JPH08502963A

JPH08502963A - ソマトトロピン修飾物

Info

Publication number: JPH08502963A
Application number: JP6511061A
Authority: JP
Inventors: レアマン，エス・ラス
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-04
Publication date: 1996-04-02
Also published as: ZA936811B; EP0669939A1; MX9306676A; CA2145546A1; AU5142293A; WO1994010200A1

Abstract

(57)【要約】生物活性を失うことなく、高次構造安定性および化学安定性の予想できない向上を供するソマトトロピン修飾物を記載する。これらの特性の改変は、部位特異的突然変異によるソマトトロピンの修飾を介して行う。これらの変化はこれらのタンパク質の保存安定性を向上させる。実施例修飾物には、１９および２０位で、各々、グルタミンのヒスチジンへの置換およびヒスチジンのアルギニンへの置換を有するブタ・ソマトトロピン（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換を有するブタ・ソマトトロピン（Ｆ５２Ｅ）、ならびに１３７位のグルタミン酸のロイシンのグルタミン酸への置換を有するブタ・ソマトトロピン（Ｉ１３７Ｅ）が含まれる。該修飾ソマトトロピンは、動物種の成長特性（例えば、ブタにおける赤肉-脂肪比の増加ならびに雌ウシにおける泌乳の増加）を向上させるのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ソマトトロピン修飾物発明の分野本発明は、非修飾タンパク質に比して安定性の向上を示すソマトトロピンの新規な単一部位または複数部位置換アナログを提供する。発明の背景ソマトトロピン（Ｓtまたは成長ホルモン（ＧＨ）とも呼ばれている）ソマトトロピンは、元来、種々の動物種からの脳下垂体抽出物中に発見された。これらのタンパク質は、約２００個のアミノ酸と２つの分子内ジスルフィド結合を含む単鎖分子である。これらのタンパク質は、炭水化物、脂質または他の補因子を含まないため、それらの分子量は、約２２，０００ダルトンである。数多くの哺乳動物、鳥類および水生動物のソマトトロピンが、それらの構造および生物学的挙動に関してよく特徴付けられている（例えば、ジェイ・エル、コストヨ（Ｊ.Ｌ.Ｋostyo）およびエイ・イィ、ウィルヘミ（Ａ.Ｅ.Ｗilhemi）、メタボリズム（Ｍetabolism）第２５巻：１０５-１２４頁（１９７６年）；オー・ジィ・ピィ、アイザックソン（Ｏ.Ｇ.Ｐ.Ｉsaksson）ら、アニュアル・レビュー・イン・フィジオロジー（Ａnn.Ｒev.Ｐhysiol.）第４７巻：４８３-４９９頁（１９８５年）;エイ・シィ、パラジニ（Ａ.Ｃ.Ｐaladini）ら、シィアールシィ・クリチカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＣrit.Ｒev.Ｂiochem.）第１５巻：２５- ５６頁（１９８３年）参照）。哺乳類のソマトトロピンは、保存された分子であって、アミノ酸配列およびタンパク質構造における類似性が異なった動物種間で認められている。脳下垂体組織から抽出しされた（「天然」）か、または組換え生物から製造させた（「組換え体」）ヒトおよび動物のソマトトロピンは、重要な商業的適用を有する。ヒト成長ホルモンは、思春期前の子供の遅い成長を通常促進させる（（ヒューマン・グロウス・ホルモン（Ｈuman Ｇrowth Ｈormone）エス、ライチ（Ｓ.Ｒaiti）、アール・エイ、トールマン（Ｒ.Ａ.Ｔolman）編;プレナム・プレス（Ｐlenum Ｐress）; ニュー・ヨーク（Ｎew Ｙork）（１９８６年）、第２１節））。雌ウシにおける泌乳を向上させるウシ・ソマトトロピンは、その目的で数カ国で販売されており、米国でも販売が検討されている。ブタ・ソマトトロピン（ｐＳt）およびウシ・ソマトトロピン（ｂＳt）は双方とも、給餌-体重増加比（feed-gain ratio）にほとんど影響せずに、各々の標的動物に対し、赤肉組織比を増加させる。いずれのタンパク質も、ヒトには活性を有さない（ジェイ・シィ、ユスケビッチ（Ｊ .Ｃ.Ｊuskevich）およびシィ・ジィ、ガイヤー（Ｃ.Ｇ.Ｇuyer）サイエンス（Ｓ cience）第２４９巻:８７５-８８４頁（１９９０年）およびジェイ・エル、コストヨ（Ｊ.Ｌ.Ｋostyo）およびエイ・イィ、ウィルヘミ（Ａ.Ｅ.Ｗilhemi）前掲）。これらの化合物を日単位で膨大な数の家畜に投与するのは不便であり、ｐＳ tおよびｂＳtを投与するための持続放出性投薬形態の開発が必要である。デリバリー期間中に該タンパク質が生物活性を維持していることを保証するには、それが高い化学安定性および高次構造安定性を有する必要がある。以前の研究では、持続性デリバリー用の成長ホルモンが、持続性デリバリーを要する要性より低い安定性を有することが示唆されている。本明細書にて開示するのは、直接的または間接的にソマトトロピンを安定化させる置換を該タンパク質に作製することである。これらの各化合物を標的動物において試験し、これが、生物学的に活性で、かつ、商業的性能に達しているかを確認する。構造研究タンパク質は、ペプチド結合により連なったアミノ酸を含有し、直鎖を形成する。しばしば、例えばシステイン残基のごとき複数のスルクヒドリル含有アミノ酸残基が存在すると、これらの化合物の酸化的環化を起こす。膨大な数のペプチド結合ならびに、アルコール、酸、カルボキシアミド、アミン、グアニジン、イミダゾール、インドール、フェノール、スルフィド、ジスルフィドおよびメルカプタン官能基を含有するアミノ酸側鎖のため、化学的または生物学的な因子の作用を通してのタンパク質修飾の強い潜在性がある。加えて、球状タンパク質のタンパク質主鎖は、非常に柔軟なことがよく知られている。しかしながら、該タンパク質は、ランダムポリマーのごとく溶液中で動いているというより、通常は半強固な三次構造物にあてはまる。タンパク質がその三次構造を維持する能力は、高次構造安定性と称される。しばしば、後者の構造は生物活性を維持するのに必須である。これらの場合においては、三次構造の消失がタンパク質分解の一形態である。さらに、タンパク質の化学安定性および高次構造安定性は、相互に関係している。すなわち、タンパク質の共有構造を修飾する反応が高次構造安定性に影響する場合があり、高次構造安定性を変化させる構造変化が、しばしばその逆の様式にて、化学的分解速度する場合がある。しばしばその逆の様式となるソマトトロピンに関しては、数多くの化学的および立体構造的な分解経路が同定されている。例えば、相同性の高い動物ソマトトロピンのアスパラギンのカルボキシアミド側鎖の脱アミノ化、加水分解および転位反応が、１３、４７、１４０および１４８位で（シィ、セッチ（Ｃ.Ｓecchi）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・プロテイン・リサーチ（Ｉnt.Ｊ.Ｐeptide Ｐrotei n Ｒes.）第２８巻：２９８頁（１９８６年）、９９位で（国際出願ＷＯ８７/ ０１７０８）、および１２９位（ウッド，ディー・シー（Ｗood,Ｄ.Ｃ.）ら、ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）、第２６４巻：１４７４１頁（１９８９年）））で見い出されている。５、１２４、１４９および１７９位のメチオニンが、対応するスルホキシドに酸化されることが示された（オウ、カスコーン（Ｏ.Ｃascone）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・プロテイン・リサーチ（Ｉnt.Ｊ.Ｐeptide Ｐrotein Ｒes. ）第１６巻：２９９-３０５頁（１９８０年））。加えて、タンパク質を好適な条件下にてアルカリで処理すると、還元可能な二量体を生成する分子内ジスルフィド架橋ができる。ソマトトロピンにおいては、これらの反応は、主にショートループ（１８１および１８９位）のシステインに含まれるようである。三次構造が消失する条件も明らかにされている。ソマトトロピンの変性は、ｐＨ、塩化グアニジン、尿素および熱での処理の結果として起こる。加えて、部分変性ソマトトロピンは、生物活性がなく、かつ、可溶性凝集種を形成することが示されている（ディ・エヌ、ブレームス（Ｄ.Ｎ.Ｂrems）、バイオケミストリー（Ｂiochem istry）第２７巻：４５４１-４５４６頁（１９８８年））。これらの分解経路の発生を最小限にとどめるために、本発明者らは、標的動物における生物活性は維持するが、個々の分解経路を最小限化することにより該タンパク質を選択的に安定化させる、ソマトトロピンの修飾形態を同定し合成した。これらの化合物は、ソマトトロピンｃＤＮＡにおける核酸置換を生成する部位特異的修飾を用いることにより得られる。次いで、該修飾ｃＤＮＡを宿主生物に形質転換し、該修飾ソマトトロピンを発現させ、精製する。本明細書中で用いる「部位特異的」なる語は、ソマトトロピン一次構造の制御された修飾の工程である。単一部位修飾とは、短断片のソマトトロピン内で１〜３個のアミノ酸残基置換を生成する、ソマトトロピン遺伝子配列における変化である。単一部位置換アナログは、（例えば、４７位におけるアスパラギンの脱アミノ化のような）特異的な分解経路を生じるように設計する。複数部位置換アナログは、ソマトトロピンをさらに安定化するために、該タンパク質中に２個またはそれを超える単一部位置換を合わせ持つ。部位特異的修飾は、化学分解を受ける官能基を直接的に除去するか、もしくは、天然の三次構造の高次構造安定性を強化することによりＳ t安定性を向上させる。加えて、中性ｐＨにおけるタンパク質の溶解性を高めることにより、該タンパク質の化学的安定性および高次構造安定性は間接的に向上される。この付加された溶解性は、該タンパク質をアルカリまたは酸へ暴露する必要性を減じ、それによって、投与中の分解産物の存在が減少する。これらのタンパク質の作用機作が明らかには判明していないため、各ソマトトロピン・アナログの生物活性を測定しなければならない。いくつかの場合においては、分解性の減少を示すソマトトロピン変異型は、商業的な製品として必要とされる必須レベルの生物活性に達していない。例えば、５６位のグルタミン酸のアラニンでの単一部位置換は、給餌-体重増加比によって示されるブタ成長バイオアッセイにおいて、このタンパク質の活性を有意（Ｐ＜０．０５）に低下させる。他の研究室では、１２２位にアスパラギン酸を含有する修飾ｂＳtを産生するトランスジェニック・マウスが、正常マウスと同じ大きさに成長することを見い出している。ｂＳtの１１９位のグリシンの代わりにアルギニンを含有するトランスジェニック・マウスは、矯小体表現型を有する（ダブリュ・ワイ、チェン（Ｗ .Ｙ.Ｃhen.）ら、モレク・エンドクリノル（Ｍolec.Ｅndocrinol.）第５巻：１８４５-１８５２頁（１９９１年））。これらの結果は、Ｓtの一次構造と生物活性との間の関係が複雑であることを明らかに示している。情報の開示ソマトトロピン・アナログとも称される数多くの変異型ソマトトロピンまたは修飾ソマトトロピンが知られている。例えば：国際公開ＷＯ９１/００８７０号には、９６〜１３３残基の間の一次構造の置換により、疎水性構造およびヘリックス構造の安定性が向上し、凝集性が減少したソマトトロピンが開示されている。国際公開ＷＯ９０/０８８２３号には、Ｃ-末端システイン残基の置換による分子間ジスルフィド結合生成の阻害が開示されている。欧州特許公開０３５５４６０号ならびに国際公開ＷＯ９２/０１７８９号およびＷＯ９０/０２７５８号にも、システイン残基の置換による修飾ソマトトロピンが報告されている。国際公開ＷＯ９０/０８１６４号には、ウシ・ソマトトロピンの９９位のアスパラギン残基の置換による、安定性の向上を示すソマトトロピンが開示されている。国際公開ＷＯ８７/０１７０８号には、ウシ・ソマトトロピンの９９位のアスパラギン残基の置換による、脱アミノ化を含む加水分解作用の阻害が開示されている。米国特許第５，１３０，４２２号および５，０８９，４７３号には、９５-１０１領域に位置するアスパラギンをグアニジンに置換することによる、安定性の向上を示すソマトトロピンが開示されている。本出願の出願日より１年未満前に公開された欧州特許第０４８８２７９号には、分子のα-ヘリックス３およびα-ヘリックス２領域にアミノ酸変化を有するソマトトロピン・アナログが開示されている。ガンター，シィ（Ｇanter,Ｃ.）およびプラックタン，エイ（Ｐluckthun,Ａ. ）、バイオケミストリー（Ｂiochemistry）第２９巻:９３９５-９４０２頁（１９９０年）には、アラニンのグリシンへの置換が、グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼの安定性を変化を起こし、かつ、これらの置換の影響がアミノ酸位置に強く依存することが記載されている。ヘクト，エム・エイチ（Ｈecht,Ｍ.Ｈ.）ら、プロテインズ（Ｐroteins）第１巻:４３-４６頁（１９８６年）には、α-ヘリックス領域におけるアラニンのグリシンへの部位特異的置換により、λ-リプレッサータンパク質の熱安定性が向上されたことが記載されている。図面の簡単な説明図１は、ＲＰ-ＨＰＬＣにより分析したrpＳtおよび修飾rpＳtの加速安定性試験の結果を示す。図２-８のデータと共にこのデータは、標準的なタンパク質分析では、特定の安定性向上を同定できるほど感度が十分でないこと示している。（初期ピーク面積比率としての）ピーク面積を時間の関数としてプロットする。ソマトトロピンを炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８に溶解し、これらの分析のために３０℃にて３０日までインキュベートする。rpＳt（○）；Ａ４８Ｐ（□ ）；Ｆ１０３Ｅ（▼）；Ｃ１８１，１８９Ｓ（▽）；Ｎ９９Ｓ（●）。さらなる詳細については、詳細な説明のセクションで記載する。図２は、アルカリ緩衝液中における天然rpＳt（上図）および３０日間後（下図）の分解性分解マップを示す。ピークはＬＣ-ＭＳ（ＬＣ-ＭＳ：液体クロマトグラフィー-質量スペクトロメトリー）を用いて同定する。天然rpＳtの個々のトリプシン分解フラグメントに対応する数を表IVで明らかにする。図２で標識した個々の分解産物（下図）を表Ｖで明らかにする。しかるに、このアプローチは、より詳細でしかも感度の良い化学安定性の評価を可能とする。図３は、アルカリ緩衝液に暴露した後のＭ５Ｓのトリプシン分解マップを示す。このpＳtの修飾形態物を図１に記載のごとくインキュベートする。試料は、ジェイ・ジェイ、ドーアティ（Ｊ.Ｊ.Ｄougherty）ら、（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnalytical Ｂiochemistry）第１９０巻：７-２０頁（１９９０年））により記載されているトリプシン分解マッピングにより分析する。簡単には、この方法は、ソマトトロピンをｐＨ８．３で５℃にて２４時間トリプシンと一緒にインキュベートすることを要する。その分解物をＨＰＬＣによりマッピングする。さらなる詳細については、詳細な説明のセクションに記載する。図４は、アルカリ水溶液に暴露した後のＮ４７Ｄのトリプシン分解地図を示している。インキュベーションおよび分析は、図１および３の脚注にそれぞれ簡単に記載されている。図５は、アルカリ水溶液に暴露した後のＡ４８Ｐのトリプシン分解地図を示している。インキュベーションおよび分析は、図１および３の説明にそれぞれ簡単に記載されている。図６は、アルカリ水溶液に暴露した後のＮ９９Ｓのトリプシン分解地図を示している。インキュベーションおよび分析は、図１および３の説明にそれぞれ簡単に記載されている。図７は、アルカリ水溶液に暴露した後のＣ１８１，１８９Ｓのトリプシン分解地図を示している。インキュベーションおよび分析は、図１および３の説明にそれぞれ簡単に記載されている。発明の概要本発明は、天然ソマトトロピンと同一または類似の生物活性レベルを維持しつつ、該タンパク質の化学安定性および高次構造安定性を向上させる１またはそれを超えるアミノ酸変化を有する修飾ソマトトロピンもしくはソマトトロピン・アナログに関する。本発明の第１の態様は、以下：アミノ酸５位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｍ5Ｓと命名したアナログ）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、アミノ酸１５位に見い出されるバリンのロイシンへの置換（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１１３Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、または１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）、の１個の単一部位置換を該タンパク質中に作製したソマトトロピン・アナログに関する。さらに詳細には、本発明は、ブタまたはウシ・ソマトトロピン・アナログ、特に詳細には、前記のうちの１個の置換を有するブタ・ソマトトロピン・アナログに関する。本発明の第２の態様は、２またはそれを超える以下：５位のメチオニンのセリンへの置換（Ｍ５Ｓ）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、１５位のバリンのロイシンへの置換（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、９９位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ９９Ｓ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１２５位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｒ１２５Ｓ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１３７Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）、または１８１および１８９位のシステインのセリンへの置換（Ｃ１８１，１８９Ｓ）、の単一部位置換をソマトトロピン・タンパク質中に有する複数部位ソマトトロピン・アナログに関する。特に、本発明のこの態様は、ソマトトロピン・タンパク質中に以下：（ａ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；（ｂ）Ａ４８Ｐ、Ｎ９９Ｓ、Ｃ１８１，１８９Ｓ；（ｃ）Ｆ５２Ｅ、Ｇ８８Ｅ、Ｆ１０３Ｅ、Ｉ１３７Ｅ；（ｄ）Ｖ１５Ｌ、Ｑ１９Ｈ、Ｈ２０Ｒ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；（ｅ）Ｎ１３Ｓ、Ｗ８６Ｆ、Ｑ１４０Ｓ、Ｎ１４８Ｓ、Ｍ１２４Ｌ、Ｍ１７９Ｌ；および（ｆ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ、Ｎ９９Ｓ、Ｆ１０３Ｅ、Ｃ１８１，１８９Ｓの複数部位置換を作製したソマトトロピン・アナログに関する。さらに詳細には、本発明は、前記した複数部位置換を有するブタまたはウシ・ソマトトロピン・アナログ、最も特には、ブタ・ソマトトロピン・アナログに関する。また、本発明のさらなる態様は、本発明の１個のソマトトロピン・アナログをコードするｃＤＮＡよりなる発現プラスミドにも関する。本発明の第３の態様は、本発明のブタまたはウシ・ソマトトロピンをコードするｃＤＮＡよりなる発現プラスミドで形質転換した宿主細胞に関する。本発明のさらなる態様は、動物の成長を促進する方法、雌ウシにおける泌乳を増加させる方法、およびブタにおける赤肉-脂肪比を増加させる方法に関するものであって、本発明の各方法は、有効量の前記の単一部位または複数部位アミノ酸置換を有するソマトトロピンアナログを該動物に投与することよりなる。特に、本発明の１方法は、以下：アミノ酸５位のメチオニンのセリンへの置換（Ｍ5Ｓと命名したアナログ）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、アミノ酸１５位のバリンのロイシンへの置換（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１３７Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、または１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）、のソマトトロピンのアミノ酸配列に１個の単一部位置換を有する有効量のソマトトロピンを動物に投与することよりなる。本発明のさらなる方法は、以下：アミノ酸５位のメチオニンのセリンへの置換（Ｍ5Ｓと命名した）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、１５位のバリンのロイシンへの置換（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９９位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ９９Ｓ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｒ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１２５位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｒ１２５Ｓ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１３７Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）、または１８１および１８９位のシステインのセリンへの置換（Ｃ１８１，１８９Ｓ）の２またはそれを超える置換を有する複数部位ソマトトロピンを有効量、動物に投与することを特徴とする。さらに特には、本発明の方法のこの態様は、以下：（ａ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；（ｂ）Ａ４８Ｐ、Ｎ９９Ｓ、Ｃ１８１，１８９Ｓ；（ｃ）Ｆ５２Ｅ、Ｇ８８Ｅ、Ｆ１０３Ｅ、Ｉ１３７Ｅ；（ｄ）Ｖ１５Ｌ、Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；（ｅ）Ｎ１３Ｓ、Ｗ８６Ｆ、Ｑ１４０Ｓ、Ｎ１４８Ｓ、Ｎ１４８Ｓ、Ｍ１２４Ｌ、Ｍ１７９Ｌ；および（ｆ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ、Ｎ９９Ｓ、Ｆ１０３Ｅ、Ｃ１８１，１８９Ｓ、よりなる群から選択される複数部位置換を有するソマトトロピンを有効量、動物に投与することからなる。発明の詳細な説明本発明は、天然の下垂体またはソマトトロピン由来の組換え体に比して高次安定性および化学安定性の向上を示すソマトトロピン修飾物を開示する。この特徴を満たす単一部位修飾としては、例えば、Ｍ５Ｓ、Ｖ１５Ｌ、Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ、Ａ４８Ｐ、Ｇ４０Ｅ、Ｎ４７Ｄ、Ｆ５２Ｅ、Ｇ８８Ｅ、Ｆ１０３Ｅ、Ｉ１３７ＥおよびＲ１２５Ｓが含まれる。この特徴を満たし、複数部位アナログとして含まれるさらなる修飾としては、例えば、Ｎ９９Ｓ、Ｃ１８１，１８９Ｓが含まれる。この簡略表示法は、例えば、Ｍ５Ｓでは、ｒｐＳt一次構造の５位のメチオニンがセリンで置換されることを示す。配列番号：１は、ブタから単離したpＳtの一次構造を示す。ｐＳt活性を有する他の密接に関連するソマトトロピンも、遺伝子的多表現型により同定した。相同的なソマトトロピンのこれら変化およびわずかに変化した構造のため、一次構造の番号付けおよび特定残基に微小な変動が文献的に見い出される。化学活性および生物学的活性試験において単一部位および複数部位アミノ酸置換ソマトトロピンを特徴付けることにより、ソマトトロピン安定性を向上させる特定のタンパク質修飾の同定を行った。該タンパク質の全体的な安定性の向上に用いたストラテジーには：（i）ソマトトロピンの高次構造安定性を向上させる該タンパク質の一次構造の修飾、および/または（ii）ソマトトロピンの分解に含まれると知られているソマトトロピン残基の特定の削除、および/または（iii）中性水溶液培媒質中でソマトトロピンを操作できるような該タンパク質一次構造の修飾、が含まれる。また、このストラテジーは、ソマトトロピンが分解される傾向がかなり低いであろう条件下にてすぐにでも修飾、保存および製剤化できるため、間接的に該タンパク質を安定化できる。以下のリストは、前記した三原理の１つに従って該タンパク質の安定性の向上が予想されるアミノ酸残基置換を詳細に記載している：５位のメチオニンの置換。この分解部位を除去し、タンパク質の溶解性を上昇させるであろう適当なアミノ酸置換は、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、プロリンおよびスレオニンである。１３位のアスパラギンの置換。この加水分解部位を除去するであろう適当なアミノ酸置換は、セリン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、アラニンおよびヒスチジンである。１５位のバリンの置換。バリンおよびイソロイシンは、この部位におけるソマトトロピンの高次構造安定性を最強化するであろう。１９位のヒスチジンのグルタミンへの置換および２０位のアルギニンのヒスチジンへの置換は、この分解部位を変化するであろう。４０位のグリシンの置換。主鎖の高次的な柔軟性が除去されるであろう適当なアミノ酸置換は、チロシン、プロリン、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンである。４７位のアスパラギンの置換。アスパラギン酸およびグルタミンは、この部位における加水分解を低下させるのに適している。４８位のプロリンのアラニンへの置換は、分子の主鎖の高次構造安定性を向上するであろう。５２位のフェニルアラニンの置換。該タンパク質の水溶性を高めるであろう適当なアミノ酸置換は、グルタミン酸、アラニン、グリシン、チロシン、プロリン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンである。６３位のグリシンの置換。該タンパク質主鎖の高次構造安定性を向上するであろう適当なアミノ酸としては、アスパラギン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、プロリン、チロシンおよびアラニンが含まれる。８６位のトリプトファンの置換。実質的に該タンパク質内部の親水性を高めることなく、この分解部位が除去されるであろう適当なアミノ酸置換には、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンが含まれる。８８位のグリシンの置換。グルタミン酸およびアスパラギン酸は、この部位における該タンパク質の高次構造安定性を強化するであろう。９８位のスレオニンの置換。該タンパク質の全体的な溶解性を維持しつつ残基９９付近の二次分解反応が除去されると予想される適当なアミノ酸には、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが含まれる。９９位のセリンのアスパラギンへの置換は、該分子の安定性を向上させることが知られている。１００位のセリンの置換。該タンパク質の全体的な溶解性を維持しつつ、残基９９付近の二次分解反応が除去されると予想される適当なアミノ酸には、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが含まれる。１０３位のフェニルアラニンの置換。該タンパク質の水溶性を高めるであろう適当なアミノ酸置換には、グルタミン酸、アラニン、グリシン、チロシン、プロリン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが含まれる。１２４位のメチオニンの置換。この残基の酸化的分解が除去されるであろう適当なアミノ酸には、ロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。また、１２５位のアルギニンのセリンでの置換も、該分子の安定性を向上することが知られている。１３７位のイソロイシンの置換。ｒｐＳtの水溶性を高めるであろう適当なアミノ酸置換には、グルタミン酸、アラニン、グリシン、チロシン、プロリン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが含まれる。１４０位のグルタミンの置換。この部位における脱アミノ化が除去されるであろう適当なアミノ酸置換は、セリン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびスレオニンである。１４８位のアスパラギンの置換。この部位における脱アミノ化が除去されるであろう適当なアミノ酸は、セリン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミンおよびスレオニンである。１７９位のメチオニンの置換。この残基における酸化的分解が除去されるであろう適当なアミノ酸置換には、ロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、セリンおよびスレオニンが含まれる。また、１８１および１８９位のセリンのシステイン残基への置換も、該分子の安定性を向上させることが知られている。前記に概説したストラテジーは、当業者なら難無く用いることができ、本発明のさらなる修飾ソマトトロピンを容易に特徴付けることができる。標的動物における生物活性を維持しつつ、ソマトトロピンの化学安定性および高次構造安定性を向上させることに焦点を当てたこれらの実験では、以下にさらに詳記する化学的および高次構造的な試験方法により、最初に本発明の修飾ソマトトロピンを特徴付ける。かくして、本明細書中で記載した安定性または高次構造試験の１つにおいて、（天然ソマトトロピンに比して）向上を一般的に示すソマトトロピンがイン・ビボ生物アッセイの候補となる。幾分かの程度の生物活性の減少は、向上した安定性により得られた利点により、部分的に許容できることは予想される。好ましい修飾は、化学安定性および/または高次構造安定性ならびに宿主動物種における生物活性の双方を向上する。修飾ソマトトロピンの合成これらの化合物は、天然アミノ酸残基の置換をコードするｃＤＮＡを用いた選択的な部位特異的突然変異を介して合成する。部位特異的突然変異は、組換え技術の分野でよく知られた技術である。ＤＮＡ配列中に特異的な変化を導入するために、いくつかの部位特異的突然変異技術が開発され、本発明の化合物を作製するのに用いることができる（クレイマー，イィ・ダブリュ（Ｋramer,Ｅ.Ｗ.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）第１２巻：９４４１-５６頁（１９８４年）；マンデッキ，ダブリュ（Ｍandecki,Ｗ.）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエー（ＰＮＡＳＵＳＡ）第８３巻:７１７７-８１頁（１９８６年）;ゾラー，エム・ジェイ（Ｚo llar,Ｍ.Ｊ.）およびスミス，エム（Ｓmith,Ｍ.）、ヌクレイック・アッシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids.Ｒes.）第１０巻：６４８７-６５００頁（１９８２年）；ノルランダー，ジェイ（Ｎorrander,Ｊ.）ら、ジーン（Ｇene）第２６巻：１０１-１０６頁（１９８３年）；クンケル，ティ・エイ（Ｋunkel,Ｔ.Ａ.）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（ＰＮＡＳＵＳＡ）第８２巻：４８８-９２頁（１９８５年）；スコルド，エイ（Ｓchold,Ａ.）ら、ディ・エヌ・エイ（ＤＮＡ）第３巻：４６９-７７頁（１９８４年）；およびマロッティ，ケイ・エム（Ｍarotti，Ｋ．Ｍ．）およびトミック，シィーエス・シィ（Ｔomich Ｃ-Ｓ.Ｃ.）、ジーン・アナリシス・テクニックス（Ｇene Ａnal .Ｔech.）第６巻：６７-７０頁（１９８９年））。突然変異反応用の１個のプライマーと、遺伝子３２タンパク質とのみを用いて突然変異効率を上げるマロッティ（Ｍarotti ）およびトミック（Ｔomich）のプライマー特異的突然変異は、著者が記載した通り行うか、あるいは、弱冠変形して行う。１つの変形は、突然変異反応に長鎖突然変異性オリゴヌクレオチド（約４０塩基）に用い、短鎖オリゴヌクレオチド（＜２０塩基）を用いて候補をスクリーニングすることである。プロトコルの他の変形は、ＢＨＭ７１-１８mutＳ::Ｔn１０またはＢＳＴ-１ｃのいずれかへの変異反応を形質転換し、該コロニーを一緒に集めることにより該コロニーを保存し、ベクターＤＮＡを単離し、ＢＳＴ-１ｃまたはＭＣ１０６１のいずれかに再形質転換することである。初期の形質転換収率が低い場合には、エレクトロポレーションを用いる。該ＭＣ１０６１およびＢＳＴ-１ｃ培養系に通じる方法は、国際公開ＷＯ８８/０６１８６号に詳細に記載されている。ＢＳＴ-１ｃは、ノザン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎothern Ｒegional Ｒesearch Ｃenter ）、イリノイ州、ペオリア（Ｐeoria，ＩＬ）のアグリカルチュアル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａgricultural Ｒesearch Ｓervice Ｃulture Ｃollection）から受託番号ＮＲＲＬＢ-１８３０３で入手できる。ＭＣ１０６１は、クロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃlontech Ｌaboratories，Ｉnc．）、カリフォルニァ州、パロ・アルト（Ｐalo Ａlto，ＣＡ．）から購入する。ＢＨＭ７１-１８ mutＳ::Ｔn１０は、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社（Ｂoehringer ＭannheimＢiochemicals）、インディアナ州、インディアナポリス（Ｉndianapolis，ＩＮ）から、サイト・ディレクティッド・ミュータジェネシス・キット（カタログ番号１０２７-４９２）の一部分として購入する。本発明の修飾ソマトトロピン作製に用いるプライマー中で、（同一のアミノ酸をコードする）他のトリプレットである遺伝子コードの変性となるよう、置換できることは当業者に明らかである。本発明の開示に教示に従うことにより、前記したのと同様な化学的および/または物理的特性を有し、かつ前記したアミノ酸位で置換されたさらなるアミノ酸残基を、同一もしくは同様な生物物理学的および/または生物的な向上を得るために、ソマトトロピン分子中で容易に置換できることも当業者には明らかである。例えば、５位のメチオニンは、本発明の範囲内で、セリンで置換できるが、セリンに化学構造が類似した他のアミノ酸（たとえば、スレオニン、アラニン等）でも、該タンパク質の三次構造を乱すことなく同様の利点を作り出すであろう。異なった種から同定したソマトトロピンは、アミノ酸配列および物理学的構造において本質的に相同であることは当業者なら理解できる。実施例に記載した配列変化をｐＳｔ内に作製したが、該技術は、変換に利用できる必須のアミノ酸残基を有するいずれのソマトトロピン、特に哺乳動物のソマトトロピンにも等しく適用できる。ブタ以外の種のアミノ酸配列および/または核酸配列は、当業者によく知られている。これらの試験に用いたブタ・ソマトトロピン遺伝子（ＰＳt１）は、アップジョン・カンパニー社（Ｕpjohn Ｃompany）で構築されたブタ下垂体ｃＤＮＡライブラリーから単離したものであって、国際公開ＷＯ８８/０６１８６号に記載されている。ｐＳt遺伝子の発現に用いるｐＵＲＡプラスミドは、国際公開ＷＯ８８/０６１８６号に記載されている。該ベクターは、ＷＯ９０/０５１８６号記載のセラチア・マルセッセンス（Ｓerratia marcescens）のtrpプロモーターならびに前掲のカリ（Ｃurry）およびトミック（Ｔomich）により記載されているＣonＳＤリボソーム結合部位を含有するよう修飾されている。イー・コリ（Ｅ． coli）菌株および本発明のソマトトロピン・アナログの発現に好ましい宿主は、ＢＳＴ-１ｃである。修飾ブタ遺伝子を含有する形質転換細胞は、１０リットルスケールで増殖させる。発酵後に、該細胞を遠心し、国際公開ＷＯ８７/００２０４号記載の方法のベンチスケール変法を用いて、修飾ブタソマトトロピンを単離する。一旦単離したら、定量性トリプシン分解地図（ジェイ・ジェイ、ドーアティー（Ｊ.Ｊ.Ｄougherty）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnalytical Ｂiochemistry）第１９０巻：７-２０頁（１９９０年））を用いることにより、該ソマトトロピン・アナログの構造を確認する。この試験において用いたトリプシンは、標品（ワーシントン・バイオケミカル社（Ｗorthington Ｂiochemical ）、ニュー・ジャージー州、フリーホールド（Ｆreehold，ＮＪ））に混入しうるキモトリプシンを不可逆的に阻害するためにＴＰＣＫ（１-トシルアミド-２- フェニルエチルクロロエチルケトン）で予め処理する。この酵素を、ＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラフィーを介してさらに精製する。簡単には、分解物の形成には、１ｍＭのＮａＯＨ（７ｍｌ）中に溶解させた（２ｍｇの）ソマトトロピンおよび１ＭのＴris、１０ｍＭのＣaＣｌ₂、ｐＨ８.３（１ｍｌ）、５℃にてのインキュベーションを要する。その反応混合物を５℃にて２４時間インキュベートし、０.１ｍｌの１０％トリフルオロ酢酸でクエンチする。この方法で調製したトリプシン分解物を、Ｃ８カラム（４.６mm ＩＤ×２５ｃｍ、５μm、３００Åポア；レジス・ケム社（Ｒegis Ｃhem.）、イリノイ州、モートン・グローブ（Ｍort on Ｇrove，ＩＬ））を用いる前記ＨＰＬＣ上でクロマトグラフィーに付す。クロマトグラフィー用の溶液は：Ａ-水中の０.１％のＴＦＡＮ、Ｂ-７０％のＣＨ₃ ＣＮ/０.０７％のＴＦＡである。注射後に、該カラムを１％のＢで５分間溶出し、１％のＢから６４.３％のＢのグラジエントを用いて１２０分間クロマトグラフする。流速は、１.２ｍｌ/分である。該カラムの溶出は、カラム温度４０℃にて２１４nmでモニターする。ＨＰＬＣ分析の溶出プロフィールの再現性および解析能力によって、野生型ソマトトロピン由来のものとは異なるリテンションタイムであるいずれのトリプシン分解フラグメントを分離し単離することは一般的に容易である。この領域のペプチド配列は、質量分析またはＮＨ₂-末端配列解析のいずれかにより確認できる。タンパク質純度は、ＲＰ-およびＳＥＣ-ＨＰＬＣならびに等電点電気泳動を用いて測定する。これらの技術は、当業者によく知られている。ソマトトロピン濃度は、１５，２７０Ｍ^-1の吸光係数を用いた２７８nmでの吸収により測定する（バーガー，エイチ・ジイ（Ｂurger,Ｈ.Ｇ.）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）第２４１巻：４４９-４５７頁（１９６６年））。相対高次構造安定性の測定これらの部位特異的突然変異の修飾が該タンパク質の高次構造安定性を向上させることの証明は、以前に記載されている（ハベル，エイチ・エイ（Ｈavel,Ｈ. Ａ.）ら、バイオケミストリー（Ｂiochemistry）第２５巻：６５３３-６５３８頁（１９８６年）；ブレームス，ディイ・エヌ（Ｂrems,Ｄ.Ｎ.）ら、バイオケミストリー（Ｂiochemstry）第２５巻：６５３９-６５４３頁（１９８６年）；ブレームス，ディ・エヌ（Ｂrems,Ｄ.Ｎ.）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）第２６２巻：２５９０-２５９６頁（１９８７年）；ブレームス，ディイ・エヌ（Ｂrems,Ｄ.Ｎ.）ら、バイオケミストリー（Ｂiochemistry ）第２４巻：７６６２-７６６８頁（１９８５年））のごとく平衡変性曲線により測定する。平衡変性分析で用いる緩衝液は、５０ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃、ｐＨ８ .５のストック溶液である。適当なタンパク質および変性物の濃度までの一連の試料の希釈は、ストック溶液緩衝液および８．０Ｍのグアニジン-ＨＣｌを用いて行う。該ストック変性溶液および緩衝液溶液は、用いる前に０.４５μｍのディスポーザブル・フィルター（コーニング社（Ｃorning Ｉnc．）、ニューヨーク州、コーニング（Ｃorning，Ｎ．Ｙ．））を通して濾過する。ストック溶液および調製試料は４℃にて保存する。分光分析の前に、試料を数時間室温に平衡化させる。タンパク質濃度は、色素結合法（ビシンコニン酸法）を用い測定する。この方法は、スミス，ピィ（Ｓmith,Ｐ．）らにより記載されている（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnal.Ｂiochem.））。蛍光測定は、フォトン-カウンティング・スペクトロフルオリメーター（ＳＬＭ・インスツルメンツ社（ＳＬＭＩnsturuments，Ｉnc．）、イリノイ州、アーバナ（Ｕrbana，ＩＬ））で行う。スペクトルは、２９５nmで励起させた後の３５５nmのタンパク質の放射をモニターすることにより得る。第２の誘導体のＵＶ吸収測定は、スキャニング・アレイ・スペクトロメーター（アビブ・アソシエーツ社（Ａviv Ａssociates）、ニュージャージー州、レークウッド（Ｌakewood, Ｎ.Ｊ.））およびダイオードーアレイ・スペクトロメーター（ヒューレット・パッカード・サイエンティフィック・インスツルメンツ社（Ｈewlett Ｐackard Ｓ cientificＩnsturuments）、カリフォルニア州、パロ・アルト（Ｐalo Ａlto,ＣＡ.））上で行う。吸収スペクトルは、２８０〜３００nmの間で得る。その後のデータ処理は、各々の販売者のソフトウェアに適応させたアルゴリズムを用いて行う。円二色性（ＣＤ）測定は、ＪＡＳＣＯ５００Ｃおよび７００シリーズ・スペクトロポラリメーター（日本光学株式会社（Ｊapan Ｓpectroscopic Ｃompany）、東京、日本（Ｔokyo，Ｊapan））上で行う。近紫外線（２７５ないし３２５nm ）および遠紫外線（２２６ないし２１８nm）のデータを分析に得る。（ミリdegの）楕円率単位で得たこの技術からの生データは、等式：［θ］＝（θ_obs・ＭＲＷ）/（１００・ｌ・ｃ）を用いた平均残基楕円率（deg・cm²/dmol）で表す（式中、θ_obsおよび［θ］は楕円率および平均残基楕円率、ＭＲＷは平均残基分子量（ｇ/モル・残基の単位で１１５）、ｌは光路長で、ｃはグラム/ミリリットルでのタンパク質濃度）。前記で論じた各技術からのデータの非線形最小二乗法および他の分析は、シグマプロット４．１（ジャンデル・サイエンティフィック社（Ｊandel Ｓcientifi c）、カリフォルニア州、コルト・マデラ（Ｃorte Ｍadera, ＣＡ））を用いて行う。各技術からの平衡データの解析は、タンパク質折りたたみの２つの状態機構：天然（折りたたまれた状態）≒変性（折りたたみを解いた状態）（式中、変性体の分離濃度での検出可能なパラメーターの分光測定は、シグモイド型変性曲線となる）。ペース，シー・エヌ（Ｐace,Ｃ.Ｎ.）、（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethods in Ｅnzymology）第１３１巻：２６６-２８０頁（１９８６年））により記載されているこの分析は、評価可能な濃度において、中間体を含有しない折りたたまれた状態から折りたたみを解いた状態への転移は中間体を含有しないことを想定する。相対化学安定性の測定ソマトトロピン（２ｍｇ/ｍｌ）を０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８に溶解する。そのバイアルに蓋をし、オーブン中に置いて３０℃にて３０日目までインキュベートする。日毎のアリコットを採取し、分析する前に-２０℃にて保存する。アリコット（２０μｌ）を、4.6mm ID×25cm Ｃ₄カラム（セプ/アラ/ションズ・グループ（（Ｔhe Ｓep/ara/tions Ｇroup）、カリフォルニア州、カリフォルニア州（Ｈesperia，ＣＡ））上にＵＶ検出器を有するツイン・ポンプ式逆層ＨＰＬＣ（ミリポア社（Ｍillipore）、マサチューセッツ州、ミルフォード（Ｍil ford，ＣＡ））を用いて分析する。グジエント条件は、１ｍｌ/分の流速設定で、１分間に１％の比率で４０％〜７０％のＣＨ₃ＣＮ/０．１％のＴＦＡである。カラム溶出は、２１４nmでモニターする。該カラム温度は２５℃である。化学安定性の相違を識別するＲＰ-ＨＰＣＬ能力は、出発物質から全ての不純物を分離するクロマトグラフィー系の能力に依存する。かくして、この技術では化学安定性の向上を測定することが不可能なため、該化合物がより優れた安定性を有する証明とはならない。さらに詳細な分子特徴付けが提供できるため、個々のフラグメントの質量分析とトリプシン分解マッピングとの組み合わせは、さらに信頼できる。トリプシン分解マッピングは、前記のごとく行う。相対溶解性の測定タンパク質を、５０ｍｇ/ｍｆのタンパク質濃度にて、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８中に溶解する。要すれば、該ｐＨを５０％のＮａＯＨで調整する。濾過した後に、２５０μｌのアリコットをくみ出し、透析に付する。マイクロ透析は、（６０００-８０００分子量をカットオフする）希釈膜を密着させた低容量チャンバーにて行う。このユニットを、１リットルの０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８を含有する容器に接続する。さらに、２番目のユニットを０．０４Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する容器に接続する。ミニパルス（Ｍiniplus）２ペリスタリックポンプ（ギルソン社（Ｇilson）、ワイオミング州、ミドルトン（Ｍiddleton，ＷＩ））を用いて、流速３０ｍｌ/時間にて、緩衝液を希釈ユニットを通してくみ出す。試料を５℃にて２０時間透析する。次いで、該透析試料ならびに出発物質を、エッペンドルフ５４１５遠心分離機（ブリンクマン・インスツルメンツ社（Brinkman Instruments）、イリノイ州、デス・プレインズ（ＤesPlaines，ＩＬ））中で１３，０００rpmにて６分間遠心する。その上清液体のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用いて定量する（ピアス・ケミカル社（ＰierceＣhemical Company）、イリノイ州、ロックフォード（Ｒockford，ＩＬ）；ピィ・ケイ、スミス（Ｐ.Ｋ.Ｓmith）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnal．Ｂiochem．）第１５０巻：７６−８５頁（１９８５年））。相対生物活性の測定本発明の化合物は、反復投与した後に下垂体切除ラットおよび標的種の成育を測定することにより生物活性を試験できる。下垂体切除ラット成育アッセイは、ソマトトロピン相対潜在性の相対的に迅速な測定を得るのに適当な方法として、当業者により一般的に認識されている。本発明の修飾ソマトトロピンは、エバンス，エイチ・エム（Ｅvans,Ｈ.Ｍ.）およびロング，ジェイ・エイ（Ｌong Ｊ.Ａ.）、（Ａnat.Ｒec.）第２１巻：６１頁（１９２１）およびエム・ディイ、グローズベック（Ｍ.Ｄ.Ｇroesbeck）およびエイ・エフ、パーロウ（Ａ.Ｆ.Ｐarlow）、エンドクライノロジー（Ｅndocrinol ogy）第１２０巻：２５８２-２５９０頁（１９８７年）の方法に従い、下垂体切除ラットを用いてスクリーニングする。簡単には、ソマトトロピンを２、１０、５０および２５０μｇ/ラット-日の投与量で８匹の下垂体切除ラットに皮下注射してアッセイの一次線形を測定する。該修飾ソマトトロピンは、１５および６０ μｇ/ｍｌで試験する。該ラットの体重は、初日から最後の注射後のその日まで毎日測定する。全体重の相対増加は、ソマトトロピンの天然形態と併せて、本発明の種々の修飾ソマトトロピンと、天然ソマトトロピンおよび/または組換えソマトトロピンを陽性対象として記録する。各アナログの相対生物能力をラット成長アッセイで測定しつつ、標的種の活性はこれらのソマトトロピンの商業的な能力で主に決定する。ほとんどの動物種において、該化合物の相対生物活性を測定するのに適当であり感度が良いものとして、アッセイは当該分野で知られている。さらに、当業者なら、標的種用のアッセイを容易に設計できるであろう。例えば、本発明の修飾ソマトトロピンの生物活性は、ヨークシャー・ブタを用いたブタ成長アッセイを用いて測定できる。この方法においては、４８匹の雌ブタおよび去勢ブタを体重で振り分け、各６匹の檻の４ブロックにランダムに割り当てる。各檻には、２匹の雌ブタと２匹の去勢ブタが入れられた。処理はブロック内の檻にランダムに割り当てた。この試験の後に、該動物を７日間放置に順応させる。次いで、それらを６０μｇ/ｋｇ/日の比率のソマトトロピンまたは修飾ソマトトロピンで、１４日間注射する。陽性対照には、組換えｒｐＳtを投与する。処理前体重を、実験の１、１５および２２日目に測定した処理後体重と比較する。本発明の化合物の用途本発明の化合物は、天然ソマトトロピンが成長関連生物活性を有することを示す種における、成長特性を促進するのに用いることができる。加えて、成長ホルモンはそのアミノ酸配列において大変類似しているため、１種由来のホルモンは早期に他の動物種の成長を促進することができる。適当なところにおいて、本発明の化合物は、この方法の用途にも適する。一般的に、子ウシおよびブタのごとき高度に進化していない種のソマトトロピンは、ヒトのごときより高度に進化した種において機能することは見い出されていない。本発明の化合物の動物への投与は、必要な用量を動物の循環系に効率的にデリバリーするいずれの経路を用いる公知方法に従って行う。投与の様式には、選択した種に典型的に適用されているものが含まれる。タンパク質は、一般的に、該分解系の分解に感受的であるため、注射は筋肉内または皮下経路を介するのが好ましい。徐放性もしくは長期放出性製剤または移植の用途も適した様式である。一般的に、徐放性製剤の注射が好ましい。有効量範囲は、動物ならびに処理する動物の年齢、体重および一般健康状態に依存する。投与する種への有効量範囲を決定するのに必要なこれらおよび他のパラメーターは、まさに当業者の視野の範囲である。例えば、ウシにおいては、該有効量は１．０ないし２００ｍｇ/動物/日の範囲である。ブタにおいては、例えば、該有効量は約６０μｇ/ｋｇ/日である。非ヒト動物における本発明の化合物の商業的用途の潜在性は、動物の代謝のそれら向上性に由来する。かくして、有効量の本発明のアナログのブタへの投与により、短期間にブタを脂肪を少なく成長し、そのように成長する食餌を要しない。さらに、有効量の本発明のウシ・アナログの有効量の投与により、乳牛のごとき泌乳動物となり、同一またはより少ない食餌量で多い牛乳を産生する。定義本発明の化合物は、置換基および天然物ならびに置換アミノ酸の位置を示す一連の文字-番号-文字を用いて定義される。この一連の文字は、アミノ酸を示す許容された単一文字記号に従う。単一文字記号およびそれに対応するアミノ酸をチャート１に示す。この命名法を用いて、最初の文字（Ｘ--）は、野生型ソマトトロピンに見い出された天然アミノ酸を示し；２番目の文字（--Ｘ）は、アナログ中で置換されたアミノ酸を示す。番号数字（-０-）は、天然ブタ・ソマトトロピン中のアミノ酸の一連の位置を示す。かくして、Ｖ１５Ｌとは、天然ブタソマトトロピンの１５位に見い出されるバリン残基の代わりにロイシンで置換した本発明のソマトトロピン・アナログを示し、Ａ４８Ｐとは天然ブタ・ソマトトロピンの４８位のアラニンの代わりにプロリンへの置換を有する本発明のソマトトロピン・アナログを示す。「動物」とは、ヒトおよび非ヒト動物の双方を意味する。「有効量」とは、標的動物おいて所望の生物学的効果を付与する、本発明の修飾ソマトトロピンの量である。「有効量」とは、効能用量を達成または維持するのに投与すべきるかかる用量ごとき効能ならびに期間の投与量レベルを包含する。「微生物」とは、細菌、酵母、アクチノマイセスならびに細胞培養で増殖させた高等植物および動物からの単細胞のごとき、単細胞原核生物および真核生物を包含する。「単一部位」とは、ソマトトロピン・タンパク質の短鎖フラグメント中で、１ないし３アミノ酸残基の置換となる、ソマトトロピン遺伝子配列中の単一または複数の変化を意味する。かくして、例えば、アナログＡ４８ＰおよびＱ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒは、単一部位置換を示す。「複数部位」置換またはアナログは、さらに所望の特性を向上させるために、２個またはそれを超える単一部位置換を個々のタンパク質に合わせ持つものである。この命名法に従えば、アナログＶ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ、Ｎ９９Ｓ、Ｆ１０３Ｅ、Ｃ１８１，１８９Ｓは複数部位修飾ソマトトロピンを示す。「天然」ソマトトロピンとは、該分子の自然に生成する形態と同一のアミ酸配列を有するソマトトロピンを意味する。天然ソマトトロピンは、天然起源または組換え体起源から由来し得る。ソマトトロピンの分子異種性のため、種々のソマトトロピンのアミノ酸残基の位番号は異なる場合がある。天然ソマトトロピンなる語は、これらの自然に発生する種を包含する。配列番号：１は、ブタ・ソマトトロピン（ｐＳt）の１種を図示している。他のソマトトロピンの番号は異なり得る。しかしながら、配列番号：１においてアミノ酸番号付け１５、４８、５２、８８、９９および１２５を用いることは、当業者なら容易に他の天然ソマトトロピンまたはこれらソマトトロピンの修飾形態中の相当するアミノ酸を位置付けして、本発明のソマトトロピンの所望の高次構造および化学安定性の向上を達成できる。「ソマトトロピン」または「Ｓt」とは、動物のソマトトロピンを意味し、下垂体組織（「天然ソマトトロピン」）、あるいは、組換え遺伝子技術により形質転換してソマトトロピンの天然に生成する形態または修飾した形態（「組換えソマトトロピン」）を生成する微生物からのソマトトロピンを包含する。（ブタ起源のソマトトロピン（ブタ・ソマトトロピンまたはｐＳt）のごとく）特定の哺乳動物起源を命名する場合にも、該ソマトトロピンは、下垂体起源または形質転換微生物からのものを包含する。本発明の新規化合物およびその種々の具体物を生成するのに用いる多くの方法には、組換えＤＮＡ工学に関連する標準的な研究室的技術が含まれる。かかる技術は、当業者の公知であるか、または、標準的な研究室的テキストを参照することにより容易に得られる。かかるテキストの例は：ジェイ、ミラー（Ｊ.Ｍiller ）、「分子遺伝学における実験（Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory ）、ニュー・ヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈar bor，Ｎ．Ｙ．）（１９７２年）；ディ・エイ、モリソン（Ｄ.Ａ.Ｍorrison）、「凍結乾燥によるコンピテント・セルの形質転換および保存（Ｔransformation and Ｐreservation ofＣompetent Ｂacterial Ｃells by Ｆreezing）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethods Ｅnzymol．）第６８巻：３２６-３３１頁（１９７９年）；および、サムブルック，ジェイ（Ｓambrook，Ｊ．）ら、「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍolecular Ｃloning ＡＬaboratory Ｍanual．）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
（Ｃ old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress）（１９８９年）である。特記する以外は、用いるすべての化学物質および物質、もしくは、それらの相当物は、商業的販売業者から容易に入手できる。本発明の化合物およびそれらの用途は、以下の具体例の方法によりさらに十分に理解できる。これらの具体例は、決して明細書および請求の範囲を限定するよう解釈されるべきではない。前記した明細書および請求の範囲において、引用した参考刊行物のすべての内容を出典明示して本明細書の一部とする。実施例１-１４：単一部位修飾ソマトトロピン実施例１：Ｍ５Ｓの作製二本鎖プライマー伸長用の部位特異的突然変異を用いて、ＰＳt１のｃＤＮＡ遺伝子のアミノ酸５位のメチオニンの改変コドンを導入する。この方法においては、標的配列を適当なプラスミドにクローン化し、プラスミドＤＮＡを調製する。ＤＮＡ分子のデオキシリボース-リン酸主鎖に「切れ目」を起こすＮａＯＨで処理することにより該プラスミドＤＮＡを変性させる。これはＤＮＡを弛緩させ、所望の配列変化を含有するオリゴマーが標的部位にハイブリダイズするのを可能とする。該オリゴマーの３’末端は、プライマーを伸長するポリメラーゼＡクレノー・フラグメントのＤＮＡポリメラーゼ活性のプライマーを生成し、突然変異オリゴマーを含有し、かつ、正常な相補鎖が置き換わった新規なＤＮＡ鎖を合成する。該伸長反応は、遺伝子的な組換えによる導入の確率を高める。該ＤＮＡをコンピテント細胞に形質転換し、得られたコロニーをコロニー・フィルターハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。プラスミドＤＮＡを陽性候補から単離して配列決定する。Ｐst１遺伝子における５位のセリン変化を構築するのに用いたオリゴマーは、国際公開ＷＯ８８/０６１８６号に記載されている技術により作製し、これを配列番号：２に示す。かく作製し、前記したオリゴヌクレオチドは適当な変化を含有する。実施例２：Ｖ１５Ｌの作製また、（配列番号：３に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１５位にロイシンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例３：Ｇ４０Ｅの作製また、（配列番号：４に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、４０位にグルタミン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例４：Ｎ４７Ｄの作製また、（配列番号：５に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、４７位にアスパラギン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例５：Ａ４８Ｐの作製また、（配列番号：６に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、４８位にプロリンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例６：Ｆ５２Ｅの作製また、（配列番号：７に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、５２位にグルタミン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例７：ＥＲ５６Ａの作製また、（配列番号：８に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、５６位にアラニンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例８：Ｇ８８Ｅの作製また、（配列番号：９に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、８８位にグルタミン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例９：Ｎ９９Ｓの作製また、（配列番号：１０に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、９９位にセリンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。この遺憾は、国際公開ＷＯ９０/００８７０号にも記載されている。実施例１０：Ｆ１０３Ｅの作製また、（配列番号：１１に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１０３位にグルタミン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１１：Ｒ１２５Ｓの作製また、（配列番号：１２に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１２５位にセリンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１２：Ｉ１３７Ｅの作製また、（配列番号：１３に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１３７位にグルタミン酸を有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１３：Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒの作製また、（配列番号：１４に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１９位にヒスチジンおよび２０位にアルギニンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１４：Ｃ１８１，１８９Ｓの作製また、所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、１８１および１８９位にセリンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。この置換は国際公開ＷＯ９０/０８８２３号にも記載されている。実施例１５：Ｇ６３Ｎの作製また、（配列番号：１５に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、６３位にアスパラギンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１６：Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａの作製また、（配列番号：１６に示すごとき）所望のアミノ酸をコードする適当なオリゴマーを置換する以外は、実施例１の技術に従い、９８位にアラニン、９９位にセリン、１００位にアラニンを有するソマトトロピン・アナログも構築する。実施例１７-２２：複数部位修飾ソマトトロピン複数部位修飾ソマトトロピンは、前記の単一部位突然変異法を用いて作製でき、その各循環を各々の単一部位置換の付加に繰り返す。この方法において、いずれの数の単一部位修飾が導入された修飾ソマトトロピンが作製できる。別法として、好ましくは、アール・ダブリュ、バーネット（Ｒ.Ｗ.Ｂarnett）およびエイチ、エルフ（Ｈ.Ｅlfle）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎu cleicＡcid Ｒesearch）第１８巻：３０９４頁（１９９０年）、ピイ・ジェイ、ディロン（Ｐ.Ｊ.Ｄillon）およびシィ・エイ、ローゼン（Ｃ.Ａ.Ｒosen）、バイオテクニックス（Ｂiotechniques）第９巻：２９８-２９９頁（１９９０年）、およびアール・エム、ホートン（Ｒ.Ｍ.Ｈorton）ら、ジーン（Ｇene）第７７巻：６１-６８頁（１９９０年）により立証されているポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で合成した長鎖オリゴヌクレオチドを結合させることにより、大きなＤＮＡ配列を構築できる。このアプローチを用いて、ブタ・ソマトトロピンの全遺伝子が所望のコドン変化を含有して構築できる。約２００塩基の２個の長鎖オリゴヌクレオチドは、以下に記載するごとく合成する（「オリゴヌクレオチドの合成（Ｓynthesis of Ｏligonucleotides）」参照）。全長オリゴヌクレオチドの濃度は、各ヌクレオチドの付加が非効率なために低い。これらの２個のオリゴヌクレオチドは、２０ないし３０塩基にて重複するように設計されており、共に混合した場合、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて４００塩基対を超えるフラグメントを形成できる。次いで、そのフラグメントを単離し、制限酵素で切断し、適当な発現ベクターにクローン化する。これらのフラグメントを２個または３個生成させることにより、全ブタ・ソマトトロピン遺伝子を構築することができる。オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成のホスホルアミダイト法により合成する。簡単には、この反応はシリカ支持体に結合したヌクレオシドの５’ジメトキシトリチルエーテルを出発物質として用いる。このヌクレオシドは、生成オリゴヌクレオシドの３’-ＯＨとなるであろう。最初の段階は酸による脱トリチル化である。次いで、付加すべきヌクレオチド・ホスホルアミダイトを活性化する。添加段階は、３分未満で起こり、９５ないし９７％完了する。付加しなかった鎖は、次の工程で反応しないようにアセチル化によりキャップする。次いで、中間ヌクレオチド結合物を、酸化により亜リン酸塩からさらに安定なリン酸塩に変換する。この化合物を脱トリチル化し、最後のヌクレオシドが付加するまで該サイクルを続ける。この時点で、該ヌクレオチドは塩基Ａ、ＧおよびＣである。次いで、該鎖を水酸化アンモニウムで支持体から切断する。ＤＮＡを含有する溶液を該機器より取り出した後に、水酸化アンモニウムで５５℃にて８時間処理することにより該保護基を切断する。実施例１７：Ｖ１５Ｌ，Ａ４８Ｐ，Ｆ５２Ｅ，Ｎ９９Ｓ，Ｆ１０３Ｅ，Ｃ１８１，１８９Ｓの作製前記の技術に従い、１５位にロイシン、４８位にプロリン、５２位にグルタミン酸、９９位にセリン、１０３位にグルタミン酸、ならびに、１８１および１８９位にセリン残基を有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例１８：Ｖ１５Ｌ，Ａ４８Ｐ，Ｆ５２Ｅ前記の技術に従い、１５位にロイシン、４８位にプロリン、５２位にグルタミン酸を有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例１９：Ａ４８Ｐ，Ｎ９９Ｓ，Ｃ１８１，１８９Ｓ前記の技術に従い、４８位にプロリン、９９位にセリン、１８１および１８９位にセリン残基を有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例２０：Ｆ５２Ｅ，Ｇ８８Ｅ，Ｆ１０３Ｅ，１１３７Ｅ前記の技術に従い、５２、８８、１０３および１３７位にグルタミン酸を有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例２１：Ｖ１５Ｌ，Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ，Ａ４８Ｐ，Ｆ５２前記の技術に従い、１５位にロイシン、１９位にヒスチジン、２０位にアルギニン、４８位にプロリン、５２位にグルタミン酸を有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例２２：Ｎ１３Ｓ，Ｗ８６Ｆ，Ｑ１４０Ｓ，Ｎ１４８Ｓ，Ｍ１２４Ｌ，Ｍ１７９Ｌ前記の技術に従い、１３位にアルギニン、８６位にフェニルアラニン、１４０および１４８位にセリン、１２４および１７９位にロイシンを有するソマトトロピン複数部位アナログを構築する。実施例２３向上した高次構造安定性の特徴付け表Ｉ、IIおよびIIIは、野生型タンパク質に比してのこれらのｒｐＳtアナログの相対高次構造安定性を要約している。前記のごとく、高次構造安定性は、幾つかの異なったスペクトル・プローブを用いた平衡変性により比較する。（すなわち、２次微分ＵＶ吸収、円二色性および蛍光分光）。折りたたみの解除の変性中間点を得るために、これらの実験をプロットする。これらのデータ（表Ｉ、IIおよびIII参照）は、ソマトトロピンの高次構造を安定化する置換を示す。Ｖ１５Ｌを含有するブタＳtアナログは、３つの各スペクトル・プローブを用いて試験した場合、野生型タンパク質よりさらに安定化した高次構造を有することが判明する。また、Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒを含有するアナログも該タンパク質の高次構造安定性を有意に安定化するが、亜鉛塩の存在する場合に限られる。亜鉛塩の不在下では、この安定化は認められない。蛍光または２次微分ＵＶ吸収により試験した場合にＡ４８Ｐは、さらに安定した高次構造が認められる。Ｇ８８Ｅ（表Ｉ）、Ｒ１２５Ｓ（表II）では僅かな高次構造不安定化が記録され、Ｅ５６Ａでは顕著に高い不安定性が記録されている。高次構造安定性を向上させる置換が明らかでないことは明白である。実施例２４向上した化学安定性の特徴付け前記したごとく、本発明の化合物を、アルカリと過酸化物を含有する緩衝液との存在下にてインキュベートし、それらのこれら試薬に対する相対感受性を測定する。圧縮された時間枠において加水分解反応を観察できるため、これらの試験にアルカリ緩衝液を用いる。同様にして、過酸化物含有緩衝液も、圧縮された時間枠において酸化的分解反応が観察できる。インキュベートした後に、アリコットをトリプシン分解に付す。トリプシン分解フラグメントは、ＬＣ-ＭＳとして知られる技術を用いて分離し同定する。この技術において、フラグメントは、それらの逆層ＨＰＬＣへのアフィニティーに応じて振り分けられ、次いでそれらの電荷に対する質量比（ｍ/ｅ）に基づいて同定される。これらのフラグメントは通常単一に帯電しているため、それらのｍ/ｅ比はそれらの分子量に等しい。表I Vは、トリプシンによる分解により生じたブタＳtフラグメント、およびそれら対応する分子量を掲載している。表Ｖは、アルカリ緩衝液存在下のブタＳtのインキュベーションで認められたさらなるピークを掲載している。１またはそれを超える後者のピークを生成しないか、または遅い比率で生成する場合に、アナログが化学安定性を向上したという。実施例２５中性ｐＨの水性緩衝液における向上した溶解性の特徴付け単一部位アミノ酸置換により修飾ソマトトロピンの中性の水性緩衝液における溶解性が有意に変化したか否かを確認するため、該化合物を特徴付けする。野生型および修飾ソマトトロピンを、前記の詳細な説明の節で記載した透析を介して試験する。その結果を表IVに示す。これらのデータは、単一部位のアミノ酸置換がこのタンパク質の溶解性に有意な影響を与え得ることを示している。例えば、疎水性アミノ酸の比較的親水性のアミノ酸での置換で溶解性を向上できる。加えて、該タンパク質の等電点の変化により溶解性を向上できる。（等電点とは、該タンパク質が正味の帯電を有しないｐＨである）。これらの結果は、化学原理の一般的理解に基づけば理解できるが、現在の技術水準からこれらの電荷の大きさは予想できない。特に、Ｉ１３７ＥおよびＦ５２Ｅは、それらの３倍より高いもタンパク質溶解性の向上で異なることは注記する。Ｇ８８ＥおよびＧ４０Ｅの溶解性アッセイ結果は、２０％異なっている。これらの相違は、精度限界外であり、従って統計的に有意である。これらの修飾ソマトトロピンのアミノ酸含量は同一であるため、この相違の結果：１）水性媒質中とのこれらのアミノ酸の個々の相互作用、または２）該タンパク質に中の高次構造の変化、によるものであるにちがいない。スペクトル試験は、これらの化合物間に顕著な高次構造の相違があることは示していないため、説明１）の方がよりありそうである。実施例２６：ラット成長バイオアッセイ該ラット成長アッセイは、本発明の該修飾ブタ・ソマトトロピンが天然タンパク質に比して同等の生物活性を有することを示している。これらの結果の要約を表VIIに示す。実施例２７：ブタ生物活性ヨークシャー交雑育種ブタをこのアッセイに利用した。約５０ｋｇの４８匹の雌ブタおよび４８匹の去勢ブタを、体重（ＢＷ）によりランク付けした。これらのランク位を用いて各種のブタを４ブロックに分けた。各種および各ブロックの中で、ブタを１ないし６個の檻にランダムに分け、同一の檻に同腹子を分けるの防いだ。各檻には、２匹の雌ブタと２匹の去勢ブタが含まれる。処理は、ブロック内の檻にランダムに付した。檻へ付した後に、最初の処理の前に、そのブタを少なくとも７日間の順応期間放置する。ブタ試験の結果の要約を表VIIIに示す。最初の２週間の各檻につき１日の平均体重増加（ＡＤＧ）および体重増加当たりの食餌量（ＦＰＧ）を算出した。該データは、処理相互作用（Ｂ×Ｔ）当たりの、ブロック、処理およびブロックを含有するモデルの分散の解析（ＡＮＯＶＡ；ＳＡＳのＧＬＭ方法）を用いて解析した。Ｂ×Ｔを、処理についての試験項として用いた。ＳＡＳの最小二乗平均値オプションを用いて、全ての対比較を行った。 ¹データはＧdm．Ｃl濃度の係数として３５５nmでモニターした蛍光放出から得る。タンパク質濃度は全て０．０５ｍｇ/ｍｌ以下。² 野生型rpＳtの対応するデータと比較した場合に＞５％異なる。中間測定値の変動は±１．５％。 ¹野生型rpＳtの対応するデータと比較した場合に＞５％異なる。中間点測定値の変動は±１．８％。 ¹野生型rpＳtの対応するデータと比較した場合に＞５％異なる。中間測定値の変動は±１．７％。 ¹図２はこれらのピークのリテンション・タイムを示す。 ¹これらの測定の精度は±５％。 ¹実験＃１² 実験＃２³ 実験＃３⁴ 実験＃４ *＝Ｐ＜０．０５で差ありの測定値を示す。統計分析は、％増加率よりむしろデータで行う。 *＝Ｐ＜０．０５で差ありの測定値を示す。統計分析は、％増加率よりむしろデータで行う。配列表（１）一般情報：（i）出願人：レアマン，シャーウッド・ラス（Ｌehrman，Ｓherwood Ｒuss）（ii）発明の名称：ソマトトロピン修飾物（iii）配列数：１６（iv）通信住所：（Ａ）受信人：コーポレート・インテレクチュアル・プロパティー・ロウ（Ｃorporate Ｉntellectual Ｐroperty Ｌaw）（Ｂ）通り：ヘンリエッタ・ストリート３０１番（Ｃ）都市：カラマズー（Ｄ）州：ミシガン州（Ｅ）国：合衆国（Ｆ）郵便番号：４９００１（v）コンピューター判読形態：（Ａ）媒体型：３．５''インチ・ディスケット（ＤＳ、ＨＤ２．０Ｍb）（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ・コンパチブルＷＩＮ３８６（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ-ＤＯＳ/ＭＳ-ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ワード・パーフェクト５．１（ＷordＰerfect５．１）（vi）最新出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）先行出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Viii）代理人/代理事務所の情報：（Ａ）氏名：スチール，グレゴリー・ダブリュ（Ｓteele，Ｇregory Ｗ．）（Ｂ）受領番号：３３７９６（Ｃ）参照/ファイル番号：４７６６（ix）テレコミュニケーション情報：（Ａ）電話：６１６３８５７２８０（Ｂ）テレファックス：６１６３８５６８９７（Ｃ）テレックス：２２４４０１アップジョン（２）配列番号：１に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５７３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１：（３）配列番号：２に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：２：（４）配列番号：３に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：３：（５）配列番号：４に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：４：（６）配列番号：５に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：５：（７）配列番号：６に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：６：（８）配列番号：７に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：７：（９）配列番号：８に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：８：（１０）配列番号：９に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：９：（１１）配列番号：１０に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１０：（１２）配列番号：１１に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１１：（１３）配列番号：１２に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１２：（１４）配列番号：１３に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１３：（１５）配列番号：１４に関する情報：（i）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１９塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１４：（１６）配列番号：１５に関する情報：（i）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１７塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１５：（１７）配列番号：１６に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号：１６：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 7/08 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ 9281−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ酸５位のメチオニンのセリンへの置換（Ｍ５Ｓ）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、アミノ酸１５位に見い出されるバリンのロイシンへの（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１３７Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、または１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）：よりなる群から選択される単一部位アミノ酸置換を有する修飾ソマトトロピン。２．ウシ、ブタ、サカナ、ヒツジ、ウマ、ラット、サルおよびヒト・ソマトトロピンよりなる群から選択される請求項１記載のソマトトロピン。３．ウシ・ソマトトロピンである請求項２記載のソマトトロピン。４．ブタ・ソマトトロピンである請求項２記載のソマトトロピン。５．Ｍ５Ｓである請求項４記載のソマトトロピン。６．Ｎ１３Ｓである請求項４記載のソマトトロピン。７．Ｖ１５Ｌである請求項４記載のソマトトロピン。８．Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒである請求項４記載のソマトトロピン。９．Ｇ４０Ｅである請求項４記載のソマトトロピン。１０．Ｎ４７Ｄである請求項４記載のソマトトロピン。１１．Ａ４８Ｐである請求項４記載のソマトトロピン。１２．Ｆ５２Ｅである請求項４記載のソマトトロピン。１３．Ｇ６３Ｎである請求項４記載のソマトトロピン。１４．Ｗ８６Ｆである請求項４記載のソマトトロピン。１５．Ｇ８８Ｅである請求項４記載のソマトトロピン。１６．Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａである請求項４記載のソマトトロピン。１７．Ｆ１０３Ｅである請求項４記載のソマトトロピン。１８．Ｍ１２４Ｌである請求項４記載のソマトトロピン。１９．Ｉ１３７Ｅである請求項４記載のソマトトロピン。２０．Ｑ１４０Ｓである請求項４記載のソマトトロピン。２１．Ｎ１４８Ｓである請求項４記載のソマトトロピン。２２．Ｍ１７９Ｌである請求項４記載のソマトトロピン。２３．５位のメチオニンのセリンへの置換（Ｍ５Ｓ）、１３位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１３Ｓ）、１５位のバリンのロイシンへの置換（Ｖ１５Ｌ）、１９位のグルタミンのヒスチジンへの置換および２０位のヒスチジンのアルギニンへの置換（Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ）、４０位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ４０Ｅ）、４７位のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４７Ｄ）、４８位のアラニンのプロリンへの置換（Ａ４８Ｐ）、５２位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ５２Ｅ）、６３位のグリシンのアスパラギンへの置換（Ｇ６３Ｎ）、８６位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換（Ｗ８６Ｆ）、８８位のグリシンのグルタミン酸への置換（Ｇ８８Ｅ）、９８位のスレオニンのアラニンへの置換、９９位のアスパラギンのセリンへの置換、および１００位のセリンのアラニンへの置換（Ｔ９８Ａ，Ｎ９９Ｓ，Ｓ１００Ａ）、９９位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ９９Ｓ）、１０３位のフェニルアラニンのグルタミン酸への置換（Ｆ１０３Ｅ）、１２４位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１２４Ｌ）、１２５位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｒ１２５Ｓ）、１３７位のイソロイシンのグルタミン酸への置換（Ｉ１３７Ｅ）、１４０位のグルタミンのセリンへの置換（Ｑ１４０Ｓ）、１４８位のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ１４８Ｓ）、１７９位のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍ１７９Ｌ）、または１８１および１８９位のシステインのセリンへの置換（Ｃ１８１，１８９Ｓ）：よりなる群から選択される複数部位アミノ酸置換を有するソマトトロピン。２４．ウシ、ブタ、サカナ、ヒツジ、ウマ、ラット、サルおよびヒト・ソマトトロピンよりなる群から選択される請求項２３記載のソマトトロピン。２５．ウシ・ソマトトロピンである請求項２４記載のソマトトロピン。２６．ブタ・ソマトトロピンである請求項２４記載のソマトトロピン。２７．ａ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；ｂ）Ａ４８Ｐ、Ｎ９９Ｓ、Ｃ１８１，１８９Ｓ；ｃ）Ｆ５２Ｅ、Ｇ８８Ｅ、Ｆ１０３Ｅ、Ｉ１３７Ｅ；ｄ）Ｖ１５Ｌ、Ｑ１９Ｈ、Ｈ２０Ｒ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ；ｅ）Ｎ１３Ｓ、Ｗ８６Ｆ、Ｑ１４０Ｓ、Ｎ１４８Ｓ、Ｍ１２４Ｌ、Ｍ１７９Ｌ；およびｆ）Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ、Ｎ９９Ｓ、Ｆ１０３Ｅ、Ｃ１８１，１８９Ｓである請求項２６記載のソマトトロピン。２８．Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅである請求項２７記載のソマトトロピン。２９．Ａ４８Ｐ、Ｎ９９Ｓ、Ｃ１８１，１８９Ｓである請求項２７記載のソマトトロピン。３０．Ｆ５２Ｅ、Ｇ８８Ｅ、Ｆ１０３Ｅ、Ｉ１３７Ｅである請求項２７記載のソマトトロピン。３１．Ｖ１５Ｌ、Ｑ１９Ｈ，Ｈ２０Ｒ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅである請求項２７記載のソマトトロピン。３２．Ｎ１３Ｓ、Ｗ８６Ｆ、Ｑ１４０Ｓ，Ｎ１４８Ｓ、Ｍ１２４Ｌ、Ｍ１７９Ｌである請求項２７記載のソマトトロピン。３３．Ｖ１５Ｌ、Ａ４８Ｐ、Ｆ５２Ｅ、Ｎ９９Ｓ、Ｆ１０３Ｅ、Ｃ１８１，１８９Ｓである請求項２７記載のソマトトロピン。３４．請求項１のソマトトロピンを有効量、動物に投与することを特徴とする動物の成長を促進させる方法。３５．該動物がウシである請求項３４記載の方法。３６．該動物がブタである請求項３４記載の方法。３７．請求項２３のソマトトロピンを有効量、動物に投与することを特徴とする動物の成長を促進させる方法。３８．該動物がウシである請求項３７記載の方法。３９．該動物がブタである請求項３７記載の方法。４０．請求項１の動物ソマトトロピンの有効量を雌ウシに投与することを特徴とする雌ウシにおける泌乳を増加させる方法。４１．請求項２３の動物ソマトトロピンの有効量を雌ウシに投与することを特徴とする雌ウシにおける泌乳を増加させる方法。４２．請求項１の動物ソマトトロピンの有効量をブタに投与することを特徴とするブタにおける赤肉-脂肪比を高める方法。４３．請求項２３の動物ソマトトロピンの有効量をブタに投与することを特徴とするブタにおける赤肉-脂肪比を高める方法。