EA002349B1 - Очистка нейротрофинов - Google Patents

Abstract

Предлагаются способы очистки нейротрофинов, включая зрелый NGF, пригодные для клинического применения в крупном масштабе. Способы предусматривают методы разделения нейротрофинов от других ненужных ошибочно процессированных, ошибочно упорядоченных, другого размера, гликозилированных или заряженных форм. Также предлагаются композиции нейротрофинов, включающие зрелый NGF, практически не содержащие данных вариантов.

Description

Область изобретения

Изобретение относится к улучшенному способу очистки нейротрофинов, особенно нейротрофинов ΝΟΡ-семейства, в частности фактора роста нервной ткани (петуе дго\\И1 Гас!ог. ΝΟΡ), нейротрофина-4/5 (пеито!торЫп-4/5. ΝΤ4/5) и нейротрофина-3 (пеиго!горЫп-3. ΝΤ-3) от других нейротрофинов, и связанных с ними примесей и загрязнений (контаминантов), особенно, когда нейротрофины продуцируются ферментацией бактериальными клетками или клетками млекопитающих.

Предпосылки изобретения

Продуцирование больших количеств относительно чистых, биологически активных полипептидов и протеинов с экономической точки зрения является важным для производства фармацевтических композиций для человека и животных, ферментов и других специальных химических продуктов. Для продуцирования многих протеинов преимущественным способом стала генная инженерия, так как большие количества экзогенных протеинов могут экспрессироваться в клетках-хозяинах млекопитающих и бактерий, и в других клетках-хозяинах.

Первичная структура ΝΟΡ млекопитающих (ΝΟΡ мыши) впервые изложена в работе Апде1е!й. Втабкйате. Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. И8А 68: 2417 (1971). Первичная структура его предшественника - пре-про-ΝΟΡ установлена из нуклеотидной последовательности ΝΟΡ к ДНК мыши (8сой е! а!.. №11иге 302: 538 (1983); ИПпсй е! а1.. Хаип-е 303: 821 (1983)).

Также был идентифицирован гомологичный ΝΟΡ ген человека (1ΝΟΡ) <и11г1сН. 8утр. оп Онап. Вю1.. Со1б 8рппд НатЬот 48: 435 (1983); патент США 5288622. опубликован 22 февраля, 1994. который приведен в данном изобретении в виде ссылки). Его гомология по отношению к ΝΟΡ мыши составляет около 90% и 87% от уровней аминокислотной последовательности и нуклеотидной последовательности, соответственно. Вследствие дефицита встречающегося в природе ΝΟΡ. относящегося к человеку, он не был получен из природных источников в количествах, достаточных для детального биохимического описания.

Позже были идентифицированы дополнительные нейротрофические факторы, относящиеся к ΝΟΡ. Они включают нейротрофическии фактор, связанный с мозгом (Ьташ-бегтуеб пеито!торЫс Гас!ог. ΒΌΝΡ) (ЬеФтоск. е! а1.. ИаЮе. 341: 149-152 (1989)). нейротрофин-3 (ΝΤ-3) (Кащйо. е! а!.. ΡΕΒ8 Ьей. 266: 187 (1990); Ма18опр1егте. е! а1.. 8аепсе. 247: 1446 (1990); К.о8еп!1а1. е! а!.. Неигоп. 4:767 (1990)) и нейротрофин 4/5 (ΝΤ-4/5) (Веткте1ет. е! а1.. кеигоп. 7: 857-866 (1991)). ΟΌΝΡ. отдаленный член ΤΟΡ-β суперсемейства. и неуртурин (пеийилп. ΝΤΝ) являются двумя. недавно идентифицированными. структурно связанными мощными факторами продолжительного функционирования для симпатических сенсорных нейронов и нейронов центральной нервной системы (Ып е! а1.. 8аепсе 260: 1130-1132 (1993); Непбегкоп е! а1.. 8аепсе 266: 1062-1064 (1994); Вн)-Ве11о е! а1.. ^шоп 15: 821-828 (1995); КоШЬаиет е! а1.. ΝηΙι.^ 384:467-470(1996)).

Продуцирование химерного (рекомбинантного) протеина включает трансфектирование клеток-хозяина ДНК-той, кодирующей протеин, и культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии химерного протеина. Прокариотическая Е.сой является подходящим хозяином, поскольку может продуцировать химерные протеины с высокими выходами и низкой стоимостью. Существуют многочисленные патенты США по общей бактериальной экспрессии ДНК, кодирующей протеины, включая патент США № 4565785 по рекомбинантной ДНК молекуле, включающей бактериальный ген внеклеточного или периплазменного белканосителя и небактериальный ген; патент США № 4673641 по совместному продуцированию чужеродного полипептида с совокупностьобразующим полипептидом; патент США № 4738921 по экспрессирующему вектору с !гр промоторным оператором и !гр ЕЕ слиянию с полипептидом, например, ΙΟΡ-1; патент США № 4795706 по экспрессирующим регулярным последовательностям для включения с чужеродным протеином; и патент США № 4710473 по специфическим плазмидам кольцевой ДНК, например, кодирующих ΙΟΡ-1.

Биофармацевтические препараты, полученные генной инженерией, обычно очищают от кондиционированной среды (супернатанта), содержащей целый ряд разных контаминантов клеток-хозяина. В частности, сообщалось, что ΝΟΡ очищали до той или иной степени с тем или другим успехом, используя разнообразные способы (см., например, Ьопдо е! а1.. 1ВК.О НапбЬоок. уо1. 12. рр. 3-30 (1989)); И.8. Ра!. 5082774. который описывает продуцирование СНО клеток ΝΟΡ; Вгисе. НетпсН (Кеигоко. Адтд 10: 89-94 (1989); 8с1ипе1хег е! а1.. 1. №игос1ет 59: 1675-1683 (1992); Виг!оп е! а1.. 1. №итосйет. 59: 1937-1945 (1992)). Данные попытки осуществлены, главным образом, в масштабах лаборатории.

Однако препаративное выделение рекомбинантного ΝΟΡ человека, приводящее к фармацевтической чистоте и высокому выходу, практически не содержащего других видов, ранее не рассматривалось.

Соответственно, имеется потребность в эффективных процедурах для селективного разделения нейротрофинов, в частности, нейротрофинов ΝΟΡ и ΝΟΡ-семейства, от других нейротрофинов (вариантов) и молекул и от других полипептидов с высокой изоэлектрической точкой - р1. Способ очистки нейротрофинов в крупном масштабе, чтобы обеспечить в них потребность клиник, должен быть пригоден для исходного материала от различных источников, включая ферментационную питательную среду, вызывающую лизис бактериальных клеток или клеток млекопитающих. Кроме того, поскольку в данном изобретении открыты ранее неизвестные, трудные для разделения виды нейротрофинов, например, ΝΟΕ-виды (варианты), способы, представленные здесь особенно пригодны для обеспечения коммерческих количеств рекомбинантных нейротрофинов, включая нейротрофины ΝΟΕ (ΛΝΟΕ), γΚΝΤ-3 и γ1ιΝΤ-4/5 человека и подходящие мутанты их, полученные генной инженерией, которые практически не содержат ненужных видов нейротрофинов. Эти и другие цели изобретения будут ясны специалистам.

Сущность изобретения

В одном варианте изобретения предлагается способ очистки нейротрофина, особенно нейротрофина ΝΟΕ-семейства, включая ΝΟΕ, ΝΤ-3, ΝΤ-4/5 и ΒΌΝΕ, которые участвуют в распознавании с помощью высокогомологичного семейства рецепторов (1гк§), предпочтительно ιΊιΝΟΕ. γΝΤ-3, γΚΝΤ-4/5, γΗΒΌΝΟ или подходящих форм их, полученных генной инженерией, с применением гидрофобной хроматографии (11у<1гор1юЫс ш1егас1юп сйгота1одгарйу, Н1С). Ввиду открытия в данном изобретении некоторых непригодных видов (вариантов) нейротрофинов, являющихся результатом рекомбинантного продуцирования нейротрофина, как уже сообщалось, при применении Н1С можно разделить химически отличающиеся или даже ошибочно упорядоченные формы нейротрофина от подходящего правильно упорядоченного интактного нейротрофина. Варианты, которые могут отделяться, являются вариантами, которые отличаются от зрелого, правильно упорядоченного нейротрофина по гидрофобности, включая частично процессированные последовательности предшественников, гликозилированные созревшие формы и предшественник-содержащие формы (когда присутствуют от эукариотической клеточной культуры) и ошибочно упорядоченные или частично упорядоченные варианты (обычно из бактериальной клеточной культуры, когда используют стадии упорядочения ίη νίΐτο). Например, Н1С особенно пригодна для удаления частично процессированных последовательностей предшественника ΝΟΕ, гликозилированных видов ΝΟΕ и предшественника (когда присутствуют от эукариотической клеточной культуры) и ошибочно упорядоченных или частично упорядоченных вариантов (обычно из бактериальной клеточной культуры, когда используют стадии упорядочения ίη νίΐτο) из смесей зрелых ΝΟΕ. ΝΟΕ имеет один Ν-связанный сайт гликозилирования при Л§п45. В случае бактерийэкспрессирующего заново упорядоченного γ1ιΝΤ-4/5. Н1С разделяет правильно упорядоченные ΝΤ-4/5 и неправильно упорядоченные формы. Благодаря способу, описанному в данном изобретении, нейротрофин, в основном, не со держит других видов (вариантов). Для очистки нейротрофина предпочтительной функциональной группой для Н1С полимера является фенильная группа, хотя могут применяться полимеры с октильной и бутильной группами. Особенно предпочтительные варианты включают Н1С полимеры - Р1епу1 Тоуореаг1, низкозамещенную фенилсефарозу быстрого пропускания (Р1епу1 Берйагоке ЕаЧ Е1оте Ьо\\· 8иЬ5Ши1юп). Т8К-Р1епу1 5Р\У или похожие полимеры.

В другом варианте предлагается способ очистки нейротрофина, особенно нейротрофина ΝΟΕ-семейства, предпочтительно ιΊιΝΟΕ. γΝΤ-3, γ1ιΝΤ-4/5 или их подходящие формы, полученные генной инженерией, с применением препаративной катионообменной хроматографии, которая разделяет зарядомодифицированные варианты, например окисленные, изоаспартатные и деамидированные формы от зрелого нейротрофина. Особенно предпочтительные варианты используют 8Р-сефарозу высокого разрешения (8Р-8ерйаго5е Н1дй РегГогтапсе), Егас1оде1 ΕΜΌ 803 или полимер полиаспарагиновой кислоты, из которых Ро1уСАТ А особенно предпочтителен. Наиболее предпочтительными для использования в крупном масштабе являются полимеры 8Р-8ер1аго5е Н1дй РегГогтапсе или Егас1оде1 ΕΜΌ 803.

Еще в другом варианте изобретения используют и Н1С и катионообменную хроматографию для получения композиции нужного нейротрофина, например, рекомбинантного зрелого ΝΟΕ, предпочтительно ΝΟΕ, относящегося к человеку, который практически гомогенен, т.е. практически не содержит и процессированных и заряженных видов (вариантов), например, ошибочно упорядоченных и химических вариантов и также практически свободен от протеинов.

В одном варианте данного изобретения предлагается усовершенствованный способ разделения нейротрофинов, особенно нейротрофинов ΝΟΕ-семейства, предпочтительно, рекомбинантных ΝΟΕ, ΝΤ-3, ΝΤ-4/5 нейротрофинов, относящихся к человеку, и их подходящих форм, полученных генной инженерией, от родственных нежелательных вариантов, например, ферментационных, расщепляемых протеазой видов, гликозилированных вариантов, ошибочно упорядоченных видов, с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Наиболее предпочтительный ΝΟΕ представляет собой 120/120 или 118/118 гомодимерную форму. В соответствии со способом, описанным в данном изобретении, самым предпочтительным является нейротрофин, по существу, не содержащий других видов (вариантов).

В другом варианте предлагается способ очистки нейротрофинов, особенно нейротрофинов ΝΟΕ-семейства, от родственных вариантов с использованием условий элюирования, включающих физиологическое рН.

Еще в другом варианте предлагается способ очистки нейротрофина, который приводит к значительному улучшению его гомогенности.

В другом варианте предлагается способ разделения нейротрофинов ΝΟΡ-семейства от его вариантов, включающий:

а) нанесение буфера, содержащего нейротрофин и его вариант при рН от 5 до 8, на гидрофобную хроматографическую колонку;

б) промывку колонки;

в) элюирование нейротрофина буфером с рН от ~5 до 8;

г) нанесение нейротрофинсодержащего элюата на катионообменную хроматографическую колонку при рН от -5 до 8; и

д) элюирование нейротрофина из колонки буфером при градиенте концентрации соли при рН от ~5 до 8, предпочтительно, с рН 6. Наиболее предпочтительным нейротрофином является ΛΝΟΡ.

В одном варианте изобретения предлагается стадия хроматографирования на силикагеле, которая практически удаляет протеины клетокхозяина из фракции нейротрофина, которая, предпочтительно, является ΝΟΡ-фракцией.

В одном варианте изобретения предлагается стадия, в которой 120 аминокислотный ΝΟΡ подвергается обработке трипсиноподобной протеазой для селективного отделения терминального ЯЛ дипептида от УЯЯЛ С-терминального с образованием 118 аминокислотного образца. Предпочтительной является колонка с иммобилизованным трипсином.

Изобретение также относится к композиции нейротрофина и составу, полученному с помощью способа, изложенного в данном изобретении, а также к применению композиции и состава. Предлагается композиция нейротрофина, которая является практически гомогенной, т. е. практически не содержащей и процессированных и заряженных вариантов, например, ошибочно упорядоченных и химических вариантов, и также практически не содержащей протеина. Предпочтительно предлагаются следующие формы - зрелый ΝΟΡ человека, зрелый ΝΤ3 человека или крысы и зрелый ΝΤ-4/5 человека. В предпочтительном варианте ΝΟΡ является 120 формой, и более предпочтительно 118 формой и наиболее предпочтительно гомодимером, например, 118/118.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 изображает хроматограмму на 8Р8ерНаго5е НР. ΝΟΡ-содержащую смесь от 12кЬ ферментации после Н1С хроматографии наносили на колонку с 8Р-сефарозой высокого разрешения (8Р-8ерНаго5е Нщй РегГотапсе) (размер колонки 1,0х35 см; объем слоя 25 отлгГй 8Р8НР полимера - 27,5 мл). Буфер А представлял собой 0,2М №С1, 20 тМ сукцинат, рН 6,0 (23 1115). Буфер В представлял собой 0,7М №С1, 20 тМ сукцинат, рН 6,0 (63 т5). Вначале колонка уравновешивалась буфером А. Н1С пул из

345 мл при концентрации 24 мг/мл доводили до 25 тМ сукцината, рН 6,0 (17 т5), 362 мл которого наносили с получением загрузки 3 мг/мл полимера; наносили 82,5 мг ΝΟΡ. Скорость нанесения составляла 40 см/ч. ΝΟΡ элюировали, применяя градиент буфера В от 30 до 80% (с 0,35 до 0,60М №С1; с 37 до 57 т5) с объемом, соответствующим 22 объемам колонки. Скорость элюирования составляла 60 см/ч. Представлена зависимость величины абсорбции (при 280 нм) от номеров фракций и объема элюирования, измеряемого в мл. Определяли и объединяли фракции, содержащие ΝΟΡ. В данном случае фракции с 43 до 60 объединяли с получением 99 мл образца с концентрацией ΝΟΡ - 0,38 мг/мл, выход составлял около 46%.

На фиг. 2 представлен 8Р-ЛРЯ НРЬС катионообменный (НР1ЕХ) анализ пула на фенилсефарозе быстрого пропускания (Р11спу1 8ер1аго5С Ρακί Б1о\\') и 8Р-8срйаго5С НР пула. Хроматограммы для каждого случая на фиг. 2 обозначены.

На фиг. 3 представлен С4 ЯР-НРЬС анализ выбранных фракций (основной пул, лидирующий край и отстающий (стелющийся) край пика основного пула) с помощью 8Р-8ерНаго5е НР хроматографической стадии. Три сигнала перекрываются и каждый из них на фиг. 3 обозначен. Как видно, основной пик (содержащий зрелый ΝΟΡ) отделяется от нескольких меньших пиков, которые содержат варианты ΝΟΡκ.

Фиг. 4 описывает последовательность препро-ΝΟΡ (8ЕО ГО Νο: 1) человека. Приведенными на фиг. 4 являются первая аминокислота зрелого ΝΟΡ (положение 1) и последняя аминокислота 120 ΝΟΡ формы (положение 120). Предпочтительной аминокислотной последовательностью ΝΟΡ является последовательность зрелой 118 формы (с положения 1 до 118). Также представленными являются варианты форм: зрелый 120 (с положения 1 до 120); зрелый 117 (с положения 1 до 117), Я1 20 (с положения 1 до 120); и сайты для другого ошибочного процессирования, которое происходит на Ν- и Сконцах, включая зрелые 114 (аминокислоты от 1 до 114), 115 (аминокислоты от 1 до 115) и 117 (аминокислоты от 1 до 117) варианты. Основной ошибочно процессированный вариант, протеолитически ошибочно процессированный, имеет Ν-концевое расщепление между двумя аминокислотами Я(-39) и 8(-38) в про-последовательности ΝΟΡ. Возможное инициирование Ме! обозначено. Другие Ν-концевые варианты включают процессированные (усеченные) формы ΝΟΡ, обладающие самым свойственным расщеплением между аминокислотами Н8 и Я9 и между Я9 и О10.

Фиг. 5 описывает аминокислотные последовательности нейротрофинов ΝΟΡ (8ЕО ГО №: 2) человека; ΝΟΡ (8 НО ГО Ыо: 3), ΒΌΝΡ (81Т) ГО №: 4), ΝΤ-3 (81Т) ГО Ыо: 5) и ΝΤ-4/5 (8 НО ГО №: 6) мыши. Отмеченные на фиг. области указывают на гомологичные цистеинсодержащие области, включающие цистеин в качестве основного лейтмотива (1Эе Уоипд е! а1., Рго!еш 8с1. 5(8): 1554-66(1996)).

Фиг. 6 описывает хроматографию γΗΝΤ-4/5 на колонке ΌΕΆΕ - сефарозы быстрого пропускания (ΌΕΛΕ - 8ерйагозе Раз! Р1о\\; ΌΕΡΡ). Хроматограмма, обозначенная ΝΤ45ΌΕ1:1_υν, представляет собой измерение УФ - абсорбции при 280 нм. Хроматограмма, обозначенная ΝΤ45ΌΕ1:1_Οοηά1 представляет собой измерение проводимости элюируемых фракций. Нейротрофинсодержащие фракции, которые объединены, обозначены горизонтальной стрелкой Пул.

Фиг. 7 описывает хроматографию γΚΝΤ-4/5 на колонке 8Р-сефарозы быстрого пропускания (8Р-8ерйагозе Раз! Р1од). Хроматограмма, обозначенная ΝΤ458ΡΡΙ:1_υν, представляет собой измерение УФ-абсорбции при 280 нм. Хроматограмма, обозначенная ЫТ458РР1:1_Соп61 представляет собой измерение проводимости элюируемых фракций. Нейротрофинсодержащие фракции, которые объединены, обозначены горизонтальной стрелкой Пул.

Фиг. 8 описывает препаративную С4-ВРНРЬС хроматографию γΗΝΤ-4/5 в условиях, описанных в тексте. Контролировалась абсорбция при 280 нм. Нейротрофинсодержащие фракции, которые объединяли, обозначены горизонтальной стрелкой Пул.

Фиг. 9 представляет аналитическую НРЬС хроматографию ΝΤ-4/5 образцов, контролируемых во время переупорядочения для указанного времени. Условия для колонки описаны в тексте. ΝΤ-4/5 816 указывает путь элюирования правильно упорядоченного, интактного ΝΤ-4/5, используемого в качестве стандарта. Путь, обозначенный 88РР (0,5т) описывает анализ ΝΤ4/5, элюируемый 0,5М №1С1 с колонки 8сефарозы быстрого пропускания (8-8ерйагозе Раз! Р1од) до переупорядочения. Поскольку ΝΤ4/5 переупорядочивается, путь элюирования приближается к таковому для стандарта.

Фиг. 10 описывает хроматограмму, демонстрирующую разделение интактного, правильно упорядоченного ΝΤ-4/5 и ошибочно упорядоченных вариантов на гидрофобной хроматографической колонке - Рйепу1 Тоуореаг1 650М. Ошибочно упорядоченные варианты, которые менее, гидрофобны, чем правильно упорядоченный ΝΤ-4/5, элюируются беспрепятственно (первым), в то время как ошибочно упорядоченные варианты (пик В), которые являются более гидрофобными, элюируются при больших концентрациях органического растворителя, чем это требуется для элюирования правильно упорядоченного ΝΤ-4/5 (пик А).

Фиг. 11 описывает путь элюирования ΝΤ4/5 и его вариантов с катионообменного полимера 8Р-сефарозы (8Р-8ерйагозе). Контролировалась абсорбция при 280 нм. Пик А содержит карбамилированные и усеченные (сйрреб) варианты, в то время как пик В содержит интактный, правильно упорядоченный ΝΤ-4/5. ΝΤ-4/5 содержащие фракции, которые объединялись, обозначены горизонтальной стрелкой Пул.

Фиг. 12 описывает типичную препаративную хроматографию гйЛТ-4/5 на ро1уСАТ А полимере в условиях, описанных в тексте.

На фиг. 13 представлен 16% 8Ό8-ΡΑ6Ε анализ (Тлз-глициновая система, предварительно отлитая от №усх. 1пс., 8ап О|сдо. СА) в восстановительных условиях для оценки чистоты и гомогенности образцов, взятых из указанных стадий способа очистки гйЛТ-4/5, описанного в тексте. Для обнаружения протеина гель окрашивали С.’оо1пазз1е-Р250 (Апбге\\'з. Н1ес1горйоге818, ОхГогб ишуегзйу Ргезз: Νο\ν Уогк, 1986). Полоса, обозначенная ΌΕ Ьоаб содержит образец ΡΕΙ-смеси, которую наносили на колонку ΌΕ-сефарозы быстрого пропускания (ΌΕ8ерйагозе Раз! Р1од): полоса, обозначенная ΌΕ РТ содержит образец, беспрепятственно полученный с колонки ΌΕ-сефарозы быстрого пропускания (ОН^ерйагозе Раз! Р1од): полоса 8 Роо1 содержит образец из объединенных фракций, содержащих ΝΤ-4/5, элюируемых из колонки 8-сефарозы быстрого пропускания (88ерйагозе Раз! Р1од) до переупорядочения: полоса КеГо1б Роо1 содержит образец пула после завершения переупорядочения; полоса С4 Роо1 содержит образец объединенных фракций после препаративной С4 КР-НРЬС; и полоса Ро1уСАТ А Роо1 содержит образец из объединенных ΝΤ-4/5 фракций из Ро1уСАТ А НРЬС колонки.

На фиг. 14 представлена УФ-абсорбция фракций при хроматографировании смеси на 8сефарозе быстрого пропускания (8-8ерйагозе Раз! Р1о\\'). содержащей бактериальнопродуцированный сульфонилированный γ1ιΝΤ-3.

На фиг. 15 представлена Масгоргер Н1дй 8 катионообменная хроматография смеси, содержащей ίη уйго переупорядоченные формы гйЛТ3. Полимер поставлялся Вюгаб. Размеры колонки 9х9 см. 700 мл 88РР пул, содержащий переупорядоченный (после 36 ч переупорядочения), рН 6,8, наносили на Масгоргер колонку при скорости потока около 310 мл/мин. Условия приведены в тексте.

На фиг. 16 представлена хроматография на высокозамещенной фенилсефарозе быстрого пропускания (Рйепу18ерйагозе Раз! Р1од) (гидрофобная хроматография) очищенного от ошибочно упорядоченных вариантов с помощью катионообменной хроматографии переупорядоченного γΙιΝΤ-3.

Фиг. 17 описывает хроматографию высокого разрешения на 8Р-сефарозе высокого разрешения (8Р-8ерйагозе Н1дй РегГогтапсе) Н1СγΙιΝΤ-3 пула.

Подробное описание изобретения Определения

Термин нейротрофин, используемый в данном изобретении, относится к нейротрофину, предпочтительно, к нейротрофину ΝΟΡсемейства, включая ΝΟΡ, ΝΤ-3, ΝΤ-4/5 и ΒΌΝΡ, из любого вида, в том числе, относящегося к мышам, овце, свинье, лошади, птице и, предпочтительно, человеку, в форме нативной последовательности или в форме, полученной генной инженерией от любого источника - природного, синтетического или полученного рекомбинантным способом. Например, ΝΟΡ относится к фактору роста нервной ткани, из любого вида, в том числе относящегося к мышам, быку, овце, свинье, лошади, птице и, предпочтительно, к человеку, в форме нативной последовательности или в форме, полученной генной инженерией, из любого источника - природного, синтетического или полученного рекомбинантным способом. Предпочтительно, если нейротрофин получен рекомбинантным способом. В предпочтительном способе нейротрофин клонировали, и его ДНК экспрессировала, например, в клетках млекопитающих, в бактериальных клетках. Способы и методы, разработанные в данном изобретении, могут также применяться к ΟΌΝΡ нейротрофинам и нейртурину.

Предпочтительной при использовании для человека является нативная последовательность зрелого ΝΟΡ человека, более предпочтительно 120 аминокислотная последовательность и даже более предпочтительной является 118 аминокислотная последовательность. Более предпочтительным является, когда данную нативную последовательность ΝΟΡ продуцируют рекомбинантно. Предпочтительная аминокислотная последовательность для пре-про-ΝΟΡ человека и зрелого ΝΟΡ человека предлагается в патенте США 5288622, который специально приведен в данном изобретении в качестве ссылки. Предпочтительной формой является форма из 120 аминокислот без дополнительных посттрансляционных модификаций, а именно, гомодимерная форма (т.е. 120/120). Еще более предпочтительной является форма из 118 аминокислот без дополнительных посттрансляционных модификаций, особенно, гомодимер (т.е. 118/118).

Термин существенно чистый означает степень чистоты всего нейротрофина, например, ΝΟΡ, по отношению ко всему протеину, в котором, по крайней мере, 70% нейротрофина, более предпочтительно, по крайней мере, 80% и даже более предпочтительно увеличение содержания нейротрофина до, по крайней мере, 90, 95 или 99%. Особенно предпочтительна чистота 95%.

Термин по существу чистый означает, что композиция является, по крайней мере, 90% чистоты или более чистой по нужному нейротрофину.

Термин практически не содержащий варианта нейротрофина означает композицию, в которой процентное содержание нужного вида нейротрофина ко всему нейротрофину (в том числе менее желаемый вид нейротрофина) составляет, по крайней мере, 70% требуемого вида нейротрофина, более предпочтительно, по крайней мере, 80% и даже более предпочтительно увеличение, по крайней мере, до 90, 93, 95 или 99%. Практически не содержащий означает, что композиция содержит, по крайней мере, 90% или более необходимого нейротрофина. Особенно предпочтительным уровнем является, по крайней мере, 95% необходимого нейротрофина, например, правильно упорядоченного, интактного 118/118 ιΊιΝΟΡ вида. Другими нежелательными видами или формами могут быть ошибочно процессированные формы или химические варианты, например, варианты с измененным зарядом, являющиеся результатом ферментации или способа очистки или всего вышеперечисленного. Например, когда ΝΟΡ упорядочен ίη νίίτο после бактериального синтеза виды или варианты могут включать ошибочно упорядоченные или частично упорядоченные формы.

Термин ошибочно упорядоченный вариант означает вариант нейротрофина, который отличается от нейротрофина спариванием его остатков цистеина или отдельными остатками цистеина, которые доступны или блокированы. Ошибочно упорядоченные варианты могут иметь также одинаковое с нейротрофином спаривание остатков цистеина, но отличаться трехмерной конформацией, являющейся следствием ошибочного упорядочения.

Под химическим вариантом понимается вариант, который отличается от нейротрофина химически, например, имеющий измененный заряд или отличающийся карбамилированием, деамидированием, окислением, гликозилированием или протеолитическим расщеплением.

Буферы, используемые в данном изобретении для колонки, обычно имеют рН в пределах от 5 до 8. Буферы, которые способны контролировать рН в данном пределе, включают, например, цитратный, сукцинатный, фосфатный, МЕ8, ΑΌΑ, В18-ТШ8 Ргорапе, Р1РЕ8, АСЕ8, имидазольный, буфер на основе диэтилмалоновой кислоты, МОР8, МОР8О, ТЕ8, ТШ8-буфер, например, ТШ8-НС1, НЕРЕ8, НЕРР8, Т'В1С1\Е. глицинамидный, В1С1ИЕ, глицилглициновый и боратный буферы. Предпочтительным является буфер МОР§О.

Под употребляемым в данном изобретении термином спирты и спиртовые растворители понимают обычно применяемую терминологию для спирта, предпочтительно спирты с числом атомов углерода от 1 до 10, более предпочтительно - метанол, этанол, изопропанол, нпропанол или трет-бутанол, а также глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, гексиленгликоль, полипропиленгликоль и полиэтиленгликоль и наиболее предпочтительно этиловый спирт или изопропиловый спирт. Эти спирты являются растворителями, которые при добавлении к водному раствору увеличивают его гидрофобность при уменьшении полярности раствора.

ΜΘΡ8Θ представляет собой 3-(Νморфолино)-2-гидроксипропан-сульфокислоту. ΗΕΡΕ8 является Ν-2-гидроксиэтилпиперазин№2-этансульфокислотой. Реактивный спирт состоит из 95 объемных частей особо денатурированного спирта формулы ЗА и 5 объемных частей изопропилового спирта). ΜΕ8 представляет собой 2-(№морфолино)этансульфокислоту. ИР/БЕ означает ультрафильтрацию/диафильтрацию. ТМАС является тетраметиламмоний хлоридом. ТЕАС представляет собой тетраэтиламмоний хлорид. ΝΟΕ-120 означает фактор роста нервной ткани с полной длиной 120/120. ΝΟΕ118 означает молекулу гомодимерного зрелого ΝΟΕ из 118 остатков. Окисленный ΝΟΕ означает разновидность молекулы ΝΟΕ - Метсульфоксидзу, о котором в данном изобретении сообщается, что его биологическая активность составляет 80% от зрелого нативного ΝΟΕ. Поакр ΝΟΕ означает изомеризованный вариант молекулы ΝΟΕ, Акр93. Деамидированный ΝΟΕ означает ΝΟΕ, у которого Акп45 превращен в Акр45. ΒΝΟΕ означает ΝΟΕ молекулу с дополнительным остатком аргинина на ее Ν-конце. СНО означает клетки яичника китайского хомячка.

Полимеры, описанные в данном изобретении включают МАСВОРКЕР НЮН 8 катионообменную смолу (ВЮ-ВАБ йаЬогаЮпек; сильная катионообменная смола с 8О₃ функциональной группой; номинальный размер частицы 50 мк; номинальный размер пор 1000А); силикагель (недериватизированный); низкозамещенную фенилсефарозу быстрого пропускания (Рйепу1 8ерйагоке Еак! Ε1ο\ν йоте 8υ6δΙίΙυΙίοη, Рйагтас1а; высокоперекрестносшитая 6% агароза; размер частиц 45-165 микрон); 8Р-сефароза НР (Рйагташа; высокоперекрестносшитая 6% агароза; размер частиц 34 микрона); Рйепу1 Тоуореаг1 650 М (ГокоНаак; размер частиц 40-90 микрон); и Егас!оде1 ΕΜΌ 8О3-650 8 (ЕМ 8ерагайоик, американский партнер Е.Мегск (Германия); размер частиц 25-40 микрон).

Способы осуществления изобретения

Нейротрофины принадлежат к семейству малых щелочных (основных) протеинов, которые играют решающую роль в развитии и сохранении нервной системы. Первым идентифицированным и, вероятно, наиболее изученным представителем данного семейства является фактор роста нервной ткани (ΝΟΕ). См. и.8. Ра!. №. 5 1 69 7 62, 188иеб БесетЬег 8, 1992. За последнее время были идентифицированы являющиеся продолжением родственных, но отличные от них полипептиды с подобными ΝΟΕ функциями. Например, относящийся к мозгу нейротрофический фактор (ΒΌΝΕ), называемый также нейротрофином-2 (ΝΤ2), клонировали и секвенировали согласно ЬеЛгоск е! а1. (№1иге. 341: 49-152 (1989)). Несколько групп, первоначально определяющих нейротрофический фактор, назывались нейронным фактором (пеигопа1 Гас Юг, ΝΕ) и в настоящее время называются нейротрофином-3 (ΝΤ3) (ΕτηΡοΓΚ е! а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. И8А, 87: 5454-5458 (1990); Нойп е! а1., №!иге, 344: 339 (1990); Ма18опр1егге е! а1., 8с1епсе, 247: 1446 (1990); Вокеп!йа1 е! а1., №игоп, 4: 767 (1990); 1опек, Веюйагб! Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 87: 8060-8064 (1990); Ка1кйо е! а1., ΕΕΒ8 Ье!!., 266: 187 (1990). Нейротрофин-4/5 (называемый или ΝΤ4 или ΝΤ5) идентифицирован авторами в работе (На11Ьоок е! а1., Иеигоп, 6: 845-858 (1991); Вегкте1ег е! а1., №игоп 7: 857866 (1991); 1р е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А, 89: 3060-3064 (1992). В патенте США (патент США 5364769, опубликован 15 ноября, 1994) описан ΝΤ-4/5 человека и способы его рекомбинантного экспрессирования, в данном изобретении этот патент приведен в качестве ссылки. Также сообщалось о химерных и пантропических нейротрофинах, например, о тех, которые описаны в американском патенте (патент США 5488099, опубликован 30 января, 1966), в работе (ИгГег е! а1., ΕΜΒΟ 1. 13(24): 5896-5909 (1994), и в международной заявке №О 95/33829, опубликованной 14 декабря 1995 г. (приведенной в качестве ссылки), в которых нейротрофин был модифицирован для связывания более одного рецептора или содержал рецепторсвязывающую активность, обычно в значительной степени не присутствующую в нативном нейротрофине. Особый интерес представляют нейротрофины, названные ΜΝΤ8-1 и Б15А ΝΤ3. Также особый интерес представляют нейротрофины, имеющие аминокислотный остов ΝΟΕ, но модифицированные для связывания рецепторов, отличных от 1гкА, например, !гкВ или !гкС. Предпочтительны те, в которых замещения аминокислот в ΝΟΕ осуществлены аминокислотой из соответствующего положения в ΝΤ-3, которое ответственно за связывание !гк рецептора ΝΤ-3. Такие ΝΟΕ мутанты имеют подобную ΝΤ-3 рецепторсвязывающую активность, сохраняя в то же время фармакокинетическое поведение и способ очистки ΝΟΕ (ИгГег, е! а1., Вюсйет181гу 36 (16): 4775-4781 (1997)). У данных ΝΟΕ мутантов может также отсутствовать !гкА связывающая активность (8й1п, е! а1., 1. Вю1. Сйет. 269 (44): 27679-86 (1994)). Такие ΝΟΕ мутанты являются особенно предпочтительными нейротрофинами для описанного в данном изобретении применения.

Выделение рекомбинантного нейротрофина человека, например, γΙιΝΟΕ. включает отделение протеина от целого ряда разнообразных контаминантов клеток-хозяина. Каждая стадия включает специальные буферные растворы, которые позволяют осуществить достаточное разделение. Конечная или предпоследняя стадия обработки для нейротрофина осложняется при сутствием нескольких вариантов нейротрофина, которые подвергаются совместной очистке при использовании стандартной хроматографической процедуры. Если в способ выделения и очистки включена стадия переупорядочения, то варианты включают ошибочно упорядоченные формы нейротрофина. Варианты также могут включать химически отличающиеся от нейротрофина варианты, например, карбамилированные, деамидированные формы или протеолитически расщепленные формы. В случае Ν6Ε данные разновидности содержат, главным образом, димерные формы - гомодимеры, например, 120/120 или 117/117, если требуется 118/118 или гетеродимеры, например, 120/118, 117/118, химически модифицированные варианты изоаспартатные, моноокисленные, гликозилированные варианты, Ν-концевые и С-концевые процессированне формы и их димеры.

Изобретение делает возможным продуцирование нейротрофинов, особенно, γΙιΝΟΕ. в больших количествах, достаточных для терапевтического применения, например, лечения болезни Альцгеймера, периферических нейропатий, включая диабетическую и связанную со СПИДом нейропатии и др.

Ввиду сходства последовательности и конформации Ν6Ε и других нейротрофинов, особенно нейротрофинов ΝΟΕ-семейства, способы, описанные в данном изобретении, могут применяться для получения данных нейротрофинов, практически не содержащих ошибочно процессированных, ошибочно упорядоченных или частично упорядоченных, гликозилированных и/или заряженных варантов. В данном изобретении предложены полимеры для колонок и условия, которые удобны для селективного разделения нейротрофинов от этих и других близких вариантов. Нейротрофины включают ΝΤ-3, ΝΤ-4/5, ΝΤ-6, ΒΌΝΕ и формы, полученные генной инженерией, включая гетеродимерные, химерные или пантропические формы его.

Предпочтительными являются нейротрофины человека или нейротрофины с близко гомологичной человеку аминокислотной последовательностью, предпочтительно, если эта гомологичность составляет более 80%, более предпочтительно - более 90% и наиболее предпочтительно - более 95% от последовательности, относящейся к человеку. Полученный генной инженерией нейротрофин должен сохранять, по крайней мере, 50% 1гк-рецепторсвязывающей функции нативного нейротрофина, предпочтительно, по крайней мере, 75% и более предпочтительно, по крайней мере, 80%. Данные формы, полученные генной инженерией, сохраняют достаточно высокую р1 или гидрофобный характер нативного нейротрофина, чтобы гарантировать аналогичное выполнение способов, описанных в данном изобретении.

Способы, описанные в данном изобретении, как это будет видно ниже, успешно были применены к γΙιΝΟΕ. γ1ιΝΤ-3 и γΙιΝΤ-4/5. Например, γΙιΝΤ-4/5. который произведен в Е.еой, изолировали во внутриклеточных тельцах и восстанавливали и солюбилизировали из внутриклеточных телец. Восстановленный ΝΤ-4/5 частично очищали хроматографией на ИЕ-сефарозе быстрого пропускания (ИЕ-8ерйаго5е ЕаЧ Ε1ο\ν) и на 8-сефарозе быстрого пропускания (88ер11аго5е ЕаЧ Ε1ο\ν). Пул от 8-сефарозы быстрого пропускания переупорядочивали в гуанидинсодержащем буфере в течение 24 ч. Ошибочно упорядоченные формы ΝΤ-4/5 удаляли с помощью хроматографии, как описано в данном изобретении для больших количеств. Большие количества карбамилированных и усеченных (ошибочно процессированных форм) ΝΤ-4/5 удаляли с помощью катионообменной хроматографии высокого разрешения на колонке с Ро1уСа1 А НРЬС или 8Р-сефарозой НР. Для приготовления композиции очищенный γ1ιΝΤ-4/5 подвергали ультрафильтрации и диафильтрации в кислый буфер.

Один вариант изобретения включает очистку нейротрофина от его родственных вариантов, обычно после того, как нейротрофин уже был очищен от большинства других примесей, как правило, на последней или близкой к последней стадии до обессоливания или диафильтрации, предшествующей получению композиции. Смесь родственных вариантов может включать не только варианты остаточных продуктов ферментации, но также продуцированные варианты, если нейротрофин разрушается при хранении или во время процессирования.

Нейротрофины, пригодные для применения, могут быть получены любыми способами, но предпочтителен рекомбинантный метод. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейротрофины, рассматриваемая в данном изобретении, пригодна из различных источников, например, полученная с помощью химического синтеза с использованием известной ДНКпоследовательности или стандартной методики клонирования, известной специалистам. кДНК клоны, содержащие нейротрофин, например, 11ΝΟΕ-кодирующую последовательность, могут быть идентифицированы с применением олигонуклеотидных зондов гибридизации, специально созданных на основе известной последовательности нейротрофина.

До получения молекулы, имеющей нейротрофин-кодирующую последовательность, молекула вставлялась в клонирующий вектор, подходящий для экспрессии в выбранных клетках-хозяина. Кодирующий вектор создавали так, чтобы обеспечить подходящие регуляторные функции, необходимые для эффективной транскрипции, трансляции и процессинга кодирующей последовательности.

Если нейротрофин получен рекомбинантным способом, подходящими клетками хозяина для экспрессии ДНК, кодирующей нейротро фин, являются прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки. Подходящие прокариоты для данных целей включают бактерии, такие как архебактерии и эубактерии. Предпочтительными бактериями являются эубактерии, такие как грамотрицательные и грамположительные организмы, например, Еи!сгоЬае1спааесас. такие как ЕзсйспсЫа, например, Е.сой. Еи!сгоЬас!сг. Επνίπία. К1сЬз1с11а. Рго!сиз. 8а1тоис11а, например, 8а1тоис11а !урЫтигшт, 8сггайа, например, 8сггаба тагссзсаиз и 8й1дс11а; ВасШ1, такие как В. зиЬй11з и В ПсйсшГопшз (например, 8. НсйсшГопшз 41 Р, описанные в ΌΌ266710, опубликовано 12 апреля, 1989); Рзсиботоиаз, такие как Р. астидтоза; 8!гср!отуссз; ЛхоЮЬасЮг. Р1пхоЫа; УйтсозсШа; и Рагасоссиз. Подходящие хозяины Е. сой включают Е.сой А3110 (АТСС 27325). Е.сой 94 (АТСС 31446). Е.сой В и Е.сой Х1776 (АТСС 31537). Данные примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.

Полностью приведенной в данном изобретении является заявка РСТ АО 95/30686, опубликованная 16 ноября 1995. В заявке подробно описывается бактериальный синтез и способ упорядочения ΝΟΕ ίη уйто. Продукты, полученные данным способом, могут подвергаться описанным в данном изобретении методам очистки.

Также могут применяться мутантные клетки любых вышеупомянутых бактерий. Конечно, необходимо отбирать подходящие бактерии, принимая во внимание способность репликации репликона в клетках бактерий. Например, разновидности Е.сой. 8сттайа или 8а1тоис11а могут соответствующим образом использоваться в качестве хозяина, когда применяются известные плазмиды, такие как рВК.322. рВР325. рАСУА177 или ркЛ410 для поставки репликона. Е.сой штамм А3110 является предпочтительным хозяином или предшественником (родителем) хозяина, так как он является обычным штаммом-хозяином для ферментации продукта рекомбинантной ДНК. Предпочтительно, когда клетка-хозяин выделяет минимальные количества протеолитических ферментов. Например, штамм А3110 может быть модифицирован, чтобы оказывать воздействие на генетическую мутацию в генах, кодирующих протеины, эндогенные к хозяину, с примерами таких хозяинов, включающих Е.сой А3110 штамм 1А2, который имеет полный генотип ЮпА Δ; Е.сой А3110 штамм 9Е4, который имеет полный генотип !оиА Δ р1т3; Е.сой А3110 штамм 27С7 (АТСС 55244). который имеет полный генотип !оиА р1т3 рйоА Δ Е15 Δ(а^дΕ-1ас)169 Δ бсдР Δ отрТкаи<г>; Е.сой А3110 штамм 37Ό6, который имеет полный генотип !оиА р1т3 рйоА Δ Е15 Δ (агдЕ-1ас)169 Δ бсдР Δ отрТΔ гЬз7 ί1νΟ каи г; Е.сой А3110. штамм 40 В4, который является штаммом 37Ό6 с неканамициновой резистентной бсдР мутацией делеции, и Е.сой штамм, содержащий мутантную периплазмическую протеазу, описанную в и.8. Ра!си! № 4946783 1ззисб Аидиз! 7. 1990.

ΝΟΕ, принадлежащий человеку, был экспрессирован в Е.сой. Выделение и последовательность гена, кодирующего β-субъединицу 1ΝΟΕ, и его экспрессия в качестве гетерологичного протеина в Е.сой описана в и.8. Ра!. № 5288622. Проведенные исследования также пригодны для того, чтобы дать возможность клеткам млекопитающих продуцировать зрелый ΝΟΕ. принадлежащий человеку. При использовании генной инженерии экпрессировался βΝΟΕ. принадлежащий человеку, не содержащий других протеинов млекопитающих. Экспрессия 11ΝΟΕ в Е.сой при использовании двух генов, которые содержат измененные аминокислотные концевые остатки, приводит к экспрессии слитого протеина, который описан в Ινηί с! а1.. Сйст. Рйагт. Ви11. 34: 4724 (1986).

Кроме того прокариоты, эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяинами экспрессии для нейротрофин-кодирующих векторов. Среди низших эукариотических микроорганизмов хозяина наиболее часто используют 8ассйаготуссз ссгстыас или обычные пекарские дрожжи. Однако обычно доступны и пригодны ряд других видов, разновидностей и штаммов, например, 8сЫхозассйаготуссз ротЬс (Всасй. Хигхс. №!игс. 290: 140 (1981); ЕР 139383 риЬйзйсб Мау 2. 1985). 1<1иутс готуссз хозяины (и.8. Ра!. № 4943529; Е1ссг с! а1.. Вю/Тссйио1оду. 9: 968-975 (1991)). такие как, например, К. 1асйз (МА98-8С. СВ8683. СВ84574; 1,оп\ спсоиП с! а1.. 1. Вас!спо1.. 737 (1983)). К. ГтадШз (АТСС 12424). К. Ьи1далсиз (АТСС 16045). К. вдскстатл (АТСС 24178). К. -тайп (АТСС 56500). К. бгозорйбагит (АТСС 36906; Уаи бси Всгд с! а1.. Вю/Тссйио1оду. 8: 135 (1990)). К.!йсгто!о1сгаи5 и К. татаииз; уагго\\аа (ЕР 402226); Р1сй1а раз!ог1з (ЕР 183070; 8гсскпзйиа с! а1.. 1. Вазю МктоЬюк. 28: 265-278 (1988)); Саиб1ба; Тпсйобсгта гссз1а (ЕР 244234.); Ксигозрога сгазза (Сазс с! а1.. Ргос. №Й. Асаб 8ск И8А. 76: 52595263 (1979)); 8сйтаииютуссз. такие как

8сйтаииютуссз осабси!айз (ЕР394538 риЬйзйсб Ос!оЬсг 31. 1990); и нитчатые грибы. такие как. например. №игозрога. РсшаШит. То1урос1аб1ит (АО 91/00357 риЬйзйсб 1аииагу 10. 1991) и АзрстдШиз хозяины. такие как А. шби1аиз (Ва11аисс с! а1.. Вюсйст. Вюрйуз. Рсз. Соттии.. 112: 284-289 (1983); ТбЬиги с! а1.. Осис. 26: 205-221 (1983); УсЙои с! а1.. Ргос. Асаб. 8с1. И8А. 81: 1470-1474 (1984)) и А. тдсг (Кс11у. Нуисз. ЕМВО 1.. 4: 475-479 (1985)).

Подходящие клетки-хозяина, пригодные для экспрессии ДНК, кодирующей нейротрофин, могут также происходить от многоклеточных организмов. Такие клетки-хозяина способны к сложной процессированной и гликозили рованной активностям. По существу, пригодна любая высшая эукариотическая клеточная культура из позвоночной или беспозвоночной культуры. Примеры беспозвоночных клеток включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие рекомендуемые клетки-хозяины насекомых из хозяинов, таких как 8робор!ега Ггищрегба (гусеница), Лебек аедурй (москит), Лебек аГЬор1с!ик (москит), ЭгокорШа те1аиодак!ег (бабочка) и ВотЬух топ (см. Ьискоте е! а1., Вю/Тесйио1оду, 6: 47-55 (1988); Мб1ег е! а1., ίη Сеиебс Еидшеегίη§, 8еботе, 1.К. е! а1., ебк., Уо1. 8 (Р1еиит РиЬНкЫид, 1986), рр. 277-279; и Маеба е! а1., Ыа!ше, 315: 592-594 (1985)). Публично доступен целый ряд вирусных штаммов для трансфекции, например, Ь-1 вариант Аи!одгарйа саПГогшса ΝΡν и Вт-5 штамм ВотЬух топ ΝΡν, и такие вирусы могут использоваться в данном изобретении, особенно для трансфекции клеток 8робор!ега Ггищрегба. ΝΟΕ, принадлежащий человеку, был продуцирован в клетках насекомых, о чем сообщалось в патенте США 5272063, опубликован 21 декабря, 1993.

В качестве хозяинов могут использоваться растительные клеточные культуры хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томата и табака. Обычно растительные клетки трансфектируют при инкубировании с определенными штаммами бактерий АдгоЬас!епит !итеГас1еик, на которые предварительно воздействовали, чтобы содержали ДНК, кодирующую нейротрофин. Во время инкубирования растительной клеточной культуры с А. !итеГас1еик, ДНК, кодирующая нейротрофин, переносится в клеткухозяина растения так, что она трансфектирует, и при определенных условиях будет экспрессировать ДНК, кодирующую нейротрофин. Кроме того, доступны (пригодны) регуляторная и сигнальная последовательности, совместимые с растительными клетками, такие как последовательность промотора нопалинсинтетазы и сигнальная последовательность полииаденилирования (Эерккег е! а1., 1. Мо1. Арр1. Сеи., 1: 561 (1982)). Кроме того, ДНК сегменты, отделенные от области в 3'-5' направлении Т-ДНК 780 гена, способны активировать или увеличивать уровни транскрипции способных экпрессировать растения генов в рекомбинантной ДНК-содержащей растительной ткани (ЕР 321196 риЬНкйеб 1иие, 1989).

Примерами пригодных линий клетокхозяна млекопитающих являются Ονί линия почки обезьяны, трансформированная 8У40 (СО8-7, АТСС СЯЬ 1651); линия эмбриональной почки человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспендированной культуре, Сгайат е! а1., 1. Сеи. УбоЕ 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомячка (ВНК, АТСС ССЬ 10); клетки ЭНЕЯ яичника китайского хомячка (СНО, Иг1аиЬ, Сйакш. Ргос №111.

Асаб. 8сг И8А, 77: 4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Ма1йег. Вю1. Яергоб., 23: 243251 (1980)); клетки почки обезьяны (СУ1, АТСС ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой обезьяны (АЕЯО-76, АТСС СЯЬ-1587); клетки цервикальной карциномы человека (НЕЬА, АТСС ССЬ 2); клетки почки собаки (МОСК, АТСС ССЬ 34); клетки печени буйвольной крысы (ВЯЬ 3А, АТСС СЯЬ 1442); клетки легкого человека (V 138, АТСС ССЬ 75), клетки печени человека (Нер С2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССЬ51); ТЯ1 клетки (Ма!йег е! а1., Аииа1к Ν.Υ. Асаб. 8ск, 383: 44-68 (1982)); МЯС 5 клетки; Е84 клетки; и линия гепатомы человека (Нер С2). Предпочтительным методом является экспрессия в СНО клетки. Экзон ΝΟΕ, принадлежащего человеку, содержащий препро-ΝΟΕ, можно использовать для достижения экспрессии секретируемого зрелого ΝΟΕ (включая 118 и 120 формы), используя подходящие промоторы и вектора (патент США 5288622). Пригодны, описанные в примерах изобретения, культуры стабильных СНО клеток, стабильно трансфектированных и секретирующих зрелые формы ΝΟΕ.

Клетки-хозяины трансфектировали и, предпочтительно, трансформировали вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами и культивировали в обычной (стандартной) питательной среде, модифицированной надлежащим образом для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. Трансфекция относится к поглощению экспрессирующего вектора клеткой-хозяином независимо от того, экспрессируются ли в действительности какие-либо кодирующие последовательности. Специалистам известны многочисленные способы трансфекции, например, СаРО₄ и электропорация. Удачная трансфекция обычно распознается, если какое-либо указание действия данного вектора происходит в клетке-хозяине.

Трансформация означает введение ДНК в организм с тем, чтобы ДНК стала способной реплицировать или как внехромосомный элемент или хромосомной составной частью. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию выполняют с применением стандартных методик, пригодных для таких клеток. Кальциевая обработка, использующая хлорид кальция, как описано в разделе 1.82 монографии 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Маииа1 (№ν Υо^к, Со1б 8рбид НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1989), или электропорация обычно применяются для прокариотов или других клеток, которые содержат значительные барьеры клеточной оболочки. Для трансформации некоторых клеток растений используют инфекцию (заражение) АдгоЬас!епит !итеГааеик, как описано в работе 811а\у е! а1., Сеие 23: 315 (1983) и в заявке XVО 89/05859, опублико ванной 29 июня 1989. Кроме того, растения могут трансформироваться под влиянием ультразвука, как описано в XVО 91/00358, опубликованной 10 января 1991.

Для клеток млекопитающих без таких клеточных оболочек предпочтителен метод осаждения фосфата кальция, описанный в работе Сгайат, уап бет Ей, У1то1оду, 52: 456-457 (1978). Общие аспекты систем трансформации клеткихозяина млекопитающих описаны Ахе1 в патенте США 4399216, опубликован 16 августа, 1983. Трансформации в дрожжах обычно проводят по методу Уап 8ойпдеп е! а1., 1. Вас!, 130: 946 (1977) и Ныао е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. (И8А), 76: 3829 (1979). Однако могут использоваться также и другие методы для введения ДНК в клетки, например, такие как нуклеарная микроинъекция, электропорация, слияние бактериального протопласта с интактными клетками или поликатионами, например, полибрином, полиорнитином и.т.д. По различным методикам трансформирования клеток млекопитающих см. Кео\\п е! а1.. Ме!йобк ш Епхуто1оду (1990) Уо1. 185, рр. 527-537, и Мапзоит е! а1., ЫаШге, 336: 348-352 (1988).

Предпочтительно, если ген для ΕΝΟΕ вставляется в вектор с тем, чтобы получить доступный метионин-инициирующий кодон, предпочтительно один из двух метионининициирующих кодонов, как определено в работе Шпсй е! а1., Уинге 303: 821-825 (1983). ΕΝΟΕ ген (И11г1сй, е! а1., Со1б 8рппд Натйот 8утроыа оп ОнаШ. Вю1. ХЬУШ, р. 435 (1983); патент США № 5288622) имеет два практически по-соседству расположенных остатков метионина, которые, вероятно, должны использоваться в качестве трансляционных инициирующих кодонов (положение 1 относится к Ν-концевому остатку серина зрелого ΕΝΟΕ). Наоборот, кДНК субмаксиллярной (подчелюстной) железы мыши для ΝΟΕ, наиболее тщательно изученные факторы роста нервной ткани, имеют метионин в положении - 187 в дополнении к остаткам метионина в положениях -121 и -119. В предпочтительном варианте для экспрессии в клетках млекопитающих имеется препро-ΝΟΕ последовательность.

Если для продуцирования нейротрофина используются прокариотические клетки, они культивируются в подходящей среде, в которой промотор может конструктивно или искусственно индуцироваться, как описано в общем, например, в монографии 8атйтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8рппд Натйот ЬаЬота!огу Ргекк, Νον Уотк 1989). Любые необходимые конглютинины (добавки), кроме источников углерода, азота и неорганического фосфата, также могут включаться в соответствующих концентрациях, вводиться одни или в виде смеси с другим конглютинином или средой, например, источником комплексносвязанного азота.

Если для продуцирования нейротрофина используются клетки-хозяины млекопитающих, они могут культивироваться в целом ряде сред. Для культивирования клеток-хозяинов пригодны коммерчески доступные среды, такие как, Нат'к Е10 (81дта), минимальная поддерживающая среда (М1шта1 Е88еп11а1 Мебшт, МЕМ, 81§та), НРМ1-1640 (81дта) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (Би1Ьессо'к МобШеб Еад1е'к Мебшт, БМЕМ, 81§та). Кроме того, любая среда, описанная в обзорах, работах, патентах и заявках, (Нат, ’№а11асе, Ме!й. Ешх., 58: 44 (1979); Вагпек, 8а!о, Апа1. Вюсйет., 102: 255 (1980); патенты США №№ 4767704; 4657866; 4927762; 5122469; или

4560655; международные заявки νθ 90/03430; νθ 87/00195; или патент США №. Не. 30985, которые приведены в данном изобретении в виде ссылок, может использоваться в качестве культуральной среды для клеток-хозяинов. Любые из этих сред могут дополняться при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (например, инсулином, трансферрином или эпидермальным фактором роста), солями (такими, как хлористый натрий, кальций, магний и фосфат), буферами (например, НЕРЕ8), нуклеозидами (такими как, аденозин и тимидин), антибиотиками (например, препаратом гентамицин - Оеп1атуст ТМ), микроэлементами (определенными как неорганические соединения обычно присутствующие в конечных концентрациях на микромолярном уровне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые конглютинины (добавки) также могут включаться в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам. Условия культивирования, например, температура, рН и другие, являются условиями, ранее используемыми для клеткихозяина, выбранной для экспрессии, и будут ясны специалистам.

Обычно, о принципах, схемах и практических методиках для доведения до максимума продуктивности клеточных культур млекопитающих ίη уйто можно найти в Маттайап Се11 Вю!есйпо1оду: А Ргасбса1 Арргоасй, М. Ви!1ег, еб. (ШЬ Ргекк а! ОхГогб Ишуегайу Ргекк, ОхГогб, 1991). Вышеупомянутый способ можно применять независимо от того, продуцируется ли нейротрофин внутриклеточно, продуцируется ли в периплазмическом пространстве или непосредственно секретируется в среду.

Обычно культуральную жидкость собирают после соответствующего периода и выполняют стандартные идентификационные анализы, например, иммуноанализ, такой как ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ) и вестерн-блоттинг или биологические анализы, такие как РС12 клеточная дифференцировка (Сгеепе, Ь.А. Тгепбк №иго8с1., 7: 91 (1986)). Анализы для определения типа и размера варианов, описанных в данном изобретении, из вестны или приведены, или упомянуты в примерах (см. например, 8с1ипе1хег е! а!., 1 №итосйет. 59(5): 1675-83 (1992) и ВитЮи е! а1., 1. Ыеигосйет. 59(5): 1937-45(1992).

Композицию нейротрофина, полученную из клеток, предпочтительно, подвергают, по крайней мере, одной стадии очистки, предшествующей Н1С. Примеры соответствующих стадий очистки включают стадии, которые описаны в данном изобретении, в том числе аффинную хроматографию, другие способы очистки протеинов, такие как хроматографию на силикагеле, хроматографию на гепарин-сефарозе, хроматографии на амино- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование и препаративную 808-РАСЕ, в зависимости от выделяемого нейротрофина и используемой исходной культуры.

В одном варианте, где нейротрофин непосредственно секретирует в среду, среду отделяют от клеточного дебриса центрифугированием и осветленный ферментационный бульон или среду затем используют для очистки на силикагеле. В случае хроматографии на силикагеле, бульон обычно пропускают через недериватизированные частицы силикагеля так, что полипептид нейротрофина подвергается адгезии на частицах силикагеля; частицы силикагеля промывают для удаления контаминантов; и полипептид элюируют с поверхности частиц силикагеля буфером, содержащим спиртовый растворитель или полярный апротонный растворитель и соль щелочно-земельного, щелочного металла или неорганической соли аммония.

В предпочтительном варианте изобретения для отделения нейротрофина от его вариантов, а также для уменьшения количества контаминантов, применяют Масгоргер Н1дй 8 катионообменную хроматографию. Данный полимер может применяться на предварительной стадии очистки нейротрофина от культуры клеток млекопитающих, предпочтительно, для фракционирования (разделения) собранной клеточной культуральной среды. В другом варианте Масгоргер Н1дй 8 катионообменную хроматографию наиболее предпочтительно использовать непосредственно после стадии переупорядочения протеина. Очень высокая способность пропускания жидкости данной катионообменной колонки позволяет большому объему разбавленного заново упорядоченного раствора протеина или собранной клеточной культуральной среды нейротрофина легко концентрироваться перед последующими хроматографическими стадиями, например, Н1С или на 8Р-сефарозе, путем регулирования условий с тем, чтобы нейротрофины связывались на колонке. Кроме того, катионообменная природа смолы позволяет удалять несвязанные массы протеинов и некоторых ошибочно процессированных и химически модифицированных вариантов (например, измененный заряд, МЕТ37-окисленный вариант). Наиболее важно, когда присутствуют ошибочно упорядоченные или химически модифицированные варианты (например, ошибочно процессированные варианты, гликозилированный вариант (как при продуцировании культуры клеток млекопитающих)), которые отличаются по гидрофобности от нативного нейротрофина; Масгоргер полимер позволяет, по крайней мере, частично удалить эти гидрофобные варианты, существенно обогащая нативным нейротрофином, как описано в данном изобретении. Ясно, что главная цепь полимера содержит гидрофобные группы, которые промотируют неспецифические взаимодействия между нейротрофинами и полимером, что дает преимущество, как показано в данном изобретении. Обычно для элюирования пригоден буфер с рН от 5 до 8, более предпочтительно от 6 до 8 и концентрацией ТМАС от 0 до 3М. Ацетат натрия, когда присутствует для увеличения ионной силы буфера для элюирования, позволяет использовать более низкую концентрацию ТМАС. Предпочтительно хлорид ион заменить на ион ацетата.

В одном примере варианта, где нейротрофин продуцируют в периплазмическом пространстве, культуральную среду или лизат центрифугируют для удаления частиц клеточного дебриса. Мембрана и фракции растворимого протеина могут при необходимости разделяться. Нейротрофин может далее очищаться от фракции растворимого протеина и от мембранной фракции культурального лизата в зависимости от того, является ли нейротрофин мембраносвязанным, растворимым или присутствует в агрегированной форме. Нейротрофин впоследствии солюбилизируют и далее переупорядочивают с применением соответствующего буфера. Детали данного метода отделения от периплазмы для продуцирования переупорядоченного протеина описываются ниже.

Нерастворимый ненативный нейротрофин изолируют от прокариотических клетокхозяинов в пригодном для отделения буфере любым подходящим способом, например, включающим выдерживание клеток в буфере соответствующей ионной силы для солюбилизации большинства протеинов хозяина, но в которых агрегированный нейротрофин практически нерастворим, и разрушение клеток с тем, чтобы выделить внутриклеточные тельца и осуществить удачное выделение, например, центрифугированием. Данный способ хорошо известен и описан, например, в патенте США N 4511503.

Если кратко, клетки суспендируют в буфере (обычно при рН от 5 до 9, предпочтительно, от ~6 до 8, при ионной силе от ~0,01 до 2М, предпочтительно, от 0,1 до 0,2М). Для поддержания достаточной величины ионной силы пригодна любая соль, включая хлористый натрий. Клетки, суспендированные в данном буфере, далее разрушались лизисом с использованием обычно применяемых технических приемов, например, механических методов, таких как например, Мап1оп-Саи1т пресс-микрофлюидизатор, Етепсй пресс или ультразвуковой осциллятор, или с помощью химических или ферментативных способов.

Примеры химических или ферментативных способов разрушения клеток включают сферопластирование, которое влечет за собой использование лизозима для разрушения стенок бактерий (Ыеи с1 а1., Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт., 17: 215 (1964)) и осмотический шок, который включает обработку жизнеспособных клеток раствором высокой тоничности (концентрации) и промывку холодной водой низкой тоничности для высвобождения полипептидов (Хеи с1 а1., 1 Вю1. Сйет., 240: 3685-3692 (1965)). Третий метод, описанный в патенте США №4680262, включает контактирование трансформированных клеток бактерий с эффективным количеством низших спиртов, содержащих от 2 до 4 атомов углерода, в течение времени и при температуре, достаточных чтобы вызвать киллинг и лизис клеток.

После разрушения клеток суспензию обычно центрифугируют для осаждения внутриклеточных телец (включений). В одном варианте изобретения данную стадию проводят при ~ от 500 до 15000 хд, предпочтительно около 12000 хд в стандартной центрифуге, в течение достаточного времени, которое зависит от объема и конструкции центрифуги, как правило от 10 мин до 0,5 ч. Полученный после центрифугирования осадок содержит практически все фракции нерастворимого полипептида, но если процесс разрушения клеток не завершен, осадок может также содержать интактные клетки или фрагменты разрушенных клеток. Полнота разрушения клеток может проверяться повторным суспендированием осадка в малом количестве того же самого буферного раствора и исследованием суспензии с помощью фазовоконтрастного микроскопа. Присутствие фрагментов разрушенных клеток или целых клеток указывает на то, что необходимо дополнительное разрушение для удаления фрагментов или клеток и связанных неспособных к рефракции полипептидов. После такого дополнительного разрушения суспензию, если требуется, повторно центрифугируют и отделенный осадок ресуспендируют и анализируют. Процесс повторяют до тех пор, пока при визуальной проверке не обнаруживаются фрагменты разрушенных клеток в осажденном центрифугированием материале или пока дополнительная обработка не уменьшает размера полученного осадка.

В другом варианте нейротрофин изолируют от периплазмического пространства солюбилизацией в соответствующем буфере. Данная процедура может быть солюбилизацией ίη кйи, включающей непосредственное прибавление реагентов в ферментер после того, как нейротрофин продуцирован рекомбинантно, тем самым, избегая дополнительных стадий сбора, гомогенизации и центрифугирования при получении нейротрофина. Оставшиеся частицы могут удаляться центрифугированием или фильтрацией, или совместным использованием этих процедур.

Если нейротрофин не являлся упорядоченным, степень неупорядоченности соответственно определялась с помощью хроматографии ненативного нейротрофина, включая КР-НРЬС. Увеличение площади пика ненативной материи указывает, как много присутствует ненативного нейротрофина.

Если получали из солюбилизированных внутриклеточных телец (включений) или на более поздней стадии очистки, нейротрофин, сответственно, переупорядочивают в активную конформацию, как описано ниже.

Если нейротрофин уже находится в нерастворимой форме, перед тем как его переупорядочивают, он может солюбилизироваться при инкубировании в щелочном буфере, содержащем с11ао1гор1с агент и восстановитель в количествах, необходимых для солюбилизации в значительной степени нейротрофина. Инкубирование происходит при концентрирации нейротрофина, температуре и времени инкубирования, которые позволят осуществить солюбилизацию нейротрофина в щелочном буфере.

Определение степени солюбилизации нейротрофина в буфере осуществляют по мутности, анализируя фракционирование нейротрофина между супернатантом и осадком после центрифугирования на восстановленном 8Ό8 геле с помощью протеинового анализа (например, набор Βίο-Каб протеинового анализа) или НРЬС.

Диапазон рН щелочного буфера для солюбилизации обычно от, по крайней мере, 7,5 с предпочтительным диапазоном от 8 до 11. Примеры соответствующих буферов, которые обеспечат рН в пределах указанного диапазона, включают: глицин, САР8О (3-[циклогексиламино]-2-гидрокси-1 -пропансульфокислоту), АМР (2-амино-2-метил-1-пропанол), САР8(3[циклогексиламино] -1 -пропансульфокислоту), СНЕ8 (2-[Ы-циклогексиламино] этансульфокислоту) и ΤΒΙ8 НС1 (трис[гидроксиметил] аминометан гидрохлорид. Предпочтительным буфером является глицин или САР8О, предпочтительно при концентрации от ~20тМ, рН от 8,5 до 11, предпочтительно 10-11.

Концентрация нейротрофина в буферном растворе для солюбилизации должна быть такой, чтобы нейротрофин в значительной степени солюбилизировался и частично или полностью восстанавливался и денатурировался. Наоборот, нейротрофин вначале может быть нерастворимым. Точное количество для использования будет зависеть, например, от концентраций и типов других ингредиентов в буферном растворе, особенно от типа и количества восстановителя, типа и количества сНао(гор1с агента и рН буфера. Например, концентрация нейротрофина может увеличиваться, по крайней мере, в три раза, если концентрация восстановителя, например, ДТТ, одновременно увеличивается, поддерживая соотношение Д ТТ : нейротрофин от ~3:1 до 10:1. Желательно продуцировать более концентрированный раствор солюбилизированного протеина до переупорядочения в разбавленном растворе. Таким образом, предпочтительная концентрация нейротрофина составляет около 30 мг/мл, наиболее предпочтительным диапазоном является 30-50 мг/мл. Например, нейротрофин может солюбилизироваться до концентраций 30-50 мг/мл при концентрациях мочевины - от 5М до 7М, ДТТ - 10 тМ и разбавляться до, например, 1 мг/мл для переупорядочения.

После того, как нейротрофин солюбилизирован, его помещают или разбавляют в буфере для переупорядочения, содержащем 5-40% (об./об.) спиртового или апротонного растворителя, сйао1торю агента и соли щелочного, щелочно-земельного металла или аммония. Буфером может быть любой буфер первоначального буферного раствора с СЛР8О, глицином и причем СЛР8 предпочтителен при рН 8,5-11, особенно при концентрации ~20 тМ и наиболее предпочтителен СЛР8О и глицин. Нейротрофин может разбавляться буфером для переупорядочения, по крайней мере, в пять раз, более предпочтительно, по крайней мере, почти в десять раз. Наоборот, нейротрофин можно подвергать диализу относительно буфера переупорядочения. Переупорядочение можно проводить при 245°С, наиболее предпочтительно при 2-8°С, по крайней мере, в течение часа. Возможно, чтобы раствор содержал восстановитель и осмолит.

Восстановитель, соответственно, выбирают из тех, которые описаны выше для стадии солюбилизации в данном диапазоне концентраций. Его концентрация будет зависеть особенно от концентраций соли щелочного металла, щелочно-земельного металла или аммония, нейротрофина и растворителя. Предпочтительно, когда концентрация восстановителя составляет от 0,5 до 8 тМ, более предпочтительно от 0,5 до 5 тМ и наиболее предпочтительно от 0,5 до 2 тМ. Предпочтительными восстановителями являются ДТТ и цистеин.

Содержание кислорода в переупорядоченном растворе можно, вероятно, уменьшить добавлением инертного газа, например, гелия и аргона для вытеснения кислорода.

Возможным осмолитом предпочтительно является сахароза (при концентрации 0,25-1М) или глицерин (при концентрации 1-4М). Более предпочтительной концентрацией сахарозы является 1М концентрация и 4М концентрация глицерина.

Начальная концентрация нейротрофина в буфере переупорядочения является такой, чтобы соотношение правильно упорядоченного к ошибочно упорядоченному выделенному конформеру было максимальное, определенное с помощью НРЬС, Κ.ΙΆ или биоанализа. Предпочтительной концентрацией нейротрофина (приводящей к максимальному выходу правильно уложенного конформера) является концентрация в диапазоне от 0,1 до 15 мг/мл, более предпочтительно от 0,1 до 6 мг/мл и наиболее предпочтительно от 0,2 до 5 мг/мл.

Степень переупорядочения, которая происходит при этом инкубировании, соответственно определяют с помощью ΚΙΆ титра нейротрофина или с помощью НРЬС по увеличению ΒΙΆ титра или размеру пика правильно упорядоченного нейротрофина, непосредственно коррелирующих с увеличенными количествами правильного упорядоченного, биологически активного конформера нейротрофина, присутствующего в буфере. Инкубирование проводят для увеличения выхода правильно упорядоченного конформера нейротрофина до максимума и увеличения до максимума соотношения правильно упорядоченного выделенного конформера нейротрофина к ошибочно упорядоченному конформеру нейротрофина, определенных по ΒΙΆ или НРЬС и для уменьшения до минимума выхода мультимерного связанного нейротрофина, определенного по материальному балансу. Наоборот, разновидность может определяться с помощью способов, приведенных ниже и в примерах. Гуанидин является предпочтительным денатурирующим агентом переупорядочения.

После того, как нейротрофин переупорядочен, следующие методики, предложенные в данном изобретении, отдельно или в комбинации, применяются для получения продукта более высокой чистоты и гомогенности: фракционирование на катионообменных колонках; гидрофобная хроматография (Н1С); и хроматография на силикагеле.

В зависимости от того, является ли стадия переупорядочения частью процесса или нет, предпочтительной стадией для отделения нейротрофина от его вариантов является разделение на полимерной колонке для гидрофобной хроматографии. Во время ферментации, очистки или переупорядочения протеина ίη νίΐτο, некоторые протеины могут химически модифицироваться, ошибочно процессироваться или могут не переупорядочиваться в нативную трехмерную структуру, а скорее в другие структуры, которые отличаются по их стабильности, растворимости, иммуногенности или биоактивности. Данные варианты должны удаляться во время выделения, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов, например, антигенности или потери эффективности. Если вариант нерастворим, его легко удалить способом отделения твердых тел от жидкости, например, цен трифугированием и фильтрацией. Однако, если вариант растворим, для его отделения потребуется адсорбционный способ более высокого разрешения, такой как хроматография. Нейротрофины образуют растворимый стабильный ошибочно упорядоченный вариант, если продуцируются в прокариотических клетках или когда переупорядочиваются ίη νίίτο. Ошибочно упорядоченный нейротрофин имеет измененную структуру дисульфидного спаривания и трехмерную структуру по сравнению с нативным нейротрофином и испытывает недостаток нативной фармакологической активности. Если продуцировали в эукариотической клеточной культуре, например, клеточной культуре млекопитающих, формы вариантов обычно являются ошибочно процессированными формами. Они также обычно испытывают недостаток нативной фармакологической активности и должны удаляться. В данном изобретении было найдено, что Н1С пригоден для отделения этих вариантов от нативного нейротрофина.

Н1С включает последовательную адсорбцию и десорбцию протеина с твердой матрицы, обусловленную нековалентным гидрофобным связыванием. Обычно образцы молекул в буфере с высокой концентрацией соли наносили на Н1С колонку. Соль в буфере взаимодействует с молекулами воды, уменьшая сольватацию молекул в растворе, тем самым, раскрывая гидрофобные области в молекулах образцов, которые в результате адсорбируются Н1С колонкой. Чем более гидрофобна молекула, тем меньше соли требуется для промотирования связывания. Обычно для элюирования образцов с колонки используют уменьшающийся солевой градиент. По мере того, как ионная сила уменьшается, раскрытие гидрофобных областей молекул увеличивается и молекулы элюируются с колонки в порядке увеличения гидрофобности.

Элюирование образца также может быть достигнуто прибавлением мягких органических модификаторов или детергентов к буферу для элюирования. Обзор по Н1С приведен в Рго1сш Рштйсайоп, 2й Ей., 8ргшдсг- Усг1ад. №\ν Уогк, рр. 175-179(1988).

Сила связывания между протеином и матрицей зависит от нескольких факторов, включая размер и гидрофобные свойства иммобилизованной функциональной группы, полярности и поверхностного натяжения окружающего растворителя и гидрофобности протеина. Связывающая способность Н1С матриц имеет тенденцию снижаться вследствие необходимого иммобилизованного гидрофобного лиганда широко размещаться. Кроме того, емкость среды для данного протеина изменяется обратно пропорционально с уровнем (количеством) гидрофобных примесей в образце. Для того, чтобы отделить нужный протеин от вариантов и других примесей, одновременно увеличивая до максимума емкость, необходимо определить подхо дящую Н1С твердофазную среду, а также подходящие подвижные фазы для нанесения, промывки и элюирования.

Как найдено в данном изобретении, самой подходящей средой для разделения правильно упорядоченных и ошибочно упорядоченных нейротрофинов или ошибочно процессированных форм от интактных правильно процессированных форм, являлась среда с иммобилизованными фенильными функциональными группами. Н1С среда на основе фенильных групп от различных поставщиков проявляла различную эффективность для разделения этих форм нейротрофина. Самые лучшие результаты достигались с Рйспу1 Тоуорсаг1 средой от ТокоНаак и низкозамещенной фенилсефарозой быстрого пропускания (Рйспу1 8срйагокс Εа8ί Р1о\\' Ьо\у 8иЬ). Также пригодна Т8К Рйспу1 5РА. Другие Н1С-иммобилизованные функциональные группы могут действовать для разделения данных форм. Примерами являлись октильные группы, как например, на Ос1у1 8срйагокс СЬ4В среде от Рйатшааа и пропильные группы, как например, на Нщй Ргору1 среде от Ваксг. Менее предпочтительны полимеры, содержащие алкоксигруппы, бутильные и изоамильные группы.

Н1С пригодна для отделения нейротрофинов от их вариантов в среде клеток млекопитающих. Например, как определено в данном изобретении, гКИОЕ-экспрессирующая СНОклеточная культура содержала ошибочно протеолитически процессированные варианты, как например, такие, в которых присутствует частичная последовательность предшественника, например, последовательности предшественника ΝΟΕ, гибридного предшественника ΝΟΕ и усеченного (сйррсй) предшественника ΝΟΕ. Также найдено, что в культуральной среде клеток млекопитающих имелись гликозилированные ΝΟΕ и гликозилированные формы ошибочно протеолитически процессированных вариантов. Нежелательные гликозилированные формы, которые в случае ΝΟΕ можно рассматривать в качестве частиц более высокого молекулярного веса (+2000 КО), могут генерировать нежелательную антигенную реакцию у пациентов и приводить к плохому качеству и активности продукта. Н1С эффективно разделяла гидрофобные варианты, главным образом, Ν-концевые протеолитически ошибочно процессированные варианты, включая гликозилированные формы 1Ί1ΝΟΕ Как показано в примерах, содержащий последовательность предшественника и последовательность усеченного (сйррсй) предшественника ΝΟΕ и гликозилированные формы и ΝΟΕ и содержащего ΝΟΕ последовательности предшественника элюировали в лидирующем (основном) крае ΝΟΕ пика во время фенил-Н1С. Таким образом, может быть получена тйКОЕ композиция, которая практически не содержала этих частиц и которая особенно годилась для последующей стадии, такой как катионообмен ная хроматография высокого разрешения. Н1С применима к другим нейротрофинам, а также к Ν6Ρ, независимо от источника. Например, Н1С пригодна для отделения Ν6Ρ мономеров от димеров или гомо- или гетеродимеров в зависимости от присутствующих мономерных форм, а также различает димерные формы, которые также отличаются по гидрофобности, которые получают после переупорядочения ίη νίίτο или когда продуцируют и секретируют из клеток млекопитающих. Предпочтительным источником смесей нейротрофинов при использвании Н1С является культура клеток млекопитающих, более предпочтительно СНО клеточная культура. Культуру предпочтительно подвергают, по крайней мере, одной предшествующей стадии очистки, как описано в настоящем изобретении. Н1С особенно эффективна при отделении ошибочно процессированного(ых) гликозилированного(ых) варианта(ов) от нативного рекомбинантного нейротрофина. В случае γΗΝΟΡ, гликозилированные и препро-ΝΟΡ формы менее гидрофобны, чем нативный Ν6Ρ, тем самым, элюируются раньше нативного Ν6Ρ. Ошибочно упорядоченные формы нейротрофинов (при бактериальном продуцировании) также более гидрофобны и элюируются раньше нативного нейротрофина.

Наиболее предпочтительным Н1С полимером для отделения форм нейротрофинов являлись полимеры, содержащие иммобилизованные фенильные функциональные группы. Фенилсодержащая Н1С среда от различных поставщиков обнаруживала различную эффективность в разделении этих Ν6Ρ форм. Из фенилН1С полимеров наиболее предпочтительна Рйепу1 Тоуреаг1 среда от ТокоНаак и предпочтительны также низкозамещенная фенилсефароза быстрого пропускания (Рйепу1 8ерйагоке Рак! Р1оте Ьо\\' 8иЬ) и Т8К Рйепу1 5Р\У. Предпочтительные Н1С функциональные группы включают алкоксигруппы, бутильные и изоамильные группы.

При использовании Н1С может применяться целый ряд подвижных фаз для промывки и дифференцированного элюирования форм нейротрофина. Эти подвижные фазы могут содержать несколько различных химических фрагментов, которые влияют по-разному на связывание нейротрофина со стационарной фазой. Правильно упорядоченные и ошибочно упорядоченные нейротрофины, например, ΝΤ-4/5 могут разделяться на Н1С колонке путем уменьшения градиентов солей или ступенчатого уменьшения, например, концентрации соли в подвижной фазе, таких как сульфата аммония, хлористого натрия, ацетата натрия. Соли могут влиять на связывание нейротрофина с полимером путем модуляции поверхностного натяжения подвижной фазы. Другими агентами, которые воздействуют на поверхностное натяжение, являлись цитрат натрия и тетраметиламмоний хлорид, как рассмотрено в примерах. Варианты могут также разделяться с помощью колоночной хроматографии при элюировании связанных протеинов возрастающими градиентами или ступенчатым увеличением концентрации относительно полярных органических растворителей. Примеры приемлемых растворителей включают этанол, ацетонитрил и пропанол. Прочность связывания форм нейротрофина и Н1С полимера также зависела от рН подвижной фазы, предпочтение отдавалось нейтральным растворам. Относительная гидрофобность правильно упорядоченного и ошибочно упрядоченного нейротрофина также зависела от рН раствора. Разделение вариантов и нативного нейротрофина также может осуществляться путем одновременного изменения нескольких свойств подвижной фазы во время градиента или ступенчатого элюирования. Например, подвижная фаза, которая одновременно изменялась по концентрации соли и концентрации неполярного растворителя во время элюирования, приводила к лучшему разрешению, чем когда только изменяли концентрацию соли.

Соли, использумые для Н1С и рассматриваемые в данном изобретении, включали сульфат, цитрат и ацетат аммония и хлорид калия. В зависимости от применяемой соли, концентрация ее, чтобы достигнуть связывания нейротрофина с полимером, обычно составляет от 0,5М до 3М, более предпочтительно от 0,5М до 2,5М. Например, для Ν6Ρ предпочтителен связывающий буфер с концентрацией соли от 0,8М до 1,5М, при более высоких концентрациях солей происходит осаждение Ν6Ρ на полимере, приводящее к снижению выделения. Для ΝΤ-3 предпочтителен связывающий буфер с рН 7 и концентрацией соли от 1,0М до 2,5М, более предпочтительным является хлористый натрий с концентрацией от 1,25М до 1,75М и наиболее предпочтителен с концентрацией 1,5М. Для ΝΤ4/5 предпочтителен связывающий буфер с рН 7 и концентрацией соли от 1М до 3М, более предпочтителен с концентрацией от 2М до 2,75М и наиболее предпочтителен хлористый натрий с концентрацией 2,5М. В случае ΝΤ-4/5, если при загрузке (нанесении) предпочтителен 2,5М №С1, тогда для элюирования предпочтителен 2М №1С1 с добавкой органического растворителя (например, 10% спирт, рН 7). Предпочтительно использовать снижающуюся концентрацию соли для элюирования и разделения нейротрофина и его вариантов. Для того, чтобы достигнуть элюирования, концентрация соли в буфере для элюирования обычно ниже, чем ее концентрации в буфере для нанесения, но эти концентрации могут быть одинаковыми, если компенсируются органическим растворителем.

Кроме того, применение органического растворителя имеет другое преимущество, о котором сообщалось в данном изобретении, заключающееся в том, что добавка органическо го растворителя улучшает характер элюирования, приводящего к более узкому профилю пика. Кроме этанола могут использоваться другие органические растворители, рассматриваемые в данном изобретении, включающие пропанол, изопропанол и низшие алкиленгликоли, такие как пропиленгликоль, этиленгликоль и гексиленгликоль. Правильно упорядоченные нейротрофины обычно элюируются органическим растворителем с 5 до 25% (об./об.), более предпочтительно с 5 до 20% (об./об.). Элюирование органическим растворителем может быть либо в градиенте или ступенчатым. Предпочтителен рН от близко к нейтральному до слабокислого; с рН от 5 до 8, более предпочтительно с рН от 6 до 8, рН от 6,5 до 7,5 и наиболее предпочтительно рН 7. Любые буферы, рассматриваемые в данном изобретении, включающие МОР8О, МОР8, НЕРЕ8, фосфатный, цитратный, аммонийный, ацетатный, могут применяться пока они оказывают буферное действие при нужном рН.

Согласно данному изобретению для некоторых нежелательных вариантов нейротрофина, являющихся результатом рекомбинантного продуцирования нейротрофина, применение катионообменной хроматографии высокого разрешения предпочтительно в препаративной форме, что позволяет разделить зарядмодифицированные варианты, например, карбамилированные, окисленные, изоаспартатные, деамидированные и некоторые усеченные (сйрреб) формы (например, С-концевые процессированные формы Ν6Ρ) и нативный нейротрофин. Например, Νконцевые усеченные (сйрреб) формы (например, от 2 до 4 Ν-концевых аминокислотных делеций), которые приводят к изменению заряда, которое может происходить во время бактериальной ферментации, как в случае ΝΤ-4/5 так и ΝΤ-3, можно в настоящее время удалять. В случае нейротрофинов, продуцируемых в культуре клеток млекопитающих, С-концевое процессирование может происходить в высокозаряженной концевой области. Например, 118 форма Ν6Ρ может ошибочно процессироваться или расщепляться у его С-конца до 117, 114 и 115 форм. Они могут отделяться от нативного 118 Ν6Ρ с помощью катионообменной хроматографии высокого разрешения. В особенно предпочтительных вариантах используют 8Р-сефарозу высокого разрешения (8Р-8ерйаго5е НЦ11 РегГо г та псе), Ргас1оде1 ЕМЭ 803 или полимеры на основе полиаспарагиновой кислоты, из которых Ро1уСАΤ особенно предпочтителен. Для крупных масштабов особенно предпочтительно использовать 8Р-сефарозу высокого разрешения (8Р-8ерйаго5е Н1дй РегГогтапсе) или Ргас1оде1 ЕМЭ 803.

Композиции, полученные с помощью описанных в данном изобретении способов, будут представлять практически чистый нейротрофин, чаще и предпочтительнее, по существу, чистый, и не будут практически содержать вариантов нейротрофина, более предпочтительно, по существу, не содержать вариантов нейротрофина. Например, типичный 8Р-8ерйаго5е пул после очистки Ν6Ρ от СНО клеточной культуры содержит около 92% 118, 4,6% 120, 1% деамидированного Ν6Ρ, 1% окисленного Ν6Ρ и 1% изоаспартатной формы Ν6Ρ. Обычно количество каждого вида варьируется от ~85 до 93% для 118, от 0 до 5% для 120 (в большой степени зависящего от степени эндогенного или экзогенного протеолиза, который применялся), от 0 до 5% для 117, от 0 до 3% для деамидированных форм, 0-2% для изоаспартатных форм и от 0 до 2% для окисленных форм. Чистота Ν6Ρ (всех видов) обычно выше 99,5%.

После того, как нейротрофин элюируют из колонки, его соответственно используют для получения композиции с носителем, предпочтительно фармацевтической композиции с физиологически приемлемым носителем. Композиции нейротрофина, предпочтительно, являются стерильными. Композиции нейротрофина также нашли применение ίη уйго, например, для промотирования роста и выживания нейронов в культуре.

Химическую устойчивость и физическую стабильность рекомбинантного фактора роста нервной ткани (Ν6Ρ), относящегося к человеку, в водном растворе исследовали в температурном интервале от 5 до 37°С, и в интервале рН от 4,2 до 5,8. Химическая устойчивость Ν6Ρ увеличивалась с ростом рН. В сукцинатном буфере при рН 5,8 физическая стабильность Ν6Ρ уменьшалась вследствие агрегации протеина. Основываясь, как на данных по устойчивости при 5°С, так и на исследованиях по ускоренной деградации (разрушению) при 37°С, найдено, что оптимальным составом являлся ацетатный буфер с рН 5,5 (см. \УО 97/17087, приведенную в данном изобретении в виде ссылки). НРЬС с обращенной фазой являлась основным методом, свидетельствующим об устойчивости, показывающей, что превращение Акп-93 в йо-Акр является основным направлением деградации при 5°С. Проведение количественной оценки Ν6Ρ деградации с помощью катионообменной хроматографии осложнялось перегруппировкой (реаранжировкой) Ν6Ρ мономерных вариантов в различные смешанные димеры с течением времени (димерный обмен). Обработка образцов и контрольных образцов разбавленной кислотой быстро уравновешивала мономерное распределение в димерах, позволяющее провести количественную оценку Ν6Ρ деградации в отсутствие димерного обмена. Бензиловый спирт и фенол оценивали по их совместимости с 1Ί1Ν0Ρ и его устойчивости в двух жидких составах (композициях) многократного назначения. Данные две композиции содержат 0,1 мг/мл протеина в 20 тМ ацетата натрия с рН 5,5 и 136 тМ хлорида натрия с 0,01% плуроновой кислоты (Ρ68) или без нее в качестве поверхностно-активного вещества. Конечные концентрации бензилового спирта и фенола в каждой из этих двух композиций составляли 0,9 и 0,25%, соответственно. Основываясь на 12-месячных данных по стабильности, в этих композициях 1Ί1ΝΟΗΕ более устойчив с бензиловым спиртом, чем с фенолом. Сохраняющаяся с помощью бензилового спирта 1Ί1ΝΟΕ композиция, в присутствии поверхностно-активного вещества является такой же стабильной, как композиция без добавок поверхностно-активного вещества, указывая на то, что добавка Ρ68 к ιΉΝΟΡ многодозовой композиции для ее стабильности не требуется. Поэтому композиция, содержащая 0,1 мг/мл протеина в 20 тМ ацетата, 136 тМ ИаС1, 0,9% бензилового спирта, рН 5,5, рекомендуется для использования γΙιΝΟΡ в качестве многократного назначения в ΙΙΙ фазе клинического лечения. Данная ιΉΝΟΡ многодозовая композиция, прошедшая И8Р и ЕР тест на эффективность хранения, по истечении 6 месяцев при 5°С являлась такой же стабильной, как обычная жидкая композиция с 2 мг/мл. Однако композицию следует предохранять от воздействия интенсивного света из-за присутствия бензилового спирта в качестве консерванта, который является светочувствительным.

Обычно композиции могут содержать другие компоненты в количествах, предпочтительно не влияющих на получение стабильных жидких или лиофилизированных форм, и в количествах, пригодных для эффективного безопасного фармацевтического введения.

Нейротрофин используется в получении композиции с фармацевтически приемлемым носителем, т. е. носителем, который не является токсичным к реципиентам в применяемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами композиции. Например, композиция предпочтительно не включает окислителей и других соединений, о которых известно, что они вредны для полипепитидов. Данная технология приготовления композиции достигается обессоливанием или диафильтрацией с использованием стандартной технологии.

Обычно композиции получают путем контактирования нейротрофина при хорошем перемешивании с жидкими носителями или мелко размельченными твердыми носителями, или и теми и другими. Далее, если необходимо, продукт принимает форму нужной композиции. Предпочтительным носителем является парентеральный носитель, более предпочтительным раствор, который является изотоническим с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор глюкозы. Также пригодны неводные носители, такие как жирные масла и этилолеат, а также липосомы.

Носитель, соответственно, содержит незначительные количества добавок, например, веществ, которые увеличивают изотоничность и химическую устойчивость. Такие вещества являются нетоксичными для реципиентов при применяемых дозах и концентрациях, и включают буферные растворы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный, уксусную кислоту и другие органические кислоты и их соли; антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее десяти остатков) полипептиды, например, полиаргинин или трипептиды; протеины, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирроллидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные - трегалозу, глюкозу, маннозу или декстрины; комплексообразующие агенты, например, ЕЭТА; сахарные (углеводные) спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, например, натрий; и/или неионные поверхностноактивные вещества, например, полисорбаты, полоксамеры или РЕС. Конечный препарат может быть жидким или в лиофилизированной твердой форме.

Нейротрофин, применяемый для терапевтического назначения, должен быть стерильным. Стерильность легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны (например, мембраны 0,2 мкн). Терапевтические композиции нейротрофина обычно помещают в сосуд, имеющий стерильное входное отверстие, например, мешок или флакон с пробкой, протыкаемой иглой для подкожной инъекции. Вышеперечисленные композиции также пригодны для использования ίη νίίτο.

Нейротрофин обычно должен храниться в одно- или многодозовых сосудах (флаконах), например, запаянных ампулах или флаконах, в виде водного раствора или лиофилизированного состава для получения композиции.

Примером лиофилизированной композиции служат 10 мл флаконы, которые заполняли 5 мл стерильно-фильтрованным 1% (мас./об.) водным раствором нейротрофина и полученную смесь лиофилизировали. Инфузионный раствор получали путем растворения лиофилизированного нейротрофина, используя бактериостатическую воду для инъекций (\Уа1ег-Гог-1п)ее1юп).

Пациенту назначают (вводят) терапевтически эффективную дозу композиции нейротрофина. Под «терапевтически эффективной дозой» понимают дозу, которая вызывает эффекты, ради чего она назначается. Точная доза будет зависеть от болезни, которую лечат, и должна быть установлена специалистами с использованием известных способов. Обычно композиции нейротрофина, описанные в настоящем изобретении, назначают от 0,01 мкг/кг до 100 мкг/кг в день. Предпочтительно от 0,1 до 0,3 мкг/кг. Кроме того, как известно, необходимо регулировать величину дозы с учетом возраста, а также веса тела, общего состояния здоровья, пола, питания, времени введения, взаимодействия лекарств и тяжести болезни, и должна устанавливаться обычным экспериментированием специалистами. Обычно лечащий врач должен вводить композиции нейротрофина, пока достигнет дозу, которая исправит, сохранит и оптимально восстановит функцию нейронов. Достижение данной терапии легко контролируется обычными анализами.

Нейротрофин, возможно, комбинируют с другими нейротрофическими факторами, включая ΝΟΡ. ΝΤ-4/5. ΝΤ-3 и/или ВОЖ или их сообща вводят и применяют с другими принятыми методами лечения нервных расстройств.

В случае ΝΟΡ. композиция предпочтительно включает фармацевтически эффективное количество фактора роста нервной ткани и фармацевтически приемлемый ацетатсодержащий буфер. Композиция может быть с рН от 5 до 6. Предпочтительным буфером является ацетат натрия. Концентрация ацетата натрия предпочтительно составляет от 0.1 до 200 тМ. Композиция содержит ΝΟΡ. предпочтительно, в концентрации от 0.07 до 20 мг/мл. И композиция, возможно, дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант, например, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, метилпарабен или пропилпарабен. Предпочтительным консервантом является бензиловый спирт. Концентрация бензилового спирта, предпочтительно, составляет от 0.1 до 2.0%. Композиция, возможно, содержит фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. И композиция предпочтительно, возможно, содержит физиологически приемлемую концентрацию хлористого натрия. Предпочтительнее, если композиция содержит фактор роста нервной ткани в концентрации, по крайней мере, ~0,1 мг/мл и концентрацию ионов ацетата от 10 до 50 тМ. Даже предпочтительнее, если композиция содержит фактор роста нервной ткани при концентрации от 0.1 до 2.0 мг/мл и ионов ацетата от 10 тМ до 50 тМ. Наиболее предпочтительно, если композиция содержит ΝΟΡ при концентрации 0.1 мг/мл, концентрация ацетата натрия 20 тМ. рН 5.5. концентрация хлористого натрия 136 тМ и бензилового спирта 0.9% (об./об.).

Другой вариант содержит ΝΟΡ в концентрации 2.0 мг/мл, ацетат натрия в концентрации 10 тМ. рН 5.5 и хлористый натрий при концентрации 142 тМ. Предпочтительно готовить композицию с 0.1 мг/мл ΝΟΡ. 20 тМ ацетата натрия, 136 тМ хлорида натрия, 0.9% (об./об.) бензилового спирта с рН 5.5. Как рассматривается в данном изобретении, предпочтительной формой ΝΟΡ является 118/118 гомодимер. ΝΟΡ очищают при рН от 6 до 8. чтобы сохранить нормальную димерную форму. Однако процентное содержание (протеолитически) усеченных (сйрреб) форм представляется мономерны ми формами, которые становятся очевидными и определяются НРЬС с обращенной фазой. В кислых условиях аналитической НРЬС димеры диссоциируют. О существовании различных димерных форм ΝΟΡ-120/120. 120/118. 118/118 и т.д. опубликовано в работе (8сйтекег е! а1.. 1. №ι.ιΐΌθι;ιη 59: 1675-1683 (1992). работа, специально приведенная здесь полностью, главным образом, для аналитических и биоанализов, которые применяли в данном исследовании, а также для общего обучения). В публикации сообщалось, что активности ш ν 11го были одинаковыми для каждой димерной формы. Однако наоборот, настоящие исследования, используя радиорецепторный анализ, впервые продемонстрировали, что 120/120 димер менее активен и его активность составляет 80-90% от активности 118/118 вида. В одном типе анализа мембраны РС-12 клеток крысы изолировали и использовали при конкурентном связывании стандартного ΝΟΡ и различных проверяемых видов. ККА имеет и Р75 и 1гкЛ рецепторы. В данном изобретении найдено, что 117/117 вид также активен, как и 118/118 вид. Кроме того, применение анализа на основе РС-1 2 подтвердило полученные на основе рецепторного анализа данные, показывающие, что активность 120/120 формы составляет 60% от активности 118/118 формы. Также полностью в качестве ссылки приведена работа Виг!оп е! а!.. 1. №ι.ιΐΌθκιη. 59: 1937-1945 (1992). главным образом, для аналитического и биологического анализа, которые применяли в данных исследованиях, а также для общего знания.

Считается, что форма 118/118 более биологически доступна у людей, чем 120/120 форма. Увеличение биологической доступности является, по крайней мере, 4-5-кратной. Данное различие значительно, удивительно и неожиданно с точки зрения науки.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения. Процитированная литература специально приведена в виде ссылок.

Примеры

Пример 1. Очистка 118/118 ΝΟΡ гомодимера.

Данный пример иллюстрирует очистку ΝΟΡ и разумное объяснение каждой стадии. Также в каждом из примеров специалисты могут легко определить и регулировать размеры колонки и скорости потока, чтобы уравнять начальные объемы культуры и концентрации протеина.

Собранная клеточная культуральная жидкость

Рекомбинантную СНО клетку трансфектировали экспрессирующим вектором, содержащим ΝΟΡ. относящийся к человеку, с 120 аминокислотными остатками, кодирующий ДНК последовательность. Для промотирования секреции и процессирования также имелась ΝΟΡ препро-последовательность. После культивиро вания рекомбинантных СНО клеток, собирали клеточную культуральную среду. Собранная клеточная культуральная жидкость (НаггеЧей Се11 СиНиге Ρ1ωά, НССΡ) содержала ΝΟΡ формы 120, 118 и 117. Около 40-70% ΝΟΡ обычно являлось 118/118 гомодимером и остальное гетеродимеры 120/118, 120/120 и небольшое количество 118/117. Как указывается в данном изобретении, данные формы могут разделяться на колонке с 8Р-сефарозой НР (8Р-8ерЬаго§е НР).

Собранную клеточную культуральную жидкость концентрировали примерно 20кратно, используя М1Шроге 10 Кй мембраны (применяли взаимозаменяющиеся мембраны из целлюлозы, композита или полисульфона). К концентрату прибавляли 0,1 объем 1,0М Тп5. рН 8,2. Разбавленный раствор подвергали микрофильтрации, используя 0,22 ит фильтр, и переносили в емкость для выдерживания при 37°С в течение от 2 до 18 часов. Превращение 120/120 формы в 118/118 форму катализируется эндогенной протеазой во время выдерживания.

Хроматография на силикагеле

Микрофильтрат доводили до 1М ΝαΟΊ и использовали колонку из силикагеля, уравновешенную 1М №С1, 25тМ МОР8О, рН 7. Колонку промывали 1М №С1, 25тМ МОР8О, рН 7. Подходящий диапазон рН составляет от 6 до 8, предпочтительно рН 7. Далее колонку промывали 25 тМ МОР8О, рН 7. Промывание раствором низкой проводимости удаляет протеины клетки-хозяина. Связанный ΝΟΡ элюировали 50 тМ МОР8О, 0,5М ТМАС, 20% реактивным безводным спиртом (94-96% специально денатурированный спирт формулы 3А (5 объемов метанола и 100 объемов 200 этанола определенной концентрации) и 4-6% изопропанола). Могут использоваться другие спирты, например, 20% пропанол, 20% изопропанол и 20% метанол. Спирт и спиртовые растворители означают общепринятую терминологию для спирта, предпочтительно спирты, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, более предпочтительно метанол, этанол изопропанол, н-пропанол или трет-бутанол и наиболее предпочтительно этанол или изопропанол. Эти спирты являются растворителями, которые при добавлении к водному раствору увеличивают гидрофобность раствора при уменьшении его полярности. Наиболее предпочтителен этанол. Низший предел спирта является спиртом любого процентного содержания, который элюирует и верхний предел устанавливается таковым, чтобы предотвратить денатурирование протеина. Концентрация растворителя предпочтительно от 5 до 25%, более предпочтительно от 5 до 20%, даже более предпочтительно от 5 до 15%. ТМАС представляет собой тетраметиламмоний хлорид, который добавляют для элюирования ΝΟΡ. Концентрация ТМАС может изменяться от 0,1 до 1М. Интервал от 0,3 до 0,7М более предпочтителен.

Количество ТМАС, применяемое для элюирования ΝΟΡ, является функцией рН и концентрации спирта. Чем ниже рН, тем меньше количества спирта и ТМАС требуются. рН может быть в пределах от 4 до 8. В данном примере предпочтительным рН являлся рН 7, который предусматривает совсем минимальное регулирование объединенных фракций до нанесения их на следующую колонку. Верхний предел рН определяется величиной рН, необходимой для загрузки следующей колонки, и нижний предел - величиной рН, пригодной для эффективного элюирования ΝΟΡ.

Хроматография на 8-сефарозе быстрого пропускания

Элюат, содержащий ΝΟΡ, собирали, разбавляли очищенной водой до проводимости меньшей, чем 15,5 мс/см и рН доводили до 7,0. Раствор выдерживали не более 8 ч, поскольку еще присутствовало несколько протеаз; однако, не наблюдалась активность эндогенной протеазы, которая превращает 120 аминокислотной ΝΟΡ в 118 форму. Вещество наносили на хроматографическую колонку с 8-сефарозой быстрого пропускания (8-8ерНаго5е Ρακί Е1о\у) (катионообменная колонка 8-8ЕРНАЯО8Е ТМ адагоке Ρακί Е1о\у ТМ (РНагтааа)), уравновешенную 25 тМ МОР8О, рН 7. Колонку промывали 25 тМ МОР8О, рН 7. Подходящий интервал рН составлял от 6 до 8, предпочтительно 7. Колонку далее промывали 0,16М №С1, рН 7. Связанный ΝΟΡ элюировали 0,5М №С1, рН 7. Молярность соли для элюирования может варьироваться от 0,3 до 1,0М, более предпочтительно от 0,4 до 0,6М. Нижний предел определяется способностью элюировать весь ΝΟΡ и верхний предел определяется необходимостью предотвратить удаление контаминантов и причину гидрофобного взаимодействия на колонке, что будет мешать элюированию ΝΟΡ. Могут использоваться другие соли, предпочтительной является КС1. Элюирование 0,5М №С1, рН 7 предпочтительно для того, чтобы получить пул малого объема. При более высоких концентрациях, например, выше 1М, можно элюировать прочносвязанные контаминанты.

Хроматография на Рйеиу1 Тоуореаг1 650М

Фракции 88ΡΡ колонки, содержащие ΝΟΡ, собирали, доводили до 1М №С1 и наносили на Р1епу1 Тоуореаг1 650М колонку. Колонку промывали 25 тМ МОР8О, рН 7. Подходящее значение рН находится в диапазоне от 5 до 8. Связанный ΝΟΡ элюировали 10 СУ (объем колонки) линейным градиентом, начиная с градиентного буфера А (25 тМ МОР8О, рН 7, 1,0М №1С1) и заканчивая градиентным буфером В (20% спирт в 80% 25тМ, МОР8О, рН 7).

Фракции, содержащие ΝΟΡ, анализировали 8Э8-РАСЕ электрофорезом в полиакриламидном геле, чтобы определить, какие фракции содержали формы предшественника ΝΟΡ. Фракции, содержащие ΝΟΡ, собирали и объе диняли для удаления, главным образом, ошибочно процессированных вариантов, например таких, в которых присутствует последовательность частичного предшественника, например, последовательности предшественника ΝΟΕ, гибридного предшественника ΝΟΕ и усеченного (сйррей) предшественника ΝΟΕ, чтобы получить ΝΟΕ композицию, практически не содержащую любые последовательности ΝΟΕ предшественников. Фенильная колонка также удаляла малое количество последовательностей гликозилированного ΝΟΕ и гликозилированного ΝΟΕ предшественника. Последовательности предшественника и усеченного (сйррей) предшественника ΝΟΕ вместе с гликозилированными формами и ΝΟΕ, и предшественника ΝΟΕ элюировали в лидирующем (основном) крае ΝΟΕ пика. Таким образом, данная колонка легко разделяет ΝΟΕ и различные формы ΝΟΕ, позволяя получить ΝΟΕ композицию, практически не содержащую эти формы. На данной стадии при использовании Н1С разделялись гидрофобные ΝΟΕ варианты, главным образом, ошибочно процессированные варианты, включающие протеолитические и гликозилированные варианты.

Наиболее пригодной средой для разделения ΝΟΕ форм являлись среды, содержащие иммобилизованные фенильные функциональные группы. Фенилсодержащая Н1С среда от различных поставщиков проявляла различную эффективность в разделении этих ΝΟΕ форм. Наилучшие результаты достигались с помощью Р1епу1 Тоуореаг1 среды отТокоНаак. Низкозамещенная фенилсефароза быстрого пропускания (Р1епу1 8ерБагоке Εакΐ Ε^ιν Ьо\\' 8иЬ) и Т8К Р1епу1 5Р\У работали хорошо. Другие Н1С функциональные группы менее пригодны и менее эффективны в этих условиях, включая алкоксигруппы, бутильные и изоамильные группы.

Р1епу1 Тоуореаг1 пул содержал 75% 118, 10% 120, 7% 117, 1,8% деамидированного ΝΟΕ, 1,4% окисленного ΝΟΕ и 2,0% изоаспартатного ΝΟΕ, оставшиеся 2,8% представляли другие неидентифицированные ΝΟΕ формы.

Обычно, объединенные фракции подкисляли для достижения вирусной инактивации при рН ниже 3,95, минимум в течение 15 мин.

Хроматография на 8Р-сефарозе НР

Н1С пул разбавляли 0,5-1 объемом воды и разбавленный пул доводили до рН 6. Пул наносили на колонку с 8Р-сефарозой НР, уравновешенной 0,2М хлорида натрия, 20 тМ сукцината натрия, рН 6, содержащую 5% реактивного спирта (как в стадии на колонке из силикагеля). Колонку промывали раствором 0,2М ЫаС1, 20 тМ сукцината натрия, рН 6, содержащим 5% реактивного спирта (спирт формулы 8ΌΑ-3Α; спирт обычно присутствует). Спирт помогает уменьшить неспецифические (главным образом гидрофобные) взаимодействия ΝΟΕ с главной цепью полимера. Пригоден диапазон концентрации спирта от 0 до 10%. рН при загрузке составляет от 5 до 8, он выбран таким, чтобы достигнуть и сохранить максимальную стабильность ΝΟΕ и разделить ΝΟΕ варианты. Колонку промывали уравновешенным буфером, объем которого соответствовал двум объемам колонки. Связанный ΝΟΕ элюировали и отделяли от вариантов с помощью линейного градиента, объем которого соответствовал 22 объемам колонки, смешиванием 11 колоночных объемов градиентного буфера А (0,25М ЫаС1, 0,02М сукцината, рН 6, содержащий 5% спирта) и 11 колоночных объемов градиентного буфера В (0,5М ЫаС1, рН 6). Спирт не является обязательной добавкой. 118/118 ΝΟΕ обычно элюировали ЫаС1 с концентрацией 0,35 - 0,40М.

Фракции из колонки анализировали на содержание ΝΟΕ и ΝΟΕ-вариантов. Фракции, предпочтительно, анализировали с помощью С4ЯР-НРЬС, как описано в работах 8с1ппе1хег е1 а1. (1992), кирга и ВшГоп е1 а1. (1992), кирга. Фракции собирали и объединяли для получения композиции ΝΟΕ, которая практически не содержала модифицированных ΝΟΕ вариантов, например, заряженных форм, таких как окисленных, деамидированных и изоаспартатных ΝΟΕ форм. Предыдущая Н1С колонка не могла эффективно удалять другие формы вариантов ΝΟΕ, например, окисленного и изоаспартатного ΝΟΕ. Н1С колонка эффективно удаляла ошибочно упорядоченные протеины и гликозилированные формы, которые связываются более прочно с Н1С полимером, чем правильно упорядоченные ΝΟΕ, т.к. они более гидрофобны. Соответственно, катионообменный полимер, например, 8Р-сефарозу НР использовали для удаления вариантов с измененным зарядом, не удаляемые Н1С полимером.

Пул с колонки с 8Р-сефарозой обычно содержал 92% 118, 4,6% 120, 1% деамидированного ΝΟΕ, 1% окисленного ΝΟΕ и 1% изоаспартатного ΝΟΕ. Обычно количество каждой формы варьируется от 85 до 93% для 118, от 0 до 5% для 120, от 0 до 5% для 117, от 0 до 3% для деамидированных форм, от 0 до 2% для изоаспартатных форм и от 0 до 2% для окисленных форм. Чистота ΝΟΕ (все формы) обычно выше 99,5%.

Приготовление композиции

Пул 8Р-сефарозы НР получали для приготовления композиции ультрафильтрацией/диафильтрацией в буфере, применяемой в композиции. Предпочтительно использовать кислый буфер, предпочтителен ацетатный буфер с рН 5, как рассматривалось выше. 118/118 ΝΟΕ композиция практически не содержит ΝΟΕ вариантов и является практически чистым ΝΟΕ. Вещества, входящие в композицию, пригодны для лечения неврологических нарушений, особенно периферической нейропатии, связанной с диабетом, и периферической сенсорной нейропатией, связанной со СПИДом.

Пример 2. Очистка 120/120 NСР гомодимера в крупном масштабе.

Собранная клеточная культуральная жидкость

НССР обычно получали из 12000 л СНО клеточной структуры, как описано в примере 1. Распределение NСΡ форм в НССР составляло 40-65% 120/120 гомодимера с 120/118 гетеродимером и оставшимся количеством 118/118 гомодимера. Обычно среду быстро процессировали, чтобы довести до минимума протеолитическое превращение 120 в 118.

Масгоргер Нщ11 8 катионообменная хроматография

НССР наносили на Масгоргер Нщ11 8 катионообменную хроматографическую колонку, промывали 1,5М ацетата натрия, 50 тМ НЕРЕ8 рН 7. Связанный NСР элюировали 1,5М №С1, 0,25М ТМАС, 0,2% тиодигликоля, рН 7. Масгоргер колонка может работать при рН от 5 до 8 с регулированием концентрации ацетата. Хлорид является предпочтительным заместителем ацетат-иона. NСР элюировали в ТМАС градиенте. ТМАС представляет собой соль, обладающую и ионным, и гидрофобным свойством, что является полезным свойством, поскольку главная цепь некоторых полимеров содержит гидрофобный фрагмент, который промотирует неспецифическое взаимодействие между NСР и полимером. Обычно для буфера элюирования с рН от 6 до 8, пригоден ТМАС с концентрацией от 0 до 3М. Собирали фракции, содержащие NСР.

Хроматография на силикагеле

Пул непосредственно наносили на хроматографическую колонку из силикагеля. Силикагель относится к смешанному типу хроматографического носителя, обладающего ионными, полярными и гидрофобными взаимодействиями, которые играют роль в протеинсвязывающих свойствах. Колонка уравновешивалась 1М №С1, 25 тМ МОР8О, рН 7. Колонку промывали 1М №С1, 25 тМ МОР8О, рН 7 (предпочтительно от рН 5,0 до 8,5, более предпочтительно с рН от 6 до 8 и наиболее предпочтительно рН 7). Связанный NСР элюировали 25 тМ сукцината, рН 3,9, 50 тМ ТЕАС (тетраэтиламмоний хлорид). ТЕАС представляет собой более мощный элюент, чем ТМАС. рН предпочтительно варьируется от 3,5 до 8. Однако рН выше 7,5 необходимо избегать в течение продолжительного периода времени для того, чтобы предотвратить или уменьшить образование деамидированных форм NСР. Обычно чем ниже рН буфера, тем ниже концентрация соли со смешанными свойствами, такой как ТМАС или ТЕАС, необходимой для элюирования NСР с колонки силикагеля. Для применения пригодны буферы, обладающие хорошей буферной емкостью при рН около 4-5. Возможно присутствие соли в буфере для элюирования, так что колонка может промываться

МОР8О буфером без соли до применения буфера для элюирования.

Хроматография на фенилсефарозе быстрого пропускания (РЬепу1 8ерЬагоае Раа! Р1о\у) Идентифицировали и объединяли фракции, содержащие NСР. Пул доводили до 0,7М ацетата, рН 7, 25 тМ МОР8О. Доведенный пул наносили на хроматографическую колонку с фенилсефарозой быстрого пропускания, уравновешенную градиентным буфером А (0,7М ацетат, 25 тМ МОР8О, рН 7). Колонку промывали градиентом из 90% градиентного буфера А (0,7М ацетат, 25 тМ МОР8О, рН 7) и 10% градиентного буфера В (25 тМ МОР8О, рН 7, 20% пропиленгликоль). Можно заменить другими гликолями, например, гексиленгликолем.

Обычно промывание составляло от 2 до 3 СУ или до тех пор, пока не достигалась стабильная нулевая линия ОЭ. Промывание удаляло некоторые протеины клеток-хозяина. Связанный NСР элюировали линейным 10 СУ градиентом от смеси из 90% градиентного буфера А и 10% градиентного буфера В до 10% градиентного буфера А и 90% градиентного буфера В. В Н1С буферах ацетат можно заменить на хлорид или сульфат натрия. Предпочтителен рН от 5 до 8, более предпочтителен от 5,5 до 7,5 с приемлемым значением рН от 6 до 8 и наиболее предпочтителен около 7. Колонка отделяла любые последовательности оставшихся предшественников, последовательности частичных предшественников или гликозилированные формы, присутствующие в виде гомодимера или гетеродимера зрелого NСР мономера и NСР мономера, который еще содержал часть имеющейся последовательности предшественника. Предшественник и гликозилированные формы NСР присутствуют в лидирующем (основном) крае элюируемого пика, так что объединяли NСРсодержащие фракции, практически исключая другие формы.

Н1С пул содержал около 72% 120 мономера, 17% 118 мономера, 2,8% 117 мономера, 3,6% 0120 мономера, 0,8% изоаспартатных форм, 1,3% окисленных форм и 1% деамидированных форм по данным разделения и определения с помощью аналитической НРЬС системы.

Хроматография на 8Р-сефарозе НР

Объединяли фракции, содержащие NСР, от Н1С стадии. В большом масштабе это достигалось направлением потока, вытекающего из колонки в соответствующее время, в сборную емкость (бак-сборник). рН пула доводили до рН 6 и наносили на хроматографическую колонку с 8Р-сефарозой НР. Колонку промывали 20 тМ сукцината, 0,2М №С1, рН 6 (градиентный буфер А). Связанный NСР элюировали 22 СУ градиентом, начиная смесью из 70% градиентного буфера А и 30% градиентного буфера В и заканчивая смесью 80% градиентного буфера В (0,7М №1С1/рН 6) и 20% градиентного буфера А. рН предпочтительно составляет 5-8, более предпоч тительно с 5,7 до 6,5 и наиболее предпочтительно рН 6. Характерная хроматограмма приведена на фиг. 1.

Пул 8Р-сефарозы НР обычно содержал около 95% 120 формы, 3% В120 формы, 0,65% изоаспартатной формы, 0,6% окисленной формы, 0,6% деамидированной формы. Другие неидентифицированные формы составляли 0,6% и включали двуокисленный ΝΟΕ (Μе!37 и Μе!92) с присутствием деамидированного Акп45. НРШХ анализ, сравнивающий характерный Н1С пул (нанесенный на 8Р-сефарозу) и пул, полученный после хроматографии на 8Р-сефарозе, показан на фиг. 2. Каждая из трех основных усеченных (сйрреб) форм ΝΟΕ - 120, 118 и 117, может иметь варианты, но варианты, например, окисленные и изоаспартатные формы, преобладающей усеченной формы во время очистки (в данном примере 1 20-форма) могут мешать анализу вариантов менее преобладающей формы (в данном примере 118 и 117 - формы). НРЬС анализ фракций характерного опыта показан на фиг. 3.

8Р-сефароза НР эффективно удаляла варианты, присутствующие в Н1С пуле. В120 форма имеет дополнительный остаток аргинина у Νконца ΝΟΕ; обычно Ν-концевой аминокислотной последовательностью γΙιΝΟΕ является 888НР, но В120 имеет В888НР Ν-концевую последовательность. Таким образом, ^120форма более основная, чем зрелый ΝΟΕ и отделялась с помощью 8Р-8НР. Она характеризуется также более низкой биологической активностью, возможно связанной с тем фактом, что ΝΟΡ Ν-конец необходим для связывания рецептора (!гкА). Окисленная ΝΟΕ форма является моноокисленной формой, содержащей метионин в положении 37, который окислен, образуя более кислую форму, которая элюируется в лидирующем (основном) крае ΝΟΕ пика. Изоаспартатная форма содержит модифицированную аспарагиновую кислоту в положении 93. Изоаспартатная форма является немного более основной и поэтому связывается немного более прочно с полимером 8Р-сефарозы НР. ΝΟΕ формы, содержащие 1коАкр93, элюировали в отстающем (стелющемся) крае пика элюирования. Деамидирование происходит с аспарагиновыми остатками, обычно с аспарагином в положении 45. ΝΟΕ, содержащий деамидированный Акп, который образует Акр в положении 45, является несколько более кислым и элюировался в лидирующем (основном) крае пика элюирования.

Егас!оде1 ΕΜΌ 803 является менее предпочтительным альтернативным полимером по сравнению с 8Р-сефарозой НР для разделения заряженных вариантов ΝΟΕ форм. При использовании данного менее предпочтительного полимера для элюирования ΝΟΕ требуются более высокие концентрации №1С1.

Получение композиции

Вещество, находящееся в объеме, использовали для получения композиции путем ИЕ/БЕ в буфер, использующийся для получении композиции, как в предыдущем примере. В конечном объеме продукта 120 форма обычно варьировалась от 92 до 97%, В120 от 1 до 4%, изоаспартатная форма от 0,2 до 1,5%, окисленная форма от 0,2 до 2% и деамидированная форма от 0,2 до 2%. Содержание 117 и 118 форм обычно составляло менее 2%. Конечный продукт обычно представлял собой, по крайней мере, чистый ΝΟΕ с содержанием 99,5% ΝΟΕ (включая все формы).

Пример 3. Выделение 118/118 формы.

В одном предпочтительном варианте, чтобы получить, по существу, чистую 118/118 ΝΟΕ композицию, которая практически не содержала бы ΝΟΕ вариантов, следовали методу, описанному в примере 2, со следующим изменением. Между Μас^ор^ер Н1дй 8 колонкой и колонкой из силикагеля использовали колонку с иммобилизованным трипсином. Пул Μас^ор^ер непосредственно подавали в колонку с иммобилизованным трипсином, доводя далее рН до 5-8,5, лучше до 6,5-7,5, если необходимо. Пул пропускали через колонку в течение времени, при котором большая часть ΝΟΕ превращалась в 118форму. Гидролизом протеазой 120 форма превращается в 118 форму при расщеплении (гидролизе) С-концевого УВВА в УВ. Для достижения неполного и селективного расщепления (гидролиза) используют трипсин или трипсиноподобную протеазу, предпочительно трипсин, более предпочтительно легкодоступный трипсин свиньи или, наоборот, бычий трипсин или рекомбинантный трипсин. Может использоваться любой протеолитический метод, который обеспечивает практически неполное и селективное расщепление (гидролиз), но предпочтительной является колонка с иммобилизованным трипсином для того, чтобы свести до минимума контаминацию ΝΟΕ продукта. Колонка работает при рН, способствующем протеазной активности, предпочтительно при рН 5,5-8,5, более предпочтительно 6,0-8,0 и наиболее предпочтительно от 6,5 до 7,5.

В данном примере гликозилированный ΝΟΕ удаляли с помощью Н1С, как предлагается в данном изобретении. После стадии на 8Рсефарозе НР, приведенной в примере 2, но, предпочительно, используя от 0,3М до 0,55М солевого градиента с объемом, равным 22кратному объему колонки, получают композицию ΝΟΕ для клинического применения. Исходя из РР-НРЬС анализов, может быть получена композиция, содержащая более 70% 118 мономера, менее 10% 120 мономера и менее 15% 117 мономера. Обычно получают композицию, которая по содержанию больше или равна 90% 118/118 γΙιΝΟΕ. обычно, чаще больше или равна 93% 118/118 γΙιΝΟΕ с меньшим или равным 7% содержанием деамидированных, изоаспартатных и окисленных вариантов. Один путь для достижения более высокой чистоты заключается в том, чтобы избежать сбора фракции, содержащей значительные количества вариантов, как например, можно получить в лидирующем (основном) или отстающем (стелющемся) крае основного пика нейротрофина, например, 118/118 1Ί1ΝΟΕ пика.

Пример 4. Частичная очистка и переупорядочение γΙιΝΤ-4/5 из бактериальных включений.

В данном примере очищали γΕΝΤ-4/5, начиная с 10 или 60 л ферментации. Хозяин, используемый для продуцирования рекомбинантного ΝΤ-4/5, относящегося к человеку, ферментацией, описанный в данном примере, являлся Е. сой штаммом, обозначенным 27С7/ ριηΝΤ5ΌΤ; хотя ΝΤ-4/5, продуцированные другими штаммами и организмами, пригодны для описанного в данном изобретении способа очистки. Используемая в данном примере, экспрессирующая плазмида содержала кодирующую последовательность зрелого ΝΤ-4/5 под транскрипционной и трансляционной контрольной последовательностями, необходимыми для экспрессии ΝΤ-4/5 гена в Е. сой. В ΝΤ-4/5 экспрессирующей плазмиде трансляционные последовательности, используемые для экспрессии гена в Е.со11, обеспечивались последовательностью щелочного фосфатазного промотора. Лямбда по отношению к терминатору транскрипции располагалась вблизи ΝΤ-4/5 терминирующего кодона. Секреция протеина из цитоплазмы управлялась 8ΤΙΙ сигнальной последовательностью. Большую часть γΕΝΤ-4/5 обнаруживали в клеточном периплазмическом пространстве как способное к рефракции тельце. Плазмиде приписывалась устойчивость к тетрациклину при трансформированном хозяине. Процесс ферментации осуществляли при 35-39°С и рН 7,0-7,8. Ферментацию проводили в течение 25-40 ч, в течение этого времени культуру охлаждали до сбора клеток, выросших в культуре. Культуру инактивировали с помощью тепловой обработки, используя аппарат с непрерывным потоком при 60°С или используя тепловую инактивацию в сосуде при этой температуре в течение 5-15 мин. Теплоинактивированную культуру центрифугировали, используя ΑΧ ΑΙρΗα-ΙαναΙ или равноценную центрифугу. Клетки Е. со11 отделяли в виде осадка.

Клетки Е.со11, экспрессирующие рекомбинантный ΝΤ-4/5, принадлежащий человеку, во внутриклеточные тельца, разрушали стандартными способами для получения пастообразной массы, содержащей ΝΤ-4/5 во внутриклеточных тельцах. В буфер не включались протеазные ингибиторы.

Для отделения внутриклеточных телец от клеточного дебриса Е.со11 ΝΤ-5 пасту ресуспендировали в 0,02М Тах, рН 8,5 тМ ΕΌΤΑ (10 мл буфера/г пасты), используя ротационное уст ройство механического диспергирования, например, Тиггах. Клеточную суспензию пропускали через микрофлюидизатор три раза при 6000 ρχί (фунт/дюйм²). Полученный гомогенат центрифугировали в 8огуа11 ЕС-3 В центрифуге при 5000 об/мин в течение 45 мин. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в 20 тМ Так, рН 8,5 тМ ΕΌΤΑ (экстракционный буфер), используя Щггах в течение 2-3 мин при средней скорости. Гомогенат центрифугировали, как описано выше. Осадок ресуспендировали в экстрационном буфере и центрифугировали, как описано выше. Полученный осадок(и) (относящийся к ΝΤ-4/5 внутриклеточным тельцам или способным к рефракции тельцам) хранили при -70°С.

ΝΤ-4/5 отделяли от внутриклеточных телец следующим образом. Осадок внутриклеточных телец суспендировали в 20 тМ Тах, рН 8, 6М мочевина, 25 тМ БТТ (10мл буфера/г внутриклеточного тельца), применяя Щггах при средней скорости в течение 10 мин. Суспензию перемешивали в течение 40 мин при 2-8°С и центрифугировали в 8огуа11 ЕС3В при 5000 об/мин в течение 45 мин. Добавляли РΕI (полиэтиленимин) до концентрации 0,1% в супернатанте, который перемешивали при 2-8°С в течение 30 мин. РЕ1 осаждает нуклеиновую кислоту и другие за кислоту ответственные молекулы. Смесь центрифугировали в 8огуа11 ВС3В при 5000 об./мин в течение 45 мин. РЕ1 супернатант наносили на колонку с ΌΕΕΕ сефарозой быстрого пропускания (ΌΕΕΕ 8срНагохс Еак! Г1од) (10смх14см; ΌΕΕΕ представляет собой диэтиламиноэтилсодержащий полимер), уравновешенную 0,02М Тпз, 6М мочевина, 10 тМ БТТ, рН 8. Эквивалент из 1 кг солюбилизированных способных к рефракции телец наносили на ΌΕΕΕ колонку. Поскольку восстановленный и денатурированный ΝΤ-4/5 не связывается с ΌΕΕΕ полимером, полученный пул, содержащий ΝΤ-4/5 и 6М мочевину, собирали (фиг. 6) и рН пула снижали до 5,0 уксусной кислотой. Пул с колонки ΌΕΕΕ с отрегулированным рН наносили на колонку с 8-сефарозой быстрого пропускания (8-8срНагохс ΕηχΙ Г1од) (8 относится к 8О₃ функциональной группе на полимере), уравновешенную 20 тМ ацетата, рН 5, содержащий 6М мочевину при условиях, когда ΝΤ-4/5 связывается с полимером. После нанесения колонку с 8-сефарозой быстрого пропускания промывали несколькими объемами, кратными объемам колонки, уравновешивающего буфера. Связанный ΝΤ-4/5 элюировали 0,5М ЫаС1, 20 тМ ацетата натрия, 6М мочевины, рН 5 (фиг. 7). 0,5 М №101 88ΕΕ пул подвергали диализу в течение ночи против 20 тМ Тах. 0,14 М ЫаС1, рН 8, условия, которые позволяют переупорядочить ΝΤ4/5, хотя и ошибочных. Ошибочно упорядоченные γΙιΝΤ-4/5 молекулы агрегировались, образуя осадок.

Агрегированный, ошибочно упорядоченный γΗΝΤ-4/5 процессировали, чтобы получить правильно упорядоченный ΝΤ-4/5. Агрегированный, ошибочно упорядоченный γΗΝΤ-4/5 собирали центрифугированием в виде осадка. Осадок ресуспендировали в 0,2М Τηκ, рН 8, 4М мочевины, 5 тМ ΌΤΤ и перемешивали при 28°С в течение 1-2 ч или пока осадок не растворится. Конечную концентрацию протеина доводили до 10 мг/мл протеина, исходя из коэффициента экстинкции 1,8 при 280 нм. К раствору солюбилизированного осадка добавляли окисленный глутатион до концентрации 20 тМ, за которым следовало слабое перемешивание в течение 15-30 мин при 2-8°С. Окисленный глутатион реагирует с ΝΤ-4/5 сульфгидрильными группами, образуя ΝΤ-4/5-З-глутатионсмешанный дисульфид. ΝΤ-4/5-8Ο смешанный дисульфид разбавляли до конечной концентрации 0,1 - 0,5 мг/мл протеина в 100 тМ Τηκ, 20 тМ глицина, 15% РЕС-300, 1М гуанидин НС1, рН 8,3. Для инициирования соответствующего переупорядочения ΝΤ-4/5, к переупорядоченной смеси добавляли цистеин при концентрации от 2 до 4 тМ, за которым следовало аэрирование (путем барботирования) раствора азотом или гелием в течение 5-60 мин перед герметизацией сосуда, чтобы исключить кислород. Переупорядочение ΝΤ-4/5 проводили в течение 18-24 ч при 2-8°С.

Наоборот, γΙιΝΤ-4/5 переупорядочивали с использованием сульфитолиза следующим образом. Осадок внутриклеточных телец (110 г) суспендировали в 1,1 л 20 тМ Τηκ, 7М мочевины, 10 тМ глицина, 100 тМ сульфита натрия, 10 тМ тетратионата натрия и солюбилизировали с применением 1иггах в течение 10 мин при средней скорости. Далее смесь (1260 мл) перемешивали при 2-8°С в течение 45 мин. Добавляли РЕ1 до конечной концентрации 0,1% РЕ1. Смесь перемешивали дополнительно 30 мин при 4°С и центрифугировали в течение 45 мин при 5500 об./мин в КС3В центрифуге. Супернатант наносили на ЭЕЕЕ колонку (4,4смх25см), уравновешенную 20 тМ Τηκ, 6М мочевины, рН 8. ЭЕЕЕ сток доводили до рН 5 уксусной кислотой и наносили на колонку 8-сефарозы быстрого пропускания (8-8ерБагоке Еак1 Иоте) (4,4смх25см), уравновешенную 20 тМ ацетата, 6М мочевины, рН 5. ΝΤ-4/5 элюировали 25 тМ МОР8О, 0,5М ЫаС1, рН 7.

88ЕЕ пул с 0,5М хлористого натрия, содержащий сульфонилированный γΗΝΤ-4/5, разбавляли до 0,1 мг/мл протеина и доводили до 1М гуанидин гидрохлорида, 100 тМ Τηκ, 20 тМ глицина, 15% РЕС-300, рН 8,3. Переупорядочение ΝΤ-4/5 начинали добавлением от 2 до 4 тМ цистеина. Реакция переупорядочения, посуществу, завершается в течение 24 ч. Аэрирование инертным газом, например, гелием или азотом, может осуществляться для вытеснения кислорода из раствора.

Пример 5. Изолирование правильно упорядоченного γΗΝΤ-4/5 от конформационных (ошибочно упорядоченных) вариантов.

Переупорядоченную смесь γΗΝΤ-4/5 примера 4 подвергали диализу против раствора с рН от 4 до 5 в течение ночи для удаления гуанидина и других реагентов. Для осветления раствора, раствор или центрифугировали в течение 45 мин при 5000 об/мин или пропускали через 0,2 мкн фильтр.

Осветленный супернатант, содержащий от 0,5 до 5 г протеина, доводили до рН 3-5 путем добавления уксусной кислоты и или наносили на С4 КР-НРЬС колонку, или хранили в замороженном состоянии при -20°С, пока не был готов для очистки. В данном примере подкисленный и осветленный раствор наносили на С4 КР-НРЬС (3смх50см) колонку, на которой полимер связывал упорядоченный γΗΝΤ-4/5. Правильно упорядоченный ΝΤ-4/5 элюировали с использованием градиента ацетонитрила в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты (ΤΕΑ): градиент от 26 до 40% ацетонитрила (в пределах 95 минутного периода) в 0,05% ΤΕΑ при скорости потока 25 мл/мин. Фракции собирали с интервалом в 1-1,5 мин (фиг. 8). Фракции анализировали на правильно упорядоченный ΝΤ-4/5 путем сравнения времени элюирования на аналитической С4 НРЬС Уубас (0,21х15 см) колонке со временем элюирования правильно упорядоченного ΝΤ-4/5 стандарта (фиг. 9). Стандартный правильно упорядоченный, интактный ΝΤ4/5 обычно элюировали 19 мин при скорости потока 2,5 мл/мин с 0,5% ΤΕΑ/ ацетонитрил буферной системой. Фракции, содержащие правильно упорядоченный γΗΝΤ-4/5, объединяли и рН доводили до 5-7. Данный пул правильно упорядоченного γΗΝΤ-4/5 также содержал карбамилированные и Ν-концевые усеченные (сйрреф формы ΝΤ-4/5.

Полимер препаративной жидкостной хроматографии с обращенной фазой представляет собой полимер с диаметром частиц 10-40 микрон, размером пор около 200-400А и С₄-, С₈или С₁₈- алкильной группой. Более предпочтительно, если диаметр частиц носителя 15-40 микрон и размер пор ~300 А и представляет собой С4 силикагель.

Пример 6. Альтернативное изолирование правильно упорядоченного γΗΝΤ-4/5 от конформационных (ошибочно упорядоченных) вариантов.

Переупорядоченную γΗΝΤ-4/5 смесь примера 4 концентрировали примерно 10-кратно с использованием М1Шроге-РеШсоп ультрафильтрационной системы с 20 квадратофутовой целлюлозной (или полисульфоновой, или эквивалентной) мембраной с 10КЭ - ограничением молекулярного веса. Сконцентрированную смесь или подвергали диализу в течение ночи против 50 л 50 тМ ацетата, рН 5,5, 50 тМ №1С1 или диафильтрации в 50 тМ ацетата 50 тМ ЫаС1, рН 5,5 до фильтрации через 0,2 мкн мембрану.

Отфильтрованную переупорядоченную смесь доводили до 2,5М ЫаС1, 20 тМ МОР8О, рН 7 и наносили на Н1С колонку, Рйепу1 Тоуореаг1 650М колонку (10смх19см), предварительно уравновешенную 2,5М ЫаС1, 20 тМ МОР8О, рН 7. Далее колонку промывали уравновешивающим буфером. Некоторые ошибочно упорядоченные формы γΗΝΤ-4/5 молекулы элюировали в полученных фракциях, в то время как другие ошибочно упорядоченные формы элюировались при высоких концентрациях органических растворителей, как, например, от 20 до 40% реактивного спирта. Правильно упорядоченный γΗΝΤ-4/5 элюировали с фенильной колонки с применением 2М хлорида натрия, 10% реактивного спирта, рН 7 (фиг. 10). Вместо полимера с остовом Тоуореаг1 могут использоваться другие полимеры, содержащие фенильные группы, как например, фенилсефароза (Рйепу1 8ерйагозе). Могут использоваться соли, предлагаемые в данном изобретении, и включающие сульфат, цитрат, ацетат аммония и хлорид калия. В зависимости от применяемой соли, концентрация соли обычно составляет от 1М до 3М, причем 2,5М ЫаС1 предпочтителен для нанесения и 2М №1С1 предпочтителен для элюирования при наличии органического растворителя. Предпочтительно использовать более низкие концентрации соли для элюирования и разделения нейротрофина и его вариантов. Для того, чтобы достигнуть элюирования, концентрация соли в буфере элюирования обычно ниже, чем концентрация ее в буфере для нанесения, но эти концентрации могут быть одинаковыми, если компенсируются органическим растворителем. Кроме того, применение органического растворителя имеет другое преимущество, как было установлено в данном изобретении, добавление органического растворителя улучшает характер элюирования, приводящий к более узкому профилю пиков. Кроме этанола, могут использоваться другие органические растворители, рассматриваемые в данном изобретении, включая пропанол, изопропанол и низшие алкиленгликоли, как например, пропиленгликоль, этиленгликоль и гексиленгликоль. Органический растворитель при концентрации от 5 до 25% (об/об), более предпочтительно при 5 до 20% (об/об), наиболее предпочтительно от 5 до 15% обычно элюирует правильно упорядоченный нейротрофин. Элюирование органическим растворителем может быть или в градиенте, или ступенчатым. Интервал рН предпочтительно от близко к нейтральному до слегка кислого, от рН 5 до 8, более предпочтительно рН от 5,5 до 7,5 и наиболее предпочтительно рН 7. Может применяться любой из буферов, рассматриваемый в данном изобретении, включая МОР8О, МОР8, НΕРΕ8, фосфатный, цитратный, аммонийный, ацетатный, пока они оказывают буферное действие при требуемом рН.

Пример 7. Очистка правильно упорядоченного γΗΝΤ-4/5 от химических вариантов.

Отделение правильно упорядоченного, интактного γΗΝΤ-4/5 от химических вариантов, включая карбамилированные и Ν-концевые усеченные (сНрреб) формы γΗΝΤ-4/5. достигалось катионообменной хроматографией высокого разрешения с использованием полимера 8Р сефарозы НР (8Р-8ерйагозе НР) или полимера Ро1уСАТа для НРЬС.

Если для удаления ошибочно упорядоченных вариантов использовали С4 КР-НРЬС колонку С4 НРЬС пул доводили до рН 5-7 и наносили на колонку 7смх19см с 8Р-сефарозой НР (8Р-8ерйагозе НР), уравновешенную 20 тМ сукцината, рН 6, 5% реактивного спирта, 0,2 М №1С1. Полимер со связанным ΝΤ-4/5 промывали буфером для уравновешивания. Связанный γΗΝΤ-4/5 элюировали и отделяли от карбамилированных и Ν-концевых усеченных (сНрреб) форм с применением градиента от 0,2М ЫаС1 до 0,4М ЫаС1, рН 6 (т.е. градиент соли в буфере для уравновешивания), объем которого соответствовал 22 объемам колонки (СУ) (фиг. 11). Фракции, содержащие ΝΤ-4/5, объединяли и использовали для приготовления композиции в 0,05М ацетата с рН от 4 до 5. Интактный γΗΝΤ4/5 идентифицировали и отличали от вариантов во фракциях, предпочтительно аналитической КР - НРЬС или 808-РАСН, сравнивая со стандартом.

Наоборот, вариантные формы ΝΤ-4/5 удаляли с помощью катионообменной хроматографии высокого разрешения НРЬС на колонке с полиаспарагиновой кислотой (Ро1уСАТа, Ро1уЬС, Со1итЫа, Мб) (9,4х200 мм) (фиг. 12). С4 НРЬС пул доводили до рН 5-6 и далее наносили на Ро1уСАТ колонку. Условия хроматографирования были следующие: буфер А представлял собой 20 тМ фосфата, 5% ацетонитрила, рН 6: буфер В представлял собой 20 тМ фосфата, 5% ацетонитрила, 0,8М КС1, рН 6. γΗΝΤ-4/5 элюировали с использованием градиента от 25 до 60% буфера В в пределах 65 мин (фиг. 12). Фракции собирали с 1 минутными интервалами и анализировали с помощью аналитической С4 НРЬС, как описано выше.

Если для удаления ошибочно упорядоченных вариантов использовали Н1С (пример 6 выше), правильно упорядоченный ΝΤ-4/5 пул подвергали диализу в течение ночи в 20 тМ сукцината, 0,1М ЫаС1, 5% реактивного спирта, рН 6 или ультрафильтрации/диафильтрации в 20 тМ сукцинатном буфере. Далее пул после диализа или иР/ЭР наносили на колонку с 8Рсефарозой НР (8Р-8ерйагозе НР) или Ро1уСАТа колонку, как описано выше.

Приготовление композиции

Фракции, содержащие правильно упорядоченный интактный ΝΤ-4/5 (от 8Р-8ерйагозе НР или Ро1уСАΤа НРЬС стадии), объединяли и концентрировали до 1-5 мг/мл в 20 тМ ацетата с рН 4-5 буфере для приготовления композиции. Наоборот, ΝΤ-4/5 применялся для приготовления композиции, используя ультрафильтрацию/диафильтрацию.

Конечный раствор анализировали с помощью аминокислотного анализа, анализом Νконцевой последовательности, масс-спектрометрией, 8^8-РАΟΕ (фиг. 13) и биологическим анализом, активационным анализом киназного рецептора (Шпаке гесер!ог асЮайоп. К1КА) рецептора, который детектирует ΝΤ-4/5 активацию аутофосфорилирования тирозинкиназного (1гк В), расположенного в клеточной мембране. Все способы применяли для характеристики очищенного 1ΉΝΤ-4/5. Использовали СНО клетки, экспрессирующие !гк В с !ад. В \УО

95/14930. риЬНккеб 1ипе 1. 1995 описан К1КА анализ и данная заявка приведена в настоящем изобретении в качестве ссылки. Согласно этому анализу Η1ΝΤ-4/5 содержал ЕС50 в количестве 12.6 нг/мл. Обычно ЕС50 правильно упорядоченного интактного ΝΤ-4/5, очищенного, как описано в данном изобретении, составляет от 5 до 30. наиболее предпочтительно, от 10 до 20.

Чистота Η1ΝΤ-4/5 по отношению к не ΝΤ4/5 протеинам обычно составляла от 90 до 99%. Гомогенность ΝΤ-4/5, что касается карбамилированных и Ν-концевых усеченных (скрреб) вариантов, составляла от 90 до 99%. Наиболее часто и предпочтительно чистота и гомогенность составляют 99% или выше.

Пример 8. Первичная очистка, переупорядочение и конечная очистка гЖТ-3 от бактериальных внутриклеточных телец.

Для изолирования внутриклеточных телец от клеточного дебриса, Е.со11 ΝΤ-3 пастообразную массу (1 кг) ресуспендировали в 10 л 100 тМ ацетата натрия, рН 5 с применением ротационной установки механического диспергирования, например, !иггах. Клеточную суспензию пропускали через микрофлюидайзер три раза при 6000 рк1 (фунт/дюйм²). Полученный гомогенат центрифугировали в 8огуа11 КС-3В центрифуге при 5000 об./мин в течение 30 мин.

ΝΤ-3 отделяли от внутриклеточных телец следующим образом. Осадок внутриклеточных телец суспендировали в 100 тМ Τηκ. 100 тМ ЫаС1. 5 тМ ЕЭЖ. 100 тМ сульфита натрия, 10 тМ тетратионата натрия, 7.5М мочевины, рН 8.3 (10 мл/г внутриклеточного тельца) с использованием !иггах при средней скорости в течение 10 мин. Суспензию перемешивали в течение одного часа при 2-8°С. Добавляли РЕ1 (полиэтиленимин) до 0.15% (конечная концентрация) и перемешивали при 2-8°С в течение 30 мин. Смесь центрифугировали в 8о1га1 КС3В при 5000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант фильтровали через Οе1таπ РгеПоху кассету. Отфильтрованный супернатант разбавляли тремя объемами 8-8ерЬагоке Но\\· буфера для уравновешивания (50 тМ ацетата натрия, 50М мочевины, рН 5). Разбавленный отфильтрованный супернатант (проводимость менее 7 т8) наносили на колонку с 8-сефарозой ΡΡ (88ерЬагоке ΡΡ). уравновешенную 50 тМ ацетата натрия, 5 М мочевины, рН 5.0. Колонку вначале промывали 50 тМ ацетата натрия, 5 М мочевины, рН 5. за которым следовало 50 тМ МОР8. 5М мочевины, 10 тМ глицина рН 7.0. Сульфитолизированный ΝΤ-3 элюировали из колонки с применением 10 колоночных объемов градиента от 0 до 0.6 М ЫаС1 в 50 тМ МОР8. 5М мочевины, 10 тМ глицина, рН 7.

Частично очищенный ΝΤ-3 переупорядочивали разбавлением 8-8еркагоке ΡΡ пула до ~0.1 мг/мл протеина в буфере переупорядочения, содержащем 0.1М Τηκ. 2М мочевины, 0.1М ЫаС1. 15% РΕΟ 300. 10 тМ глицина, 25 тМ этаноламина, рН 9.1. Переупорядочение инициировали добавлением цистеина до примерно 5 тМ и перемешиванием в течение 2-5 дней при 2-8°С. Буфер для переупорядочения может разбрызгиваться гелием или аргоном, чтобы уменьшить концентрацию кислорода в растворе для переупорядочивания.

рН переупорядоченного пула доводили до рН 7. фильтровали и наносили на Масгоргер Нщ11 8 катионообменную хроматографическую колонку, уравновешенную 50 тМ НЕРЕ8. рН 7. После нанесения рН доведенного переупорядоченного пула на Масгоргер колонку, в начале колонку промывали 50 тМ. МОР8, рН 7. за которым следовало 50 тМ МОР8. 0.1М ТМАС, 0.3М ЫаС1, рН 7. ΝΤ-3 элюировали 50 тМ МОР8. 0.25М ТМАС, 1.5М ЫаС1. рН 7.

Масгоргер пул далее дополнительно очищали на колонке с высокозамещенной фенилсефарозой быстрого пропускания (Р1епу1 8ер1агоке Эак1 Но\\· Нщ11 8иЬкй!и!юп). Колонку, содержащую фенильные группы, уравновешивали 50 тМ НЕРЕ8. 1.5М ЫаС1. рН 7 и Масгоргер пул непосредственно наносили на фенильную колонку. Колонку промывали уравновешивающим буфером и затем правильно упорядоченный ΝΤ-3 элюировали с использованием 15 колоночных объемов градиента, начиная с 50 тМ НЕРЕ8. 1.5М ЫаС1. рН 7 до 50 тМ НЕРЕ8. 10% реактивного спирта, рН 7. Фракции анализировали или с С4 НРЬС или 8^8-РАΟΕ и фракции, содержащие правильно упорядоченный ΝΤ-3. объединяли.

Фенильный пул разбавляли до менее, чем 25 т8 (обычно ~2 объемами воды) и наносили на колонку с 8Р-сефарозой НР (8Р-8еркагоке НР), предварительно уравновешенную 25 тМ МОР8О. рН 7. В начале колонку промывали уравновешенным буфером и ΝΤ-3 элюировали с колонки, применяя объем градиента, соответствующего 20 объемам колонки, начиная с 0.35 М ТМАС до 0.65 М ТМАС в 25 тМ МОР8О, рН 7. Фракции, содержащие 1ΉΝΤ-3 (исходя из С4 НРЬС анализа), объединяли.

8Р-сефарозный НР (8Р-8ерйагоке НР) пул концентрировали до ~1 мг/мл на 10000 молекулярного веса мембране и далее подвергали диафильтрации 6 объемами 10 тМ ацетата, 140 тМ №С1, рН 5,0.

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 1: Характеристики последовательности (A) Длина: 241 аминокислота (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 1:

МеЬ 1

Зег МеЬ

Ьеи РНе 5

Туг ТИг

Ьеи

Не ТНг А1а 10

РНе

Ьеи

Не

С1у 15

11е

С1п

А1а

С1и

Рго

Ηίε

Зег

С1и

Зег

Азп

Уа1

Рго

А1а

С1у

НЬз

20

25

30

ТИг

Не

Рго

С1п

Уа1

ΗΪ3

Тгр

ТИг

Ьуз

Ьеи

С1п

ΗΪ3

Зег

Ьеи

Азр

35

40

45

ТИг

А1а

Ьеи

Агд

Агд

А1а

Агд

Зег

А1а

Рго

А1а

А1а

А1а

Не

А1а

50

55

60

А1а

Агд

Уа1

А1а

С1у

С1п

ТИг

Агд

Азп

Не

ТНг

Уа1

Азр

Рго

Агд

65

70

75

Ьеи

РНе

Ьуз

Ьуз

Агд

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Рго

Агд

Уа1

Ьеи

РНе

Зег

80

85

90

ТИг

С1п

Рго

Рго

Агд

С1и

А1а

А1а

Азр

ТНг

С1п

Азр

Ьеи

Азр

РНе

95

100

105

С1и

Уа1

С1у

С1у

А1а

А1а

Рго

РНе

Азп

Агд

ТНг

НЬз

Агд

Зег

Ьуз

но

115

120

Агд

Зег

Зег

Зег

ΗΪ3

Рго

Не

РНе

ΗΪ3

Агд

С1у

С1и

РНе

Зег

Уа1

125

130

135

Суз

Азр

Зег

Уа1

Зег

Уа1

Тгр

Уа1

С1у

Азр

Ьуз

ТНг

ТНг

А1а

ТНг

140

145

150

Азр

Не

Ьуз

С1у

Ьуз

С1и

Уа1

МеЪ

Уа1

Ьеи

С1у

С1и

Уа1

Азп

Не

155

160

165

Азп

Азп

Зег

Уа1

РНе

Ьуз

С1п

Туг

РНе

РНе

С1и

ТНг

Ьуз

Суз

Агд

170

175

180

Азр

Рго

Азп

Рго

Уа1

Азр

Зег

С1у

Суз

Агд

С1у

Не

Азр

Зег

Ьуз

185

190

195

Η13

Тгр

Азп

Зег

Туг

Суз

ТИг

ТНг

ТНг

ΗΪ3

ТНг

РНе

Уа1

Ьуз

А1а

200

205

210

Ьеи

ТИг

МеЬ

Азр

С1у

Ьуз

С1п

А1а

А1а

Тгр

Агд

РНе

Не

Агд

Не

215

220

225

Азр

ТИг

А1а

Суз

Уа1

Суз

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

Агд

Агд

230

235

240

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 2:

Характеристики последовательности (A) Длина: 120 аминокислот (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 2:

Зег 1

Зег

Зег

ΗΪ3

Рго 5

Не РНе

ΗΪ3 Агд С1у 10

С1и

РНе Зег

Уа1

Суз 15

Азр

Зег

Уа1

Зег

Уа1

Тгр

Уа1

С1у

Азр

Ьуз

ТНг

ТНг

А1а

ТНг

Азр

20

25

30

Не

Ьуз

С1у

Ьуз

С1и

Уа1

Меб

Уа1

Ьеи

С1у

С1и

Уа1

Азп

Не

Азп

35

40

45

Азп

Зег

\7а1

РНе

Агд

С1п

Туг

РНе

РНе

С1и

ТНг

Ьуз

Суз

Агд

Азр

50

55

60

Рго

Азп

Рго

Уа1

Азр

Зег

С1у

Суз

Агд

С1у

Не

Азр

Зег

Ьуз

ΗΪ3

65

70

75

Тгр

Азп

Зег

Туг

Суз

ТИг

ТНг

ТНг

ΗΪ3

ТНг

РНе

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

80

85

90

ТНг

МеЬ

Азр

С1у

Ьуз

С1п

А1а

А1а

Тгр

Агд

РНе

Не

Агд

Не

Азр

95

100

105

ТНг

А1а

Суз

Уа1

Суз

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

Агд

Агд

А1а

110

115

120

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 3:

Характеристики последовательности (A) Длина: 120 аминокислот (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 3:

Зег Зег ТНг Нхз Рго Уа1 РНе Ηίε Мей С1у С1и РНе Зег Уа1 Суз

1015

Азр Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 С1у Азр Ьуз ТНг ТНг А1а ТНг Азр , 20 2530

Не Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 ТНг УаЬ Ьеи А1а С1и Уа1 Азп Не Азп

4045

Азп Зег Уа1 РНе Агд С1п Туг РНе РНе С1и ТИг Ьуз Суз Агд А1а

50

55

60

Зег

Азп

Рго

ν31

С1и

Зег

С1у

Суз

Агд

С1у

Не

Азр

Зег

Ьуз

ΗΪ3

65

70

75

Тгр

Азп

Зег

Туг

Суз

ТНг

ТНг

ТНг

ΗΪ3

ТНг

РНе

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

80

85

90

ТНг

ТНг

Азр

С1и

Ьуз

С1п

А1а

А1а

Тгр

Агд

РНе

Не

Агд

11е

Азр

95

100

105

ТНг

А1а

Суз

νηΐ

Суз

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

Ьуз

А1а

ТНг

Агд

Агд

С1у

110 115 120

А1а

241

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 4: Характеристики последовательности (A) Длина: 118 аминокислот (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 4:

ΗΪ3 1

Зег

Азр

Рго

А1а 5

Агд

Агд

С1у

С1и Ьеи Зег Уа1 10

Суз

Азр

Зег 15

Не

Зег

С1и

Тгр

Уа1

ТНг

А1а

А1а

Азр

Ьуз

Ьуз

ТНг

А1а

\Га1

Азр

20

25

30

МеЬ

Зег

С1у

С1у

ТНг

\7а1

ТНг

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

Уа1

Рго

Уа1

Зег

35

40

45

Ьуз

О1у

О1п

Ьеи

Ьуз

С1п

Туг

РНе

Туг

С1и

ТНг

Ьуз

Суз

Азп

Рго

50

55

60

МеЬ

С1у

Туг

ТИг

Нуе

С1и

С1у

Суз

Агд

<31у

Не

Азр

Ьуз

Агд

ΗΪ3

65

70

75

Тгр

Азп

Зег

С1п

Суз

Агд

ТНг

ТНг

С1п

Зег

Туг

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

80

85

90

ТНг

Мее

Азр

Зег

Ьуз

Ьуз

Агд

Не

С1у

Тгр

Агд

РНе

Не

Агд

Не

95

100

105

Азр

ТНг

Зег

Суз

\7а1

ТИг

Ьеи

ТНг

Не

Ьуз

Агд

С1у

Агд

110

115

118

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 5:

Характеристики последовательности (A) Длина: 119 аминокислот (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 5:

Туг 1

А1а С1и

ΗΪ3

Ьуз 5

Зег

ΗΪ3 Агд С1у С1и Туг Зег Уа1 10

Суз Азр 15

Зег

С1и

Зег

Ьеи

Тгр

Уа1

ТЬг

Азр

Ьуз

Зег

Зег

А1а

11е

Азр

11е

20

25

30

Агд

С1у

ΗΪ3

С1п

Уа1

ТИг

Уа1

Ьеи

<31у

С1и

11е

Ьуз

ТЬг

<31у

Азп

35

40

45

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

С1п

Туг

РЬе

Туг

С1и

ТЬг

Агд

Суз

Ьуз

С1и

А1а

50

55

60

Агд

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

С1у

Суз

Агд

С1у

Не

Азр

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

65

70

75

Азп

Зег

С1п

Суз

Ьуз

ТИг

Зег

С1п

ТЬг

Туг

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

ТИг

80

85

90

Зег

С1и

Азп

Азп

Ьуз

Ьеи

Уа1

С1у

Тгр

Агд

Тгр

11е

Агд

11е

Азр

95

100

105

ТЬг

Зег

Суз

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Зег

Агд

Ьуз

11е

С1у

Агд

ТИг

110

115

119

Данные о последовательности 8Ер ГО №: 6: Характеристики последовательности (A) Длина: 130 аминокислот (Б) Тип: аминокислотный (B) Топология: линейная

Описание последовательности: 8Ер ГО №: 6:

С1у Уа1 Зег С1и ТИг А1а Рго А1а Зег Агд Агд <31у С1и Ьеи А1а

1015

Уа1 Суз Азр А1а Уа1 Зег <31у Тгр Уа1 ТЪг Азр Агд Агд ТЪг А1а 20 2530

Уа1 Азр Ьеи Агд С1у Агд С1и Уа1 С1и Уа1 Ьеи С1у С1и Уа1 Рго

4045

А1а А1а С1у С1у Зег Рго Ьеи Агд Θΐη Туг РЪе РИе С1и ТЬг Агд

5560

Суз Ьуз А1а Азр Азп А1а С1и <31и С1у <31у Рго С1у А1а <31у <31у ' 65 7075

С1у С1у Суз Агд С1у Уа1 Азр Агд Агд Н1з Тгр Уа1 Зег С1и Суз

8590

Ьуз А1а Ьуз Θΐη Зег Туг Уа1 Агд А1а Ьеи ТИг А1а Н1з А1а 61п

100105

С1у Агд Уа1 С1у Тгр Агд Тгр Не Агд 11е Азр ТИг А1а Суз Уа1

110 115120

Суз ТИг Ьеи Ьеи Зег Агд ТЪг С1у Агд А1а

125130

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ выделения нейротрофина из смеси, содержащей варианты данного нейротрофина, которая может включать ошибочно упорядоченный вариант, неправильно протеолитически процессированный вариант и гликозилированный вариант данного нейротрофина, включающий

   а) нанесение смеси на полимер гидрофобной хроматографии,

   б) элюирование нейротрофина с полимера буфером для элюирования в условиях, при которых нейротрофин отделяется от варианта, и

   с) сбор нейротрофина.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полимер содержит фенильную функциональную группу.
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь, нанесенная на полимер гидрофобной хроматографии, имеет рН от 5 до 8.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь, нанесенная на полимер, имеет концентрацию соли от 0,5 до 3М.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что смесь, нанесенная на полимер, имеет концентрацию соли от 0,5 до 2,5М.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что смесь, нанесенная на полимер, имеет концентрацию соли 0,7М ацетата или от 1,0 до 2,5М №С1.
7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что буфер для элюирования содержит органический растворитель.
8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрация органического растворителя составляет от 5 до 20 об.%.
9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН буфера для элюирования составляет от 5 до 8.
10. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование включает уменьшающийся градиент соли.
11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что нейротрофин относится к ΝΟΡ-семейству.
12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что нейротрофин представляет собой ΝΟΡ, ΝΤ-4/5 или ΝΤ-3.
13. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что нейротрофин получают из бактериальной культуры и переупорядочивают ίη νίίΓο с применением гидрофобного полимера.
14. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что нейротрофин отделяют от культуры клеток млекопитающих.
15. 15. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию отделения нейротрофина от его вариантов с использованием полимера катионообменной хроматографии высокого разрешения.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что стадия отделения с помощью катионообменной хроматографии высокого разрешения включает нанесение смеси, содержащей нейротрофин и его варианты, на полимер катионообменной хроматографии высокого разрешения и элюирование нейротрофина с полимера в условиях, при которых нейротрофин отделяется от вариантов, при этом нейротрофин имеет высокую р1.
17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что катионообменным полимером высокого разрешения является 8Р-сефароза НР, полиаспарагиновая кислота, полисульфоэтилкатионообменный или Ргас1о§е1 ЕМЭ 803 полимер.
18. 18. Способ по п.16, отличающийся тем, что нейротрофинсодержащий элюат от катионообменного полимера высокого разрешения обессоливают или подвергают диафильтрации и далее используют с носителем для получения композиции.
19. 19. Способ по п.1, дополнительно включающий отделение нейротрофина от других протеинов с использованием силикагеля путем элюирования нейротрофина буфером для элюирования, содержащего, в основном, ТМАС или ТЕАС, буферируемые при рН от 3,5 до 8,0.
20. 20. Способ по п.19, включающий отделение нейротрофина от других протеинов с использованием силикагеля в отсутствии спиртового или полярного апротонного растворителя.
21. 21. Способ по п.15, отличающийся тем, что нейротрофин и его вариант до разделения, посуществу, являются чистыми.
22. 22. Способ по п.15, дополнительно включающий стадию отделения нейротрофина от ошибочно упорядоченного варианта данного нейротрофина с применением полимера препаративной хроматографии с обращенной фазой.
23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что полимер содержит С₄ функциональную группу.
24. 24. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию очистки с использованием хроматографии высокого разрешения и состоящий, таким образом, из следующих стадий:

    а) нанесение смеси, содержащей нейротрофин и его варианты, на полимер гидрофобной хроматографии при рН от 5 до 8,

    б) промывание полимера буфером с рН от 5 до 8,

    в) элюирование нейротрофина буфером с рН от 5 до 8, содержащим спиртовой или полярный апротонный растворитель с концентрацией от 5 до 25% (об./об.),

    г) нанесение нейротрофинсодержащего элюата на полимер катионной хроматографии высокого разрешения при рН от 5 до 6 и

    д) элюирование нейротрофина с полимера катионнообменной хроматографии высокого разрешения буфером с рН от 5 до 6, содержащим концентрацию катиона от 0,2 до 0,5М.
25. 25. Композиция, содержащая нейротрофин, полученный способом по любому из предыдущих пунктов.
26. 26. Композиция по п.25, дополнительно содержащая приемлемый носитель.
27. 27. Композиция по п.26, выполненная стерильной.