CN108753753B - Lrr受体激酶-pxy的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种LRR受体激酶‑PXY的纯化方法，包括：S1：获得表达PXY的重组菌，诱导表达PXY；S2：破碎经诱导表达PXY后的重组菌，分离得到含有包涵体的第一沉淀物；S3：用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体；S4：将所述第一含有PXY的包涵体用第一包涵体溶解液进行孵育，分离得到第二含有PXY的包涵体；和S5：将所述第二含有PXY的包涵体用第二包涵体溶解液进行孵育，分离得到PXY膜蛋白。

Description

LRR受体激酶-PXY的纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LRR受体激酶—PXY的纯化方法。
背景技术
LRR受体激酶是一种表达在植物细胞膜表面的跨膜蛋白。LRR受体激酶作为重要的影响植物生长发育的一类调控分子，广泛作用于各类信号转导过程。“LRR受体激酶—PXY”是一种表达在植物形成层细胞膜的跨膜蛋白。PXY是2007年Turner实验室通过正向遗传学手段在拟南芥中筛选到的，其表达于特定细胞的膜表面，在胞外含有22个亮氨酸重复序列，有一个短的单次跨膜区，胞内部分具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
PXY影响植物形成层发育的调控，但具体的信号转导过程仍然存在很多未知。现有的研究结果认为，当上游TDIF多肽分子结合到PXY时，信号通路被激活，一方面上调表达转录因子WOX4和(或)WOX14，起到促进形成层增殖的作用；另一方面通过释放与PXY胞质区结合的BIN2，从而将抑制形成层向木质部发育的信号传递下去。
目前，完整形式的LRR受体激酶可溶性蛋白一直没有得到。以PXY作为研究对象，如果能应用基因工程技术，在大肠杆菌中表达纯化重组的PXY，并进而寻找其底物及进行相应生化分析，将具有巨大的应用价值。
应用原核表达体系表达蛋白具有简便、快捷、蛋白表达量高的优势。但是由于PXY是一种在细胞膜表面的疏水性强的跨膜蛋白，因此与分泌型蛋白比较，要想在大肠杆菌中实现表达纯化是非常困难的。并且PXY在大肠杆菌中表达，往往具有很强的细胞毒性。应用pET15b、pET41b等多种常用的表达质粒系统均未获成功。目前，重组LRR受体激酶在大肠杆菌中的高效表达纯化方面尚未见报道。
背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。
发明内容
针对现有技术存在问题中的一个或多个，本发明提供一种LRR受体激酶-PXY的纯化方法，包括：
S1：获得表达PXY的重组菌，诱导表达PXY；
S2：破碎经诱导表达PXY后的重组菌，分离得到含有包涵体的第一沉淀物；
S3：用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体；
S4：将所述第一含有PXY的包涵体用第一包涵体溶解液进行孵育，分离得到第二含有PXY的包涵体；和
S5：将所述第二含有PXY的包涵体用第二包涵体溶解液进行孵育，分离得到PXY膜蛋白。
根据本发明的一个方面，上述步骤S1中所述获得表达PXY的重组菌的具体操作方法为：
扩增基因片段：选取拟南芥PXY基因，根据所述PXY基因设计引物对，利用所述引物对扩增所述PXY基因；
构建重组质粒：选用质粒pHUE作为转化载体，酶切所述质粒pHUE和所述已扩增的PXY基因，再利用连接酶将所述酶切后的质粒pHUE和所述酶切后的PXY基因片段连接，得到重组质粒；和
构建表达PXY的重组菌：将所述重组质粒转化入感受态大肠杆菌，得到表达PXY的重组菌。
根据本发明的一个方面，上述步骤扩增基因片段步骤中，所述引物对包括上游引物F'5'-CTCCGCGGTGGACTCAAGTTTTCACCTCAACTC-3'和下游引物R'5'-GGGGTACCTCACACCCCAATCCTTTGAC-3'；优选地，所述上游引物引入酶切位点SacII，所述下游引物引入酶切位点KpnI。
根据本发明的一个方面，上述扩增基因片段步骤中采用的PCR反应体系为50μl，其中包含2μl的PXY基因cDNA模板、1μl的所述上游引物、1μl的所述下游引物、25μl的DNA聚合酶，21μl的去离子水；其中所述PCR反应采用的扩增条件为：在98℃下预变性4min，在98℃下变性10s，在50℃～60℃下退火15s，在72℃下延伸30s，共30个循环，然后在72℃下延伸10min，然后在4℃下保温。
根据本发明的一个方面，上述构建重组质粒步骤中，所述酶切采用内切酶SacII和内切酶KpnI分别同时酶切所述已扩增的PXY基因和所述质粒pHUE。
根据本发明的一个方面，上述构建重组质粒步骤中，所述连接酶为T7连接酶。
根据本发明的一个方面，上述构建表达PXY的重组菌步骤中，所述感受态大肠杆菌为BL21(DE3)。
根据本发明的一个方面，上述步骤S1中所述诱导表达PXY之前还包括：
筛选表达PXY的重组菌阳性菌落：将所述表达PXY的重组菌接种在氨苄青霉素LB培养基上，筛选获得表达PXY的重组菌阳性菌落。
根据本发明的一个方面，上述步骤S1中所述诱导表达PXY的操作方法为：
将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中过夜培养，获得第一培养物；
将所述第一培养物接种至第二LB培养基中继续培养，得到第二培养物；和
向所述第二培养物中加入诱导剂诱导表达PXY，并再次培养；
根据本发明的一个方面，上述第一LB培养基和所述第二LB培养基中均包含浓度为100μg/ml的硫酸卡那霉素。
根据本发明的一个方面，上述过夜培养的温度为37±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下过夜培养。
根据本发明的一个方面，上述将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中的接种量按照在40-60ml的所述第一LB培养基中接入一个菌落量的表达PXY的重组菌。
根据本发明的一个方面，上述将所述第一培养物接种至第二LB培养基中的接种量的为所述第一培养物与所述第二LB培养基的体积比为8％-12％，所述继续培养的温度为37±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下继续培养2-3小时；进一步优选地，所述继续培养时间为至所述第二培养物的OD600为0.6。
根据本发明的一个方面，所述诱导剂为IPTG诱导剂，所述诱导剂的浓度为0.45mM-0.55mM，所述再次培养的温度为28±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下再次培养5-7小时；优选地，所述诱导剂的浓度为0.5mM。
根据本发明的一个方面，上述步骤S2中所述破碎采用超声破碎的方法，其中所述超声破碎的方法具体为：
将所述步骤S1中经诱导表达PXY后的重组菌液体离心分离得到第二沉淀物；优选地，其中所述离心转速为6000rpm-10000rpm，离心时间为5-15min；
向所述第二沉淀物中加入细胞裂解液，在室温下重悬，得到重悬液；优选地，其中所述加入的细胞裂解液的量为使所述第二沉淀物与所述加入的细胞裂解液的体积比为1：(3-5)；和
超声处理所述重悬液；优选地，所述超声在冰上进行，频率为600atp-1000atp，超声次数为25-35次，每次超声时间和间隔时间分别为10s和30s。
根据本发明的一个方面，上述步骤S2中所述分离得到含有包涵体的第一沉淀物的具体操作方法为：
将破碎后的诱导表达PXY后的重组菌离心分离得到所述第三沉淀物；优选地，所述离心在4℃条件下进行，所述离心转速为450g-550g，离心时间为5min-15min；进一步优选为所述离心转速为490g，离心时间为10min；和
将所述第三沉淀物继续离心得到第一沉淀物；优选地，所述继续离心在4℃条件下进行，所述继续离心转速为10000g-14000g，继续离心时间为5min-15min。
根据本发明的一个方面，上述步骤S3中所述包涵体洗涤液包括第一包涵体洗涤液、第二包涵体洗涤液、第三包涵体洗涤液和第四包涵体洗涤液；其中所述第一包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10μg/ml DNaseI，pH 8.0；所述第二包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，0.2mg/ml Lysozyme，pH 8.0；所述第三包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，2mg/ml脱氧胆酸钠，pH 8.0；和所述第四包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，pH 8.0。
根据本发明的一个方面，上述步骤S3中所述用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体的具体操作方法为：
将所述第一沉淀物用所述第一包涵体洗涤液重悬，37±1℃孵育25min-35min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第四沉淀物；
将所述第四沉淀物用所述第二包涵体洗涤液重悬，室温孵育13-17min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第五沉淀物；
将所述第五沉淀物用所述第三包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第六沉淀物；
将所述第六沉淀物用所述第四包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第七沉淀物；和
将所述第七沉淀物用去离子水重悬后以10000g-14000g的转速离心8min-12min，得到所述第一含PXY的包涵体。
根据本发明的一个方面，上述步骤S4中所述第一包涵体溶解液包含20mM Tris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
根据本发明的一个方面，上述步骤S4中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育，优选地，所述震荡的频率为16-20rpm。
根据本发明的一个方面，上述步骤S4中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min。
根据本发明的一个方面，上述步骤S5中所述第二包涵体溶解液包含20mM Tris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
根据本发明的一个方面，上述步骤S5中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育，优选地，所述震荡的频率为16-20rpm。
根据本发明的一个方面，上述步骤S5中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是根据本发明的一个实施例的LRR受体激酶-PXY的纯化方法的流程示意图；
图2是根据本发明的一个实施例利用本发明的实施例的引物对扩增拟南芥PXY基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3是根据本发明的一个实施例对扩增后的PXY基因片段和质粒pHUE进行酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图4是根据本发明的一个实施例构建的重组质粒pHUE-PXY的示意图；
图5是根据本发明的一个实施例将诱导表达PXY后的重组菌和只含有质粒pHUE的大肠杆菌获得的可溶性蛋白和包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果；
图6是根据本发明的一个实施例的两次用包涵体溶解液孵育分离后得到的上清液中PXY膜蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语"第一"、"第二"、"第三"、"第四"、"第五"、"第六"、"第七"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"、"第三"、"第四"、"第五"、"第六"、"第七"的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本发明的描述中，"多个"的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同效果。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的特征进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或效果之间的关系。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，在本发明的第一实施方式中，本发明提供一种LRR受体激酶-PXY的纯化方法，包括：
S1：获得表达PXY的重组菌，诱导表达PXY；
S2：破碎经诱导表达PXY后的重组菌，分离得到含有包涵体的第一沉淀物；
S3：用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体；
S4：将所述第一含有PXY的包涵体用第一包涵体溶解液进行孵育，分离得到第二含有PXY的包涵体；和
S5：将所述第二含有PXY的包涵体用第二包涵体溶解液进行孵育，分离得到PXY膜蛋白。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S1中所述获得表达PXY的重组菌的具体操作方法为：
1)扩增基因片段：选取拟南芥PXY基因，根据所述PXY基因设计引物对，利用所述引物对扩增所述PXY基因。
首先，选取拟南芥PXY基因，该基因的DNA序列在TAIR已公布，其中基因序列号为At5g61480。在本发明的研究过程中，发明人曾经考虑利用现有技术教导的His或者GST标签亲和层析法来纯化PXY膜蛋白，因此将去除信号肽(1-29aa)的PXY基因构建进pHUE或者pET41b载体，但是其对NTA琼脂糖中的镍离子或者亲GST琼脂糖没有亲和吸附作用，因此PXY膜蛋白无法利用亲和层析进行纯化。因此，本领域技术人员就不能利用现有的利用His或者GST标签亲和层析法来纯化膜蛋白的方法应用到PXY膜蛋白的纯化中。因此本发明人放弃现有的利用标签纯化膜蛋白的技术，开发出一种应用于PXY膜蛋白的有效的纯化方法：为构建pHUE-PXY，根据PXY基因设计引物对，利用常规的PCR反应进行目的基因扩增。
根据本发明的一个优选实施例，本发明人根据PXY基因设计出一对引物，所述引物对包括上游引物F'5'-CTCCGCGGTGGACTCAAGTTTTCACCTCAACTC-3'和下游引物R'5'-GGGGTACCTCACACCCCAATCCTTTGAC-3'。根据常规的PCR反应利用本发明开发出的引物对进行目的基因扩增，其中PCR反应体系为50μl，其中包含2μl的PXY基因cDNA模板、1μl的上游引物、1μl的下游引物、25μl的DNA聚合酶(优选型号为PrimeSTAR)，21μl的去离子水(ddH20)。该PCR反应扩增的条件为：在98℃下预变性4min，在98℃下变性10s，在50℃～60℃下退火15s，在72℃下延伸30s，共30个循环，然后在72℃下延伸10min，接着在4℃下保温。如图2所示，是根据本发明的一个实施例利用本发明开发的引物扩增拟南芥PXY基因得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M列为marker，即DNA分子量标准，可以明显看到利用本发明开发的引物采用上述PCR反应体系对拟南芥PXY基因片段的扩增效果很好。
2)构建重组质粒：选用质粒pHUE作为转化载体，酶切所述质粒pHUE和所述已扩增的PXY基因，再利用连接酶将所述酶切后的质粒pHUE和所述酶切后的PXY基因片段连接，得到重组质粒。
具体地，选用质粒pHUE作为转化的载体，可以在上述设计的引物对中引入酶切位点，如在上述上游引物中引入的酶切位点为SacII，下游引物引入的酶切位点为KpnI。先用内切酶SacII和KpnI同时酶切上述扩增好的PXY基因，并用同样的内切酶SacII和KpnI同时酶切上述质粒pHUE，如图3所示，根据本发明的一个实施例对扩增后的PXY基因片段和质粒pHUE进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M列为marker，即DNA分子量标准，可以明显看出对扩增后的PXY基因片段和质粒pHUE进行酶切效果良好。再用连接酶将同样双酶切过的PXY基因片段和质粒pHUE进行连接，例如连接酶可为T7连接酶，从而获得重组质粒pHUE-PXY。如图4所示，是根据本发明的一个实施例构建的重组质粒pHUE-PXY的示意图。
3)构建表达PXY的重组菌：将所述重组质粒转化入感受态大肠杆菌，得到表达PXY的重组菌。
具体地，将上述重组质粒pHUE-PXY转化入感受态大肠杆菌，其中所述将重组质粒pHUE-PXY转化入感受态大肠杆菌的方法对本领域技术人员是熟知的，该感受态大肠杆菌可为BL21(DE3)，得到表达重组PXY的重组菌BL21(DE3)/pHUE-PXY。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S1中所述诱导表达PXY之前还包括：
筛选表达PXY的重组菌阳性菌落：将所述表达PXY的重组菌接种在氨苄青霉素LB培养基上，筛选获得表达PXY的重组菌阳性菌落。根据该实施例，可将上述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pHUE-PXY接种在氨苄青霉素(AMP)LB培养基上，由于质粒pHUE与氨苄青霉素存在细菌抗性，经筛选可获得表达PXY的重组菌阳性菌落。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S1中所述诱导表达PXY的操作方法为：
1)将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中过夜培养，获得第一培养物。例如根据该实施例，所述第一LB培养基中包含浓度为100μg/ml的硫酸卡那霉素；所述过夜培养可在200-240rpm的搅拌条件下、37±1℃的温度条件下过夜培养；其中将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中的接种量可按照在40-60ml的所述第一LB培养基中接入一个菌落量的表达PXY的重组菌，例如可以通过使用牙签等工具将筛选出的一个表达PXY的重组菌菌斑全部接入40-60ml的第一LB培养基中，本领域技术人员还可以构思出其他的接入方式将菌斑接入培养基中，这些都在本发明的保护范围之内。
2)将所述第一培养物接种至第二LB培养基中继续培养，得到第二培养物。例如根据该实施例，所述第二LB培养基中包含浓度为100μg/ml的硫酸卡那霉素；其中将所述第一培养物接种至第二LB培养基中的接种量的为所述第一培养物与所述第二LB培养基的体积比为8％-12％，所述继续培养的温度为37±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下继续培养2-3小时；进一步优选地，所述继续培养时间为至所述第二培养物的OD600为0.6。
3)向所述第二培养物中加入诱导剂诱导表达PXY，并再次培养。例如根据该实施例，所述诱导剂为IPTG诱导剂，所述诱导剂的浓度为0.45mM-0.55mM，所述再次培养的温度为28±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下再次培养5-7小时；进一步根据该实施例，所述诱导剂的浓度为0.5mM。
本发明人还取含空质粒(未引入PXY基因的pHUE质粒)的大肠杆菌BL21(DE3)/pHUE作为空白对照组，用上述重组菌BL21(DE3)/pHUE-PXY的诱导表达方法进行诱导表达。分别取1ml的PXY重组菌菌液和空白对照组菌液，先离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，12.6％甘油)重悬，再超声破碎菌体得到上清液和沉淀物，该上清液为可溶性蛋白，该沉淀物为包涵体。将该上清液和包涵体悬液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测扫描，对目的蛋白PXY进行可溶性分析。分析结果如图5所示，其中M列为标准蛋白(marker)的分子量，-1WC列为含空质粒菌全蛋白检测结果，+1WC列为重组菌全蛋白检测结果，-1S列为含空质粒菌可溶性蛋白的检测结果，+1S列为重组菌可溶性蛋白检测结果，-1P列为含空质粒菌包涵体的检测结果，+1P列为重组菌包涵体的检测结果。结果显示构建于BL21(DE3)/pHUE-PXY原核表达载体中的PXY基因，在宿主菌BL21(DE3)中经诱导表达后，目的蛋白PXY主要以包涵体形式存在。经凝胶扫描后，通过Quantity One半定量分析，得知包涵体的含量占总蛋白的80％以上。
根据图5所示结果，由于大部分的目的蛋白以包涵体的形式存在于重组菌中，因此需要将步骤S1中经诱导表达后的重组菌破碎。根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S2中所述破碎采用超声破碎的方法，其中所述超声破碎的方法具体为：
将所述步骤S1中经诱导表达PXY后的重组菌液体离心分离得到第二沉淀物；根据该实施例，其中所述离心转速为6000rpm-10000rpm，离心时间为5-15min；
向所述第二沉淀物中加入细胞裂解液，在室温下重悬，得到重悬液；根据该实施例，其中所述加入的细胞裂解液的量为使所述第二沉淀物与所述加入的细胞裂解液的体积比为1：(3-5)，例如：1:3、1:4、1:5等；和
超声处理所述重悬液；根据该实施例，所述超声在冰上进行，频率为600atp-1000atp，超声次数为25-35次，每次超声时间和间隔时间分别为10s和30s。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S2中所述分离得到含有包涵体的第一沉淀物的具体操作方法为：
将破碎后的诱导表达PXY后的重组菌离心分离得到所述第三沉淀物；根据该实施例，所述离心在4℃条件下进行，所述离心转速为450g-550g，离心时间为5min-15min；进一步根据该实施例所述离心转速为490g，离心时间为10min；和
将所述第三沉淀物继续离心得到第一沉淀物；根据该实施例，所述继续离心在4℃条件下进行，所述继续离心转速为10000g-14000g，继续离心时间为5min-15min。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S3中所述包涵体洗涤液包括第一包涵体洗涤液、第二包涵体洗涤液、第三包涵体洗涤液和第四包涵体洗涤液；其中所述第一包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10μg/ml DNaseI，pH 8.0；所述第二包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，0.2mg/ml Lysozyme，pH 8.0；所述第三包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，2mg/ml脱氧胆酸钠，pH8.0；和所述第四包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，pH 8.0。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S3中所述用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体的具体操作方法为：
将所述第一沉淀物用所述第一包涵体洗涤液重悬，37±1℃孵育25min-35min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第四沉淀物；
将所述第四沉淀物用所述第二包涵体洗涤液重悬，室温孵育13-17min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第五沉淀物；
将所述第五沉淀物用所述第三包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第六沉淀物；
将所述第六沉淀物用所述第四包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第七沉淀物；和
将所述第七沉淀物用去离子水重悬后以10000g-14000g的转速离心8min-12min，得到所述第一含PXY的包涵体。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S4中所述第一包涵体溶解液包含20mMTris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S4中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育，例如所述震荡可以选用四维旋转混合仪进行震荡操作，本领域技术人员还可以选用其他的震荡方式，这些都在本发明的保护范围之内。根据该实施例，所述震荡的频率为16-20rpm。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S4中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S5中所述第二包涵体溶解液包含20mMTris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
根据本发明的一个优选实施例，上述步骤S5中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育，例如所述震荡可以选用四维旋转混合仪进行震荡操作，本领域技术人员还可以选用其他的震荡方式，这些都在本发明的保护范围之内。根据该实施例，所述震荡的频率为16-20rpm。
根据本发明的一个方面，上述步骤S5中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min。如图6所示，是根据本发明的一个实施例的两次用包涵体溶解液孵育分离后得到的上清液中PXY膜蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果，其中M列为标准蛋白(marker)的分子量，溶解前为第一含有PXY的包涵体的检测结果，第一次溶解为用第一次包涵体溶解液将第一含有PXY的包涵体孵育分离后得到的上清液的检测结果，第二次溶解为用第二次包涵体溶解液将第二含有PXY的包涵体孵育分离后得到的上清液的检测结果。由图6可知，第一次溶解得到的上清中含有PXY，但纯度不高；第二次溶解得到的上清是纯度更好的可溶性PXY膜蛋白。本发明人还发现，若将第二次溶解得到的沉淀物再次经过第三次包涵体溶解液溶解后分离得到的上清液中可溶性PXY膜蛋白的含量急剧下降。经凝胶扫描后，通过Quantity One半定量分析，得知第二含有PXY的包涵体的含量占总蛋白的60％以上，当把对应于PXY的条带(图6中箭头标示的第二次溶解的条带)切割并进行LC-MS/MS分析后，证实从包涵体里纯化出来的主要蛋白就是PXY，并且通过本发明提供的纯化方法获得的PXY膜蛋白具有较高的活性，可用于后续多项应用和研究。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> LRR受体激酶-PXY的纯化方法
<141> 2018-05-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
ctccgcggtg gactcaagtt ttcacctcaa ctc 33
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
ggggtacctc acaccccaat cctttgac 28

Claims (10)

1.一种LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，包括：
S1：获得表达PXY的重组菌，诱导表达PXY；
S2：破碎经诱导表达PXY后的重组菌，分离得到含有包涵体的第一沉淀物；
S3：用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体；
S4：将所述第一含有PXY的包涵体用第一包涵体溶解液进行孵育，分离得到第二含有PXY的包涵体；和
S5：将所述第二含有PXY的包涵体用第二包涵体溶解液进行孵育，分离得到PXY膜蛋白；
所述步骤S4中所述第一包涵体溶解液包含20mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷；和/或
所述步骤S4中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育；和/或
所述步骤S4中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min；和/或
所述步骤S5中所述第二包涵体溶解液包含20mM Tris-HCl,pH 7.5，20mM K2HPO4，100mM NaCl，12.6％甘油，5mMβ-巯基乙醇，1.5％十二烷基-β-D-麦芽糖苷；和/或
所述步骤S5中所述孵育为在4℃条件下过夜震荡孵育；和/或
所述步骤S5中所述离心的转速为10000g-14000g，离心的时间为5min-15min。
2.根据权利要求1所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S4和S5中的振荡频率为16-20rpm。
3.根据权利要求1所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中所述获得表达PXY的重组菌的具体操作方法为：
扩增基因片段：选取拟南芥PXY基因，根据所述PXY基因设计引物对，利用所述引物对扩增所述PXY基因；
构建重组质粒：选用质粒pHUE作为转化载体，酶切所述质粒pHUE和所述已扩增的PXY基因，再利用连接酶将所述酶切后的质粒pHUE和所述酶切后的PXY基因片段连接，得到重组质粒；和
构建表达PXY的重组菌：将所述重组质粒转化入感受态大肠杆菌，得到表达PXY的重组菌。
4.根据权利要求3所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤扩增基因片段步骤中，所述引物对包括上游引物F'5'-CTCCGCGGTGGACTCAAGTTTTCACCTCAACTC-3'和下游引物R'5'-GGGGTACCTCACACCCCAATCCTTTGAC-3'；所述上游引物引入酶切位点SacII，所述下游引物引入酶切位点KpnI；和/或
所述扩增基因片段步骤中采用的PCR反应体系为50μl，其中包含2μl的PXY基因cDNA模板、1μl的所述上游引物、1μl的所述下游引物、25μl的DNA聚合酶，21μl的去离子水；其中所述PCR反应采用的扩增条件为：在98℃下预变性4min，在98℃下变性10s，在50℃～60℃下退火15s，在72℃下延伸30s，共30个循环，然后在72℃下延伸10min，然后在4℃下保温；和/或
所述构建重组质粒步骤中，所述酶切采用内切酶SacII和内切酶KpnI分别同时酶切所述已扩增的PXY基因和所述质粒pHUE；和/或
所述构建重组质粒步骤中，所述连接酶为T7连接酶；和/或
所述构建表达PXY的重组菌步骤中，所述感受态大肠杆菌为BL21(DE3)。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中所述诱导表达PXY之前还包括：
筛选表达PXY的重组菌阳性菌落：将所述表达PXY的重组菌接种在氨苄青霉素LB培养基上，筛选获得表达PXY的重组菌阳性菌落。
6.根据权利要求5所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中所述诱导表达PXY的操作方法为：
将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中过夜培养，获得第一培养物；
将所述第一培养物接种至第二LB培养基中继续培养，得到第二培养物；和
向所述第二培养物中加入诱导剂诱导表达PXY，并再次培养。
7.根据权利要求6中所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述第一LB培养基和所述第二LB培养基中均包含浓度为100μg/ml的硫酸卡那霉素；和/或
所述过夜培养的温度为37±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下过夜培养；和/或
所述将所述表达PXY的重组菌接入第一LB培养基中的接种量按照在40-60ml的所述第一LB培养基中接入一个菌落量的表达PXY的重组菌；和/或
所述将所述第一培养物接种至第二LB培养基中的接种量的为所述第一培养物与所述第二LB培养基的体积比为8％-12％，所述继续培养的温度为37±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下继续培养2-3小时；所述继续培养时间为至所述第二培养物的OD600为0.6；和/或
所述诱导剂为IPTG诱导剂，所述诱导剂的浓度为0.45mM-0.55mM，所述再次培养的温度为28±1℃，在转速为200-240rpm的搅拌条件下再次培养5-7小时；所述诱导剂的浓度为0.5mM。
8.根据权利要求1所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中所述破碎采用超声破碎的方法，其中所述超声破碎的方法具体为：
将所述步骤S1中经诱导表达PXY后的重组菌液体离心分离得到第二沉淀物；其中所述离心转速为6000rpm-10000rpm，离心时间为5-15min；
向所述第二沉淀物中加入细胞裂解液，在室温下重悬，得到重悬液；其中所述加入的细胞裂解液的量为使所述第二沉淀物与所述加入的细胞裂解液的体积比为1：(3-5)；和
超声处理所述重悬液；所述超声在冰上进行，频率为600atp-1000atp，超声次数为25-35次，每次超声时间和间隔时间分别为10s和30s；
和/或，
所述步骤S2中所述分离得到含有包涵体的第一沉淀物的具体操作方法为：
将破碎后的诱导表达PXY后的重组菌离心分离得到第三沉淀物；所述离心在4℃条件下进行，所述离心转速为450g-550g，离心时间为5min-15min；和
将所述第三沉淀物继续离心得到第一沉淀物；所述继续离心在4℃条件下进行，所述继续离心转速为10000g-14000g，继续离心时间为5min-15min。
9.根据权利要求8所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，步骤S2中将破碎后的诱导表达PXY后的重组菌离心分离得到第三沉淀物，所述离心转速为490g，离心时间为10min。
10.根据权利要求1所述的LRR受体激酶-PXY的纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中所述包涵体洗涤液包括第一包涵体洗涤液、第二包涵体洗涤液、第三包涵体洗涤液和第四包涵体洗涤液；其中所述第一包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10μg/ml DNaseI，pH 8.0；所述第二包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，0.2mg/ml Lysozyme，pH 8.0；所述第三包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA，2mg/ml脱氧胆酸钠，pH 8.0；和所述第四包涵体洗涤液包含50mM Tris-HCl，100mMNaCl，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，pH 8.0；和/或
所述步骤S3中所述用包涵体洗涤液重悬所述第一沉淀物并离心，得到第一含有PXY的包涵体的具体操作方法为：
将所述第一沉淀物用所述第一包涵体洗涤液重悬，37±1℃孵育25min-35min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第四沉淀物；
将所述第四沉淀物用所述第二包涵体洗涤液重悬，室温孵育13-17min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第五沉淀物；
将所述第五沉淀物用所述第三包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第六沉淀物；
将所述第六沉淀物用所述第四包涵体洗涤液重悬，室温孵育8min-12min，再以10000g-14000g的转速离心5min-15min，得到第七沉淀物；和
将所述第七沉淀物用去离子水重悬后以10000g-14000g的转速离心8min-12min，得到所述第一含PXY的包涵体。
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