 수 없는 지연이며 다량의 활성성장인자가 필요한 경우 바람직하지 않은 높은 수행비용이라는 결과를 낳는다.
따라서, 본 발명의 목적은 폴딩, 또는 리폴딩, 전환성장인자 베타 상과의 일원에 대한 종전 기술과 관련된 문제를 해결하기 위한 것이다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면 용해화된, 폴드되지 않은 단량체성 성장인자를 (i) 2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰산 또는 그것의 기능적 유사체; 및 (ii) 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계를 포함하는 용액에 첨가하는 단계; 및
이합체성 생물학적 활성성장인자가 형성될 때까지 용액 내에서 성장인자를 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 전환성장인자 베타, 또는 그것의 기능적 유사체 (functional analogue)를 이합체성, 생물학적 활성 형태로 폴딩하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명은 종전 기술 폴딩 방법을 개선하기 위한 시도를 수행하는 본 발명자에 의해 수행된 실험에 근거한 것이다.
전환성장인자 베타 (TGF-베타)는 TGF-베타 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)가 될 수 있다. 그러나, TGF-베타가 TGF-베타 3 (TGF-β3)인 것이 바람직하다.
"그것의 기능적 유사체"는 야생형 성장인자의 생물학적 활성을 유지하는 TGF-베타의 변형체를 의미한다. 기능적 유사체는 바람직하게 단백질이며, 성숙된 형태에서, 비록 기능적 유사체는 야생형과 비교할 때 줄어들거나 늘어날 수 있음을 인식하게 될 것이지만, 길이에서 약 112 아미노산의 두 단량체성 폴리펩티드의 이합체를 포함할 수 있다. 본 용어는 또한 야생형과 비교할 때 활성을 유지하거나 심지어 개선된 야생형 TGF-베타 및 특정 TGF-베타 3의 돌연변이체도 포함한다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 이러한 돌연변이체의 폴딩 또는 리폴딩에도 적용됨을 발견하였다.
본 발명에서 정의한 바와 같이, "폴딩"은 이전에 폴드된 단백질의 "리-폴딩 (re-folding)"을 포함하는 것으로 인식될 것이며, 실제로 이 단백질의 리-폴딩은 본 발명에 의해 포함되는 더욱 광범위한 폴딩의 바람직한 일원을 구성한다.
EP 0 433 225호는 변성된 단량체가 이합체화 되고 생물학적 활성 형태를 나타내도록 하는 폭넓고 다양한 "리폴딩 조건"을 생각하였다. EP 0 433 225호는 티올/이황화물 짝의 연속적인 산화 및 환원을 허용하는 "용해화제" 및 산화환원계의 존재를 포함하여야 하는 조건을 개시한다. 그것은 더욱이 세제; 유기, 물 혼화성 (water miscible), 용매; 및 인지질 또는 둘 이상의 이러한 시약의 혼합물을 포함하는 이러한 용해화제의 긴 목록이 의도된다. 명세서에서 세제의 예들은 아래의 것들을 포함한다: 소듐 도데실설페이트 (SDS), 트리톤 또는 트윈와 같은 표면 활성 화합물, 비이온성 경세제 (mild detergent)(예를 들어, 디지토닌), 양이온성 경세제 (예를 들어, N-[2,3-(디오레이록시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄), 음이온성 경세제 (예를 들어, 소듐 콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트) 및 쯔비터 이온성 세제 (예를 들어, 설포베타인 (쯔비터제), 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸아미노-1-프로판 설포네이트 (챕스(Chaps)), 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸아미노-2-하이드록시- 1-프로판 설포네이트 (챕소(Chapso)).
본 발명자들은 EP 0 433 225에서 계획된 것들을 포함하는 다양한 세제를 시험해보기로 결정하였고, 놀랍게도 시험된 대부분의 세제가 유용한 양의 활성성장인자를 얻기 위해 용인되지 않는 양의 시간이 걸리는 작업을 했던 반면에 TGF-베타 상과의 일원의 폴딩 또는 리폴딩에 대해서는 비효율적임을 발견하였다. 실시예의 표 1 및 2는 수많은 이러한 세제들이 비효율적임을 설명한다. 그러나, 본 발명자가 놀란 것은, 본 발명의 제 1 양태와 일치하는, 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계와 조합된 2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰산 (CHES), 및 그들의 유사체의 사용이 정확하게 폴드된 이합체성 성장인자를 제조하는데 특히 효과적이었다는데 있다.
본 발명자들은 본 발명의 제 1 양태에 따른 방법이 종전 기술 방법보다 상당한 개선점을 나타내는 것을 발견하였다. 상기 방법은 문헌에서 이전에 개시된 방법과 비교하여 공정의 속도가 상당히 개선된 결과를 나타내었다. 본 발명의 방법의 바림직한 구체예에서, 성장인자의 폴딩은 5일 내; 바람직하게는 3일 내; 좀더 바람직하게는 2일 내; 및 가장 바람직하게는 폴딩 공정 개시 후 약 24시간 후에 완결될 수 있다.
용어 "2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰산 또는 그들의 유사체는 CHES의 리폴딩 특성을 유지하는 세제 CHES 및 그것의 화학적 유사체를 의미한다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 CHES의 적당한 유사체는 아래의 화학식에 의해 정의될 수 있다:
Figure 112008067349416-PCT00001
여기서:
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 수소, 치환되거나 치환되지 않은 C1 -4 알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 C3 -8 싸이클로알킬기, 또는 치환되거나 치환되지 않은 방향족 중심으로 구성된 군으로부터 선택되거나 R1 및 R2가 함께 10개 원자까지 갖는 고리계를 형성하고;
X1 및 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -S(O), -S(O2)-, -NR3-, -CHR4- 및 -CHR5-로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 R3, R4, 및 R5는 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소, 치환되거나 치환되지 않은 C1 -4 알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 C3 -8 싸이클로알킬기, 또는 치환되거나 치환되지 않은 방향족 중심으로 구성된 군으로부터 선택되거나 R3, R4, 및 R5 중 두 개가 함께 6개 탄소 원자까지 갖는 고리계를 형성하고, 하나 이상의 X1 및 X2가 -CHR4- 또는 -CHR5-임을 조건으로 하며;
X3는 C, S, S=O, 또는 P-OH로 구성된 군으로부터 선택된다.
만약 하나 이상의 R1 -5가 알킬기이면, 그들이 포함하고 있는 탄소 원자수에 의존하여, 그들은 노멀, 세컨더리, 터셔리, 또는 이소기가 될 수 있다. R1 -5에 대한 적당한 알킬기의 실시예들은 Me, Et, n-Pr, i-Pr, n-Bu, sec-Bu 및 E-Bu 기이다.
만약 하나 이상의 R1 -5가 고리형 지방족이면 그들은 바람직하게는 치환되거나 치환되지 않은 싸이클로헥실기이며, 가장 바람직하게는 치환되지 않은 것이다.
만약 하나 이상의 R1 -5가 방향족이면 그들은 바람직하게는 치환되거나 치환되지 않은 페닐기이다.
바람직하게는 R1이 수소이고 R2가 싸이클로헥실이다. 택일적으로 또는 추가적으로 X1 및 X2는 바람직하게 -CH2-이고, 택일적으로 또는 추가적으로 X3는 -S=O이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 화학식 (I)의 화합물들의 바람직한 예들은 다음과 같다:
Figure 112008067349416-PCT00002
(즉, X1 및 X2가 모두 -CH2-이고 X3가 S=O인 화학식 (I)의 화합물);
Figure 112008067349416-PCT00003
(즉, R1이 수소, R2가 싸이클로헥실이고 X3가 S=O인 화학식 (I)의 화합물); 및
Figure 112008067349416-PCT00004
(즉, R1이 수소, R2가 싸이클로헥실이고 X1 및 X2가 모두 -CH2-인 화학식 (I)의 화합물).
각 화학식 (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 바람직한 예는 즉, CHES이다.
Figure 112008067349416-PCT00005
본 발명자들은 성장인자를 폴드하는데 CHES, 및 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계가 단독으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명자들은 세제/폴딩 활성을 갖는 다른 시약과 유리하게 결합할 수도 있음을 발견하였다. 이러한 시약의 예들은 다음을 포함한다: 타우로데옥시콜레이트, 이소프로필 알코올, 아르기닌-HCl, 비-세제 설포베타인-201 및 비-세제 설포베타인-211.
용액은 2.0M CHES에 대해 약 1OmM의 농도를 포함하는 것이 바람직하며; 좀더 바람직하게는 lOOmM-l.OM 및 가장 바람직하게는 약 0.7M CHES이다.
CHES가 다른 시약과 결합할 때도 상기 CHES의 농도가 사용될 수 있다. 예를들어, 리폴딩을 촉진하는데 바람직한 시약의 조합은 약 3OmM 타우로데옥시콜레이트 및 0.7M CHES이다.
용어 "저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계"는 용액 내에서 이황화물 결합이 형성되도록 하는 계를 의미한다. 적당한 계는 그것의 산화 및 환원된 형태 내의 글루타치온, 그것의 산화 및 환원된 형태 내의 디티오트레이톨, 그것의 산화 및 환원된 형태 내의 베타-머캅토에탄올 또는 베타-머캅토메탄올, 그것의 환원된 형태 내의 시스틴, 및 그것의 환원된 형태 내의 시스타민과 같은 조합 시약을 포함한다. 이들 시약들은 약 lμM 내지 250 mM, 특히 약 lOOμM 내지 10 mM의 농도로 사용될 수 있다. 산화되고 환원된 형태에 대한 이러한 계들의 몰비율은 100: 1 내지 1: 100, 특히 6: 1 내지 1: 6이 될 수 있다.
저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계는 그것의 환원되고 (GSH) 산화된 (GSSG) 형태 내의 글루타치온의 사용을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게 용액은 약 20μM-200mM 환원된 글루타치온을 포함하며; 좀더 바람직하게는 200μM-20mM 환원된 글루타치온; 및 가장 바람직하게는 약 2mM 환원된 글루타치온을 포함한다. 용액은 또한 약 4μM-40mM 산화된 글루타치온; 좀더 바람직하게는 40μM-4mM 산화된 글루타치온; 및 가장 바람직하게는 약 400μM 산화된 글루타치온을 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계는 200μM-20mM 환원된 글루타치온 및 40μM-4mM 산화된 글루타치온을 포함할 수 있다. GSH:GSSH의 정확한 비는 다음의 수많은 인자들에 의존할 것이다: 본 발명의 방법에서 사용되는 폴드되는 성장인자; 용액의 pH 및 CHES 유사체. 예로서, 폴딩 TGF-베타 3에 대해 바람직한 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계는 약 2mM 환원된 글루타치온 및 약 400 μM 또는 약 2mM 환원된 글루타치온을 포함한다.
아래에서 더욱 자세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계는 TGF-베타를 리폴드하는데 사용되기 전에 "숙성"될 수 있다.
성장인자를 폴딩하기 위한 바람직한 방법은 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계로서 GSH 및 GSSG 조합 내의 CHES의 사용을 포함한다.
바람직한 조건의 예들은 폴드되지 않은 성장인자를 아래에 노출하는 단계를 포함한다:
(a) 0.7M CHES, 2mM GSH 및 0.4mM GSSG;
(b) 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH 및 0.4mM GSSG; 또는
(c) 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH 및 2mM GSSG.
본 발명에 따른 용액을 제조하기 위해 상술한 시약은 물에 용해될 수 있다는 점을 인식할 것이다. 그러나, 또한 인식되어야 하는 것은, 상기 시약이 수많은 다른 화합물을 포함하는 용액 내에 용해될 수 있다는 점이다. 예를 들어, 용액은 염을 더 포함할 수도 있다. 용액 내에 사용될 수 있는 염은 소듐, 포타슘, 및 칼슘과 클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트 등의 염을 포함한다. 바람직한 용액은 0.5 내지 2 M 농도의 소듐 클로라이드 용액이다. 용액은, 예를 들어, 포스페이트가 완충용액화된 셀린이 될 수 있다.
시험 도중에 본 발명자들은 또한 폴딩 공정이 촉진되는 pH 및 온도의 조절에 의해 최적화될 수 있는 폴딩 조건을 확립하였다.
최적의 온도는 사용되는 시약, pH 및 리폴드되기 위한 성장인자의 양과 같은 수많은 인자들에 의존한다. 최적 환경하에서 약 15℃ 미만의 온도가 바람직하다 (예를 들어 2-8℃ 또는 약 10℃). 그러나, 더 높은 온도 (예를 들어, 실온) 역시 일부 조건에 대해 효과적이다.
본 발명자들은 일반적으로 염기성 pH에서 본 발명의 방법을 수행하는 것이 바람직함을 발견하였다. pH는 약 pH 8.0 초과가 바람직하며 약 pH 8.5 초과의 pH가 좀더 바람직하다. 용액에 대해 가장 바람직한 pH는 약 9.5의 pH이다.
용액에 첨가되는 폴드되지 않은 성장인자의 양 역시 폴딩의 효율에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 약 0.005-0.75mg/mL의 성장인자가 용액에 첨가될 수 있으며; 바람직하게는 0.01-0.5mg/mL; 좀더 바람직하게는 약 0.12-0.25mg/mL의 성장인자; 및 가장 바람직하게는 약 0.25mg/mL (즉, 250μg/ml)이다.
본 발명의 방법은 전환성장인자 베타 상과의 어떤 단량체를 이합체성, 생물학적 활성 형태로 폴드하는데 사용될 수 있다. 방법은 TGF-베타 자체 (예를 들어 TGF-베타 1, TGF-베타 2, 또는 TGF-베타 3)를 폴드하는데 사용되는 것이 바람직하다.
또한 상기 방법은 성장인자를 발현하도록 변형되는 원핵 숙주 내에서 생성되는 단량체성 전구체를 (활성 이합체 성장인자로) 폴드하는데 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어 상기 방법은 재조합 성장인자를 엔코딩하는 발현 벡터와 함께 변형되는 박테리아의 봉입체 내에 위치되는 폴딩 성장인자에 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 TGF-베타 3 발현 벡터와 함께 변형된 박테리아의 봉입체 내에 위치한 단량체성 TGF-베타 3 (예를 들어, 실시예 1에 기재되거나 당업계에 알려진 바와 같이)를 폴드하는데 사용되는 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직한 TGF-베타 3는 인간 TGF-베타 3, 재조합 인간 TGF-베타 3, 또는 인간에서 임상을 위해 성장인자를 최적화한 돌연변이체를 포함하는 인간 TGF-베타 3이다.
TGF-베타 3을 폴드하기 위해 사용되는 가장 바람직한 조건의 예들을 다음을 포함한다:
(a) 2-8℃에서 0.7M 2-(싸이클로헥실아미노) 에탄설폰산 (CHES), 2mM 환원된 글루타치온 (GSH), 0.4mM 산화된 글루타치온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5;
(b) 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5;
(c) 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 2mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5; 또는
(d) 2-8℃/실온에서 0.7M CHES, 1M NaCl, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.25mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
본 발명자들은 실험실에서 본 발명에 따른 폴딩 방법을 개발하였으며 (실시예 1에서 기재한 바와 같이) 다음에 계속해서 실시예 2에서 기재한 바와 같이 스케일-업을 하였다. 상기 방법의 스케일-업은 본 발명의 중요한 특징을 나타내는 것으로 인식될 것이다. 따라서 본 발명의 제 2 양태에 따르면 원핵 숙주로부터 전환성장인자 베타 상과의 활성 일원을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 전환성장인자 베타 상과의 일원을 발현하기 위해 변형되는 원핵 유기체의 발효;
(b) 봉입체의 분리 및 봉입체로부터 발현되는 단백질의 회수;
(c) 본 발명의 제 1 양태에 따른 전환성장인자 베타 상과의 일원의 리폴딩; 및
(d) 전환성장인자 베타 상과의 리폴드된 일원의 정제.
전환성장인자 베타 상과의 일원을 엔코딩하는 발현 벡터와 함께 변형되는 박테리아의 발효 단계 (a)를 포함하는 것이 바람직하다. 벡터는 바람직하게 TGF-베타를 엔코딩하며 가장 바람직하게는 인간 TGF-베타 3, 또는 그것의 기능적 유사체를 엔코딩한다. 변형된 박테리아는 당업계에 공지된 분자 생물학적 기술을 사용하여 생성될 수 있음이 인식될 것이다. 이러한 박테리아의 예는 실시예 1에서 주어졌다.
유기체는 전형적인 기술에 따라 발효되는 것이 바람직하다. 이것은 세포 페이스트의 발효 및 발효로부터 샘플을 수확함에 의한 세포 수거 단계 및 유기체를 분리하기 위해 샘플 원심분리 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 2 양태의 방법의 단계 (b)는 원심분리에 의해 회수된 유기체의 용해를 포함할 수 있다. 봉입체 (IB)는 다음에 추가 원심분리 및 세척 단계에 의해 회수될 수 있다. 바람직하게 IB는 IB 내의 단백질을 용해화하기 위해 수확 단계에 의해 진행되고 다음에 정화된다.
IB로부터 분리된 단백질 (즉, 폴드되지 않은 성장인자)은 다음에 본 발명의 제 2 양태의 방법의 단계 (c)에 따른 본 발명의 제 1 양태의 폴딩 방법으로 처리된다.
리폴드된 성장인자는 다음에 단계 (d)에 따라 더 정제되어야 한다. 정제는 한외 여과 및 크로마토그래피와 같은 수많은 생화학적 정제 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 정제 방법은 실시예 1의 1.15, 1.16 및 1.17에서 설명하였다. 바람직한 구체예에서 성장인자는 1차로 여과되고; 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 더 정제된 다음; 최종적으로 양이온 교환 크로마토그래피로 정제된다.
선택적으로 본 발명의 제 2 양태의 방법은 단계 (e)를 포함하며, 여기서 성장인자는 용액 내에서 바람직한 농도에서 포뮬레이트되고 바이알 내에 놓여진다. 이 용액은 임상적 사용을 위해 최종 포뮬레이션될 수 있거나 저장 및/또는 운반을 위해 포뮬레이트될 수 있다. 성장인자는 후일에 최종 임상 생성물을 형성하기 위해 완성될 수 있다.
본 발명자들은 WO 제99/18196호에서 리폴딩 골 형태형성 단백질 (BMPs)에 대한 CHES의 사용을 기술하고 있다는 것을 인지하였다. 그러나 WO 제99/18196호에서 공지된 방법은 당업자에게 본 발명의 제 1 또 제 2 양태에 따른 TGF-베타, 및 특히 TGF-베타 3 리폴딩에 대해 유용하다고 간주되지 않는다. 당업자는 수많은 동기에 의해 이 결론에 이르게 될 것이다. 이들은 다음을 포함한다:
(a) WO 제99/18196호는 구아니딘-HCL과 같은 변성체를 사용해야만 하거나 아세트산과 같은 산으로의 산성화에 의한 BMP 봉입체의 용해화에 대한 방법을 개시하고 있다. 본 발명자들은 산성화가 봉입체로부터 TGF-베타 3의 낮은 회수라는 결과를 나타낸다는 점을 발견하였다. 그들이 찾은 것은 TGF-베타 3가 산에서 용해화되고 pH가 9.5로 적정될 때 (본 발명에 따른 리폴딩에 대한 바람직한 pH), 이러한 산으로부터 염기 pH로의 변화가 TGF-베타 3 (그것의 등전점 (pH 6.4)을 가로지른 TGF-베타 3에 기인하는)의 비가역성 응집이라는 결과를 낳는다는 점이다. 이것은 매우 낮은 TGF-베타 3 수율이라는 결과를 낳는다. 구아니딘-HCL은 또한 용해화제로 연구되며, 봉입체로부터 TGF-베타 3의 회수를 매우 좋게 해주지만 너무 강한 변성제이고 TGF-베타 3이 리폴딩하는 것을 방해한다. 따라서 본 발명자들은 종전 기술의 용해화 단계가 적당하지 않음을 발견하였다. 실험은 6M 우레아 및 0.1M DTT를 사용하는 봉입체의 용해화가 TGF-베타 3의 회수를 좋게 하며 TGF-베타 3가 일단 리폴드 완충용액에 희석되면 리폴드되게 함을 확인하였다. 따라서 우레아 및 DTT를 사용하여 봉입체로부터 용해화되는 것이 바람직하다.
(b) WO 제99/18196호는 또한 BMP가 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 사용하여 정화될 수 있다고 기재하고 있다. 이들 방법 모두 TGF-베타 3의 상업적 스케일 제조에 적당하지 않다. SEC에서, 샘플 부피는 샘플의 분해능에 영향을 준다 (더욱 적은 샘플 부피 더욱 나은 정제 분해능). 본 발명의 제 2 양태에 따른 상업적 스케일 방법은 약 5OL의 용해화된 봉입체를 제조할 수 있다. 이러한 부피는 SEC를 사용하기에 실용적이지 못한데 이는 한 번에 이 부피를 처리하기 위해서는 724 L의 단일/조합된 베드-부피를 갖는 컬럼 (또는 다중 컬럼)이 필요하기 때문이다. RP-HPLC는 일반적으로 적은 컬럼 부피 때문에 분석 장치로서 사용되며 역시 같은 이유로 TGF-베타 3의 상업적 스케일 방법에 사용하기에 실용적이지 못하다. 본 발명의 제 2 양태의 방법은 70% 및 초과의 TGF-β3 순도를 주는 접면 유동 여과 (TFF)를 사용하는 것이 바람직하다.
(c) 발현된 단백질의 순도는 리폴드 수율에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 일반적인 원리에 따르면 더 높은 발현된 단백질의 순도는 더 높은 리폴드 수율을 나타낸다. 본 발명자들은 70%의 TGF-β3 순도 (단백질 전체의) 및 이것이 높은 리폴드 수율을 주고 낮은 TGF-β3 순도 (<50%의 전체 단백질)가 낮은 리폴드 수율을 줌을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 TGF-β3는 50% 초과의 순도 및 좀더 바람직하게는 약 70% (또는 초과)의 순도인 것이 바람직하다. 이 순도는 봉입체의 세척단계 및 TFF (예를 들어, 실시예 2를 참조)를 사용하는 용해화된 TGF-베타 3의 정화를 포함하는 것에 의해 달성될 수 있다.
(d) TGF-베타 3는 다른 pH들에서 형태 (2차 구조) 및 용해도에서 상당한 변화를 겪는다. 용액을 포함하는 TGF-베타 3의 pH가 산성 (<pH 3.8)으로부터 염기성 pH(<pH 8.0)으로 움직임에 따라, 응집이 나타나며, pH 6.5 내지 pH 8.5에서 최대 응집이 일어난다. WO 제99/18196호는 바람직한 리폴딩 BMP의 pH가 약 8.5라고 기재하고 있다. 그러나 이는 TGF-베타 3의 응집을 초래함으로써 TGF-베타 3의 리폴딩에 적당하지 않으며, 따라서 리폴드 효율 및 수율이 상당히 감소된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 8.5 초과의 pH에서 리폴딩 완충용액을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 9.0 초과 및 가장 바람직하게는 약 9.5의 pH이다.
(e) 본 발명자들은 또한 리폴드 완충용액 내에서 산화환원 짝 (예를 들어, 환원되고 산화된 글루타치온)의 최적의 농도는 BMP 및 TGF-베타 3에 대해 달라질 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 TGF-베타 3의 제조에서 사용되는 환원된 글루타치온 (GSH) 및 산화된 글루타치온 (GSSG)의 바람직한 농도는 각각 2mM 및 0.4mM이다. 또한 본 발명자들은, 일단 산화환원 짝이 용액에 용해되면, 완충용액이 적어도 2시간, 바람직하게는 적어도 3-5시간 및 가장 바람직하게는 약 7시간 동안 숙성되는 것이 가장 바람직하다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 산화환원 짝 "숙성"의 이점에 관해 어떠한 가설에도 구애받지 않으려고 하였으며, 그들은, 수용액에서 GSH는 쉽게 산화되어 GSSG를 제조하고 생리학적 pH에서 GSH의 반감기는 약 4시간임을 나타내었다. 또한 본 발명자들은 바람직한 TGF-베타 리폴딩 완충용액 (pH 9.5)에서 GSH의 반감기가 상당히 낮은 것으로 추정하였다 (염기성 pH에서 적은 수소 이온이 GSH 내의 재활성 티올레이트에 양자화되어 반응하지 않은 티올을 생성). pH 9.5에서 GSH의 반감기의 전형적인 추정치는 3시간이 될 것이다. 따라서 7시간의 완충용액 숙성 후 산화환원 짝의 농도는 따라서 약 0.5mM의 GSH 및 1.15mM의 GSSG가 될 것이다. 따라서 이들 농도가 리폴딩 TGF-베타 3에 대한 바람직한 농도가 된다. WO 제 99/18196호는 산화환원 짝의 바람직한 농도가 2mM의 GSH 및 1mM의 GSSG (폴딩 BMP에 대한)라고 기재하고 있다. GSH의 이러한 증가된 농도는 TGF-베타 3의 리폴딩을 상당히 연장하며, 수율을 감소시킬 수 있다 (단백질에서 GSH가 이황화물 결합을 깨는 것과 같이). 더하여 WO 제99/18196호는 리폴드 완충용액 내에서 5mM EDTA가 필요하다고 기재하고 있다. 리폴드 완충용액 내의 EDTA와 같은 킬레이트화제의 존재는 GSH (즉, GSH 반감기 증가)를 안정화시키며, 이는 TGF-베타 3의 리폴드를 더 연장시키며 수율을 감소시킬 수 있다.
(f) WO 제99/18196호는 리폴드 완충용액 내에서 BMP의 바람직한 농도가 1-lOOμg/mL라고 기재하고 있는데, 이것은 본 발명자가 TGF-베타 3 (최적 250μg/mL)의 제조에서 유용한 것으로 발견한 농도보다 상당히 낮은 것이다. 250μg/mL의 TGF-베타 3는 100μg/mL의 TGF-베타 3 보다 더욱 높은 리폴드 효율을 준다. 따라서, 본 발명의 방법은 리폴딩 단계에서 100μg/mL 초과의 TGF-베타 3 및 바람직하게는 약 250μg/mL의 TGF-베타 3을 사용하는 것이 바람직하다.
(g) WO 제99/18196호는 BMP의 리폴드의 바람직한 온도가 2O℃라고 기재하고 있다. 본 발명자들은 TGF-베타 3의 리폴드를 실온 (22℃)에서 수행하면 TGF-베타 3의 응집을 나타내며 TGF-베타 3의 리폴딩은 TGF-베타 3의 생산적인 폴딩 경로 및 소수성 상호작용의 억제를 유지하기 위해 15℃ (바람직하게는 2-8℃ 또는 약 1O℃) 미만에서 일어나야 한다.
본 발명의 제 2 양태에 따른 가장 바람직한 방법은 도 10에서 설명된다. 도 10에서 설명된 바람직한 방법에서 사용하기에 적당한 상세한 조건 및 프로토콜은 도 11 내지 26에 나타내었다. 당업자는 비록 이들 도면에서 기재하고 있는 조건 및 프로토콜이 도 10에서 설명하고 있는 방법에 바람직하게 사용될 수 있지만, 그들이, 필요하지 않은 환경을 제외하고, 본 발명에 따른 적당한 폴딩 방법에 효과적으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 실시예 및 아래의 도면을 참조하여 더 설명될 것이다:
도 1은 실시예 1의 1.4를 참조하여 교반 플라스크로부터 유도 후 샘플의 예증이 되는 SDS-PAGE 겔의 사진이며, 여기서 레인 1 & 6은 Mark 12 표준 (인비트로젠)이고 레인 2-5는 각각 3μL의 클론 1-4로 로딩된다 (3시간 유도 후);
도 2는 웨스턴 블롯을 도시한 사진이며 여기서 제 1 레인은 비환원된 TGF-베타 3의 표준이며 레인 2-12는 실시예 1의 표 1에서 조건 2-12에 상응하며 조건 12는 정확하게 폴드된 이합체성 TGF-베타 3 생성에 성공한 것을 나타낸다;
도 3은 실시예 1의 1.14에서 논의된 바와 같이 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3의 폴딩을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 사진이며, 여기서 레인 1-18은 7일간 인큐베이션 후 실시예 1의 표 3에서 실험 조건 1-18에 상응한다;
도 4는 실시예 1의 1.14에서 논의된 바와 같이 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3의 폴딩을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 사진이며, 여기서 레인 19-36은 7일간 인큐베이션 후 실시예 1의 표 3에서 실험 조건 19-36에 상응한다;
도 5는 실시예 1의 1.14에서 논의된 바와 같이 본 발명에 따른 가장 바람직한 리폴딩 조건에 대해 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3의 폴딩을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 사진이며, 여기서 레인 1은 0일에서 리폴딩을 나타내고; 레인 2는 1일 후 리폴딩을 나타내며; 레인 3은 2일 후 리폴딩을 나타내고; 레인 4는 3일 후 리폴딩을 나타내며 레인 5는 비환원된 TGF-베타 3의 표준이다;
도 6은 실시예 1의 1.14에서 논의된 바와 같이 종전의 리폴딩 기술을 사용한 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3의 폴딩을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 사진이며, 레인 1은 1일 후 리폴딩을 나타내며; 레인 2는 2일 후 리폴딩을 나타내고; 레인 3은 3일 후 리폴딩을 나타내며; 레인 5는 7일간 처리 후의 리폴딩을 나타낸다;
도 7은 (a) 0일에서, (b) 1일 후 및 (c) 2일 후의 리폴드된 TGF-베타 3 샘플의 양이온 교환 HPLC에 의한 정제 후, 실시예 1의 1.14에서 논의된 바와 같이 본 발명에 따른 가장 바람직한 리폴딩 조건에 의해 생성된 이합체성 TGF-베타 3의 양을 도시한 크로마토그램을 나타낸다;
도 8은 부틸-세파로스 컬럼 상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제 후, 실시예 1의 1.15에서 논의된 바와 같이 본 발명에 따른 가장 바람직한 리폴딩 조건에 의해 생성된 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3의 양을 도시한 크로마토그램을 나타낸다;
도 9는 세파로스 컬럼 상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제 후, 실시예 1의 1.16에서 논의된 바와 같이 본 발명에 따른 가장 바람직한 리폴딩 조건에 의해 생성된 이합체성 TGF-베타 3의 양을 도시한 크로마토그램을 나타낸다;
도 10은 다음과 같은 본 발명의 제 2 양태에 따른 바람직한 방법을 도시한 플로우 다이어그램이다: (A)는 발효 및 봉입체 (IB)를 회수하는 단계를 나타내고; (B)는 IB 용해화 및 정화 단계를 나타내며; (C)는 본 발명의 제 1 양태에 따른 리폴드 단계를 나타내고; (D)는 정제 단계를 나타내며; (E)는 포뮬레이션 및 의약 제품의 파일에 대한 단계를 나타낸다.
도 11은 도 10(A)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 발효에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 12는 도 10(A)(ii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 수거 및 원심분리에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 13은 도 10(A)(iii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 세포 용해 및 IB 회수에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 14는 도 10(B)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 봉입체 용해화에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 15는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 (A) 정화 막 제조 (도 10(B)(ii)); 및 (B) 예비-리폴드 UF/DF 막 제조 (도 10(B)(iii))에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 16은 도 10(B)(ii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 봉입체 정화에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 17은 도 10(B)(iii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 예비-리폴드 UF/DF에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 18은 도 10 (C)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 단백질 리폴딩에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 19는 도 10 (D)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 리폴딩 후 한외 여과 막 제조에 대한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 20은 도 10 (D)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 리폴드 후 한외 여과 및 부틸 로드 제조에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 21은 도 10 (D)(ii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 레진 패킹에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 22는 도 10 (D)(ii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 방식에서 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 레진을 사용하기 위한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 23은 도 10 (D)(ii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용 후 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 레진의 세척 및 재생을 위한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 24는 도 10 (D)(iii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용 전 SP 세파로스 패스트 플로우 레진 세척을 위한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 25는 도 10 (D)(iii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 SP 세파로스 패스트 플로우 레진을 패킹하기 위한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 26은 도 10 (D)(iii)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 방식에서 SP 세파로스 패스트 플로우 레진을 사용하기 위한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다;
도 27은 도 10 (D)(iii)에서 설명한 것과 같이 (A) 사용 후; 및 (B) 사용 전/재생에 있어서 SP 세파로스 패스트 플로우 레진 세척을 위한 바람직한 조건 및 프로토콜을 도시한다;
도 28은 도 10 (E)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 최종 UF/DF 막 제조에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다; 및
도 29는 도 10 (E)(i)에서 설명한 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한, SP 세파로스 용리 정제된 TGF-β3 용액의 UF/DF, 및 최종 파일링에 대한 두 개의 바람직한 조건 및 프로토콜 (A 및 B)을 도시한다.
실시예 1
본 발명자들은 TGF-베타 상과의 리-폴딩 일원의 개선된 방법이 확립되었는지의 여부를 연구하였다. 하기 실시예는 TGF-베타 3의 리-폴딩에 대한 본 발명의 방법의 적용을 예시한다.
우선, 연구는 제 1 스크린 리-폴드 시약 (1.13을 참조)을 설정하였다. 1차 스크린에서 리-폴딩을 돕는 것으로 발견된 시약을 수율을 최대로 하고 리폴드 타임 라인을 감소시키는 최적화 (1.14를 참조)를 위해 여기에서 기재한 바와 같이 넣었다. 리폴드된 성장인자 정제의 최종 방법을 연구하였다 (1.15- 1.17).
TGF-베타 3의 생물학적 활성을 시험하기 위해 사용된 방법은 1.18에서 설명하였다.
이들 연구들은 본 발명자들로 하여금 본 발명의 제 1 양태에 의해 정의되는 방법에 따라 확립될 수 있는 활성 형태로의 TGF-베타 상과의 일원을 폴딩하는 개선된 방법을 이해하게 하였다.
실험:
1.1 뉴클레오티드 시퀀스
TGF-베타 3 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 아래와 같다:
Figure 112008067349416-PCT00006
(SEQ ID No. 1)
1.1 cDNA 생성
인간 절제 상처로부터의 전체 RNA (상처형성 5일 후에 채취)에 DNA-Free (Ambion)를 처리하여 임의의 오염 DNA를 제거하였다. 전체 RNA를 주형으로 이용하여, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 TGF-베타 3 cDNA를 생성시켰다. 브릴리언트® QRT-PCR 코어 리전트 키트 (Brilliant® QRT-PCR Core Reagent Kit, 1-Step (Stratagene))로부터 RT-PCR 마스터 믹스를 제조하였다. 1 마이크로그램의 RNA를, 원-스텝 (One-step) QRT-PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 3.5mM MgCl2, 1 μL 스트라타스크립트 (StrataScript) 역전사효소, Taq 중합효소 2.5 유닛, 0.4 μM 센스 프라이머 (5' GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3')(SEQ ID No. 2), 0.4μM 센스 프라이머 (5'- CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGA C 3')(SEQ ID No. 3)를 포함하는 50 μL의 용액에 첨가하였다. 반응물을 열 사이클러 (Hybaid PCR Expresses)에 두고 하기 조건으로 수행하였다: 45℃에서 30분, 95℃에서 10분, 이후 30초 동안 95℃, 1분 동안 65℃ 및 1분 동안 72℃의 40 주기, 10분 동안 72℃의 최종 단계. PCR 샘플을 2% (w/w) 아가로오스 젤에서 영동시켜, 밴드 크기를 확인하고, 위저드 PCR 프렙 키트 (Wizard PCR Prep Kit) (Promega)를 이용하여 정제시켰다.
1.2. 벡터 클로닝 및 숙주 세포 형질전환.
pET-24d 벡터는 pBR322 벡터로부터 유래되며, 이는 LacUV5 조절하의 T7 프로모터 및 카나마이신 내성 마커 유전자를 함유한다.
TGF-베타 3 cDNA 단편을 4시간 동안 37℃에서 15μL의 반응물 (Nuclease Free Water, Novagen) 중의 0.75μL의 NcoＩ (New England Biolabs) 및 0.75μL의 BamHＩ (New England Biolabs)와 1 X BamHＩ 완충용액 (New England Biolabs)을 이용하여 분해하였다. 1 마이크로리터의 pET-24d 플라스미드 (Novagen)를 동일한 방식으로 분해하였다. 분해된 cDNA 및 큰 플라스미드 단편을 아가로오스 젤 정제시 키고, 스핀프렙 (SpinPrep) 젤 DNA 추출 키트 (Novagen)를 이용하여 회수하였다.
정제된 cDNA 및 플라스미드 단편을 T4 리가아제 키트 (Novagen)를 이용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션된 cDNA/플라스미드를 HMS174 (DE3) (Novagen HMS 174 (DE3) 형질전환 키트)로 형질전환시켰다. 50μg/mL 카나마이신 (Invitrogen)을 함유하는 루리아 브로쓰 (LB) 아가 플레이트에 플레이팅하여 형질전환체를 선택하였다. 제한 절단 및/또는 발현을 위한 적절한 클론을 선택하였다.
1.3. 생성물 발현을 위한 클론 스크리닝
클론을 절반 강도의 '테리픽 브로쓰 (Terrific Broth)' (6g/L 피톤 (phytone) 펩톤 (Becton Dickinson), 12g/L 효모 추출물 (Becton Dickinson), 2g/L 글리세롤 (JT Baker), 1.16g/L 제 1 인산칼륨 (JT Baker), 6.25g/L 제 2 인산칼륨 (JT Baker), 1리터로 채우는 증류수)의 플라스크 배양물을 교반하면서 성장시키고, 1 mM 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 이용하여 0.65 내지 0.85의 OD6O0의 지수기를 유도하였다. 유도후 샘플을 IPTG의 첨가 3시간 후에 수집하고, 생성물 유도 및 발현에 대해 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석하였다. 유도전/유도후 클론 1-4 샘플 분취량 및 마크 12 분자량 표준 (Invitogen - 2.5-20OkDa의 분자량 범위)을 120 밀리암페어 및 200 볼트에서 약 40-50분 동안 NuPAGE® 노벡스 12% 비스-트리스 젤, 1.0mm (Invitrogen)에서 영동시키고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 6 내지 14.4kDa의 크기의 단백질 (즉, TGF-베타 3 단량체)이 가장 많은 양의 TGF-β3 단백질을 발현하는 클론 2로 각각의 상기 배양물에서 명백하게 유도되었다 (도 1 참조).
1.4. 동결 세포 스톡
클론 1-4를 절반 강도의 테리픽 브로쓰에서 약 1의 OD600으로 교반 플라스크에서 성장시키고, 글리세롤을 20%(v/v)로 첨가하여 글리세롤 스톡으로 보관하였다. 1.2 mL의 브로쓰를 12 x 2mL의 냉동바이얼 (0.3 mL의 글리세롤 함유)에 분취시키고, -70℃에서 보관하였다.
1.5. TGF -베타 3 유전자의 서열 확인.
동결 세포 스톡에 사용된 배양물 샘플을 수집하고, 글리세롤을 첨가하고, 키아젠 미니프렙 키트를 이용하는 플라스미드 분리에 사용하였다. 분리된 플라스미드를 T7 프로모터 프라이머 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3')(SEQ ID No. 4) 및 T7 종료자 프라이머 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3')(SEQ ID No. 5)를 이용하여 서열 분석하고 확인하였다.
1.6. 시드 배양.
클론 2가 가장 많은 양의 TGF-베타 3 단백질을 발현함에 따라, 동결 스톡 앰풀 (섹션 1.4)을 회수하고, 50OmL의 HySoy 배지 (12g/L Hy-Soy (Quest International), 24g/L 효모 추출물 (Becton Dickinson), 10g/L NaCl (Sigma) 및 10g/L 글리세롤 (Sigma) 및 50μg/mL의 카나마이신)를 함유하는 2리터의 배플드 에를렌마이어 플라스크에 접종시켰다. 플라스크를 37℃ 및 200 rpm에서 교반하면서 인큐베이팅시키고, OD550을 측정하기 위해 주기적으로 샘플을 채취하였다. 배양물 의 OD가 3.21 U/mL에 도달 (7시간 후)하는 경우, 세포 브로쓰를 150L 발효기 (100 L 작업 부피)에 시딩하기 위해 사용하였다.
1.7. 발효
900 밀리리터의 세포 브로쓰 (섹션 3.6)을 90L의 배치 배양 배지 (0.6g/L K2HPO4, 0.4g/L KH2HPO4, 1.25g/L NH4SO4, 12g/L HY-Soy, 24g/L 효모 추출물 및 10g/L 글리세롤)를 함유하는 150L 발효기 (WHE)에 접종하기 위해 사용하였다. 발효 수행 파라미터를 다음과 같이 조절하였다: 온도 설정, 37℃; pH 설정, 7.0 (4N 수산화암모늄 및 4N 인산을 이용하여 유지); 및 최초에 100%로 조정된 용존산소 (OD). 용기 수두압은 7 psi였고, 교반 및 기류 (vvm 또는 slpm)는 각각 분당 배지 부피당 1 부피의 공기를 이용하여 200-400 rpm이었다. 하기의 우선사항의 발효 설정 파라미터를 조정하여 DO를 20%를 초과하도록 유지시켰다: 진탕 (최대 400 rpm), 통기 (최대 1.5 vvm), 산소 보충 (최대 33.3 Ipm), 및 역위압 (최대 12 psi). 플루로닉 (Pluronic) L-61 (25% v/v)를 이용하여 기포형성을 조절하였다. 배양물의 OD가 10 U/mL에 도달하는 경우, 글리세롤 공급 (50% v/v)을 45 mL/분의 유속으로 개시하였다. OD가 40 U/mL에 도달하는 경우, IPTG를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하여 세포를 유도시켰다.
1.8. 수거
유도 4시간 후, 발효기를 10℃로 냉각시키고, 기류 및 교반을 각각 0.3 vvm 및 100 rpm으로 감소시켰다. 기포 및 pH 조절을 중지하고, 역위압을 3 psi로 조정 하였다. 10℃에서 웨스트팔리아 (Westfalia) CSA 8 연속 원심분리를 이용한 연속적인 원심분리에 의해 배양물을 수거하였다. 원심분리를 15,000 rpm 및 분당 3리터의 유속에서 수행하고, 세포 슬러리를 수집하였다.
1.9. 세포 용해 및 IB 회수
발효 세포 페이스트 (섹션 1.8)를 용해 완충용액 (6.1g/L 트리즈마베이스 (TrizmaBase)(트리스), 3.7g/L 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 58.44g/L NaCl 및 10g/L 트리톤 X-100, pH 8.0)으로 1:5로 희석시키고, 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 재현탁시켰다. 재현탁된 세포 페이스트를 고압 균질화기 (파라미터: 압력, 10,000 psig; 유속, 450 mL/분; 및 온도, 15℃)를 통해 2회 통과시켰다. 이후, 균질화된 세포 용해물을 4℃에서 20분 동안 5,000xg에서 원심분리 (bucket centrifuge, fixed-angle rotor)시켰다. 상청액을 불용성 (봉입체) TGF-베타 3을 남기고 폐기하였다. 봉입체 (IB) 펠렛을 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 세척 완충용액 (6.1 g/L 트리스 및 3.72 g/L EDTA, pH 8.0)에 재현탁시키고, 원심분리 (4℃에서 20분 동안 5,000xg)시켰다.
1.10. 봉입체 용해화
섹션 1.9로부터의 침전물을 용해화 완충용액 (6.1g/L 트리스, 15.4g/L DL-디티오트레이톨 (DTT) 및 360.4g/L 우레아, pH 8.0)에 1:10으로 희석시키고, 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 재현탁시켰다. 현탁액의 커버를 씌우고, 60-75분 동안 실온에서 교반시켜, 봉입체를 용해시키고, TGF-베타 3을 이의 단량체 형태로 환원시켰다. 재현탁된 펠렛의 pH를 NaOH/아세트산을 이용하여 pH 9.4-9.6으로 조정하고, 60-75분 동안의 두 번째 시간 동안 인큐베이팅시켰다.
1.11. 정화/ 한외 여과 및 정용여과
섹션 3.10의 용해된 물질을 정화시키고, 농축시키고, 접면 유동 여과 (Tangential Flow Filtration) (TFF) 시스템 (Millipore)으로 정용여과시켰다. 최초 정화 및 농축을 미리 조절된 정화 TFF 막 (Millipore Pellicon 1000kDa, regenerated cellulose, screen V)을 이용하여 수행하였다. 정화된 TGF-베타 3을 투과액에서 수거하였다. 한외 여과/정용여과 (UF/DF) 막 (Millipore Pellicon 5kDa, regenerated cellulose, screen C)으로 전환시킨 후, TGF-베타 3을 6 정용부피의 용해화 완충용액 (6.1g/L 트리스, 15.4g/L DTT 및 360.4g/L 우레아, pH 9.5)으로 세척하였다.
1.12. 리폴드 스크리닝 매트릭스 1
1.12.1. 방법
섹션 1.11로부터의 정화된 물질 내의 TGF-베타 3 단백질 함량을 SDS-PAGE, 쿠마시 블루 염색 및 농도 계측과 함께 RC DC™ 단백질 분석 (BioRad)을 이용하여 정량하였다. TGF-베타 3 물질을 일련의 리폴드 완충용액에 희석시켰다 (표 1 및 2 참조). 1 mL의 샘플을 6일의 시간에 걸쳐 매일 채취하고, SDS-PAGE를 이용하여 비환원 조건하에서 분석하였다. 샘플 분취량 및 마크 12 분자량 표준 (Invitogen - 2.5-20OkDa의 분자량 범위)을 120 밀리암페어 및 200 볼트에서 약 40-50분 동안 NuPAGE® 노벡스 12% 비스-트리스 젤, 1.0mm (Invitrogen)에서 영동시켰다. 이후, 단백질 샘플을 노벡스 블로팅 (Novex Blotting) 장치 (Invitrogen)를 이용하여 니 트로셀룰로오스 막 (Invitrogen)으로 전기영동적으로 옮겼다. 막을 포스페이트 완충 염수 중의 5% (w/v) 탈지유 분말, 1% (v/v) 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20, Sigma)를 이용하여 블로킹시켰다. 막을 세척 (PBS, 0.1%(v/v) Tween 20)하고, 일차 항체 (PBS 및 0.1(v/v) 트윈 20에 1:500으로 희석된 항-TGF-β3, MAB643(R&D systems))로 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 일차 항체와 인큐베이팅시킨 후, 니트로셀룰로오스를 세척 완충용액 (PBS, 1% (v/v) Tween 20)으로 세척하였다. 이후, 니트로셀룰로오스를 이차 항체 (PBS, 0.1% (v/v) Tween 20으로 1:2000으로 희석된 알칼리성 포스파타아제에 컨쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG (Abcam PO397))로 1시간 동안 추가로 인큐베이팅시켰다. 막을 다시 세척 (PBS, 1% (v/v) Tween 20)하고, 알칼리성 포스파타아제에 대한 웨스턴 블루 (Western Blue) 안정화 기질 (Promega)을 이용하여 발달시켰다.
MAB 643 항체로 정확하게 리폴딩된 단량체 및 이합체 TGF-베타 3 종을 검출하였다.
1.12.2. 결과
표 1 및 2는 50개의 다양한 실험 조건하에서의 TGF-베타 3의 리폴딩 시험에서 얻어진 결과를 요약한다.
본 발명자들은 하기 기술된 조건 (즉, 실험 조건 12, 19, 및 44)이 정확하게 리폴딩된 이합체 TGF-베타 3을 생성한 것을 확인하였다:
1. 2-8℃에서 0.7M 2-(싸이클로헥실아미노) 에탄설폰산 (CHES), 2mM 환원된 글루타치온 (GSH), 0.4mM 산화된 글루타치온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5 (실험 조건 12).
2. 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5 (실험 조건 19).
3. 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 2mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5 (실험 조건 44).
예로써 도 2는 실험 조건 12의 효율성을 설명한다.
표 1. 리폴드 스크리닝 매트릭스 및 결과
Figure 112008067349416-PCT00007
표 2. 리 폴드 스크리닝 매트릭스 및 결과
Figure 112008067349416-PCT00008
1.13 리폴드 최적화
실험 12 (pH 9.5, 2-8℃에서 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3)의 조건으로부터 특히 잘-폴드된 TGF-베타 3을 얻었다. 이들 조건은 따라서 더욱 최적화되기 위해 선택되었다.
연구된 파라미터는 다음과 같다:
● TGF-베타 3 농도 (0.1mg/mL5 0.25mg/mL 및 0.5mg/mL)
● pH (8.0, 9.0 및 9.5)
● 온도 (2-8℃ 및 실온)
● 1M NaCl의 첨가
섹션 1.12로부터의 TGF-베타 3 물질을 일련의 리-폴드 조건 (표 3 및 4 참조)으로 희석하였다. 1ml 샘플을 6일 타임라인에 걸쳐 매일 취하였다. 6일 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (방법을 위한 섹션 1.13 참조)을 사용하여 비-환원 조건하에서 분석하였다. 정확하게 리-폴드된 TGF-베타 3 단량체를 모든 리-폴드 조건에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 정확하게 리-폴드된 TGF-베타 3 이합체를 1.0M NaCL 을 포함하는 모든 실험 조건 (도 3 및 4 참조)에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.
그것의 이합체성 상태로 리-폴드되는 다량의 TGF-베타 3하에서 조건은 실험 조건 34 (2-8℃/실온에서 0.7M CHES, 1M NaCl, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.25mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5)이었다.
실험 조건 34로부터의 0, 1, 2 및 3일 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 상에서 영동시키고 웨스턴 블롯화하여 정확하게 리폴드된 TGF-베타 3가 생성되는 시간점을 결정하였다. 도 5에서 보여주는 바와 같이 최초 출발물질 및 1일 샘플은 소량의 정 확하게 폴드된 단량체성 및 이합체성 TGF-베타 3을 포함한다. 리폴딩의 2일 및 3일에 정확하게 폴드된 TGF-베타 3의 양이 상당히 증가하였다.
도 6은 미국특허 제5,922,846호, 미국특허 제5,650,494호 및 EP 0 433 225 (2-8℃에서 0.05M 트리스, 1M NDSB-201, 20%(v/v) DMSO, 2%(w/v) CHAPS, 1M NaCl5 l%(w/v) GSH, 0.2mg/mL TGF-베타 3, pH 9.3)에서 계획된 종전의 리폴딩 조건에 의해 달성된 리폴딩을 설명한다. 리폴드된 TGF-베타 3의 양은 7일 처리 후 (도 6의 레인 4 및 5를 비교)에도 여전히 증가하지만, 대조적으로, 성장인자는 본 발명에 따른 방법이 사용될 때 (도 5의 레인 3 및 4를 비교) 2일 처리 후 완전히 폴드되는 것을 볼 수 있다.
실험 조건 34에서 TGF-베타 3의 리-폴딩은 또한 양이온-교환 (CEX) HPLC를 사용하여 모니터되었다. 폴리설포에틸-A HPLC 컬럼 (200 x 4.6mm, 5μm, 1OOOA, 폴리엘씨사)을 이동상 A (10% (v/v) 아세트산, 30%(v/v) 이소프로필 알코올)로 평형화된다. 리폴드 샘플을 20% 아세트산, 60% 이소프로필 알코올의 1:1 혼합에 의해 산성화하였다. lOOμL의 산성화 리-폴드 샘플을 0.5mL/min (이 플로우 속도는 공정을 통해 사용된다)의 플로우 속도에서 컬럼상에 로드하였다. 컬럼을 이동상 A로 5분간 세척하였다. 선형 기울기를 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B (10% (v/v) 아세트산, 30%(v/v) 이소프로필 알코올 및 1M NaCl)의 혼합물로 끝나도록 10분간 실행하였다. 이 완충용액의 적용은 5분간 더 유지하였다. 제 2 선형 기울기가 100% 이동상 B로 끝나도록 10분간 실행하였고 더 유지하였다. 도 7은 0일에서 정확하게 리-폴드된 이합체성 TGF-베타 3(7(a) 참조)가 소량만이 존재하는 반면 1일 에서는 정확하게 폴드된 TGF-베타 3 단백질의 농도가 상당히 증가함을 보여준다 (7(b) 참조)는 사실을 설명한다. 2일 상의 이합체성 TGF-베타 3의 농도는 1일과 유사하고, 리폴딩이 24 시간 후에 완료됨을 나타낸다 (7(c) 참조). 24 시간 후 리폴딩의 완료는 종전 기술보다 상당히 빠르다 (도 6 참조).
표 3. 리폴드 최적화 매트릭스 및 결과 (실험 조건 1-18)
Figure 112008067349416-PCT00009
주: RT= 실온
2-8℃/RT= 2-8℃에서 3일 실온에서 3일.
표 4. 리폴드 최적화 매트릭스 및 결과 (실험 조건 19-36)
Figure 112008067349416-PCT00010
주: RT= 실온
2-8℃/RT= 2-8℃에서 3일 실온에서 3일.
섹션 1.14 - 1.16는 어떻게 본 발명의 제 1 양태에 따르는 리폴드된 TGF-베타 3을 정제할지 확립하기 위해 수행되는 실험에 대해 기재하였다.
1.14 한외 여과/ 소수성 상호 작용 크로마토그래피.
섹션 1.13으로부터 실험 조건 34처럼 확인된 CHES 리폴드 용액을 한외 여과 (막은 평평한 시트인 밀리포어 펠리콘 5kDa, 0.1m2, 재생된 셀룰로오스, 스크린)에 의해 5 배로 농축하였다. 농축된 리폴드 물질의 pH는 다음에 희석 완충용액에서 (2.72g/L 소듐 아세테이트, 264.28g/L 암모늄 설페이트, 100g/L 아세트산, 및 210.7g/L 아르기닌 하이드로클로라이드 pH 3.3)에서 사용 전에 1:1로 희석되는 빙초산을 사용하여 pH를 2.5-2.8로 조절하였다. 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 컬럼 (Amersham, 16cm 베드 높이)을 완충 용액 (2.72g/L 소듐 아세테이트, 132.14g/L 암모늄 설페이트 및 lOOg/L 아세트산 pH 3.3)의 4개의 컬럼 부피로 평형화하였다. 리폴드 물질은 lOOcm/hr (이 플로우 속도는 실험 방법을 통해 사용된다)의 흐름속도에서 부틸 세파로스 컬럼상에 로드되기 전에 0.22μM 막 (밀리포어 밀리팩 여과)을 통해 여과된다. 컬럼은 다음에 4개의 컬럼 부피에 대해 완충 용액 A에서 세척하였다. TGF-베타 3 단백질을 완충 용액 B (2.72g/L 소듐 아세테이트, 100g/L 아세트산 및 300g/L 에탄올 pH 3.3)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 단량체성 및 이합체성 형태 모두인 TGF-베타 3 단백질을 포함하는 1차 피크를 모았다 (도 8 참조).
1.15 양이온 교환 크로마토그래피
단량체성 단백질로부터 이합체성 TGF-베타 3 단백질을 분리하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하였다. 섹션 1.14로부터 모은 TGF-베타 3 부분을 SP 로드 희석 완충용액 (2.72g/L 소듐 아세테이트, 100g/L 아세트산, 300g/L 에탄올 pH 4.0)에서 5배로 희석하였다. SP 세파로스 패스트 플로우 컬럼 (Amersham)을 완 충 용액 A (2.72g/L 소듐 아세테이트, 100g/L 아세트산, 300g/L 에탄올 및 1.46g/L 소듐 클로라이드 pH 4.0)의 4개의 컬럼 부피로 평형화시켰다. 희석된 TGF-베타 3 물질을 169cm/hr (이 플로우 속도는 배출 공정을 통해 사용하였다)의 플로우 속도에서 SP 세파로스 컬럼 상에 로드하였다. 컬럼은 다음에 4개의 컬럼 부피에 대해 완충 용액 B (2.72g/L 소듐 아세테이트, 100g/L 아세트산, 300g/L 에탄올 및 2.92g/L 소듐 클로라이드 pH 4.0)에서 세척되었다. TGF-베타 3 단백질을 완충 용액 C (2.72g/L 소듐 아세테이트, 100g/L 아세트산, 300g/L 에탄올 및 11.69g/L 소듐 클로라이드 pH 4.0)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 1차 피크가 단량체성 TGF-베타 3이고 다음이 이합체성 TGF-베타 3이다. TGF-베타 3 이합체를 포함하는 부분을 모았다 (도 9 참조).
1.16 한외 여과/ 정용여과
섹션 1.15로부터 정제된 이합체성 TGF-베타 3 분자를 포함하는 부분을 2OmM 아세트산, 20% (v/v) 에탄올로 완충용액을 교환하도록 한외 여과/정용여과하고 ~10mg/mL (TGF-베타 3 농도는 U.V 분광기에 의해 검출되었다)로 샘플을 농축하였다.
1.17 생물학적 활성을 위한 분석.
세포 성장 억제 분석 (A Meager, 1991 - Journal of Immunological Methods; 141; pages 1 to 14)를 TGF-베타 분자에 대한 시험관 내 생물학적 활성 시험으로서 사용하였다. 비색분석(colorimetrical assay)은 밍크 폐 상피세포 (MLEC)의 성장에 TGF-베타 분자의 억제 효과를 근거로 한다. 50μL의 희석 배지 (글루타막스 I 과 함께 최소 필수 배지 (Invitrogen) 및 0.1%(w/v) 소 세럼 알부민 (Sigma))을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 50μL의 순차적으로 희석된 (5000pg/mL에서 9.75pg/mL) TGF-베타 3 표준품 (National Institute of Biological Standards and Controls), 50μL의 순차적으로 희석된 (5000pg/mL에서 9.75pg/mL) TGF-베타 3 (특허에서 기재된 방법에 의해 생성됨: 미국특허 제5,922,846호, 미국특허 제5,650,494호 및 EP-B-0433 225호) 및 50μL의 순차적으로 희석된 (5000pg/mL에서 9.75pg/mL) TGF-베타 3 (섹션 1.17에 따라 정제된 CHES 리폴드된 성장인자) 단백질을 플레이트(들)에 첨가하였다. 50μL의 세포 서스펜젼은 다음을 포함한다: 완전 배지 (글루타막스 I과 함께 최소 필수 배지 (Invitrogen), 소 세럼 알부민 (Sigma) 및 10%(v/v) 태아 소 세럼 (Invitrogen)) 내 1 xlO5 MLEC cells/mL를 각 웰에 첨가하였다.
플레이트(들)을 5% CO2에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 각 웰의 성분을 흡입하고 200μL 포스페이트 완충용액화된 셀린 (Invitrogen)으로 세 번 세척하였다. lOOμL의 기질 용액 (1M 소듐 아세테이트, 104 포스페타아제 기질 (Sigma) 및 l% (v/v) 트리톤 X-1OO (Sigma))을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 인큐베이팅하였다. 2시간 후 1N 소듐 하이드록사이드를 사용하여 반응을 중단시켰다. 플레이트(들)을 405nm에서 다중채널 리더 및 492nm에서 표준 필터를 사용하여 읽었다.
TGF-베타 3 대조 표준 (NIBSC) 및 TGF-베타 3 (특허에 기재된 방법에 의해 생성: 미국특허 제5,922,846호, 미국특허 제5,650,494호 및 EP-B-0433 225호)의 IC50값은 각각 242.33pg/mL 및 90pg/mL이었고, 이는 이전에 분석된 표준과 유사하였다. 본 발명에 따라 리폴드된 물질은 85.573pg/mL의 IC50를 갖는 것을 발견했으며, 이는 본 발명에 따라 리폴드된 TGF-베타 3을 나타내고, 종전 기술 방법에 의해 생성된 TGF-베타 3에 대해 적어도 동일한 효능 (생물학적 활성)을 갖는다.
결론
표 1 및 2에서 기재된 조건의 리폴드 스크리닝 매트릭스로부터 세 개의 조건은 정확하게 리-폴드된 이합체성 TGF-베타 3을 생성한다:
1. 2-8℃에서 0.7M 2-(싸이클로헥실아미노) 에탄설폰산 (CHES), 2mM 환원된 글루타치온 (GSH), 0.4mM 산화된 글루타치온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
2. 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
3. 2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 2mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
CHES를 포함하는 리폴드 실험 조건은 수율을 최대로 하고 타임라인을 감소시키기 위해 더욱 최적화되었다. 최적의 리-폴드 조건은 0.7M CHES, 1M NaCl, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.25mg/mL TGF-베타 3 및 pH 9.5를 포함하며, 그것은 24-48시간 사이에 리폴딩이 완료된다. 이것은 다음의 특허에서 기재된 방법을 사용한 7일보 다 상당히 빠른 것이다: 미국특허 제5,922,846호, 미국특허 제5,650,494호 및 EP-B-0433 225호.
최적화된 CHES 리-폴드는 더욱 정제되며 TGF-베타 3 표준 (NDBSC) 및 종전 기술에서 공지된 방법을 사용하여 생성된 TGF-베타 3에 대해 비교될 수 있는 생물학적 활성을 가짐을 발견하였다.
실시예 2
본 발명의 제 2 양태에 따라 개발된 산업적 공정이 개발되었다.
도 10은 공정의 개요를 제공하며, 이에 반해 도 11-29는, 플로우 도면의 형태로, 도 10에서 기재된 개개의 단계의 자세한 설명을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Renovo Ltd Ferguson, Mark Mellors, Phil Laverty, Hugh Occleston, Nick O'Kane, Sharon Higginbottom, Simon <120> PROTEIN FOLDING <130> P90081PWO <150> GB0604964.7 <151> 2006-03-11 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctttggaca ccaattactg cttccgcaac ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 60 tacattgact tccgacagga tctgggctgg aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 120 gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 180 gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 240 caggacctgg agcccctgac catcctgtac tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 300 ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa tgtagc 336 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense primer <400> 2 gatataccat ggctttggac accaattact actgc 35 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense primer <400> 3 cagccggatc cggtcgactc agctacattt acaagac 37 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 promoter primer <400> 4 taatacgact cactataggg 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 terminator primer <400> 5 gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (31)

  1. 전환성장인자 베타, 또는 그것의 기능적 유사체 (functional analogue)를 이합체성, 생물학적 활성 형태로 폴딩하기 위한 방법으로써,
    용해화된, 폴드되지 않은 단량체성 성장인자를,
    (i) 2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰산 (CHES) 또는 그것의 기능적 유사체; 및
    (ii) 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계를 포함하는 용액에 첨가하는 단계; 및
    이합체성 생물학적 활성성장인자가 형성될 때까지 용액 내에서 성장인자를 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 CHES가 약 1OOmM-1.OM의 농도에서 사용되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 약 0.7M CHES가 사용되는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CHES의 기능적 유사체가 아래의 화학식에 의해 정의되는 방법:
    Figure 112008067349416-PCT00011
    여기서:
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 수소, 치환되거나 치환되지 않은 C1 -4 알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 C3 -8 싸이클로알킬기, 또는 치환되거나 치환되지 않은 방향족 중심으로 구성된 군으로부터 선택되거나 R1 및 R2가 함께 10개 원자까지 갖는 고리계를 형성하고;
    X1 및 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -S(O), -S(O2)-, -NR3-, -CHR4- 및 -CHR5-로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 R3, R4, 및 R5는 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소, 치환되거나 치환되지 않은 C1 -4 알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 C3 -8 싸이클로알킬기, 또는 치환되거나 치환되지 않은 방향족 중심으로 구성된 군으로부터 선택되거나 R3, R4, 및 R5 중 두 개가 함께 6개 탄소 원자까지 갖는 고리계를 형성하고, 하나 이상의 X1 및 X2가 -CHR4- 또는 -CHR5-임을 조건으로 하며;
    X3는 C, S, S=O, 또는 P-OH로 구성된 군으로부터 선택된다.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 CHES의 기능적 유사체가 아래의 화학식에 의해 정의되는 방법:
    Figure 112008067349416-PCT00012
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 CHES의 기능적 유사체가 아래의 화학식에 의해 정의되는 방법:
    Figure 112008067349416-PCT00013
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 CHES의 기능적 유사체가 아래의 화학식에 의해 정의되는 방법:
    Figure 112008067349416-PCT00014
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 설피드릴/이황화물 산화환원계가 그것의 산화되고 환원된 형태 내의 글루타치온인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 설피드릴/이황화물 산화환원계가 약 200μM-20mM 환원된 글루타치온 및 40μM-4mM 산화된 글루타치온인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 pH 8-10에서 인큐베이팅되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 약 8.5 내지 9.5의 pH에서 인큐베이팅되는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 0℃-37℃의 온도에서 인큐베이팅되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 0.1-0.5 mg/mL의 농도에서 용액에 첨가되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 전환 성장인자 베타 3인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 전환성장인자 베타 3이 0.12-0.25mg/mL의 농도에서 용액에 첨가되는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴딩이 아래의 조건에서 수행되는 방법:
    2-8℃에서 0.7M 2-(싸이클로헥실아미노) 에탄설폰산 (CHES), 2mM 환원된 글루타치온 (GSH), 0.4mM 산화된 글루타치온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴딩이 아래의 조건에서 수행되는 방법:
    2-8℃/실온에서 0.7M CHES, 1M NaCl, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.25mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 타우로데옥시콜레이트 또한 용액에 첨가되는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 1OmM-10OmM의 농도에서 타우로데옥시콜레이트와 함께 인큐베이팅되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 약 3OmM의 농도에서 타우로데옥시콜레이트와 함께 인큐베이팅되는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴딩이 아래의 조건에서 수행되는 방법:
    2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴딩이 아래의 조건에서 수행되는 방법:
    2-8℃에서 3OmM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 2mM GSSG, 0.25mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 용액 내에서 단백질의 50%를 초과하여 나타나는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계를 포함하는 용액에 첨가되기 전에 저분자량 설피드릴/이황화물 산화환원계가 형성되고 약 7시간 동안 숙성되는 방법.
  25. 원핵 숙주로부터 활성 전환성장인자 베타를 제조하는 방법으로써, 아래의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 전환성장인자 베타 상과 (superfamily)의 일원 (member)을 발현하기 위해 변형되는 원핵 유기체의 발효;
    (b) 봉입체 (inclusion bodies)의 분리 및 봉입체로부터 발현되는 단백질의 회수;
    (c) 본 발명의 제 1 양태에 따른 전환성장인자 베타 상과의 일원의 리폴딩; 및
    (d) 전환성장인자 베타 상과의 리폴드된 일원의 정제.
  26. 제 25 항에 있어서, 단계 (A)에서 원핵 숙주가 전환성장인자 베타를 엔코딩하는 발현 벡터와 함께 변형된 박테리아인 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 단계 (C)에서 성장인자가 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따라 리폴드된 방법.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 한외 여과 (ultrafiltration) 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단계 (D)에 따라 정제되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 이은 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하며, 여기서 전환성장인자 베타가 용액 내에서 바람직한 농도에서 포뮬레이트되고 바이알에 위치되는 방법.
  30. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환성장인자 베타가 용액 내에서 바람직한 농도에서 포뮬레이트되고 바이알에 위치되는 단계 (E)를 더 포함하는 방법.
  31. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 도 10에서 정의한 바와 같이 단계 (A)-(E)를 본질적으로 포함하는 방법.
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