MX2008011706A - Plegamiento de proteina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para plegar un factor de crecimiento transformante beta, o un análogo funcional del mismo, en una forma dimérica biológicamente activa; el método incluye el agregado de un factor de crecimiento monomérico no plegado solubilizado a una solución que contiene ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico (CHES) o un análogo funcional del mismo y un sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular; la solución luego se incuba en condiciones adecuadas para generar el factor de crecimiento transformante beta dimérico biológicamente activo.

Description

PLEGAMIENTO DE PROTEINA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un método para plegado o replegado de proteínas en una forma activa. La invención se refiere en particular al plegado de miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta. La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-Beta) de los factores de crecimiento está involucrada en la regulación de muchos procesos celulares que incluye proliferación, migración, apoptosis, adhesión, diferenciación, inflamación, ¡nmunosupresión y expresión de proteínas extracelulares. La superfamilia TGF-Beta incluye: TGF-Beta 1 , TGF-Beta 2, TGF-Beta 3, TGF-Beta 4, TGF-Beta 5, proteínas morfogenéticas de hueso (BMP 1-16), factores de crecimiento y diferenciación (GDF 1-16) y activinas/inhibinas. Existen tres isoformas de mamíferos de TGF-Beta, denominadas TGF-Beta 1 , 2 y 3. Las TGF-Beta son producidas prácticamente por todos los tipos celulares (por ej., células de tejido epitelial, endotelial, hematopoyético, neuronal, y conectivo). Las TGF-Beta se secretan como moléculas precursoras inactivas latentes de 100 kDa (LTGF-Beta). Las moléculas de LTGF-Beta consisten en: (a) un péptido señal dimérico C-terminal de 25 kDa (fragmento activo) y (b) el péptido asociado latente (LAP). LTGF-Beta se activa por la escisión de LAP del fragmento activo por medio de las endopeptidasas tales como furina, plasmina, trombina y la acidificación del especio pericelular. El fragmento dimérico activo de TGF-Beta liberado se estabiliza por interacciones hidrofóbicas y por un puente disulfuro entre las subunidades. Además cada monómero comprende varias cadenas beta extendidas entrelazadas por tres o cuatro enlaces i ntra-d ¡sulfuro y forma una estructura apretada conocida como "nudo de cisteína". Se han propuesto las proteínas de la familia TGF-Beta para numerosos propósitos médicos. Estos incluyen la reducción de la formación de cicatrices, promoción de la cura de heridas y la estimulación del reemplazo de tejido dañado o enfermo en una variedad de sitios. Estos sitios incluyen la piel, hueso, cartílago, tejido neural, tejido conectivo (por ej., tendones y ligamentos), tejido ocular, hígado y vasos sanguíneos, etc. Se ha demostrado que TGF-Beta 1 y TGF-Beta 2 aceleran la curación de heridas en modelos animales experimentales, mientras que su inhibición reduce la posterior formación de cicatrices. TGF-Beta 3 tamb y humanos y, en 2006, representa uno de los miembros de la superfamilia que está más próximo a obtener la aprobación regulatoria para uso como medicamento. Se apreciará que dichos usos clínicos de los miembros de la superfamilia TGF-Beta requiere disponer de métodos eficientes para producir cantidades significativas de los factores de crecimiento. Los miembros de la superfamilia TGF-Beta se han aislado o producido por medios recombinantes durante muchos años. A modo de ejemplo, TGF-Beta 3 se purificó originalmente a partir de plaquetas humanas, placenta humana y riñon bovino durante los 1980. En vista del potencial terapéutico de TGF-Beta 3, se han realizado numerosos intentos de producir esta proteína por métodos recombinantes. Debido a la complejidad de las moléculas de TGF-Beta nativas biológicamente activas (proteína homodimérica con 8 enlaces disulfuro intracatenarios y un enlace disulfuro entre cadenas), ellas se expresaron originalmente en organismos eucarióticos (por ej., ver EPO200341 B1 ). Sin embargo, la expresión eucariótica originó niveles de expresión relativamente bajos y también se asoció con altos costos de procesamiento. En consecuencia, se investigaron los huéspedes procarióticos. Sin embargo, se halló que los huéspedes microbianos eran incapaces de formar correctamente los múltiples enlaces disulfuro necesarios para que los factores de crecimiento se plieguen en una forma activa. La proteína mal plegada que se forma como cuerpos de inclusión dentro de la célula huésped y estos cuerpos requirieron la solubilización seguida por la renaturalización permite que la proteína se repliegue en su conformación nativa biológicamente activa. Se han realizado numerosos intentos para superar los problemas asociados con la formación de los factores de crecimiento activos a partir de huéspedes procarióticos. Por ejemplo, US 5.922.846, US 5.650.494 y EP-B-0433 225 proponen métodos para la renaturalización de las proteínas de la familia TGF-Beta provenientes de los cuerpos de inclusión. Si embargo, ninguno de estos métodos proporciona métodos rápidos y eficientes para la producción factores de crecimiento de calidad clínica. Por ejemplo los inventores han hallado que muchos de los métodos de replegamiento del arte previo contemplados en las patentes mencionadas anteriormente son ineficaces. Además, los inventores han hallado que aun las condiciones de replegamiento del arte previo más preferidas (por ej., 0.05 M de Tris, 1 M de NDSB-201 , 20%(v/v) de DMSO, 2%(p/v) de CHAPS, 1 M de NaCI, 1 %(p/v) de GSH, 0.2 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.3 a 2-8 °C) pueden llevar aproximadamente 7 días para replegar los factores de crecimiento. Este tiempo de plegamiento representa un retraso inaceptable en la fabricación de cGMP y debería producir altos costos operativos no deseables cuando se requieren grandes cantidades de factor de crecimiento activo. En consecuencia es un objetivo de la presente invención superar los problemas asociados con los métodos de I arte previo para plegar o replegar los miembros la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para plegar un factor de crecimiento transformante beta, o análogo funcional de éste en una forma dimérica biológicamente activa que comprende agregar un factor de crecimiento monomérico no plegado solubilizado a una solución que contiene: (i) ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico o un análogo funcional de este; y (¡i) un sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular; e incubar el factor de crecimiento de la solución hasta que se forma un factor de crecimiento dimérico biológicamente. La presente invención se basa en experimentos realizados por los inventores que se llevaron a cabo en un intento de mejorar los métodos de plegamiento del arte previo. El factor de crecimiento transformante beta (TGF-Beta) puede ser cualquier TGF-Beta (por ej., TGF-ß? , TGF- 2 o TGF- 3). Sin embargo se prefiere que el TGF-Beta sea TGF-Beta3 (TGF- 3). Por "análogo funcional de este' se entienden las variantes de un TGF-beta que retiene la actividad biológica del factor de crecimiento de tipo salvaje. El análogo funcional con preferencia es una proteína y, en forma madura, puede comprender un dímero de polipéptidos monoméricos de aproximadamente 1 12 aminoácidos de longitud si bien se apreciará que los análogos funcionales pueden estar truncados o elongados cuando se comparan con los de tipo salvaje. El término también abarca las mutantes de TGF-beta tipo salvaje y en particular de TGFBeta 3 que retienen, o incluso han mejorado la actividad cuando se comparan con los de tipo salvaje. Los inventores han hallado que los métodos de la invención también son aplicables para el plegamiento o replegamiento de dichos mutantes. Se apreciará que "plegamiento", definido en la presente invención, abarca el "replegamiento" de proteínas plegadas previamente, y en efecto este replegamiento de proteínas constituye un subconjunto preferido del plegamiento más amplio abarcado por la invención. EP 0 433 225 contempla una amplia variedad de "condiciones de replegamiento" que se afirma que permiten que un monómero desnaturalizado se dimerice y supone una forma biológica activa. EP 0 433 225 describe que dichas condiciones deben incluir la presencia de un "agente solubilizante" y un sistema redox que permite la oxidación y reducción continua de los pares tiol/disulfuro. Además contempla una larga lista de dichos agentes solubilizantes que incluyen detergentes; solventes orgánicos miscibles en agua y fosfolípidos o una mezcla de dos o más de dichos agentes. Los ejemplos de los detergentes contemplados en la memoria descriptiva incluyen: compuestos tensoactivos, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), Tritón o Tween, detergentes moderados no iónicos (por ej., digitonina), detergentes moderados catiónicos (por ej. , N-[2,3-(Dioleiloxi)-propil]-N,N,N-tRimetilamonio), detergentes moderados aniónicos (por ej., colato de sodio, desoxicolato de sodio) y onas zwitteriónicas (por ej., sulfobetaínas (Zwittergent), 3-(3-clolamidopropil)-dimetilamonio-l-propan-sulfonato (Chaps), 3-(3-clolamidopropil)dimetilamonio-2-hidroxi-l-propan-sulfonato (Chapso). Los inventores decidieron examinar una variedad de detergentes, que incluyen los contemplados en EP 0 433 225, y se sorprendieron al hallar que la mayoría de los detergentes que ellos examinaron fueron ineficaces para el plegamiento o replegamiento de miembros de la superfamilia TGF-Beta mientras que los que actuaron, llevaron una cantidad de tiempo inaceptable para producir cantidad útil de factor de crecimiento activo. Los cuadros 1 y 2 del ejemplo ilustran que muchos de estos detergentes fueron ineficaces. Sin embargo los inventores se sorprendieron al hallar que el uso del ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico (CHES), y sus análogos, en combinación con un sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular, de acuerdo con el primer aspecto de la invención fue particularmente efectivo para producir correctamente el factor de crecimiento dimérico plegado. Los inventores han hallado que el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención representa una mejora significativa respecto de los métodos del arte previo. El método da como resultado una velocidad significativamente mejorada del proceso en comparación con los métodos previamente descriptos en la bibliografía. En realizaciones preferidas del método de la invención, el plegamiento del factor de crecimiento se puede completar dentro de 5 días; con preferencia dentro de 3 días; con más preferencia dentro de 2 días; y con máxima preferencia después de aproximadamente 24 horas de iniciar el proceso de plegamiento. Por el término "ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico o sus análogos' se entiende el detergente CHES y sus análogos químicos que retienen las propiedades de replegamiento del CHES. Los análogos adecuados de CHES que se pueden usar de acuerdo con los métodos de la invención se pueden definir por la siguiente fórmula: ¾ ?? X3 (I) en donde: R1 y R2 son ¡guales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo d-4 sustituidos o no sustituidos, grupos cicloalquilo C3-8 sustituidos o no sustituidos, o un núcleo aromático sustituido o no sustituido, o R1 y R2 juntos forman un sistema anular que tiene hasta 10 átomos; X1 y X2 se seleccionan de modo independiente de -O-, -S-, -S(0), -S(02)-, -NR3-, -CHR4- y CHR5 donde R3, R4, y R5 son iguales o diferentes y se seleccionan de modo independiente del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C- sustituidos o no sustituidos, grupos cicloalquilo C3-8 sustituidos o no sustituidos, o un núcleo aromático sustituido o no sustituidos, o un núcleo aromático sustituido o no sustituido o dos de R3, R4 y R5 pueden formar juntos un sistema anular que tiene hasta 6 átomos de carbono, sujeto a la condición de que al menos uno de X1 y X2 es -CHR4- o -CHR5-; y X3 se selecciona de C, S, S=0, o P-OH. Si uno o más de Ri-5 son grupos alquilo, de acuerdo con la cantidad de átomos de carbono que contienen, estos pueden ser grupos secundarios, terciarios o iso normales. Los ejemplos de grupos alquilo adecuados para Ri_5 son los grupos Me, Et, n-Pr, i-Pr, n-Bu, sec-Bu y E-Bu. Si uno o más de Ri-5 son cicloalifáticos, entonces ellos con preferencia son un grupo ciciohexilo sustituido o no sustituido, con máxima preferencia no sustituido. Si uno o más de R-i-5 son aromáticos entonces estos con preferencia son un grupo fenilo sustituido o no sustituido. Con preferencia R-\ es hidrógeno y R2 es ciciohexilo. En forma alternativa o adicional X1 y X2 con preferencia son -CH2-, en forma alternativa o adicional X3 es -S=0. Los ejemplos preferidos de los compuestos de fórmula (I) que se pueden emplear en la invención son: (la) decir, un compuesto de fórmula (I) en el que X1 y X2 son CH2- y X3 es S=0); (Ib) (es decir, un compuesto de fórmula (I) en el que Ri es hidrógeno, R2 es ciclohexilo y X3 es S=0); y (le) (es decir, un compuesto de fórmula (I) en el que Ri hidrógeno, R2 es ciclohexilo, y X1 y X2 son -CH2-). El ejemplo preferido de cada fórmula (la), (Ib) y (le) es CHES, decir, Los inventores han establecido que CHES, y el sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular, se puede usar solo para plegar el factor de crecimiento. Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención, los inventores han hallado que CHES también se puede combinar ventajosamente con otros agentes que tienen actividad detergente/plegamiento. Los ejemplos de dichos agentes incluyen: taurodesoxicolato, alcohol isopropílico, arginina-HCI, sulfobeatina-201 no detergente y sulfobeatina-2 1 no detergente.

Se prefiere que la solución comprenda una concentración de aproximadamente 10 mM a 2.0 M de CHES; con más preferencia 100 mM-1.0 M y con máxima preferencia aproximadamente 0.7 M de CHES. Las concentraciones mencionadas anteriormente de CHES también se pueden usar cuando se combina CHES con otros agentes. Por ejemplo una combinación preferida de los agentes que promueven el replegamiento es aproximadamente 30 mM de taurodesoxicolato y 0.7 M de CHES. Por el término "sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular" se entiende a los sistemas que permiten la formación de enlaces disulfuro en la solución. Los sistemas adecuados incluyen combinaciones de reactivos tales como glutatión en su forma oxidada y reducida, ditiotreitol en su forma oxidada y reducida, beta-mercaptoetanol o betamercaptometanol en su forma oxidada y reducida, cistina y su forma reducida, y cistamina y su forma reducida. Estos reactivos se pueden usar a una concentración de aproximadamente 1 µ? a 250 mM, especialmente de aproximadamente 100 µ? a 10 mM. La relación molar de dichos sistemas para las formas oxidadas y reducidas puede estar entre 100: 1 y 1 : 100, especialmente entre 6: 1 y 1 : 6. Se prefiere que el sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular comprenda el uso de glutatión en sus formas reducidas (GSH) y oxidada (GSSG). Con preferencia la solución contiene aproximadamente 20 µ?-200 mM de glutatión reducido; con más preferencia 200 µ?-20 mM de glutatión reducido; y con máxima preferencia aproximadamente 2 mM de glutatión reducido. La solución también puede contener aproximadamente 4 µ?-40 mM de glutatión oxidado; con más preferencia 40 µ?-4 mM de glutatión oxidado; y con máxima preferencia aproximadamente 400 µ? de glutatión oxidado. Conforme a ello, los sistemas redox su If h id rilo/d isu If u ro de bajo peso molecular preferidos pueden comprender 200 µ?-20 mM de glutatión reducido y 40 µ?-4 mM de glutatión oxidado. La relación exacta de GSH:GSSH dependerá de varios factores que incluyen: qué factor de crecimiento se está plegando; el pH de la solución y el análogo de CHES empleado en el método de la invención. A modo de ejemplo, los sistemas redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular preferidos para el plegamiento de TGF-Beta 3 comprenden aproximadamente 2 mM de glutatión reducido y aproximadamente 400 µ? o aproximadamente 2 mM de glutatión reducido. Como se explica con más detalle a continuación, en realizaciones preferidas de la invención el sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular se puede "envejecer" antes de usar para replegar el TGF-Beta. Los métodos preferidos para el plegamiento de los factores de crecimiento incluye el uso de CHES en combinación con GSH y GSSG como sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular. Los ejemplos de condiciones preferidas incluyen la exposición del factor de crecimiento no plegado a: (a) 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH y 0.4 mM de GSSG; (b) 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH y 0.4 mM de GSSG; o (c) 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH y 2 mM GSSG. Se apreciará que los agentes mencionados anteriormente se pueden disolver en agua para obtener una solución de acuerdo con la invención. Sin embargo, también se apreciará que los agentes se pueden disolver en una solución que comprende muchos otros compuestos. Por ejemplo, la solución también comprender sales. Las sales que se pueden usar en la solución incluyen sales de sodio, potasio y calcio con cloruro, sulfato, fosfato, acetato, etc. Se prefiere que la solución sea una solución de cloruro de sodio a una concentración de 0.5 a 2 M. La solución, por ejemplo, puede ser solución salina buferizada con fosfato. Durante estas investigaciones los inventores también establecieron que se podrían optimizar las condiciones de plegamiento por ajuste del pH y la temperatura a la que se estimula que proceda el plegamiento. La temperatura óptima depende de numerosos factores tales como los agentes usados, el pH y también la cantidad de factor de crecimiento para replegarse. En la mayor parte de las circunstancias se prefiere una temperatura inferior a aproximadamente 15°C (por ejemplo 2-8°C o aproximadamente 10°C). Sin embargo, en algunas condiciones también fueron efectivas temperaturas superiores (por ej. , temperatura ambiente). Los inventores descubrieron que generalmente fue preferible llevar a cabo el método de la invención a pH alcalino. El pH es con preferencia aproximadamente superior a pH 8.0 y con preferencia superior a un pH de aproximadamente pH 8.5. Un pH de máxima preferencia para la solución es un pH de aproximadamente 9.5. También se halló que la cantidad de factor de crecimiento no plegado agregado a la solución influencia la eficiencia del plegamiento. En general se pueden agregar aproximadamente 0.005-0.75 mg/ml de un factor de crecimiento a la solución; con preferencia 0.01 -0.5 mg/ml; con más preferencia aproximadamente 0.12-0.25mg/ml del factor de crecimiento; y con máxima preferencia aproximadamente 0.25 mg/ml (es decir, 250 pg/ml). Los métodos de la invención se pueden emplear para plegar cualquier monómero de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta en una forma dimérica biológicamente activa. Se prefiere que el método se use para plegar un TGF-Beta per se (por ejemplo, TGF-Beta 1 , TGF-Beta 2 o TGF-Beta 3). También se prefiere que el método se use para plegar precursores monoméricos (en un factor de crecimiento dimérico activo) que se han producido en huéspedes procarióticos que se han transformado para expresar el factor de crecimiento. Por ejemplo, el método es particularmente útil para el plegamiento de factores de crecimiento que se ubican dentro de los cuerpos de inclusión de las bacterias que han sido transformadas con un vector de expresión que codifica un factor de crecimiento recombinante. Es de máxima preferencia que los métodos de la invención se usen para plegar TGF-Beta 3 monomérico que se ubica en un cuerpo de inclusión de una bacteria transformada con un vector de expresión de TGF-Beta 3 (por ej., como se describen en el Ejemplo 1 o como es conocido en el arte). Es de máxima preferencia que el TGF-Beta 3 sea TGF-Beta 3 humano, TGF-Beta 3 humano recombinante o TGF-Beta 3 humano que contiene mutaciones que optimizan el factor de crecimiento para uso clínico en seres humanos. Los ejemplos de las condiciones de máxima preferencia empleadas para plegar TGF-Beta 3 incluyen: (a) 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C; (b) 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C; (c) 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C; o (d) 0.7 M de CHES, 1 M de NaCI, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.25 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C/temperatura ambiente. Los inventores desarrollaron los métodos de plegamiento de acuerdo con la invención en un laboratorio (como se describe en el Ejemplo 1 ) y luego se llevaron a metodología en escala como se describe en el Ejemplo 2. Se apreciará que los métodos en escala representan una característica importante de la invención. En consecuencia, de acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un método de producir un miembro activo de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta a partir de un huésped procariótico, el método comprende: (a) fermentación de organismos procarióticos que han sido transformados para expresar un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta; (b) aislamiento de los cuerpos de inclusión y recuperación de la proteína expresada a partir de los cuerpos de inclusión; (c) replegamiento del miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y (d) purificación del miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta replegado. Se prefiere que la etapa (a) incluya la fermentación de las bacterias que se han transformado con un vector de expresión que codifica un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta. El vector con preferencia codifica un TGF-Beta y con máxima preferencia codifica un TGF-Beta 3 humano, o un análogo funcional de este. Se apreciará que la bacteria transformada se puede generar usando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Un ejemplo de dicha bacteria se da en el Ejemplo 1 . Se prefiere que los organismos se fermenten de acuerdo con técnicas convencionales. Estas pueden incluir la fermentación de una pasta de células y la recolección de las células por la toma de muestras de la fermentación y centrifugación de la muestra para aislar los organismos. La etapa (b) del método del segundo aspecto de la invención puede incluir la lisis de los organismos recuperados por la centrifugación. Luego se pueden recuperar los cuerpos de inclusión (IB) por centrifugación adicional y etapas de lavado. Con preferencia los IB se procesan adicionalmente adoptando los pasos de solubilizar la proteína dentro de los IB y luego clarificarlos. La proteína (es decir, el factor de crecimiento no plegado) proveniente de los IB aislados luego se somete a los métodos de plegamiento del primer aspecto de la invención de acuerdo con la etapa (c) del método del segundo aspecto de la invención. El factor de crecimiento replegado luego se debería purificar de acuerdo con la etapa (d). La purificación puede incluir numerosos pasos depurificación bioquímica tales como ultrafiltración y cromatografía. Los procedimientos de purificación se ilustran en 1 .15, 1 .16 y 1 .17 del Ejemplo 1 . En una realización preferida, primero se filtra el factor de crecimiento; posteriormente se purifica por cromatografía de interacción hidrofóbica; y luego finalmente se purifica por cromatografía de intercambio catiónico.

Opcionalmente el método del segundo aspecto de la invención puede comprender adicionalmente un paso (e) en donde el factor de crecimiento se formula a una concentración deseada en una solución y se coloca en viales. Esta solución puede ser la formulación final para uso clínico o se puede formular almacenamiento y/o transporte. El factor de crecimiento luego se puede terminar para formar el producto clínico final en una fecha posterior. Los inventores han reconocido que W099/18196 describe el uso de CHES par el replegamiento de proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs). Si embargo las técnicas descriptas en W099/18196 no deberían ser consideradas por los expertos en el arte como útiles para el replegamiento de TGF-Beta, y TGF-Beta3 en particular, de acuerdo con los métodos del primer o segundo aspecto de la invención. Los expertos deben llegar a esta conclusión por numerosas razones. Estas incluyen: (a) W099/18196 describe métodos para la solubilización de los cuerpos de inclusión BMP, se debería usar desnaturalizantes tales como Guanidina-HCL o por acidificación con un ácido tal como ácido acético. Los inventores han hallado que la acidificación produjo bajas recuperaciones del TGF-Beta 3 de los cuerpos de inclusión. Ellos hallaron que cuando TGF-Beta 3 se solubilizó en ácido y luego el pH se tituló a 9.5 (el pH preferido para el replegamiento de acuerdo con la invención), este cambio del pH ácido al alcalino produjo una agregación irreversible de TGF-Beta 3 (debido al cruzamiento de TGF-Beta 3 en sus punto isoeléctrico (pH 6.4)). Esto produjo muy bajos rendimientos de TGF-Beta 3. También se examinó guanidina-HCL como agente de solubilización, si bien este dio muy buenas recuperaciones de TGF-Beta 3 de los cuerpos de inclusión fue un desnaturalizante demasiado potente e impidió el replegamiento de TGF-Beta 3. Por consiguiente, los inventores hallaron que los pasos de solubilización del arte previo no son adecuados. La experimentación estableció que la solubilización de los cuerpos de inclusión usando 6 M de urea y 0, 1 M de DTT dio buenas recuperaciones de TGF-Beta 3 y permitió que el TGF-Beta 3 se repliegue una vez que se diluyó en el buffer replegado. Por consiguiente, se prefiere que TGF-Beta 3 se solubilice a partir de los cuerpos de inclusión usando urea y DTT. (b) WO99/18196 también establece que los BMP se pueden clarificar usando cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) o cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC). Estos métodos no serían adecuados para la fabricación en escala comercial del TGF-Beta 3. En SEC, el volumen de muestra influye en la resolución de la muestra (a menor volumen de muestra, mejor resolución de la purificación). Los métodos de escala comercial de acuerdo con el segundo aspecto de la invención pueden producir aproximadamente 50 L de cuerpos de inclusión solubilizados. No sería práctico usar la SEC para dichos volúmenes ya que procesar este en una corrida única requeriría una columna (o columnas múltiples) con volumen de lecho simple/combinado de 724 L. En general se usa RP-HPLC como herramienta analítica debido al volumen de columna pequeño y nuevamente no sería poco práctico para la fabricación en escala comercial del TGF-Beta 3 por las mismas razones. Se prefiere que el método del segundo aspecto de la invención use filtración de flujo tangencial (TFF) que brinda purezas de TGF-P3 de 70% y superiores. (c) Se sabe que la pureza de la proteína expresada afecta los rendimientos del replegamiento. Por regla general a mayor pureza de la proteína expresada mayores rendimientos de replegamiento. Los inventores han hallado que las purezas de TGF- 3 de 70% (de proteína total) y superiores dieron altos rendimientos de replegamiento y que las purezas bajas de TGF-P3 (<50% de proteína total) dieron bajos rendimientos de replegamiento. Por consiguiente se prefiere que el TGF-P3 usado en los métodos de la invención sea mayor que 50% puro y con más preferencia aproximadamente 70% (o más) puro. Esta pureza se puede obtener incluyendo etapas de lavado de cuerpos de inclusión y clarificación del TGF-Beta 3 solubilizado usando TFF (por ej., ver Ejemplo 2). (d) TGF-Beta 3 experimenta cambios significativos en la conformación (estructura secundaria) y solubilidad a pH diferentes. Debido a que el pH de una solución que contiene TGF-Beta 3 se mueve de ácido (<pH 3.8) a alacalino (<pH 8.0), aparecen agregados con un máximo de agregación que ocurre entre pH 6.5 y pH 8.5. WO99/18196 establece que el pH preferido de replegamiento de los BMP es de aproximadamente 8.5. Sin embargo, sería inadecuado para el replegamiento de TGF-Beta 3 ya que podría causar que el TGF-Beta 3 se agregue y en consecuencia se reduce significativamente la eficiencia y rendimiento del replegamiento. Por consiguiente, se prefiere que los métodos de la invención utilicen un buffer de replegamiento a un pH mayor de 8.5, con preferencia mayor de pH 9.0 y con máxima preferencia un pH de aproximadamente 9.5. e) Los inventores también han hallado que las concentraciones óptimas del par Redox (por ej., glutatión reducido y oxidado) en el buffer de replegamiento puede ser diferente para BMP y TGF-Beta 3. Las concentraciones preferidas de glutatión reducido (GSH) y glutatión oxidado (GSSG) usadas en la fabricación de TGF-Beta 3 de acuerdo con la invención es 2 mM y 0.4 mM respectivamente. Además, los inventores han hallado que es más preferible, una vez que se ha disuelto el par redox en solución, que el buffer envejezca durante al menos 2 horas, con preferencia al menos 3-5 horas y con máxima preferencia durante aproximadamente 7 horas. Los inventores sin desear estar ligados a ninguna hipótesis con respecto a los beneficios del "envejecimiento" del par redox, han indicado que en soluciones acuosas el GSH se oxida fácilmente para producir GSSG y a pH fisiológicos la vida media de GSH es aproximadamente 4 horas. Además los inventores presumen que la vida media de GSH en el buffer de replegamiento de TGF-Beta preferido (pH 9.5) se reduciría significativamente (a pH alacalinos habría menos iones hidrógeno para protonar los grupos tiolato reactivos en GSH a tioles no reactivos producidos). Una estimación conservadora de la vida media de GSH a pH 9.5 sería de 3 horas. En consecuencia después de 7 horas de envejecimiento del buffer las concentraciones del par redox sería en consecuencia de aproximadamente 0.5 mM de GSH y 1 .15 mM de GSSG. Por consiguiente, estas concentraciones son las concentraciones preferidas para el replegamiento de TGF-Beta3. W099/18196 establece la concentración preferidas del par redox en 2 mM de GSH y 1 mM de GSSG (para el plegamiento de BMP). Esta concentración aumentada de GSH prolongaría significativamente el replegamiento de TGF-Beta 3, y puede reducir el rendimiento (ya que GSH rompe los enlaces disulfuro de las proteínas). Además W099/18196 establece el requerimiento de 5 mM de EDTA en el buffer de replegamiento. La presencia de agentes quelantes tales como EDTA en el buffer de replegamiento estabilizaría el GSH (es decir aumento de la vida media de GSH), lo que aumentaría adicionalmente el tiempo de replegamiento de TGF-Beta 3 y puede reducir el rendimiento. (f) W099/ 8196 establece la concentración de BMP preferida en el buffer de replegamiento en 1 -100 pg/ml, este es significativamente más bajo que las concentraciones que los inventores han hallado que son útiles para la fabricación de TGF-Beta 3 (en forma óptima 250 pg/ml). 250pg/ml de TGF-Beta 3 dieron eficiencias de replegamiento superiores que 100 pg/ml de TGF-Beta 3. En consecuencia, se prefiere que los métodos de la invención utilicen más de 100 pg/ml de TGF-Beta 3 en el paso de replegamiento y con preferencia aproximadamente 250 pg/ml de TGF-Beta 3. (g) WO99/18196 establece la temperatura preferida del replegamiento de los BMP en 20°C. Los inventores han observado que los replegamientos de TGF-Beta 3 realizados a temperatura ambiente (22°C) producen la agregación de TGF-Beta 3 y que el replegamiento de TGF-Beta 3 debería ocurrir a menos de 15°C (con preferencia 2-8°C o aproximadamente 10°C) para sostener la vía de plegamiento productivo de TGF-Beta 3 y la supresión de la interacción hidrofóbica. Un método más preferido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención se ilustra en la Figura 10A-10E. Los detalles de las condiciones y protocolos adecuados para usar en el método preferido ilustrado en la Figura 10A-10E se exponen en las Figuras 11 a 26. Será apreciado por los expertos en el arte, que si bien las condiciones y protocolos expuestos en estas Figura con preferencia se pueden usar en el método ilustrado en la Figura 10?-10?, ellas se pueden usar, excepto que el contexto lo requiera de otro modo, para efectuar cualquier método de plegamiento adecuado de acuerdo con la presente invención. La invención se ilustrará adicionalmente con los Ejemplos y con referencia a los siguientes dibujos, en los que: Figura 1 : es una fotografía de un gel de SDS-PAGE ilustrativo de muestras pos-inducción de los matraces de agitación referidos a 1.4 del Ejemplo 1 en donde la calle 1 & 6 son estándares Mark 12 (Invitrogen); y las calles 2-5 se cargan con 3 pL de clones 1-4 respectivamente (3 horas pos-inducción); Figura 2: es una fotografía de una transferencia Western ilustrativa donde la primera calle es un estándar de TGF-Beta 3 no reducido y las calles 2-12 corresponden a o condiciones experimentales 2-12 del cuadro 1 del Ejemplo 1 y demuestra que la condición 12 fue exitosa en producir correctamente TGF-Beta 3 dimérico plegado; Figura 3: es una fotografía de una transferencia Western ilustrativa que demuestra que el plegamiento de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico descripto en 1 .14 del Ejemplo 1 en donde las calles 1 -18 corresponden a las condiciones experimentales 1 -18 del cuadro 3 del Ejemplo 1 después de incubaciones de 7 días; Figura 4: es una fotografía de una transferencia Western ilustrativa que demuestra que el plegamiento de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico descriptos en 1 .14 del Ejemplo 1 en donde las calles 19-36 corresponden a condiciones experimentales 19-36 en el cuadro 4 del Ejemplo 1 después de incubaciones de 7 días; Figura 5: es una fotografía de una transferencia Western ilustrativa que demuestra que el plegamiento de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico para condiciones de replegamiento de máxima preferencia de acuerdo con la invención descriptas en 1 .14 del Ejemplo 1 en donde la calle 1 representa el replegamiento del día 0; calle 2 representa replegamiento después de 1 día; calle 3 representa replegamiento después de 2 días; calle 4 representa replegamiento después de 3 días y calle 5 es un estándar de TGF-Beta 3 no reducida; Figura 6: es una fotografía de una transferencia Western ilustrativa que demuestra que el plegamiento de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico que utilizan técnicas de replegamiento del arte previo descriptos en 1 .14 de Ejemplo 1 en donde calle 1 representa replegamiento después de 1 día; calle 2 representa replegamiento después de 2 días; calle 3 representa replegamiento después de 3 días; calle 4 representa replegamiento después de 4 días y calle 5 representa replegamiento después de 7 días de tratamiento; Figura 7A-7C: representa cromatogramas que ilustran la cantidad de TGF-Beta 3 dimérico producido por una condición de replegamiento de máxima preferencia de acuerdo con la invención descripta en 1 .14 del Ejemplo 1 después de la puRi ficación por HPLC de intercambio catiónico de muestras de TGF-Beta 3 replegadas (figura 7A) en día 0, (figura 7B) después de 1 día y (figura 7C) después de 2 días. Figura 8: representa un cromatograma que ilustra la cantidad de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico producido por la condición de replegamiento de máxima preferencia de acuerdo con la invención descripto en 1 .15 del Ejemplo 1 después de la purificación por ultrafiltración y cromatografía de interacción hidrofóbica en una columna de butil-Sefarosa; Figura 9: representa un cromatograma que ilustra la cantidad de TGF-Beta 3 dimérico producido por una condición de replegamiento de máxima preferencia de acuerdo con la invención descripto en 1 .16 del Ejemplo 1 después de lar purificación por cromatografía de intercambio catiónico en una columna de SP-Sefarosa; Figura 10A-10E: es un diagrama de flujo esquemático que ilustra un método preferido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención en que: (figura 10A) representa la etapa de fermentación y recuperación de cuerpo de inclusión (IB); (figura 10B) representa la etapa de solubilización de IB y clarificación; (figura 10C) representa una etapa de replegamiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención; (figura 10D) representa una etapa de purificación; y (figura 10E) representa una etapa de formulación y presentación del producto del fármaco. Figura 1 1 : ilustra condiciones preferidas y protocolos para fermentación adecuados para usar en los métodos de la invención tales como las que se exponen en la Figura 10(A) (i); Figura 12: ilustra condiciones preferidas y protocolos para la recolección y centrifugación adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los expuestos en la Figura 10(A) (ii); Figura 13: ilustra condiciones preferidas y protocolos para lisis celular y recuperación de IB adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los expuestos en la Figura 10(A) (iii); Figura 14: ilustra condiciones preferidas y protocolos para la solubilización de los cuerpos de inclusión adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los expuestos en la Figura 10(B) (i); Figura 15A y figura 15B: ilustran condiciones preferidas y protocolos para: (figura 15A) preparación de la membrana de clarificación (Figura 10(B) (ii)); y (figura 15B) preparación de la membrana de pre-replegamiento UF/DF (Figura 10(B) (iii)) adecuados para usar en los métodos de la invención; Figura 16A y figura 16B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 16A y figura 16B) para la clarificación de cuerpos de inclusión adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los expuestos en la Figura 10(B) (ii); Figura 17A y figura 17B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 17A y figura 17B) para pre-replegamiento UF/DF adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los expuestos en la Figura 10 B (iii); Figura 18A y figura 18B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 18A y figura 18B) para el replegamiento de proteínas adecuados para usar en los métodos de la invención tales como en la Figura 10 (C)(i); Figura 19: ilustra condiciones preferidas y protocolos para preparación de la membrana de pos-replegamiento adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (i); Figura 20A y 20B: ¡lustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 20A y figura 20B) para la ultrafiltración de pos-replegamiento y preparación de carga de butilo adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (i); Figura 21 A y figura 21 B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 21 A y figura 21 B) para empacamiento de la resina de flujo rápido 4 de butilsefarosa adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (ii); Figura 22A y figura 22B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 22A y figura 22B) para usar la resina de flujo rápido 4 de butil sefarosa de una manera adecuada para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (ii); Figura 23A y figura 23B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 23A y figura 23B) para la limpieza y regeneración de la resina de flujo rápido 4 de butil sefarosa después de usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (ii), Figura 24: ilustra condiciones preferidas y protocolos para la limpieza de la resina de flujo rápido de sefarosa SP antes de usar los métodos de la invención como los que se exponen en la Figura 10 (D) (¡ii); Figura 25: ilustra condiciones preferidas y protocolos para empacamiento de la resina de flujo rápido de sefarosa SP adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (¡ii); Figura 26A y figura 26B: ilustran dos condiciones preferidas y protocolos (figura 26A y figura 26B) para usar la resina de flujo rápido de sefarosa SP de una manera adecuada para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (D) (iii); Figura 27A y figura 27B: ilustra condiciones preferidas y protocolos para la limpieza de la resina de flujo rápido de sefarosa SP: (figura 27A) después del uso; y (figura 27B) pre-uso/regeneración como se expone en la Figura 10 (D) (iii); Figura 28A y 28B: ilustra dos condiciones preferidas y protocolos (figura 28A y figura 28B) para la preparación de membrana final UF/DF adecuada para usar en los métodos de la invención que se exponen en la Figura 10 (E) (i); y Figura 29A y figura 29B: ilustra dos condiciones preferidas y protocolos (figura 29A y figura 29B) para UF/DF de la solución de TGF-P3 purificada por elución en Sefarosa SP, y llenado final, que son adecuados para usar en los métodos de la invención tales como los que se exponen en la Figura 10 (E) (i).

EJEMPLO 1 Los inventores investigaron si se podrían establecer o no métodos mejorados de re-plegamiento de miembros de la superfamilia de TGF-Beta. El siguiente ejemplo es ilustrativo de la aplicación de los métodos de la invención al re-plegamiento de TGF-Beta 3. Primero, se estableció un estudio para una primera prueba de reactivos de replegamiento (ver 1.13). Se halló que los reactivos que ayudaban al re-plegamiento en la prueba primaria que luego se llevó adelante como se describió en la presente, para optimización adicional para maximizar el rendimiento y reducir el cronograma de replegamiento (ver 1.14).

Finalmente se investigaron los métodos de purificar el factor de crecimiento replegado (1 .5-1 .7).

Los métodos empleados para examinar la actividad biológica de TGF-Beta 3 se describen en 1 .18.

Estos estudios llevaron a los inventores a darse cuenta que los métodos mejorados de plegamiento de los miembros de la superfamilia de TGF-Beta en una forma activa se pueden establecer por el siguiente método definido por el primer aspecto de la invención.

Experimental 1 .1 Secuencia de nucleótidos La secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento activo de TGF-Beta 3 es el siguiente: GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC (SEQ ID NO. 1 ) 1 .1 Generación de ADNc El ARN total de un herida incisional humana (tomado el día 5 pos-herida) se trató con ADN libre (Ambion) para eliminar cualquier ADN contaminante. Usando ARN total como templado, se generó ADNc de TGF-Beta3 por la reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR). Se preparó la mezcla maestra de RT-PCR a partir del kit de QRT-PCR Core Reagent 1 -paso Brilliant® (Stratagene). Se agregó un microgramo de ARN a 50 µ? de una solución que contiene: buffer QRT-PCR de 1 paso, 0.2 mM de dNTP, 3.5 mM de MgCI2, 1 µ?_ de transcriptasa reversas StrataScript, 2.5 unidades de Taq Polymerase, 0.4 µ? de cebador de sentido (5' GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3') (SEQ ID NO. 2), 0.4 µ? de cebador de sentido (5 -CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGA C 3') (SEQ ID NO. 3). La reacción se colocó en un ciclador térmico (Hybaid PCR Express) y se corrió en las siguientes condiciones: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, luego 40 ciclos de 95°C durante 30 seg, 65°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. La etapa final fue de 72°C durante 10 min. Las muestras de PCR se corrieron en gel de agarosa 2% (p/p) para verificar el tamaño de banda y se purificó usando el kit Wizard PCR Prep (Promega). 1 .2 Clonación del vector y transformación en célula huésped. El vector pET-24d se deriva del vector pBR322 y contiene un promotor T7 bajo control de LacUV5 control y un gen marcador resistente a kanamicina. Los fragmentos de ADNc de TGF-Beta 3 (generados en la Sección 1 .1 ) se digirieron con 0.75 µ? de Nco1 (New England Biolabs) y 0.75 µ? de BamH 1 (New England Biolabs) con buffer BamH1 1X (New England Biolabs) en una reacción de 15 pL (agua libre de nucleasa, Novagen) a 37°C durante 4 horas. Se digirió un microlitro de plásmido pET-24d (Novagen) de la misma manera. El ADNc digerido y el fragmento del plásmido mayor se purificaron en gel de agarosa y se recuperaron usando el kit de extracción de ADN en gel SpinPrep (Novagen). El ADNc y los fragmentos de plásmido purificados se ligaron usando un kit de T4 ligasa (Novagen). El ADNc/plásmido ligado se transformó en HMS174 (DE3) (kit de transformación Novagen HMS174 (DE3)). Se seleccionaron los transformantes por sembrado en placas de agar con caldo Luria (LB) que contienen 50 pg/ml de kanamicina (Invitrogen). Se seleccionaron tres clones para la digestión por restricción y/o expresión. 1 .3 Selección del clon para la expresión del producto Los clones se cultivaron en cultivos en matraces de agitación de "caldo Terrific" de concentración media (6 g/L de peptona de fitona (Becton Dickinson), 12 g/L de extracto de levadura (Becton Dickinson), 2 g/L de glicerol (IT Baker), 1 .16 g/L de fosfato de potasio monobásico (JT Baker), 6.25 g/L de fosfato de potasio dibásico (IT Baker), con es a 1 litro de agua destilada) y se induce una fase exponencial a una ??ß?? entre 0.65 y 0.85 con 1 mM de beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG). Se tomaron las muestras pos-inducción 3 horas después de la adición de IPTG y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para la inducción y expresión del producto. Se corrieron alícuotas de muestra de los clones 1 -4 pre/pos-inducción y estándares de peso molecular Mark 12 (Invitrogen- rango de peso molecular 2.5-200 kDa) en un gen NuPAGE® Novex 12% de Bis-Tis, 1.0 mm (Invitrogen) durante aproximadamente 40-50 minutos a 120 miliAmp y 200 voltios y luego se tiñeron con azul de Coomassie. Una proteína con un tamaño entre 6 y 14.4 kDa (es decir, monómero de TGF-Beta 3) es claramente inducida en cada uno de estos cultivos (ver Figura 1 ) con el Clon 2 que expresa la mayor cantidad de proteína de TGF-Beta 3. 1 .4 Patrón de células congeladas Los clones 1 -4 se cultivaron en un matraces de agitación en caldo Terrific de concentración media a una DO6oo de aproximadamente 1 y se conservaron como patrones de glicerol por la adición de glicerol a 20% (v/v). Se alicuotaron 1 .2 mi de caldo en crioviales de 12 x 2 mi (que contenían 0.3 mi de glicerol) y luego se conservaron a -70°C. 1 .5 Confirmación de secuencia del gen de TGF-Beta 3. Se tomaron muestras de los cultivos usados para los patrones de células congeladas antes de la adición de glicerol y se usaron para el aislamiento del plásmido usando un kit Qiagen MiniPrep. El plásmido aislado se secuenció y verificó usando un cebador promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') (SEQ ID NO. 4) y un cebador terminador T7 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3') (SEQ ID NO. 5). 1 .6 Cultivo de semilla. Debido a que el Clon 2 expresó la mayor cantidad de proteína de TGF-Beta 3, se recuperó una ampolla de patrón congelado (de la Sección 1 .4) y se inoculó en un matraz erlenmeyer con tabique de 2 litros, que contiene 500 mi de medio HySoy (12 g/L de Hy-Soy (Quest Internacional), 24 g/L de extracto de levaduras (Becton Dickinson), 10 g/L de NaCI (Sigma) y 10 g/L de glicerol (Sigma) y 50 g/ml de kanamicina. El matraz se incubó con agitación a 37°C y 200 rpm y se muestreó periódicamente para medir la DO550. Cuando la DO del cultivo alcanzó 3.21 U/ml (después de 7 horas) se usó el caldo de células para sembrar un fermentador de 150 L (volumen de trabajo de 100 L). 1 .7 Fermentación Se usaron novecientos mililitros de caldo celular (de la Sección 1 .6) para inocular un fermentador de 150 L (WHE) que contiene 90 L de medio de cultivo en lote (0.6 g/L de K2HPO4, 0.4 g/L de KH2PO4, 1 .25 g/L de NH4SO4, 12 g/L de HY-Soy, 24 g/L de extracto de levaduras y 10 g/L de glicerol). Los parámetros operativos de la fermentación se controlaron de la siguiente manera: punto de ajuste de temperatura 37°C; punto de ajuste de pH, 7.0 (mantenido usando 4 N de hidróxido de amonio y 4 N de ácido fosfórico), y oxígeno disuelto (DO) calibrado inicialmente a 100%. La presión del cabezal del recipiente fue 7 psi, y la agitación y flujo de aire fueron de 200-400 rpm con un volumen de aire por volumen de medio por minuto (vvm o slpm), respectivamente. El DO se mantuvo por encima de 20% por el ajuste de los parámetros de ajuste con la siguiente prioridad: agitación (máx. 400 rpm), aereación (máx. 1.5 vvm), suplemento de oxígeno (máx. 33.3 Ipm), y presión trasera (máx 12 psi). La formación de espuma se controló con Pluronic L-61 (25% v/v). Cuando la DO del cultivo alcanzó 10 U/ml se inició una alimentación de glicerol (50% v/v) con una velocidad de flujo de 45 ml/min. Cuando la DO alcanzó 40 U/ml, las células se indujeron con la adición de IPTG hasta una concentración final de 0.2 mM. 1 .8 Recolección Después de 4 horas pos-inducción, el fermentador se refrigeró a 10°C y se redujeron el flujo de aire y la agitación a 0.3 vvm y 100 rpm respectivamente. Los controles de espuma y pH terminaron y se ajustó la presión trasera a 3 psi. Se recolectó el cultivo por centrifugación continua con una centrífuga continua Westfalia CSA8 a 10°C. La centrífuga operó a 15.000 rpm y una velocidad de flujo de 3 litros por minutos y se recolectaron las suspensiones celulares. 1 .9 Lisis celular y recuperación de IB La pasta de células de fermentación (de la Sección 1 .8) se diluyó 1 :5 con buffer de lisis (6.1 g/L de TrizmaBase (Tris), 3.7 g/L de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 58.44 g/L de NaCI y 10 g/L de Tritón X-100, pH 8.0) y se resuspendió usando un homogenizador manual. La pasta celular resuspendida se pasó dos veces a través de un homogenizador de alta presión (parámetros: presión, 10.000 psig; velocidad de flujo, 450 ml/min; y temperatura, 15°C). El lisado celular homogenizado luego se centrifugó (centrífuga de cabezal, rotor de ángulo fijo) a 5.000 xg durante 20 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante dejando el TGF-Beta 3 insoluble (cuerpos de inclusión). El pellet de cuerpos de inclusión (IB) se resuspendió en buffer de lavado (6.1 g/L de Tris y 3.72 g/L de EDTA, pH 8.0) usando un homogenizador manual y se centrifugó (5.000 xg durante 20 minutos a 4°C). 1 .10 Solubilización de cuerpos de inclusión El sedimento de la Sección 1 .9 se diluyó 1 : 10 con el buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 15.4 g/L de DL-ditiotreitol (DTT) y 360.4 g/L de urea, pH 8.0) y re-suspendió en un homogenizador manual. La suspensión se cubrió y dejó agitar durante 60-75 minutos, a temperatura ambiente para solubilizar los cuerpos de inclusión y reducir el TGFBeta 3 a sus forma monomérica. El pH del pellet resuspendido se ajustó a pH 9.4-9.6 con NaOH/ácido acético antes de la incubación durante un segundo tiempo de 60-75 minutos. 1 .1 1 Clarificación/ultrafiltración y diafiltración El material solubilizado de la Sección 1 .10 se clarificó, concentró y diafiltró en un sistema de flujo tangencial (TFF) (Millipore). La clarificación y concentración iniciales se obtuvo con una membrana de clarificación TFF preacondicionada (Millipore Pellicon 1000 kDa, celulosa regenerada, prueba V). El TGF-Beta 3 clarificado se recolectó en el permeato. Luego se cambia a una membrana de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) (Millipore Pellicon 5kDa, celulosa regenerada, prueba C), el TGF-Beta 3 luego se lava en 6 volúmenes de diafiltración del buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 15.4 g/L de DTT y 360.4 g/L de urea, pH 9.5). 1 .12 Prueba de replegamiento en matriz 1 1 .12.1 Metodología El contenido de proteína de TGF-Beta 3 en el material clarificado de la Sección 1 .1 1 se cuantificó usando el ensayo de proteína RC DCTM (BioRad) en conjunto con SDS-PAGE, tinción con azul de Coomassie y densitometría. El material de TGF-Beta 3 se diluyó en una serie de bufferes de replegamiento (ver cuadros 1 y 2). Se tomaron diariamente muestras de 1 mi durante un cronograma de 6 días y se analizaron en condiciones no reductoras usando SDS-PAGE. Se corrieron las alícuotas de las muestras y los estándares de peso molecular Mark 12 (Invitrogen- rango de peso molecular 2.5-200 kDa) en gel NuPAGE® Novex 12% de Bis-Tris 1 .0 mm (Invitrogen) durante aproximadamente 40-50 minutos a 120 miliAmp y 200 voltios. Las muestras de proteína luego transfirieron por electroforesis a la membrana de nitrocelulosa (Invitrogen) usando un aparato Novex Blotting (Invitrogen). La membrana se bloqueó con 5% (p/v) de leche en polvo descremada, 1 % (v/v) de monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 20;Sigma) en solución buffer salina (PBS). Se lavó la membrana (PBS, 0.1 % (v/v) Tween 20) y se incubó durante 1 hora en anticuerpo primario (Anti-TGF-Beta 3, MAB643 (sistemas R&D) diluido 1 :500 en PBS y 0.1 (v/v) de Tween 20). Después de la incubación con el anticuerpo primario, la nitrocelulosa se lavó con buffer de lavado (PBS, 1 % (v/v) de Tween 20). Luego la nitrocelulosa se incubó durante 1 hora adicional en el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Abcam P0397) diluida 1 :2000 con PBS, 0.1 % (v/v) de Tween 20). La membrana se lavó nuevamente (PBS, 1 % (v/v) de Tween 20 antes de desarrollar color con el substrato estabilizado Western Blue para fosfatasa alcalina (Promega). El anticuerpo MAB 643 detecta especies de TGF-Beta 3 monoméricas y diméricas correctamente replegadas. 1 .12.2 Resultados Los cuadros 1 y 2 sintetizan los resultados obtenidos por el análisis de replegamiento de TGF-Beta 3 en 50 condiciones experimentales diferentes. Los inventores establecieron que las condiciones que se describen a continuación (es decir, las condiciones experimentales 12, 19, y 44) produjeron TGF-Beta 3 dimérico correctamente replegado: 1 . 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 12). 2. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 19). 3. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2 mM de GSSG, 0.12 mg/ml TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 44). A modo de ejemplos la Figura 2 ilustra la efectividad de de la Condición experimental 12.

CUADRO 1 Matriz de prueba de replegamiento y resultados CUADRO 2. Matriz de prueba de replegamiento y resultados 1. 3 Optimización de replegamiento Las condiciones del Experimento 12 (0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3 a pH 9.5 a 2-8°C) produjeron TGFBeta 3 particularmente bien plegado. En consecuencia se seleccionaron estas condiciones para una optimización adicional. Los parámetros investigados fueron: Concentración de TGF-Beta 3 (0.I mg/ml, 0.25 mg/ml y 0.5 mg/ml) pH (8.0, 9.0 y 9.5) Temperatura (2-8°C y temperatura ambiente) Adición de NaCI 1 M El material de TGF-Beta 3 de la Sección 1 .12 se diluyó en una serie de condiciones de replegamiento (ver cuadros 3 y 4). Se tomaron diariamente muestras de 1 mi durante un cronograma de 6 días. Las muestras del día 6 se analizaron en condiciones no reductoras usando SDS-PAGE y transferencia Western (ver Sección 1 .13 para la metodología). Se detectó TGF-Beta 3 monomérico correctamente replegado por transferencia Western blot en todas las condiciones de replegamiento. Se detectó TGF-Beta 3 dimérico correctamente replegado por transferencia Western en todos los experimentos que contienen 1 .0 M de NaCI (ver Figuras 3 y 4). Las condiciones en las que se replegó la mayor cantidad de TGF-Beta 3 en su estado dimérico fue la condición experimental 34 (0.7 M de CHES, 1 M de NaCI, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.25 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C/temperatura ambiente). Las muestras de los días 0, 1 , 2 y 3 de la condición experimental 34 se corrieron en SDS-PAGE no reductor y transferencia Western para determinar los puntos de tiempo en los que se produjo TGF-Beta 3 correctamente replegado. Como se muestra en la Figura 5 el material de partida inicial y la muestra del día 1 contenían cantidades pequeñas de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico correctamente replegados. Existe un aumento significativo de la cantidad de TGF-Beta 3 correctamente replegado en el día 2 y 3 de replegamiento. La Figura 6 ilustra el replegamiento obtenido por las condiciones de replegamiento del arte previo contempladas en US 5.922.846, US 5.650.494 y EP 0 433 225 (0.05 M de Tris, 1 M de NDSB-201 , 20% (v/v) de DMSO, 2% (p/v) de CHAPS, 1 M de NaCI, 1 % (p/v) de GSH, 0.2 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.3 a 2-8 °C). Se puede observar que la cantidad de TGF-Beta 3 replegado es todavía creciente después de 7 días de tratamiento (contrastar calles 4 y 5 de la Figura 6) mientras que, en contraste, el factor de crecimiento se plegó por completo después de 2 días de tratamiento cuando se emplean los métodos de acuerdo con la invención (comparar calles 3 y 4 de la Figura 5). El replegamiento de TGF-Beta 3 en la condición experimental 34 también se controló usando HPLC de intercambio catiónico (CEX). Se equilibró una columna HPLC de PoliSulfoetil-A (200 x 4.6 mm, 5 µ?t?, 1000 A de PolyLC Inc.) con una fase móvil A (10% (v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de alcohol isopropílico). Las mué stras de replegamiento se acidificaron por la mezcla 1 : 1 con 20% de ácido acético, 60% de alcohol isopropílico. Se cargaron 100 pL de muestra de replegamiento acidificada en una columna de velocidad de flujo de 0.5 ml/min (esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna se lavó con fase móvil A durante 5 minutos. Se corrió un gradiente lineal durante 10 minutos finalizando con una mezcla de 60% de fase móvil A y 40% de fase móvil B (10% (v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de alcohol isopropílico y 1 M de NaCI). La aplicación de este buffer se mantuvo durante 5 minutos adicionales. Se aplicó un segundo gradiente lineal durante 10 minutos finalizando con 100% de fase móvil B y se mantuvo durante 5 minutos. La Figura 7A-7C ilustra que en el día 0 existen pequeñas cantidades de TGF-Beta 3 dimérico correctamente replegado (ver figura 7(A)) mientras que en el día 1 existe un aumento significativo de la concentración de la proteína de TGF-Beta 3 correctamente plegada (ver figura 7(B)). La concentración de TGF-Beta 3 dimérico en el día 2 es similar al día 1 , lo que indica que el replegamiento está completo después 24 horas (ver figura 7(C)). La finalización del replegamiento después de 24 horas es significativamente más rápida que en las técnicas del arte previo (ver Figura 6).

CUADRO 3 Matriz de optimización de repleqamiento y resultados (Condiciones experimentales 1-18) Nota: RT= Temperatura ambiente 2-8°C/RT= 3 días a 2-8°C y 3 días a temperatura ambiente CUADRO 4 Matriz de optimización de replegamiento y resultados (Condiciones experimentales 19-36) Nota: RT= Temperatura ambiente 2-8°C/RT= 3 días a 2-8°C y 3 días a temperatura ambiente.

Secciones 1 .14 - 1 .16 Describen experimentos realizados para establecer cómo se puede purificar el TGF-Beta 3 replegado de acuerdo con el primer aspecto de la invención. 1 .14 Ultrafiltración/Cromatografía de interacción hidrofóbica. La solución replegada de CHES identificada como condición experimental 34 de la Sección 1 .13 se concentró 5 veces por ultrafiltración (la membrana fue una lámina plana Millipore Pellicon 5 kDa, 0.1 m2, prueba de celulosa regenerada). El pH del material replegado concentrado luego se ajustó a un pH de 2.5-2.8 usando ácido acético glacial antes de diluir 1 : 1 en buffer de dilución (2.72 g/L de acetato de sodio, 264.28 g/L de sulfato de amonio, 100 g/L de ácido acético, y 210.7 g/L de clorhidrato de arginina de pH 3.3). Se equilibró una columna de flujo rápido de Butilsefarosa 4 (Amersham, 16 cm de altura de lecho) con cuatro volúmenes de columna de Buffer A (2.72 g/L de acetato de sodio, 132.14 g/L de sulfato de amonio y 100 g/L de ácido acético a pH 3.3). El material replegado se filtró a través de una membrana de 0.22 µ? (filtro Millipore Millipak) antes de cargarse en una columna de butilsefarosa a una velocidad de flujo de 100 cm/hora (esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna luego se lavó en Buffer A para cuatro volúmenes de columna. Las proteínas de TGF-Beta 3 se eluyeron de la columna usando Buffer B (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético y 300 g/L de etanol, pH 3.3). Se mezcló el primer pico, que contiene proteínas TGF-Beta 3 en formas monoméricas y diméricas (ver, Figura 8). 1 .15 Cromatografía de intercambio catiónico Se usó la cromatografía de intercambio catiónico para aislar las proteínas de TGF-Beta 3 dimérico de las proteínas monoméricas. Las fracciones de TGF-Beta 3 combinadas de la Sección 1 .14 se diluyeron 5 veces en SP buffer de dilución de carga (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético, 300 g/L de etanol pH 4.0). Se equilibró una columna de flujo rápido de Butilsefarosa 4 (Amersham) con cuatro volúmenes de columna de Buffer A (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético, 300 g/L de etanol y 1 .46 g/L de cloruro de sodio, pH 4.0). El material de TGFBeta 3 diluido se cargó en una columna de sefarosa SP con una velocidad de flujo de 169 cm/horas ((esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna luego se lavó en Buffer B (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético, 300 g/L de etanol y 2.92 g/L de cloruro de sodio pH 4.0) para cuatro volúmenes de columna. Las proteínas de TGF-Beta 3 se eluyeron de la columna usando el Buffer C (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético, 300 g/L de etanol y 1 1 .69 g/L de cloruro de sodio pH 4.0). El primer pico eluido es TGF-Beta 3 monomérico seguido por el TGF-Beta 3 dimérico. Se combinaron las fracciones que contienen el dímero TGFBeta 3 dímero (ver Figura 9) 1 .16 Ultrafiltración/Diafiltración Las fracciones que contienen moléculas de TGF-Beta 3 diméricas purificadas de la Sección 1 .15 se sometieron a ultrafiltración/diafiltración para cambiar el buffer a 20 mM de ácido acético, 20% (v/v) de etanol y concentrar la muestra a -10 mg/ml (se determinó la concentración de TGF-Beta 3 por espectrometría de U.V). 1 .17 Ensayo de actividad biológica El ensayo de inhibición del crecimiento celular (A Meager, 991 -Journal of Immunological Methods; 141 ; páginas 1 a 14) se usó como un ensayo de actividad biológica in vitro para las moléculas de TGFBeta. El ensayo colorimétrico se basa en el efecto inhibitorio de las moléculas de TGF-Beta sobre el crecimiento de las células epiteliales de pulmón Mink (MLEC). Se agregaron 50 µ?_ de medio de dilución (medio esencial mínimo con Glutamax I (Invitrogen) y 0.1 % (p/v) de albúmina sérica bovina (Sigma)) a cada pocilio de una placa de 96 pocilios. Se agregaron 50 µ?_ de diluciones seriadas (5000 pg/ml a 9.75 pg/ml) de estándar de referencia de TGF-Beta 3 (National Institute of Biological Standards y Controls), 50 µ?_ de diluciones seriadas (5000 pg/ml a 9.75 pg/ml) de TGF-Beta 3 (producida por métodos descriptos en la patentes: US 5.922.846, US 5.650.494 y EP-B-0433 225) y 50 µ?_ de diluciones seriadas (5000 pg/ml a 9.75 pg/ml) de proteína TGF-Beta 3 (CHES factor de crecimiento replegado purificado de acuerdo con la sección 1 .17) a la(s) placa(s). Se agregaron 50 µ?_ de suspensión celular que contiene: 1 x105 células MLEC/ml en medio completo (medio esencial mínimo con Glutamax I (Invitrogen), 0.1 % (p/v) de albúmina sérica bovina (Sigma) y 10% (v/v) de suero bovino fetal (Invitrogen) a cada pocilio. La(s) placa(s) se incubaron durante 72 horas a 37°C en 5% de CO2. Se aspiraron los contenidos de cada pocilio y se lavaron tres veces con 200 µ?_ de solución salina bufferada con fosfato (Invitrogen). Se agregaron 100 µ?_ de solución de sustrato (1 M de acetato de sodio, 104 sustrato fosfatasa (Sigma) y 1 % (v/v) de Tritón X-100 (Sigma)) a cada pocilio y se incubó a 37°C. Después de 2 horas la reacción se inactivo usando hidróxido de sodio 1 N. La(s) placa(s) se leyeron usando un lector multicanal a 405 nm y un filtro de referencia a 492 nm. Los valores de Cl50 del estándar de referencia de TGF-Beta 3 (NIBSC) y TGF-Beta 3 (producido por los métodos descriptos en la patentes: US 5.922.846, US 5.650.494 y EP-B-0433 225) fueron 242.33 pg/ml y 90 pg/ml respectivamente, que fueron similares a los estándares previamente ensayados. Se halló que el material replegado de acuerdo con la invención tenía una IC50 de 85.573 pg/ml, que indica la TGF-Beta 3 replegada de acuerdo con la invención, tiene al menos una potencia equivalente (actividad biológica) a TGF-Beta 3 producido por los métodos del arte previo.

Conclusiones A partir de la matriz de detección de replegamiento de las condiciones descriptas en los cuadros 1 y 2, tres condiciones produjeron correctamente TGF-Beta 3 dimérico replegado: 1 . 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 2. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 3. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. Las condiciones experimentales de replegamiento que contienen CHES se optimizaron adicionalmente para maximizar el rendimiento y reducir los cronogramas de tiempo. Las condiciones de replegamiento óptimas incluyeron 0.7 M de CHES, 1 M de NaCI, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.25 mg/ml de TGF-Beta 3 y pH 9.5, que completo el replegamiento entre 24-48 horas. Esto es significativamente más rápido que 7 días usando métodos descriptos en las patentes: US 5.922.846, US 5.650.494 y EP-B-0433 225. El replegamiento optimizado con CHES se purificó adicionalmente y se halló que tiene actividad biológica comparable de un estándar de TGF-Beta 3 (NIBSC) y TGF-Beta 3 generado usando la metodología descripta en el arte previo.

EJEMPLO 2 Se desarrolló un proceso industrial de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. La Figura 10A-10E provee un panorama del proceso mientras que las Figuras 11-29B proporcionan detalles adicionales, en la forma de diagramas de flujo de las etapas individuales descriptas en la Figura 10A-10E.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para plegar un factor de crecimiento transformante beta, o un análogo funcional de éste, en una forma dimérica biológicamente activa que comprende agregar un factor de crecimiento monomérico no plegado solubilizado a una solución que contiene: (i) ácido 2-(ciclohexilam¡no)-etansulfónico (CHES) o un análogo funcional del mismo; y (ii) un sistema redox de sulfidrilo/disulfuro de bajo peso molecular; e incubar el factor de crecimiento en la solución hasta que se forma el factor de crecimiento dimérico biológicamente activo. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque CHES se usa en una concentración de aproximadamente 100 mM-1.0 M. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se usan aproximadamente 0.7 M de CHES. 4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el análogo funcional de CHES está definido por la fórmula: en donde: Ri y R2 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C- sustituidos o no sustituidos, grupos cicloalquilo C3-8 sustituidos o no sustituidos, o un núcleo aromático sustituido o no sustituido, o R1 y R2 juntos forman un sistema anular que tiene hasta 10 átomos; X1 y X2 se seleccionan de modo independiente de -O-, -S-, -S(O), -S(O2)-, -NR3-, -CHR - y CHR5 en donde R3, R4 y R5 son iguales o diferentes y se seleccionan de modo independiente del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci- sustituidos o no sustituidos, grupos cicloalquilo C3-8 sustituidos o no sustituidos, o un núcleo aromático sustituido o no sustituido o dos de R3, R4 y R5 pueden formar juntos un sistema anular que tiene hasta 6 átomos de carbono, sujeto a la condición de que al menos uno de X1 y X2 sea -CHR - o -CHR5-; y X3 se selecciona de C, S, S=0, o P-OH 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el análogo funcional de CHES se define por la fórmula: 6.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el análogo funcional de CHES se define por la fórmula: (Ib) 7.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el análogo funcional de CHES se define por la fórmula: (le) 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el sistema redox sulfhidrilo/disulfuro es glutatión en sus formas oxidadas y reducidas. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el sistema redox sulfhidrilo/disulfuro es aproximadamente 200 µ?-20 mM de glutatión reducido y 40 µ?-4 mM de glutatión oxidado. 10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se incuba a un pH de 8-10. 1 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se incuba a un pH de aproximadamente 8.5 y 9.5. 12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se incuba a temperaturas de 0°C-37°C. 13. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se agrega a la solución en una concentración de entre 0.1 -0.5 mg/ml. 14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta es factor de crecimiento transformante beta 3. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta 3 se agrega a la solución en una concentración de entre aproximadamente 0.12-0.25 mg/ml. 16 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el plegado se lleva a cabo en las siguientes condiciones: 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C . 17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, caracterizado además porque el plegado se lleva a cabo en las siguientes condiciones: 0.7 M de CHES, 1 M de NaCI, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.25 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C/temperatura ambiente. 18. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque también se agrega taurodesoxicolato a la solución. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se incuba con taurodesoxicolato a una concentración de entre 10 mM-100 mM. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta se incuba con taurodesoxicolato a una concentración de aproximadamente 30 mM. 21 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el plegado se lleva a cabo en las siguientes condiciones: 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C; 22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 , caracterizado además porque el plegado se lleva a cabo en las siguientes condiciones: 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2 mM de GSSG, 0.25 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 23. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el factor de crecimiento transformante beta representa más del 50% de la proteína de la solución. 24. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque se obtiene un sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular y se envejece durante aproximadamente 7 horas antes de agregar el factor de crecimiento transformante beta a la solución que contiene el sistema. 25. - Un método para producir un factor de crecimiento transformante beta activo de un huésped procariótico, el método comprende: (A) fermentación de organismos procarióticos que se han transformado para expresar un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta; (B) aislamiento de cuerpos de inclusión y recuperación de proteína expresada de los cuerpos de inclusión; (C) replegado del miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y (D) purificación del miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta replegado. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque en paso (A) el huésped procariótico es una bacteria que ha sido transformada con un vector de expresión que codifica un factor de crecimiento transformante beta. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado además porque en el paso (C) el factor de crecimiento se repliega de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 -24. 28.- El método de conformidad con alguna de las reivindicaciones 25 - 27, caracterizado además porque factor de crecimiento transformante beta se purifica de acuerdo con el paso (D) por ultrafiltración y cromatografía de intercambio iónico. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la cromatografía de intercambio iónico comprende cromatografía de interacción hidrofóbica seguida por cromatografía de intercambio catiónico; en donde el factor de crecimiento transformante beta factor de crecimiento se formula en una concentración deseada en una solución y se coloca en viales. 30.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 - 27, caracterizado además porque el método comprende un paso adicional (E) en donde el factor de crecimiento se formula en una concentración deseada en una solución y se coloca en viales. 31.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, caracterizado además porque el método comprende esencialmente los pasos (A) a (E) definidos en la Figura 10A-10E.