KR20240083148A - 이량체 단백질에 대한 재접힘 완충용액 조성물 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법 - Google Patents
이량체 단백질에 대한 재접힘 완충용액 조성물 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이량체 단백질에 대한 재접힘 완충용액 조성물 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 상기 재접힘 완충용액 조성물을 이용하면 TGF ß 슈퍼 패밀리인 BMP2 또는 GDF5의 높은 효율의 재접힘이 가능한 효과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 이량체 단백질에 대한 재접힘 완충용액 조성물 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
최근 유전자 재조합 기술의 발달과 함께 산업적으로 유용한 단백질을 생산하기 위하여 미생물을 이용한 재조합 단백질 형태의 유용 유전자 산물을 대량 생산하려는 연구가 이루어지고 있다. 재조합 단백질은 치료용 단백질, 진단 및 연구 시약용 단백질, 산업용 단백질 등 다양한 분야에서 널리 이용되고 있다.
재조합 단백질 시장은 꾸준히 증가하고 있으며, 인간 게놈 프로젝트가 끝나고 20,000 내지 25,000개의 인간 유전자가 확인되었으며, 단백질 구조를 연구하거나 치료용 단백질을 개발하기 위한 타깃 (target)이 늘어난 만큼, 단백질의 재접힘 기술 또한 중요한 의미를 갖게 되었다.
재조합 단백질을 생산하기 위해 이용되는 미생물로는 대장균이 유전적으로 가장 잘 알려져 있으며, 발현 벡터도 다양하게 개발되어 있다. 대장균은 발현의 편이성과 비용, 시간적인 측면에서 유리하여 대장균의 발현 시스템이 널리 이용되고 있다.
그러나, 대장균을 진핵세포 유래 단백질 생산의 숙주세포로 이용할 경우, 단백질 성숙에 필요한 세포 내 요소를 갖추고 있지 않아 글리코실레이션 (glycosylation)과 같은 해독 후 변형 (post-translational modification) 과정이 수행되지 않는다는 단점이 있다. 또한, 외래 단백질을 과량으로 발현할 경우 불용성 침전물인 내포체 (inclusion body) 형태로 세포질 내 축적되는 경우가 많다.
내포체는 단백질 접힘이 제대로 이루어지지 못하여 올바른 단백질 3차 구조가 형성되지 않기 때문에 생기는 균체 내의 비수용성 침전물을 말한다. 따라서, 이러한 내포체 형태로 생산된 목적단백질은 재접힘 과정을 거쳐 생물학적 활성을 회복해야 하는 부가적인 공정을 필요로 한다.
이에, 재조합 단백질의 생산에 있어서, 내포체 형태로 발현되는 재조합 단백질을 활성을 가진 단백질로 회수하는 재접힘 (refolding) 기술이 발전하고 있다. 이러한 재접힘 공정은 변성제 (denaturant)를 이용한 내포체의 가용화 단계와 단백질의 올바른 접힘을 유도하기 위한 변성제 제거 공정으로 구성된다.
변성제의 제거 방법에 따라, 단순 희석, 단계적 희석, 유가식 희석, 투석, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법이 사용되고 있다. 단순 희석에 의한 단백질 재접힘 방법은 시료를 5 내지 100 배 이상의 부피로 희석하는 과정이 필요하므로, 커다란 반응기가 필요한 점, 정제 비용이 높은 점, 및 무작위적인 이황화 결합이 발생할 수 있는 등의 단점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 최근에는 크로마토그래피를 이용한 단백질 재접힘 방법이 개발되어 이용되고 있다.
겔 여과 (크기 배제) 크로마토그래피를 이용한 단백질 재접힘 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하므로 완충액 조성의 치환이 용이하며, 재생이 불완전하게 이루어진 단백질 부분 및 재접힘 공정에서 사용된 단백질 변성제 등의 제거가 용이하다는 장점이 있다.
이러한 단백질 재접힘 공정에서는 재접힘 완충액으로 요소 (urea)를 포함하는 완충액 (buffer)을 사용한다. 요소는 단백질을 재접힘시키는 공정에서 중요한 역할을 한다. 단백질 재접힘을 위해 변성제를 이용하여 재조합 대장균에 의해 생산된 단백질 내포체를 풀어주는 (unfolding) 과정이 필요한데 이를 위해 요소가 주로 사용된다. 이 때, 단백질 재접힘 공정에 사용되는 재접힘 완충액에 있어서 요소가 대체될 경우 재접힘 공정 후 쉽게 회수하고 재활용할 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 이량체 단백질의 재접힘 완충용액 및 이량체 단백질의 제조방법을 예의 연구한 결과, 발현 벡터를 포함하는 목적 유전자 서열, 균주 및 배양방법을 최적화하고, 요소를 포함하지 않는 최적의 단백질 재접힘 완충액 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법을 통해 공정 컨트롤 및 스케일업이 용이하고, 공정시간이 단축되며, 다양한 성장인자 단백질의 재접힘이 높은 효율로 이루어짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 재접힘 완충액과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 단량체 형태로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하기 위한 재접힘 완충액 조성물로서, 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다 (comprises)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 구성요소들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 비록 "제1", "제2" 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
본 발명은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 재접힘 완충액과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 가용화는 변성 (denaturation)과 동일한 의미로, 가용화된 폴리펩티드는 리폴딩 (refolding; 재접힘)을 통해 3차 구조를 회복할 수 있도록 가역적으로 변성된 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질은 둘 이상의 개별 아미노산들이 펩티드 결합을 통해 연결된 임의의 중합체를 지칭하며, 하나의 아미노산의 알파-탄소에 연결된 카르복실산의 카르복실 탄소 원자가 인접 아미노산의 -탄소에 연결된 아미노 그룹의 아미노 질소 원자에 공유적으로 결합될 때 생성된다. 상기 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드라는 용어의 의미를 포함한다. 또한, 다중 폴리펩티드 소단위를 포함하는 단백질을 포함한다. 단백질 및 폴리펩티드의 단편 또한 본 발명의 범위에 속하며, 단백질로서 본원에서 언급될 수 있다.
본 발명의 아미노산은 중심 탄소 원자 (알파-탄소 원자)가 수소 원자, 카르복실산 그룹, 아미노 그룹 및 곁사슬 그룹인 R과 연결되는 구조를 갖는 분자이다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 혼입되는 경우, 아미노산은 하나의 아미노산이 다른 아미노산과 연결되는 탈수 반응에서 아미노산 카르복실 그룹의 하나 이상의 원자들이 소실된다. 결과적으로, 단백질에 혼입될 때 아미노산은 아미노산 잔기로 지칭된다.
본 발명의 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드는 임의의 종, 구체적으로 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 사람을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류 및 천연, 합성, 반합성 또는 재조합과 같이 임의의 공급원으로부터 얻어진 정제된 TGF β 슈퍼 패밀리 단백질의 아미노산 서열을 의미한다.
주어진 단백질의 특정 아미노산 서열은 유전 정보, 일반적인 유전체 DNA에 의해 차례로 구체화되는 mRNA의 코딩 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정된다. 따라서, 유전자의 서열을 결정하는 것은 상응하는 폴리펩티드의 1차 서열 및 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 구체적인 역할 또는 활성의 예측에 도움이 된다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 뉴클레오티드의 중합 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 그것이 유래된 생물의 자연적으로 발생한 유전체에서 코딩 서열 중 어느 하나와 바로 인접하지 않은 서열과 바로 인접한 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 벡터; 자율적으로 복제하는 플라스미드; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA에 혼입되거나 다른 서열에 독립적인 별개의 분자로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 유전체 DNA 또는 RNA뿐만 아니라 유전체 DNA에 의해 코딩되는 mRNA 및 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 TGF β 슈퍼 패밀리의 단백질은 다양한 인간 세포에서 관찰되는 세포의 사이토킨으로 구성된다. ~40개인 TGF β 슈퍼 패밀리 리간드는 TGF β, 골형성 단백질 (BMP), 액티빈과 인히빈, 성장분화인자 (GDF), Noda1, 뮐러관 저해물질 (Mullerian Inhibiting Substance, MIS), 및 아교세포주-유래 신경영양성 인자 (GDNF)를 비롯한 더욱 작은 패밀리로 구분될 수 있다.
TGF β 슈퍼 패밀리 구성원은 다양한 범위의 세포 유형에서 관찰되고, 등배 패턴화 및 좌우축 결정에서부터 골형성 및 조직수복까지 많은 근본적 세포 현상에서 일정한 역할을 한다. 상기 TGF β 리간드는 줄기 세포의 유지에 관여하거나, 줄기 세포의 분화를 촉진한다. TGF β 리간드 신호전달의 조절은 골격과 근육 비정상에서부터 다수의 신생물 현상까지 넓은 범위의 질환 치료에 유용할 수 있다. 이러한 패밀리 또는 단백질의 다양한 구성원에 대한 서열은 본원에 제시되지만, 당업자는 단어 검색 또는 서열 BLAST 검색에 의해 공개적으로 가용한 데이터베이스를 이용하여 확인할 수 있다.
TGF β 슈퍼 패밀리의 골형성 단백질에는 포유동물 골원성 단백질-1 (OP-1, 일명 BMP-7), 골원성 단백질-2 (OP-2, 일명 BMP-8), 골원성 단백질-3 (OP3), BMP-2 (일명, BMP-2A 또는 CBMP-2A, 그리고 초파리 동족체 DPP), BMP-3, BMP-4 (일명, BMP-2B 또는 CBMP-2B), BMP-5, BMP-6과 이의 뮤린 동족체 Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (일명, Vgr2), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (일명, CDMP-1 또는 MP52), GDF-6 (일명, CDMP-2 또는 BMP13), GDF-7 (일명, CDMP-3 또는 BMP-12), 개구리 동족체 Vgl 와 NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL 등이 포함된다.
TGF β 슈퍼 패밀리의 최대 하위-패밀리는 BMP/GDF 패밀리인데, 이는 모든 공지된 리간드의 거의 절반을 차지한다. BMP/GDF 패밀리에서 많은 리간드는 BMP와 GDF 명칭 둘 모두를 공유한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 TGF β 슈퍼 패밀리는 BMP2 또는 GDF5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 BMP2는 서열번호 1의 아미노산 잔기를 포함하고, GDF5는 서열번호 2의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 재접힘은 내포체 (inclusion body) 형태로 얻어진 단백질을 원래의 활성 구조를 가진 형태로 변화시키는 과정을 의미한다. 폴리펩티드의 재접힘은 가용화 (solubilization) 공정 및 활성회복 (renaturation) 공정으로 이루어진다. 가용화 공정에서는 변성제 (chaotropic agents)를 사용하여 분자 간의 소수성 결합과 비정상적인 이황화결합 (disulfied bond)을 끊어줌으로써 구조를 와해시킨다. 활성회복 공정에서는 가해진 변성제를 제거하여 올바른 3차 구조의 형성을 유도한다.
상기 내포체는 단백질의 접힘이 제대로 이루어지지 못하여 올바른 단백질 3차 구조가 형성되지 않기 때문에 생기는 균체 내의 비수용성의 침전물을 의미한다. 내포체는 목적단백질의 생성 속도와 접힘 속도간의 불균형으로 인하여 목적 단백질의 접힘 중간체가 외부로 노출되어 있는 소수성 부위들의 상호결합에 의해 형성된다. 이 경우 내포체를 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 일반적으로 단백질 분해효소에 영향을 덜 받으며, 세포 내에 고농도로 축적되므로 생산성 면에서 우수하고, 목적단백질을 쉽게 분리해낼 수 있는 장점을 지니고 있어 세포내 접힘 (folding)이 용이하지 않은 단백질 생산에 이용되기도 한다. 그러나, 내포체 형태로 생산된 목적단백질은 재접힘 과정을 거쳐 생물학적 활성을 회복하여야 하는 부가적인 공정을 필요로 하는 것이다. 즉, 재접힘 공정은 변성제를 이용한 내포체의 가용화 단계와 단백질의 올바른 접힘을 유도하는 변성제 제거 공정으로 구성된다.
본 발명의 재접힘 완충액은 우레아 (urea)가 결핍되어 있으며, 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 0.1 내지 1 g/L의 최종 농도로 희석할 수 있다. 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함할 수 있다.
본 발명의 재접힘 완충액과 접촉시키는 단계는 3 내지 20 ℃에서 60 내지 80 시간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 ℃에서 70 내지 75 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공정시간이 60시간 미만이면, 재접힘 과정중에 있는 단백질의 비율이 높으므로 재접힘 효율이 낮은 문제가 있고, 80시간 초과이면 단백질의 안정성이 떨어져 활성을 잃은 단백질의 비율이 증가하는 문제가 있다.
본 발명의 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함할 수 있다.
본 발명의 가용화 이전에 박테리아에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 박테리아는 서열번호 3으로 표시되는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 형질전환된 것일 수 있다. 상기 박테리아는 대장균 (E.coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 대장균에서 생산하는 단백질마다 최적의 재접힘 완충액의 조건이 상이할 수 있다.
상기 박테리아에서 폴리펩티드를 발현시키는 단계는 효모 추출물 (Yeast extract), NaCl (Sodium chloride) 및 글리세롤 (Glycerol)을 포함하는 1차 배지에서 박테리아를 배양하는 것일 수 있다. 상기 YSG 배지를 사용함으로써, 대량생산이 유리하고 안정적이고 균일한 폴리펩티드를 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 1차 배지는 증류수 100 내지 130 mL에 글리세롤 2 내지 3 g, 효모 추출물 2 내지 3 g 및 NaCl 1 내지 2 g을 순차적으로 넣고 교반한 후 추가로 증류수를 첨가하여 최종적으로 200 mL에 맞추어 제조할 수 있다.
상기 배양은 제일인산칼륨 (Potassium phosphate monobasic), 황산마그네슘칠수화물 (Magnesium sulfate heptahydrate), 황산암모늄 (Ammonium sulfate), 글리세롤 (Glycerol) 및 효모 추출물 (Yeast extract)을 포함하는 2차 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 2차 배지는 증류수 100 내지 130 mL에 제일인산칼륨 (Potassium phosphate monobasic) 0.5 내지 1 g, 황산마그네슘칠수화물 (Magnesium sulfate heptahydrate) 0.1 내지 0.5 g, 황산암모늄 (Ammonium sulfate) 2 내지 3 g, 글리세롤 (Glycerol) 3 내지 5 g 및 효모 추출물 (Yeast extract) 3 내지 5 g을 순차적으로 넣고 교반한 후 추가로 증류수를 첨가하여 최종적으로 200 mL에 맞추어 제조할 수 있다.
또한, 상기 배양은 D-갈락토오스 (D-Galactose)를 포함하는 3차 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 D-갈락토오스를 사용함으로써, 높은 수율 및 높은 활성을 가진 단백질을 수득할 수 있다.
본 발명의 가용화 완충액은 7 내지 9 M 우레아 (urea) 및 30 내지 60 mM DTT를 포함할 수 있고, pH 7.0 내지 9.0일 수 있다. 상기 가용화 완충액을 사용하여 우수한 재접힘을 달성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 단량체 형태로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 정제는 i) 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계; ii) 상기 i) 단계의 결과물에 대해 소수성 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 iii) 상기 ii) 단계의 결과물에 대해 이온성 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 i) 내지 iii) 단계에서 수행되는 크로마토그래피는 평형화 완충용액과 용출 완충용액의 농도구배를 이용할 수 있다.
상기 i) 단계에서 수행되는 크로마토그래피에서 상기 평형화 완충용액은 pH 5 내지 7이고 40 내지 60 mM 인산나트륨(sodium phosphate) 및 3 내지 5 M 우레아(urea)를 포함할 수 있고, 상기 용출 완충용액은 pH 5 내지 7이고 40 내지 60 mM 인산나트륨(sodium phosphate), 3 내지 5 M 우레아(urea) 및 1 내지 3 M NaCl을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하기 위한 재접힘 완충액 조성물로서, 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 형태의 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 재접힘 완충액은 우레아 (urea)가 결핍될 수 있고, 상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 형태의 글루타치온을 포함할 수 있다. 상기 재접힘 완충액은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 0.1 내지 1 g/L의 최종 농도로 희석할 수 있다.
본 발명의 TGF β 슈퍼 패밀리는 BMP2 또는 GDF5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 최적의 재접힘 완충 조건은 상기 TGF β 슈퍼 패밀리 내에서도 상이할 수 있다.
본 발명의 재접힘 완충액 조성물을 이용하는 경우, TGF β 슈퍼 패밀리인 BMP2 또는 GDF5의 높은 효율로 재접힘이 가능하며, 공정 제어 및 스케일 업이 용이하고, 공정 시간이 최적화되는 우수한 효과가 있다.
본 발명은 이량체 단백질에 대한 재접힘 완충용액 조성물 및 이를 이용한 이량체 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 상기 재접힘 완충용액 조성물을 이용하면 TGF ß 슈퍼 패밀리인 BMP2 또는 GDF5의 높은 효율로 재접힘이 가능한 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 코돈(codon) 최적화하여 합성한 GF101 유전자 서열을 나타내는 도이다.
도 2는 GF101 배양 공정을 나타내는 도이다.
도 3은 GF101의 정제 단계별 시료의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 GF101 주성분부 제조 공정을 나타내는 도이다.
도 5는 GF101 첨부용제부 제조 공정을 나타내는 도이다.
도 6은 GF101의 제조 공정을 전체적으로 나타내는 도이다.
도 7은 BMP2와 관련하여 비교예 대비 높은 효율로 재접힘됨을 나타낸 도이다.
도 8은 GDF5와 관련하여 비교예 대비 높은 효율로 재접힘됨을 나타낸 도이다.
도 9는 아르기닌의 농도에 따른 재접힘 효율을 비교한 도이다.
도 2는 GF101 배양 공정을 나타내는 도이다.
도 3은 GF101의 정제 단계별 시료의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 GF101 주성분부 제조 공정을 나타내는 도이다.
도 5는 GF101 첨부용제부 제조 공정을 나타내는 도이다.
도 6은 GF101의 제조 공정을 전체적으로 나타내는 도이다.
도 7은 BMP2와 관련하여 비교예 대비 높은 효율로 재접힘됨을 나타낸 도이다.
도 8은 GDF5와 관련하여 비교예 대비 높은 효율로 재접힘됨을 나타낸 도이다.
도 9는 아르기닌의 농도에 따른 재접힘 효율을 비교한 도이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1. 목적 단백질의 구조 유전자 및 이의 클로닝
GF101 (재조합 인간 골형성단백질-2)의 생산을 위한 유전자 서열은 이미 알려진 천연형 인간 골형성단백질-2의 아미노산 서열을 이용하여 최종적으로 아미노산 서열이 천연형 인간 골형성단백질-2와 동일하도록 설계하였다.
성숙한 인간 골형성단백질-2는 총 114개 아미노산으로 이루어져 있고, DNA 서열로는 342 bp이다. 인간 골형성단백질-2 cDNA에는 대장균에서 사용빈도가 낮은 코돈 (codon)을 다수 가지고 있기 때문에 대장균에서의 발현을 증진시키고자 적합한 코돈으로 바꾸는 과정을 수행한 다음 GF101 DNA 서열을 합성하였다. 단백질 발현 시작이 가능할 수 있도록 5' 쪽에 메티오닌 (ATG 코돈) 잔기를, 발현을 종결시키고자 3' 쪽에 두 개의 종결 코돈 (TGA, TAA 코돈)을 추가하였다. 또한, 벡터로의 유전자 클로닝 (cloning)이 용이하도록 제한효소 인식부위를 추가하였다 (도 1).
합성한 유전자를 pBH 벡터 (Bioneer)에 삽입하고, GF001-pFK-Mock라 명명하였다. GF001-pFK-Mock와 Addgene사에서 구매한 pET-29a(-) 벡터를 제한효소인 NdeI과 XhoI으로 동시에 처리한 후, 아가로스 겔에 전개하여 QIAQuick gel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 GF101 유전자를 분리하였다. 분리한 유전자를 Quick ligation kit (Invitrogen)를 이용하여 라이게이션 (ligation) 반응을 수행하였다.
라이게이션 반응물을 competent cell (Invitrogen)에 형질전환한 후 카나마이신 (kanamycine)으로 선별하였다. 선별된 콜로니 (colony)에서 플라스미드를 추출하고 NdeI과 XhoI로 처리하여 유전자형을 확인하였다. 최종적으로 구축된 GF101 발현 벡터를 pET001라 명명하였으며, pET001 벡터를 발현 숙주인 E.coli BL21 (DE3)에 형질전환하여 GF101 생산 균주인 E.coli BL21 (DE3)/ pET001을 제조하였다.
실시예 2. GF101을 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주
GF101을 생산하기 위한 발현 벡터는 pET29a(-) 벡터를 기본 골격으로 GF101 유전자를 삽입하여 제작되었다.
GF101은 T7 프로모터로부터 발현이 유도되는데, T7 프로모터는 숙주인 E.coli BL21 (DE3)에서 IPTG에 의해 발현이 조절되어 재조합 단백질의 발현을 손쉽게 조절할 수 있다. GF101의 전사는 trpA transcription terminator에 의해 종결되며, par region을 가지도록 설계하여 벡터가 대장균 내에서 안정하게 유지될 수 있도록 하였다.
항생제 내성 마커로는 카나마이신을 사용하여 배양 시 다른 균에 의한 오염을 방지하였다. 또한, 대장균에서 발현을 극대화하고자 GF101 유전자 서열이 대장균에 최적화된 코돈으로 설계하였다.
숙주인 E.coli BL21 (DE3)의 유전자형은 F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)로 염색체 DNA에 파지 람다 DE3 라이소젠 (T7 RNA 폴리머라제 유전자)을 포함한다. DE3은 lacUV5 프로모터로부터 T7 RNA 폴리머라제를 발현하여 IPTG에 의해 T7 RNA 폴리머라제 발현이 유도된다. T7 RNA 폴리머라제가 플라스미드의 T7 프로모터의 단백질 발현을 유도함으로써 재조합 단백질의 합성이 유도된다. E.coli BL21 (DE3)은 Invitrogen 사에서 구입하여 형질전환에 사용하였다.
실시예 3. 세포은행의 제조 및 재조합체의 배양
3-1. 연구용 세포은행의 제조 및 보존
연구용 세포은행 (Research cell bank)은 GF101을 발현하도록 제조한 pET001 벡터에 의해 형질 전환된 E.coli BL21 (DE3)/pET001로부터 만들어졌다. 연구용 세포은행은 특정 단백질의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 포함하는 숙주세포가 만들어진 후, 이 재조합 세포의 성질이 변하지 않는 상태에서 연속적인 씨드 (seed) 공급을 수행할 수 있도록 제조, 보관하는 씨드풀을 말한다. 이러한 연구용 세포은행은 표현형, 유전자형, GF101 단백질 발현 등 그 특성이 파악되고 동정되었으며, 순수하게 분리된 단일 콜로니 (single colony)로부터 만들어져 균일성을 가진다.
E.coli BL21 (DE3)/pET001의 단일 콜로니를 카나마이신이 포함된 YSG 평판배지에서 선별하고 선별된 콜로니를 카나마이신이 포함된 YSG 배지에서 배양하였다. 카나마이신이 포함된 YSG 배지 200 mL을 1L 배양용 플라스크에 넣고 콜로니 배양액을 접종하였다.
600 nm에서 배지를 기준 (blank)으로 흡광도를 측정하여 흡광도 0.8~1 (대수기)에서 배양액을 회수하였다. 80% 글리세롤 (glycerol)과 섞어 글리세롤이 15 %가 되게 하였다. 1 mL씩 cryovial에 분주하여 -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.
유전적 안정성이 보장될 수 있도록 분주한 생산용 세포은행 냉동바이알 (cryovial)은 -70 ℃가 유지되는 초저온 냉동기에 독립된 공간을 별도로 만들어 각 50개씩 다른 세포들과 혼합되거나 오염되지 않도록 하면서 보관하였다.
또한, 생산용 세포은행 cryovial의 관리는 지정된 관리자로 제한하였으며, 각 바이알의 배치에 관하여 기록하였다. 생산용 세포은행은 각 생산 및 시험마다 필요한 수의 바이알을 꺼내어 사용하였으며, 한 번 사용한 바이알은 생산용 세포은행이 남았을 경우라도 재보관하지 않고 폐기하였다.
3-2. 재조합체의 배양
3-2-1. 생산 배지의 성분 및 제조방법
GF101 생산을 위한 전반적인 배양 공정은 도 2에 나타냈다. GF101 생산균주를 배양하기 위한 발효 배지의 성분은 다음과 같다.
1) 1차 종배양 배지
1차 종배양 배지를 제조하기 위해 증류수 120 mL에 glycerol 2.52 g (2.02 mL), yeast extract 2.0 g, sodium chloride 1.0 g의 원료를 순차적으로 넣고 교반하였다. 추가로 증류수를 첨가하면서 최종 200 mL로 맞추고, 1L Erlenmeyer baffled flask에 옮겨 담았다. 이후, 121℃, 20분간 멸균 진행하였다. 멸균이 완료되면 클린벤치 또는 BSC로 멸균품을 이동 보관하였다.
2) 2차 종배양 배지
2차 종배양 배지를 제조하기 위해 증류수 120 mL에 potassium phosphate monobasic 0.86 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.38 g, ammonium sulfate 2.64 g, glycerol 4.0 g (3.2 mL), yeast extract 4.0 g의 원료를 순차적으로 넣고 교반하였다. 이후 3.1 % (v/v) 암모니아 용액을 이용하여 pH를 7.0 ± 0.2로 조정하였다. 추가로 증류수를 첨가하여 최종 200 mL로 맞추고, 1L Erlenmeyer baffled flask에 옮겨 담았다. 이후, Antifoam204를 40 μL 넣고, 121 ℃, 20 분간 멸균 진행하였다. 멸균이 완료되면 클린벤치 또는 BSC로 멸균품을 이동 보관하였다.
3) 본배양 배지
본배양 배지를 제조하기 위해 증류수 2 kg에 potassium phosphate monobasic 12.9 g, magnesium sulfate heptahydrate 5.7 g, ammonium sulfate 39.6 g, glycerol 120.0 g, 96M1 Yeast extract 90.0 g의 원료를 순차적으로 넣고 교반하였다. 이후, 3.1% (v/v) 암모니아 용액을 이용하여 pH를 7.0±0.2로 조정하였다. 추가로 증류수를 첨가하여 최종 3 kg으로 맞추고, 발효 jar에 옮겨 담았다. Antifoam204를 0.6 mL 넣고, 121 ℃, 20 분간 멸균 진행하였다. 멸균이 완료되면 발효기에 이동 장착하였다.
4) 추가 배지
증류수 400 mL에 glycerol 645 g (516 mL), yeast extract 258.0 g의 원료를 넣고 교반하였다. 이후, 증류수를 추가하여 1.5 kg으로 맞추고, 2L 바틀 (bottle)로 옮겨 담았다. 발효기로 배지를 이송할 수 있도록 tool을 장착하고, 121℃, 20분간 멸균 진행하였다. 멸균이 완료되면 클린벤치 또는 BSC로 멸균품을 이동 보관하였다.
3-2-2. 1차 종배양
1차 종배양 진행 전 플라스크 배양기를 37 ℃, 200 rpm으로 세팅하였다.
클린벤치 또는 BSC에서 RCB를 해동하였다. 1차 종배양 배지에 Kanamycine sulfate 용액을 143 μL를 첨가하였다. 1차 종배양 배지에 해동된 RCB 100 μL를 접종하고, 플라스크 배양기에서 37 ± 1 ℃, 200 rpm으로 배양을 진행하였다. 1차 종배양 시작 후, 세포농도 값이 1.5 ~ 4.5 AU가 되면 배양을 종료하였다.
3-2-3. 2차 종배양
2차 종배양 배지에 trace element 용액 200 μL, kanamycine sulfate 용액 143 μL, citric acid 용액 2 mL을 첨가하였다.
2차 종배양 배지에 1차 종배양 완료액 1 mL을 접종하였다. 플라스크 배양기에서 32 ± 1 ℃, 200 rpm으로 배양을 진행하였다. 2차 종배양 시작 후 세포농도 값이 10 ~ 20 AU가 되면 배양을 종료하였다.
3-2-4. 본배양
본배양 배지에 trace element 용액 3 mL, kanamycine sulfate 용액 3 mL, citric acid 용액 30 mL, D-galactose 용액 15 mL을 첨가하였다.
하기 조건으로 배양기를 세팅한 후, DO cal'을 수행하였다.
800 rpm, Air 공급 3.6 lpm, 온도 32 ℃, 10 % 인산용액, 12.5 % 암모니아 용액, 본배양 추가 배지를 발효기와 연결하였다.
본배양 배지에 2차 종배양 전량 (200 mL)을 접종하였다. 접종 후 다음과 같이 발효기를 운영하여 배양을 진행하였다: 온도 32 ± 1 ℃, DO cascade 30 %, pH 6.8 ± 0.2, Air 공급 3.6 lpm.
glycerol 고갈 직전 산소가 가장 많이 투입된다. O2 %가 50 %를 넘어도 DO 유지가 안될 경우에는 Air lpm을 최대 9 lpm으로 증가시켜야 한다. DO, pH 패턴 확인 후, glycerol 고갈로 판단되면 추가 배지 공급을 시작한다. 추가 배지 공급은 58.2 g/h의 속도로 공급한다. 추가 배지 공급 예상 시점은 세포 농도 50 내지 70, 배양 시작 후 7 내지 9 시간 사이이다. 추가 배지 공급 시작 후 0, 5, 10, 15 시간에 발현분석용 샘플링을 실시하고, 추가 배지 공급 15 시간이 지나면 배양을 종료하였다.
실시예 4. 분리 및 정제
재조합 대장균을 배양하여 얻은 배양액으로부터 3개의 칼럼을 이용하여 GF101을 분리 및 정제하였다. 하기 실시예 4-1 내지 4-7의 순서로 진행하였다.
4-1. 세포 파쇄
배양 완료된 세포는 연속원심분리기로 회수하였다. 회수된 세포는 세포 파쇄액에 현탁시킨 후, 파쇄균질기를 이용하여 파쇄하였다.
세포 파쇄 여부는 세포 탁도를 측정하여 파쇄 후가 파쇄 전보다 50% 이상 감소하도록 하였다.
4-2. 봉입체 분리 및 가용화
세포 파쇄액에서 원심분리를 통하여 봉입체를 분리하였다. 분리된 봉입체는 가용화 용액에 넣고, 교반기로 가용화시킨 후 단백질 정량을 하였다: i) 20 mM Tirs / 1 mM EDTA / 1.5 % Tween 20, pH 8.0; ii) 8 M urea / 50 mM DTT, pH 8.0.
4-3. 재접힘
가용화된 시료를 재접힘 용액에 첨가하고, 교반을 통하여 재접힘 반응을 유도하였다: 0.5 M L-arginine / 0.5 CHES / 5mM GSH/ 0.5 mM GSSG, pH 8.3.
재접힘 반응 후, SDS-PAGE를 통하여 재접힘 여부를 확인하였다 (도 3). 재접힘이 완료된 시료는 HCl을 첨가하여 재접힘 반응을 중지시켰다.
4-4. 친화성 크로마토그래피_Heparin HP 정제
재접힘 완료 후 GF101을 회수하기 위하여 친화성교환 수지를 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. GF101을 흡착시킨 후 i) 평형화 완충용액과 ii) 용출 완충용액의 농도구배로 GF101을 용출시켰다: i) 50 mM sodium phosphate / 4M urea, pH 6.5; ii) 50 mM sodium phosphate / 4M urea / 2M NaCl, pH 6.5.
4-5. 소수성 크로마토그래피 Phenyl HP
친화 교환 크로마토그래피를 통과한 GF101을 불순물로부터 분리하기 위하여 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. GF101을 흡착시킨 후 평형화 완충용액과 용출 완충용액의 농도구배로 GF101을 용출시켰다.
4-6. 이온 크로마토그래피 CM FF
소수성 크로마토그래피에서 얻은 GF101을 다른 불순 단백질로부터 정제하기 위하여 이온 크로마토그래피를 수행하였다. GF101을 흡착시킨 후 평형화 완충용액과 용출 완충용액의 농도구배로 GF101을 용출시켰다.
4-7. 원액의 제조
다이아필트레이션 시스템을 이용하여 제형 완충용액으로 교체하고, 제균 여과한 후 GF101 농도가 약 1.5 ± 0.5 mg/mL이 되도록 맞추어 원액을 제조하였다.
원액은 기준 및 시험법에 따라 성상, pH, 무균, 엔도톡신, 확인 (SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, RP-HPLC), 순도 (RP-HPLC, 숙주 유래 펩타이드, 숙주 유래 DNA), 비활성, 정량 시험을 실시하였다. 제조된 원액은 -20 ℃에 보관하였다.
실시예 5. GF101 반제품의 제조
5-1. 주성분부 제조방법
주성분부의 경우, L-글루타민산, 글리신, 백당, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80 및 주사용수를 비이커에 넣고, 자석식 교반기로 완전히 용해시킨다. 수산화나트륨 용액을 적량 첨가하여 용액의 pH를 4.5 ± 0.5가 되도록 조절하였다.
GF101의 농도가 1 mg/mL가 되도록 GF101 원액에 상기 제조한 부형제 용액을 첨가하여 희석한 후 무균여과를 실시하였다. 유리 바이알에 바이알 당 0.5 mg의 GF101이 되도록 최종 원액을 충전하고, 고무전으로 반밀전하여 동결건조를 실시하였다. 동결건조가 완료되면 고무전을 완전히 밀전시키고, 알루미늄 캡을 씌워 씰링하였다.
GF101 반제품 제조방법에 관한 흐름도는 도 4에 나타내었다.
5-2. 첨부용제부 제조방법
주사용수를 무균여과한 후, 유리 바이알에 0.5 mL 충전량이 되도록 충전한 후 고무전으로 밀전하고 그 위에 알루미늄 캡을 씌워 씰링을 하였다. GF101 첨부용제부 제조방법에 관한 흐름도는 도 5에 나타내었다.
또한, 상기 실시예 1 내지 실시예 5에 기재된 GF101의 제조공정도는 도 6에 나타낸 바와 같다.
실험예 1. GF101 재접힘(리폴딩) 완충액의 효과 확인
본 발명의 GF101 재접힘 완충액의 효과를 확인하기 위해 표 1에 나타낸 조건으로 비교 실험을 수행하였다.
그 결과, 비교예 1 내지 3과 비교하여, 본 발명의 재접힘 완충액에서 BMP2 및 GDF5의 높은 효율의 리폴딩 (재접힘)을 확인하였다 (도 7 및 도 8). 구체적으로, 도 7은 BMP2와 관련하여 비교예 1 내지 3과 비교하여 높은 효율로 재접힘됨을 확인한 것이고, 도 8은 GDF5와 관련하여 비교예 1 내지 3과 비교하여 높은 효율로 재접힘됨을 확인한 것이다.
또한, 아르기닌 (L-arginine)의 농도에 따른 재접힘 효과를 비교한 결과, 본 발명의 재접힘 완충액에서 높은 효율로 리폴딩 (재접힘)됨을 확인하였다 (표 2 및 도 9).
이를 통해, 본 발명에 개시된 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 재접힘 완충액을 이용하면 TGF ß 슈퍼 패밀리인 BMP2 또는 GDF5의 높은 효율의 재접힘 효과를 제공할 수 있다.
이상, 첨부된 도면을 참조로 하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 제한적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (22)
- 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 상기 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 재접힘 완충액과 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 TGF ß슈퍼 패밀리는 BMP2 또는 GDF5인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 BMP2는 서열번호 1의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 GDF5는 서열번호 2의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 재접힘 완충액은 우레아(urea)가 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 재접힘 완충액은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 0.1 내지 1 g/L의 최종 농도로 희석하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 재접힘 완충액과 접촉시키는 단계는 3 내지 20 ℃에서 60 내지 80 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 가용화 이전에 박테리아에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 박테리아는 서열번호 3으로 표시되는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 형질전환된 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 박테리아는 대장균 (E.coli)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 박테리아에서 폴리펩티드를 발현시키는 단계는 효모 추출물, NaCl 및 글리세롤을 포함하는 1차 배지에서 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 배양은 제일인산칼륨 (Potassium phosphate monobasic), 황산마그네슘칠수화물 (Magnesium sulfate heptahydrate), 황산암모늄 (Ammonium sulfate), 글리세롤 (Glycerol) 및 효모 추출물 (Yeast extract)을 포함하는 2차 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 배양은 D-갈락토오스 (D-Galactose)를 포함하는 3차 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 가용화 완충액은 7 내지 9 M 우레아 및 30 내지 60 mM DTT를 포함하고, pH 7.0 내지 9.0인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항의 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 단량체 형태로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재접힘된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드 정제 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 정제는 i) 친화 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
ii) 상기 i) 단계의 결과물에 대해 소수성 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
iii) 상기 ii) 단계의 결과물에 대해 이온성 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 i) 내지 iii) 단계에서 수행되는 크로마토그래피는 평형화 완충용액과 용출 완충용액의 농도구배를 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 i) 단계에서 수행되는 크로마토그래피에서 상기 평형화 완충용액은 pH 5 내지 7이고 40 내지 60 mM 인산나트륨 (sodium phosphate) 및 3 내지 5 M 우레아 (urea)를 포함하며, 상기 용출 완충용액은 pH 5 내지 7이고 40 내지 60 mM 인산나트륨 (sodium phosphate), 3 내지 5 M 우레아 (urea) 및 1 내지 3 M NaCl을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드의 재접힘을 유도하기 위한 재접힘 완충액 조성물로서,
상기 재접힘 완충액은 0.1 내지 1 M 농도의 아르기닌, 0.1 내지 1 M 농도의 CHES, 및 0.5 내지 10 mM 농도의 산화 및 환원된 글루타치온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 TGF β 슈퍼 패밀리는 BMP2 또는 GDF5인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 재접힘 완충액은 우레아(urea)가 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 재접힘 완충액은 가용화된 TGF β 슈퍼 패밀리 폴리펩티드를 0.1 내지 1 g/L의 최종 농도로 희석하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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