KR100554332B1 - 뉴로트로핀의 정제 - Google Patents

Abstract

임상적 용도에 적합한 뉴로트로핀(성숙 NGF 포함)의 대량 정제 방법이 제공된다. 이 방법은 여러가지의 덜 바람직한 잘못 프로세싱된 형, 잘못 폴딩된 형, 덜 바람직한 크기, 글리코실화된 형, 또는 하전된 형으로부터 뉴로트로핀을 분리하는 수단을 제공한다. 이러한 변형체가 충분히 제거된 뉴로트로핀(성숙 NGF 포함)의 조성물이 또한 제공된다.

뉴로트로핀, NGF, NT-4/5, NT-3, HIC

Description

뉴로트로핀의 정제{Purification of Neurotrophins}

본 발명은 특히 박테리아나 포유류 세포의 발효에 의해 생성될 때, 함께 섞여 있는 변형체, 불순물 및 오염물로부터 뉴로트로핀, 특히 NGF 군의 뉴로트로핀, 더욱 특히 신경성장인자(nerve growth factor) (NGF) 및 뉴로트로핀-4/5 (NT-4/5), 및 뉴로트로핀-3 (NT-3)을 정제하는 개선된 방법에 관한 것이다.

비교적 순수하고 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 및 단백질의 대량 생산은 인간 및 동물의 약학 제제, 효소 및 다른 특정한 화학물질의 제조에 있어서 경제적으로 중요하다. 포유류 숙주세포, 박테리아 및 다른 숙주세포에서는 다량의 외부 단백질이 발현될 수 있기 때문에, 많은 단백질의 생산을 위해서는 재조합 DNA기술이 최상의 방법이다.

포유류 NGF (생쥐 NGF)의 1차 구조는 안젤레티 및 브라드쇼(Angeletti and Bradshaw)의 논문 [Proc. Natl. Acad. Aci. USA 68:2417(1971)]에서 처음 밝혀졌다. 그 전구체, pre-pro-NGF의 1차 구조는 생쥐 NGF cDNA의 핵산 서열로부터 유추되었다(Scott et al. Nature 302 : 538 (1983); Ullrich et al. Nature 303 : 821 (1983)).

동형 인간 NGF(hNGF) 유전자도 밝혀졌다(Ullrich, Symp. on Quan. Biol., Cold Spring Harbor 48 : 435 (1983); 1994년 2월 22일 특허된 미국 특허 제5,288,622호, 이를 참고 문헌에 의해 본문에포함한다). 인간 NGF의 생쥐 NGF에 대한 유사성은 아미노산 서열 수준에서는 약 90%이고, 핵산 서열 수준에서는 약 87%이다. 자연적으로 생성되는 인간 NGF의 희소성으로 인하여, 자연적 원천으로부터는 생화학적으로 자세히 특성을 밝히기에 충분한 양이 얻어지지 않았다.

NGF와 관련이 있는 또다른 향신경적 인자들이 이후 발견되어졌다. 이들로는, 뇌-유래 향신경적 인자 (BDNF) (Leibrock, et al., Nature 341 : 149-152 (1989)), 뉴로트로핀-3 (NT-3) (Kaisho, et al., FEBS Lett., 266 : 187 (1990); Maisonpierre, et al., Science, 247 : 1446 (1990); Rosenthal, et al., Neuron, 4 : 767 (1990)) 및 뉴로트로핀 4/5 (NT-4/5) (Berkmeier, et al., Neuron, 7 : 857-866 (1991))가 포함된다. TGF-β 초군(superfamily)의 먼 멤버인 GDNF 및 뉴르투린(neurturin) ("NTN")은 최근에 밝혀진 구조적으로 연관성이 있는, 교감 지각 뉴우런 및 중추 신경계 뉴우런에 대한 잠재 생존 인자인 두 가지이다(Lin et al. Science 260 : 1130-1132 (1993); Henderson et al. Science 266 : 1062-1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron 15 : 821-828 (1995); Kotzbauer et al. Nature 384 : 467-470 (1996)).

단백질을 암호화하는 DNA를 숙주세포에 형질감염시키고, 그 재조합 단백질의 발현에 최적인 조건에서 숙주세포를 성장시켜 재조합 단백질을 생산한다. 원핵생물 대장균 저비용으로 고수율의 재조합 단백질을 생산하도록 만들 수 있기 때문에 선호되어온 숙주였다. 단백질을 암호화하는 DNA의 일반적인 박테리아내 발현에 관 한 수많은 미국 특허가 있는데, 여기에는 세포외 또는 막주위 수송 단백질의 박테리아 유전자와 비박테리아 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 미국특허번호 제4,565,785호, 외부 폴리펩티드와 응집-형성(aggregate-forming) 폴리펩티드의 동시-생산(co-production)에 관한 미국특허번호 제4,673,641호, trp프로모터/오퍼레이터 및 IGF-I과 같은 폴리펩티드와 trpLE와의 융합을 갖는 발현 벡터에 관한 미국특허번호 제4,738,921호, 외부 단백질과 함께 포함하는 발현 조절 서열(expression control sequence)에 관한 미국특허번호 제4,795,706호, IGF-I을 암호화하는 환DNA 플라스미드와 같은 특정 환DNA 플라스미드에 관한 미국특허번호 제4,710,473호 등이 있다.

유전공학적 바이오-약학제제들은 일반적으로 다양한 숙주세포 오염원을 함유하는 상청액으로부터 정제된다. 특히 NGF는 수많은 다른 방법을 사용하여 여러 다양한 노력 및 성공 정도로 정제되고 있다고 보고되고 있다. 예를 들어 론고(Longo et al.)의 서적 [IBRO Handbook, 12권, 3-30쪽(1989)]; NGF의 CHO 세포에서의 생성을 발표하고 있는 미국 특허 제5,082,774호; 브루스 및 헤인리히(Bruce and Heinrich)의 논문 [Neurobio. Aging 10:89-94(1989)]; 쉬멜져(Schmelzer)의 논문 [J. Neurochem 59:1675-1683(1992)]; 버톤(Burton et al.)의 논문[J. Neurochem. 59:1937-1945(1992)]을 참고로 한다. 이들 노력들은 주로 실험실 규모였었다.

그러나, 약학적 순도 및 고수율로 본질적으로 변형체가 없는 재조합 인간 NGF의 제조적 단리는 당업계에 공지되어 있지 않다.

따라서, 당업계에서는 뉴로트로핀 특히 NGF 및 NGF-계 뉴로트로핀을 그들의 변형체 및 다른 분자들로부터 그리고 높은 pI를 갖는 다른 폴리펩티드들로부터 선택적으로 분리하는 효율적인 방법에 대한 필요성이 존재한다. 대규모로 뉴로트로핀을 정제하는 이 방법은 다양한 원천(발효 배양액, 파열된 박테리아 또는 포유류 세포를 포함)으로부터의 출발물질에 응용 가능하여 임상적으로 사용할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명자들은 이전에는 알려지지 않았고 분리하기 어려운 뉴로트로핀 변형체(예를들어 NGF 변형체)를 발견하였기 때문에, 본문에제시된 방법은 불요한 변형체가 충분히 제거된 상업적으로 유용한 양의 재조합 뉴로트로핀(인간 NGF(rhNGF), rhNT-3 및 rhNT-4/5 등, 및 이들의 바람직하게 유전공학적으로 조작된 돌연변이 등)을 제공하는데 특히 유용하다. 본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들이 이제 이 기술분야의 당업자에게 명백해질 것이다.

<발명의 요약>

본 발명의 일 구현예에서는 뉴로트로핀 (특히 매우 동질적인 수용체 군(trks)에 의해 모두 인식되는 공통성을 갖는 NGF, NT-3, NT-4/5 및 BDNF를 포함하는 NGF 군의 뉴로트로핀, 바람직하게는 rhNGF, rhNT-3, rhNT-4/5, rhBDNF 또는 이들의 바람직한 유전공학적으로 조작된 형인 뉴로트로핀)을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 이용하여 정제하는 방법을 제공한다. 여기서 보고하는 바와 같이, 본 발명자에 의한 뉴로트로핀의 재조합적 생산에서 발생하는 불요한 뉴로트로핀 변형체들의 발견에서 볼 때, HIC를 사용하면 소망하는 정폴딩된 완전한 뉴로트로핀로부터 화학적으로 다른 형 또는 잘못 폴딩된 뉴로트로핀 형태 조차도 분리할 수 있다. 제거되는 변형체들은 성숙한 정폴딩된 뉴로트로핀과 소수성에서 다른 것, 예를 들어, 부분 프로세싱된 전구체 서열, 글리코실화된 성숙 형 및 글리코실화된 전구체 함유 형(진핵세포 배양으로부터 생길 때), 및 잘못 폴딩된 변형체 및 부분적으로 폴딩된 변형체(일반적으로 박테리아 세포 배양으로부터, 시험관내 폴딩 단계가 사용된 경우 생긴다) 등이다. 예를 들어, HIC는 성숙 NGF의 혼합물로부터, NGF의 부분적으로 프로세싱된 전구체 서열, NGF 및 전구체의 글리코실화된 종(진핵세포 배양으로부터 생길 때), 및 잘못 폴딩 및 부분적으로 폴딩된 변형체(일반적으로 박테리아 세포 배양으로부터, 시험관내 폴딩 단계가 사용된 경우)를 제거하는데 특히 유용하다. NGF에는 Asn45 위치에 N-링크 글리코실화 자리가 하나 있다. 박테리아에서 발현된 재폴딩된 rhNT-4/5의 경우에는, HIC가 부정확하게 폴딩된 형태로부터 정폴딩된 NT-4/5를 분리한다. 본 명세서에 기술된 방법의 결과로서, 이 뉴로트로핀에는 본질적으로 이들 변형체가 없다. 뉴로트로핀 정제를 위하여, 바람직하게는 HIC 수지 관능기가 페닐기이고, 한편, 옥틸 및 부틸기도 유용할 수 있다. 특히 바람직한 구현예는 HIC 수지로, 페닐 토요펄, 페닐 세파로스 패스트 플로우 저 치환, TSK-페닐 5PW 등을 포함한다.

또다른 구현예에서는 뉴로트로핀, 특히 NGF 군의 뉴로트로핀, 바람직하게는 rhNGF, rhNT-3, rhNT-4/5, 또는 이들의 바람직한 유전공학적으로 조작된 형인 뉴로트로핀을 예비적 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 방법을 제공한다. 이 예비적 양이온 교환 크로마토그래피는 성숙 뉴로트로핀로부터 전하가 변형된 변형체(산화형, 이소아스프(isoasp)형, 및 탈아미드형)를 분리한다. 특히 바람직한 구현예는 SP-세파로스 고 성능 수지, 프락토겔 EMD SO3 수지 또는 폴리아스파르트 산 수지를 사용하고, 이 중 PolyCAT A가 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는 대용량의 SP-세파로스 고성능 수지 또는 프락토겔 EMD SO3 수지가 사용된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는 HIC 및 양이온 교환 크로마토그래피를 모두 사용하여 소망하는 뉴로트로핀(예를 들어 재조합 성숙 NGF), 바람직하게는 인간 NGF인 뉴로트로핀의 조성물을 제조하였는데, 이 뉴로트로핀은 충분히 동질이고 즉, 예를 들어 잘못 폴딩된 변형체 및 화학적 변형체와 같은 프로세싱 및 하전 변형체들이 모두 충분히 제거된 것이고 또한 단백질 함량의 관점에서 충분히 순수한 것이다.

본 발명의 일 구현예에서는, 뉴로트로핀, 특히 NGF 군의 뉴로트로핀, 바람직하게는 rhNGF, rhNT-3, rhNT-4/5, 및 이들의 바람직한 유전공학적으로 조작된 형인 뉴로트로핀을 불요한 관련 변형체들(예를 들어, 발효, 프로테아제-절단된 변형체, 글리코실화된 변형체, 잘못 폴딩된 변형체)로부터 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 개선된 방법이 제공되었다. 더욱 바람직하게는 NGF가 120/120 또는 118/118 동형 2분자체형이다. 본문에 기술된 방법의 결과와 같이, 이 뉴로트로핀은 가장 바람직하게는 변형체가 본질적으로 제거된 것이다.

또다른 구현예에서는, 생리학적 pH를 포함하는 용리 조건을 이용하여 연관된 변형체로부터 뉴로트로핀, 특히 NGF-군 뉴로트로핀을 정제하는 방법을 제공하고 있다.

또 다른 구현예에서는, 그 동질성에서 상당한 개선이 이루어진 뉴로트로핀의 정제 과정이 제공된다.

또 다른 구현예에서는,

a) pH 약 5-8의 뉴로트로핀 및 그 변형체를 포함하는 완충액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼상에 적하하고,

b) 칼럼을 세척하고,

c) pH 약 5-8의 완충액으로 뉴로트로핀을 용리시키고,

d) 뉴로트로핀 함유 용리액을 pH 약 5-8의 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼상에 적하하고,

e) pH 약 5-8, 바람직하게는 pH 6의 염 구배 완충액으로 칼럼으로부터 뉴로트로핀을 용리시키는 것을 포함하는 NGF-군 뉴로트로핀을 그의 변형체로부터 분리하는 과정을 제공한다. 상기 뉴로트로핀은 가장 바람직하게는 rhNGF이다.

본 발명의 한 구현예에서는 바람직하게는 NGF 분획인 뉴로트로핀 분획으로부터 숙주세포 단백질을 효과적으로 제거하는 실리카겔 크로마토그래피 단계를 제공한다.

본 발명의 한 구현예에서는, VRRA C-말단으로부터 말단 RA 디펩티드를 선택적으로 제거하기 위하여 120 아미노산 NGF에 트립신-유사 프로테아제 처리를 하여 118 종을 만드는 방법단계를 제공한다. 고정된 트립신 칼럼이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 뉴로트로핀 조성물 및 제제와 그 조성물 및 제제의 용도에 관한 것이다. 충분히 동질적이고, 즉 프로세싱 변형체 및 전하 변형체(예를 들어, 잘못 폴딩된 변형체 및 화학적 변형체)가 모두 충분히 제거되었고, 또한 단백질 함량에 있어서 충분히 순수한 뉴로트로핀의 조성물이 제공된다. 바람직하게는 성숙 인간 NGF, 성숙 인간 또는 들쥐 NT-3 및 성숙 인간 NT-4/5가 이러한 형태로 제공된다. 바람직한 구현예에서는, 상기 NGF가 120개 아미노산 종이고, 특히 바람직하게는, 118 형이고, 가장 바람직하게는, 동형 2분자체(예를 들어, 118/118)이다.

도 1은 SP-세파로스 HP 크로마토그램을 나타낸다. HIC 크로마토그래피 후 12 kL 발효물로부터의 NGF-함유 혼합물을 25 옴니핏(omnifit) SP SHP수지의 SP-세파로스 고성능 수지(칼럼 크기 1.0 × 35 cm; 베드(bed) 부피 27.5 ml)상에 적하시켰다. 완충액A는 0.2 M NaCl, 20 mM 호박산염, pH 6.0(23ms)이다. 완충액B는 0.7 M NaCl, 20 mM 호박산염, pH 6.0(63 ms)이다. 이 칼럼을 먼저 완충액A로 평형화시켰다. 0.24 mg/ml의 345 ml HIC 푸울을 25 mM 호박산염, pH 6.0(17 ms)로 조정하고, 이 중 362 ml을 3 mg/ 수지 ml 로드(load)를 주도록 적하하였다. 82.5 mg의 NGF가 적하되었다. 적하속도는 시간당 40 cm이었다. NGF를 완충액 B(0.35 내지 0.60 M NaCl; 37 내지 57 ms)가 30% 내지 80%로 구배된 22 칼럼 부피를 사용하여 용리시켰다. 용리속도는 시간당 60 cm였다. 흡광 유닛(280nm) 및 ms/cm를 분획 번호 및 용리부피(ml)에 대하여 도표로 나타내었다. NGF를 함유한 분획을 확인하여 수집하였다. 이 경우 분획 43 내지 60을 수집하여 0.38 mg/ml NGF 표본을 99 ml 얻었고, 회수율은 약 46%였다.

도 2는 페닐 세파로스 패스트 플로우 푸울 및 SP-세파로스 HP 푸울의 SP-NPR HPLC 양이온-교환(HPIEX) 분석 결과를 도시한다. 각각의 크로마토그램이 표시 되어 있다.

도 3은 SP-세파로스 HP 크로마토그래피 단계로부터 선택된 분획(주 푸울, 주피크 푸울의 선단 및 말단)의 C4 RP-HPLC 분석 결과를 도시한다. 세 개의 피크가 겹쳐치고 표시된 바와 같다. 나타난 바와 같이, 주 피크(성숙 NGF를 함유한)가 변형 NGF들을 함유한 몇 개의 작은 피크와 구별된다.

도 4는 인간 prepro-NGF(SEQ ID NO:1)의 서열을 도시한다. 성숙 NGF(위치 1)의 첫 번째 아미노산 및 120NGF(위치 120) 형태의 마지막 아미노산이 도면에 표시되어 있다. 바람직한 NGF 아미노산 서열은 성숙 118 형태(위치 1 내지 118)의 서열이다. 변형체 형태도 나타나 있다: 성숙 120(위치 1 내지 120); 성숙 117(위치 1 내지 117); R120(위치 -1 내지 120); 및 성숙 114(아미노산 1 내지 114), 115( 아미노산 1 내지 115) 및 117(아미노산 1 내지 117)을 포함하는, N- 및 C-말단에서 발생한 다른 미스프로세싱 위치. 단백질 분해효소로 미스 프로세싱된 변형체는 NGF pro 서열의 아미노산 R(-39) 및 S(-38) 사이의 N-말단에서 절단된다. 가능 개시 Met에 밑줄이 그어져 있다. 다른 N-말단 변형체로는 대체로 아미노산 H8과 R9사이 및 R9와 G10사이가 절단된 형태의 단축형 NGF가 있다.

도 5는 향신경성 인간 NGF(SEQ ID NO: 2), 생쥐 NGF(SEQ ID NO: 3), BDNF (SEQ ID NO: 4), NT-3 (SEQ ID NO: 5) 및 NT-4/5 (SEQ ID NO: 6)의 아미노산 서열을 도시한다. 상자로 된 부분은 시스테인 매듭 모티프에 수반되는 동종 시스테인-함유 영역을 나타낸다.(데 영(De Young) 등., Protein Sci. 5(8): 1554-66(1996)).

도 6은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(DEFF) 수지 칼럼의 rhNT-4/5의 크로마 토그래피 유형을 도시한다. "NT45DE1:1_UV"로 표시된 크로마토그램은 280nm에서의 자외선 흡광도 측정값이다. "NT45DE1:1_Condl"로 표시된 크로마토그램은 용리 분획의 전도율의 측정값이다. 수집된 뉴로트로핀-함유 분획은 수평화살 표시된 "푸울"로 표시된다.

도 7은 SP-세파로스 패스트 플로우(DEFF) 수지 칼럼의 rhNT-4/5의 크로마토그래피 유형을 도시한다. "NT45SFF1:1_UV"로 표시된 크로마토그램은 280 nm에서의 자외선 흡광도 측정값이다. "NT45SFF1:1_Condl"로 표시된 크로마토그램은 용리 분획의 전도율의 측정값이다. 수집된 뉴로트로핀-함유 분획은 수평화살 표시된 "푸울"로 표시된다.

도 8은 본문에 기재된 조건하에서 rhNT-4/5의 전형적인 예비 C4-RP-HPLC 크로마토그래피 유형을 도시한다. 280 nm에서 자외선 흡광도를 관측하였다. 수집된 뉴로트로핀-함유 분획은 수평화살 표시된 "푸울"로 표시된다.

도 9는 표시된 시간에서 재폴딩되는 동안 관측된 NT-4/5 표본의 분석적 HPLC 크로마토그래피 유형을 제공한다. 칼럼 조건은 본문에 나타나 있다. "NT-4/5 Std."는 본래의 NT-4/5를 기준으로 하여 정확하게 폴딩된 것의 용리 유형을 나타낸다. "SSFF(0.5m)"로 표시된 유형은 재폴딩 전에 S-세파로스 패스트 플로우 칼럼으로 부터 0.5M NaCl로 용리시킨 NT-4/5의 분석결과를 도시한다.

도 10은 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(페닐 토요펄 650M 칼럼)에서 잘못 폴딩된 변형체로부터 본래의, 정확히 접힌 NT-4/5를 분리하는 것을 도시한다. 더 소수성인 잘못 폴딩된 변형체(피크 B)는 정폴딩된 NT-4/5(피크 A)를 용리시키기 위해 필요한 농도보다 진한 농도의 유기용매에서 용리시키는 반면에, 정폴딩된 NT-4/5 보다 소수성이 작은 잘못 폴딩된 변형체는 통과시켜(flow-through) 용리시킨다.

도 11은 양이온-교환 수지(SP-세파로스)에서의 NT-4/5 및 변형체들의 용리 유형을 도시한다. 280 nm에서 흡광도를 관측하였다. 피크 B가 본래의, 정확히 접힌 NT-4/5를 함유하는 반면에, 피크 A는 카르바밀화되고 절단된 변형체를 함유한다. NT-4/5를 함유하는 수집된 분획은 수평화살 표시 "푸울"로 표시되어 있다.

도 12는 본문에 기재된 조건하에서 rhNT-4/5의 전형적인 예비 폴리 CAT A 수지 크로마토그래피 유형을 도시한다.

도 13은 본문에 기재된 rhNT-4/5 정제 과정의 표시된 단계로부터 취해진 표본의 순도 및 균질성을 평가하기 위하여 환원 조건하에서의 16% SDS-PAGE(트리스-글리신 시스템, 예비-주입된, 노벡스(Novex, Inc., San Diego CA)에서 구입한) 분석결과를 도시한다. 겔은 단백질을 분석하기 위해서 코마시(Coomassie)-R250으로 염색하였다(앤드류(Andrew), 전기영동(Electrophoresis), 옥스포드 대학 출판부: 뉴욕, 1986). "DE-적하"으로 표시된 레인은 DE-세파로스 패스트 플로우 칼럼에 적하된 PEI-혼합물의 표본을 함유한다; "DE FT"로 표시된 레인은 DE-세파로스 패스트 플로우 칼럼을 그냥 통과한(flow through) 표본을 함유한다; "S 푸울"로 표시된 레인은 재폴딩 전에 S-세파로스 패스트 플로우 수지 칼럼으로부터 용리된 NT-4/5를 함유하는 수집된 분획의 표본을 함유한다; "재폴딩 푸울"로 표시된 레인은 완전히 재폴딩된 푸울의 표본을 함유한다; "C4 푸울" 레인은 예비 C4 RP-HPLC후에 수집된 분획의 표본을 함유한다; "폴리CAT A 푸울" 레인은 폴리CAT A HPLC 칼럼으로부터 수집된 NT-4/5 분획의 표본을 함유한다.

도 14는 박테리아에 의하여 생성된 술포닐화 rhNT-3를 함유한 혼합물의 S-세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피로부터 얻어진 분획의 UV 흡광도를 도시한다.

도 15는 시험관내에서 재폴딩된 형태의 rhNT-3를 함유한 혼합물의 대용량 High S 양이온-교환 크로마토그래피를 도시한다. 수지는 Biorad에서 구입하였다. 칼럼의 용적은 9 x 9 cm 였다. 재폴딩된 형(재폴딩 36시간 후)을 함유하고, pH가 6.8인 SSFF 푸울 700 ml를 대용량 칼럼에 약 310 ml/min의 유속으로 적하하였다. 조건은 본문에 기재되어 있다.

도 16은 잘못 폴딩된 변형체를 제거하기 위하여 양이온-교환-정제되고, 재폴딩된 rhNT-3의 페닐 세파로스 패스트 플로우 고 치환(소수성 상호작용 크로마토그래피)를 도시한다.

도 17은 HIC-rhNT-3 푸울의 SP-세파로스 고성능 크로마토그래피를 도시한다.

<정의>

여기서 사용되듯이, "뉴로트로핀"는 쥐, 소, 양, 돼지, 말, 새 및 바람직하게는 인간을 포함하는 어떤 종으로부터의, 천연서열 또는 유전공학적으로 조작된 형태일 수 있으며, 천연적 생성이나 합성 또는 재조합적인 생성 등 어떤 소스로부터도 가능한, NGF, NT-3, NT-4/5 및 BDNF를 포함하는 뉴로트로핀, 바람직하게는 NGF군 뉴로트로핀을 말한다. 예를 들어, "NGF"는 쥐, 소, 양, 돼지, 말, 새 및 바람직하게는 인간을 포함하는 어떤 종으로부터의, 천연서열 또는 유전공학적으로 조작된 변형 형태일 수 있으며, 천연적 생성이나 합성 또는 재조합적인 생성 등 어떤 소스로부터도 가능한 신경성장인자를 말한다. 바람직하게는 재조합적으로 생성된 뉴로트로핀이다. 바람직한 방법에서는 뉴로트로핀이 클로닝되고 그 DNA가 포유류 세포나 박테리아 세포에서 발현된다. 여기서 교습된 공정 및 방법은 뉴로트로핀 GDNF 및 뉴르투린(neurturin)에도 또한 적용될 수 있다.

인간에의 사용을 위하여는, 인간 천연 서열, 성숙 NGF, 특히 바람직하게는 120개 아미노산 서열 및 더욱 바람직하게는 118 아미노산 서열이 선호된다. 더욱 바람직하게는, 이 천연서열 NGF가 재조합적으로 생성된다. 인간 프리-프로-NGF 및 인간 성숙 NGF의 바람직한 아미노산 서열이 미국특허번호 제5,288,622호에서 제공되어 있고, 특히 이를 참고로 여기에 삽입한다. 번역후 부가적인 변형이 없는 120개 아미노산형은 동형 2분자체 (homodimer) 형태(즉, 120/120)가 바람직한 형태이다. 더욱 바람직한 것은 번역후 부가적인 변형이 없는 118개 아미노산형으로 특히 동형 2분자체(즉, 118/118)형이다.

"충분히 순수한"이란, 전체 단백질에 대한 전체 뉴로트로핀, 특히 NGF의 순도가, 최소한 70%의 뉴로트로핀, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 또는 99%로 증가하는 순도를 의미한다. 특히 바람직한 순도는 최소한 95%이다. "본질적으로 순수한"이란, 조성물에서 원하는 뉴로트로핀의 순도가 90%이상임을 의미한다.

"뉴로트로핀 변형체가 충분히 제거된"이란, 전체 뉴로트로핀(덜 바람직한 뉴로트로핀 종을 포함한다)에 대한 원하는 뉴로트로핀 종의 퍼센트가 최소한 70%의 소망하는 뉴로트로핀 종, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90%, 93%, 95%, 또는 99%까지 증가하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 제거된"이란, 조성물이 소망하는 뉴로트로핀을 적어도 90% 이상 함유함을 의미한다. 특히 바람직한 수준은 적어도 95%의 소망하는 뉴로트로핀, 예를들어 정확하게 폴딩되고 완전한 118/118 rhNGF인 뉴로트로핀 종이다. 다른 원하지 않는 종이나 형태는 잘못 프로세싱된 형이거나 화학적 변형체, 예를 들면 바람직하게는 본문에서 공개한 바와 같이, 발효나 정제과정에서 생긴 변형된 전하를 갖는 변형체, 또는 이전의 모든 것일 것이다. 예를 들어, NGF가 박테리아에서 합성된 후 시험관내에서 폴딩될 때, 잘못 폴딩되거나 부분적으로 폴딩된 형태가 "종" 또는 "변형체"에 포함될 수 있다.

"잘못 폴딩된" 변형체란, 뉴로트로핀과 시스테인 자리의 결합이 다르거나 또는 특정 시스테인 자리가 자유롭거나 또는 블록킹되어 있는 것이 다른 뉴로트로핀 변형체를 의미한다. 잘못 폴딩된 변형체에는 뉴로트로핀과 시스테인 짝짓기는 같으나 잘못 폴딩으로 3차 구조가 다른 것도 또한 있다.

"화학적" 변형체란 예를 들어 변형된 전하를 갖고, 카바밀화 (carbamylation), 탈아미드화(deamidation), 산화, 글리코실화 (glycosylation) 또는 단백질 분해적 절단에 의해 화학적으로 뉴로트로핀과 다른 변형체를 의미한다.

본 발명의 칼럼용 완충액은 일반적으로 약 5 내지 8의 pH 범위를 갖는다. 이 범위안에서 pH를 조절할 완충액으로는 예를 들어, 구연산염, 호박산염, 인산염, MES, ADA, BIS-TRIS 프로판, PIPES, ACES, 이미다졸, 디에틸말론산, MOPS, MOPSO, TES, TRIS 완충액(TRIS-HCl 등), HEPES, HEPPS, TRICINE, 글리신 아미드, BICINE, 글리실글리신 및 붕산염 완충액 등이 있다. 바람직한 완충액은 MOPSO 완충액이다.

여기에 사용된 "알코올" 및 "알코올성 용매"는 알코올에 대해 일반적으로 사용되는 용어의 의미로, 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알콜, 특히 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-프로판올, 또는 t-부탄올, 뿐만 아니라 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜, 및 가장 바람직하게는 에탄올 또는 이소-프로판올을 의미한다. 이러한 알코올은 수용액에 첨가되었을때 용액 극성을 감소시켜 용액의 소수성을 증가시키는 용매이다.

MOPSO는 3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판술폰산이다. HEPES는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산이다. 반응성 알코올은 95 부피부(특별하게 변성된 알코올 공식 3A 및 이소프로필 알코올 5 부피부)이다. MES는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산이다. UF/DF는 울트라필트레이션 / 디아필트레이션 (Ultrafiltration / Diafiltration)을 의미한다. TMAC는 테트라메틸암모늄 클로라이드이다. TEAC는 테트라에틸암모늄 클로라이드이다. NGF-120은 완전한 길이의 120/120 신경성장인자를 의미한다. NGF-118은 동형 2분자체의 성숙 NGF 분자(118개의 아미노산)를 의미한다. 산화 NGF는 생물학적 활성이 성숙 천연 NGF의 약 80%라고 여기서 보고되어 있는 NGF 변형 분자, 메트설폭시드37(Metsulfoxide37)을 의미한다. 이소아스프(isoasp) NGF는 이성질체화된 변형 분자 Asp93인 NGF를 의미한다. 탈아미드화된 NGF는 Asn45가 Asp45로 변환된 NGF를 의미한다. RNGF는 NGF분 자의 N-말단에 아르기닌을 더 갖는 NGF분자를 의미한다. CHO는 챠이니즈 햄스터 난소세포를 의미한다.

본문에 기술된 수지로는 MACROPREP HIGH S 양이온-교환수지(BIO-RAD Laboratories사; 강한 양이온 교환; SO₃ 관능기; 명목 입도 약 50 m; 명목 공극 크기 1000A); 실리카 겔 수지(유도화되지 않은); 페닐 세파로스 패스트 플로우 저 치환(파마시아사; 고도로 가교된 6% 아가로스; 45-165 미크론의 입도); SP-세파로스 HP (파마시아사; 고도로 가교된 6% 아가로스; 34 미크론의 입도); 페닐 토요펄 650 M(Phenyl Toyopearl 650 M)(TosoHass사; 40-90 미크론의 입도); 및 프락토겔 EMD SO₃-650 S(EM Seperation사, E. 머크(독일)의 미국 연합사; 25-40 m의 입도).

<본 발명을 수행하는 방식>

뉴로트로핀은 신경계의 발달 및 유지에 중요한 역할을 하는 소형 염기성 단백질군에 속한다. 이 군 중에서 최초로 밝혀지고, 아마 가장 잘 알려져 있는 것은 신경성장인자(NGF)이다. [참조: 1992년 12월 8일 특허된 미국 특허 제5,169,762호] 최근에 NGF와 유사한 기능을 가지며 순차적으로 관련성이 있으나 구별되는 폴리펩티드들이 동정화되고 있다. 예를 들어, 뉴로트로핀-2(NT2)라고도 불리는 뇌-유래 향신경적 인자(BDNF)가 레이브록(Leibrock et al)에 의해 클로닝되고 서열이 동정화되었다(Nature, 341:49-152[1989]). 처음에는 향신경성 인자(NF)라고 불렸고, 지금은 뉴로트로핀-3(NT3)라고 칭하는 향신경적 인자가 여러 연구가들에 의해 밝혀졌다(Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5454-5458[1990]; Hohn et al., Nature, 344:339[1990]; Maisonpierre et al., Science, 247:1446[1990]; Rosenthal et al., Neuron, 4:767[1990]; Jones and Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87;8060-8064[1990]; Kaisho et al., FEBS Lett., 266:187[1990]). 뉴로트로핀-4/5(NT4 또는 NT5라고 불린다)가 밝혀졌다(Hallbook et al., Neuron, 6:845-858[1991]; Berkmeier et al., Neuron, 7:857-866[1991]; Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89:3060-3064[1992]). 1994년 11월 15일자로 특허된 미국특허번호 제5,364,769호는 인간 NT-4/5 및 그 재조합의 발현 과정에 대해 기술하고 있고, 이를 참고로 본문에삽입한다. 또한 1996년 1월 30일자로 특허된 미국특허번호 제5,488,099호, 우르퍼(Urfer et al.,)의 논문 [EMBO J. 13(24):5896-909(1994)] 및 1995년 12월 14일자로 국제공개된 WO95/33829(참고로 본문에삽입한다)에서 보고되고 있는 바와 같이, 하나 이상의 수용체에 결합하도록 변형되거나 천연 뉴로트로핀에는 보통 상당한 정도로 존재하지 않는 수용체 결합 활성을 갖도록 변형된 뉴로트로핀인 잡종 및 범친화적 뉴로트로핀이 보고되고 있다. 특히 흥미로운 것은 MNTS-1 및 D15ANT3라고 명명되는 뉴로트로핀이다. 또한 특히 흥미로운 것은 NGF 아미노산의 주쇄를 가지나 trkA 이외의 수용체, trkB나 trkC와 같은 수용체에 결합하도록 변형된 뉴로트로핀이다. 바람직한 것은 NGF내 아미노산 치환이 NT-3내 NT-3용 trk 수용체 결합에 관여하는 상응 위치의 아미노산으로 치환되는 것이다. 이러한 NGF 돌연변이는 NT-3 유사 수용체 결합 활성을 가지는 한편, NGF의 약물속도론 및 정제시 특성을 보유한다(Urfer, et al, Biochemistry 36(16):4775-4781(1997)). 이들 NGF 돌연변이들은 또한 trkA 결합 활성이 결여될 수 있다(Shih et al., J. Biol. Chem. 269(44):27679-86(1994)). 이러한 NGF 돌연변이들이 본문에기술된 본 발명에 사용되기에 특히 바람직한 뉴로트로핀이다.

재조합 인간 뉴로트로핀, 예를 들어 rhNGF의 단리는 다양한 숙주세포의 오염물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 각 단계마다 충분한 분리가 일어날 수 있는 특별한 완충액들이 사용된다. 종래의 크로마토그래피적인 매질을 사용하면, 여러 뉴로트로핀 변형체가 공동-정제되기 때문에, 뉴로트로핀 분리의 최종 또는 최종 전단계에서 문제가 복잡해진다. 회수 및 정제 과정에서 재폴딩(re-folding) 단계가 포함되면, 잘못 폴딩된 형의 뉴로트로핀이 변형체로 포함되게 된다. 변형체는 또한 카바밀화된 형, 탈아미드화된 형, 탈아미드화 또는 단백질 분해효소로 절단된 형과 같은 뉴로트로핀과 화학적으로 다른 형태들을 포함할 수 있다. NGF의 경우, 이러한 종들은 주로 2분자체--동형 2분자체(예를 들어, 120/120 또는 118/118이 원하는 경우에는 117/117) 또는 이형 2분자체(예를 들어, 120/118, 117/118)--, 화학적으로 개질된 변형체(이소아스팔테이트, 모노-옥시다이즈드, 글리코실레이션 변형체), N-말단이 절단된 형 및 C-말단이 절단된 형, 및 그들의 2분자체로 구성된다.

본 발명은 예를 들어 알쯔하이머병의 치료, 당뇨 및 AIDS관련 신경질환을 포함하는 말초신경질환 등의 치료와 같은 치료적 용도에 충분한 양의 뉴로트로핀(특히 rhNGF)의 대규모 생산을 가능하게 한다.

NGF와 다른 뉴로트로핀, 바람직하게는 NGF군의 뉴로트로핀 사이의 서열 및 구조적 유사성에서 볼 때, 본 발명의 방법은 미스프로세싱된 것, 잘못 폴딩된 것, 또는 부분적으로 폴딩된 것, 글리코실레이션 및/또는 전하 변형체가 모두 충분히 제거된 이들 뉴로트로핀을 만드는데 응용가능하다. 본 발명에서는, 이들 그리고 다른 밀접하게 관련된 변형체로부터 뉴로트로핀을 선택적으로 분리하는데 바람직한 컬럼 수지 및 조건을 밝혔다. 뉴로트로핀에는 NT-3, NT-4/5, NT-6, BDNF 및 이들의 이형 2분자체형, 잡종형, 범친화형 등의 조작된 형태들이 있다. 바람직하게는 뉴로트로핀이 인간 뉴로트로핀이거나, 인간의 아미노산 서열과 매우 유사한, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 인간 서열과 동일한 뉴로트로핀이다. 조작된 뉴로트로핀은 조작 뉴로트로핀의 모체인 천연 뉴로트로핀의 trk수용체 결합 기능의 최소한 50%, 바람직하게는 최소한 75%, 특히 바람직하게는 최소한 80%를 보유할 것이다. 이 조작된 것들은 본문에기술된 과정에서 유사한 수행능력을 보유할 수 있도록 천연 뉴로트로핀의 높은-pI 또는 소수적 특성을 충분히 가지고 있는 것들이다.

하기하는 바와 같이, 본문에 기술된 방법들은 rhNGF, rhNT-3 및 rhNT-4/5에 성공적으로 적용되었다. 예를 들어, 대장균에서 만들어진 rhNT-4/5는 봉입체로 단리되고 봉입체로부터 환원되고 용해되어진다. 환원된 NT-4/5는 DE 세파로스 패스트 플로우 및 S-세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피에 의해 부분 정제되었다. S-세파로스 패스트 플로우 푸울은 구아니딘 함유 완충액에서 24시간 동안 재폴딩되었다. NT-4/5의 잘못 폴딩된 형태는 본문에 기술된 바와 같이 대규모 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 카바밀화된 NT-4/5 및 단축형(미스프로세싱된) NT-4/5는 대규모의 Poly Cat A HPLC 수지 또는 SP-세파로스 HP 수지에 의한 고성능 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 칼럼 형식으로 제거하였다. 정제된 rhNT-4/5는 제제화를 위해 한외여과(ultrafiltration)하고 산성 완충액내로 투석여과(diafiltering)하였다.

본 발명의 한 구현예에서는, 일반적으로 뉴로트로핀이 이미 다른 대부분의 불순물로부터 정제되어진 후, 전형적으로 제제화되기 전 탈염 또는 투석여과 이전의 최종 또는 거의 최종단계에서 연관된 변형체들로부터 뉴로트로핀이 정제된다. 혼합물내 연관된 변형체로는 발효의 잔류물인 변형체뿐만 아니라, 저장 또는 처리도중에서 뉴로트로핀이 분해되어 생긴 변형체 등이 있다.

본 발명의 구현예에 사용하기에 적합한 뉴로트로핀은 어떤 수단에 의해서도 제조될 수 있으나, 바람직하게는 재조합적으로 제조된다. 본문에논의된 뉴로트로핀을 암호화하는 핵산 분자는 여러 방법, 예를 들어 공지의 DNA서열을 이용한 화학 합성을 통하여 또는 이 기술분야의 당업자에게 공지인 표준적의 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 뉴로트로핀의 공지된 서열에 기초하여 특별하게 제작된 올리고뉴클레오티드 혼성화 탐침을 이용하여, 뉴로트로핀(특히 hNGF 코딩 서열)를 갖는 cDNA 클론을 찾을 수 있다.

뉴로트로핀 코딩 서열을 갖는 분자를 얻은 다음, 선택 숙주세포내에서 발현되기에 적합한 클로닝 벡터에 이 분자를 삽입한다. 클로닝 벡터는 코딩 서열의 효율적인 전사, 번역 및 프로세싱에 필요한 적합한 조절 기능을 제공하도록 구성되었다.

뉴로트로핀이 재조합적으로 제조된다면, 뉴로트로핀을 암호화하는 DNA의 발현에 적합한 숙주세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 이 목적에 적합한 원핵세포로는, 아케박테리아(archaebacteria) 및 유박테리아(eubacteria)와 같은 박테리아가 있다. 바람직한 박테리아는 그람 음성균 또는 그람 양성균 (예를 들면, 대장균 등의 에스케리키아 (Escherichia)와 같은 엔테로박테리아 (Enterobacteriaceae), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 같은 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans)와 같은 세라티아 (Serratia) 및 시겔라 (Shigella))과 같은 유박테리아; 비. 서브틸리스 (B. subtillis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis)와 같은 바실러스(B. licheniformis 41P는 1989년 4월 12일에 발간된 DD266,710에서 공개되었다); 피. 에루지노사 (P. aeruginosa)와 같은 수도모나스; 스트렙토미체스 (Streptomyces); 아조토박터 (Azotobacter); 리조비아 (Rhizobia); 비트레오실라 (Vitreoscilla); 및 파라코커스(Paracoccus))이다. 적합한 대장균 숙주로는 대장균 W3110 (ATCC27,325), 대장균 94 (ATCC31,446), 대장균 B 및 대장균 X1776 (ATCC31,537)이 있다. 이 예시들은 제한적이기 보다는 예시적이다.

1995년 11월 16일자로 국제공개된 PCT 공보 WO95/30686호 전문을 본문에 삽입한다. 이 공보는 특히 NGF의 박테리아내 합성 및 시험관내 폴딩에 관하여 기술되어 있다. 이 방법으로부터 생성된 산물에 본 발명의 정제 방법이 적용될 수 있다.

상기의 모든 박테리아의 돌연변이 세포도 또한 사용될 수 있다. 박테리아 세포내에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적합한 박테리아를 선택하는 것이 물론 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYA177 또는 pKN410과 같은 잘 알려진 플라스미드를 레플리콘 공여체로 사용한 경우는 대장균, 세리티아(Serritia) 또는 살모넬라(Salmonella) 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 대장균 종 W3110은 재조합 DNA산물 발효에 흔한 숙주 종이기 때문에 대장균 종 W3110이 바람직한 숙주 또는 부모 숙주이다. 바람직하게, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해효소를 분비한다. 예를 들어, 세포주 W3110은 숙주 자체의 단백질을 암호화하는 유전자에 유전적 변형이 일어나도록 개질되어질 수 있다. 이러한 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA△를 갖는 대장균 W3110 종 1A2, 완전한 유전자형 tonA △ ptr3를 갖는 대장균 W3110 종 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA △ E15 △ (argF-lac) 169 △ degP △ omp T kan<r>를 갖는 대장균 W3110 종 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA △ E15 △ (argF-lac) 169 △ degP △ omp T △ rbs7 ilvG kan r 를 갖는 대장균 W3110 종 37D6, 비-카나마이신 저항성의 degP 결손 돌연변이를 갖는 37D6 종인 대장균 W3110 종 40 B4, 및 1990년 8월 7일자로 등록된 미국 특허 제4,946,783호에 공개된 돌연변이된 막주위 프로테아제를 갖는 대장균 종 등이 있다.

인간 NGF가 대장균 내에서 발현되었다. hNGF의 β-서브유니트를 암호화하는 유전자의 단리 및 서열화와 대장균 내에서 이종 단백질로서의 그 발현이 미국 특허 제5,288,622호에 기술되어 있다. 그 기술은 성숙 인간 NGF를 생성하는 포유류 세포를 제공하는데 또한 적합하다. 재조합 기술을 이용하여, 다른 포유류의 단백질 없이 인간 β-NGF만을 발현시켰다. 변형된 아미노-말단을 함유하는 두개의 유전자를 이용하여 대장균 내에서 hNGF를 발현시키면, 융합 단백질이 발현되는데, 이는 이와이(Iwai et al)의 논문 [Chem. Pharm. Bull. 34:4724(1986)]에 기술되어 있다.

원핵생물 이외에, 필라멘트형 진균류 및 효모와 같은 진핵 미생물도 뉴로트로핀을 암호화하는 벡터의 발현 숙주로서 적합하다. Saccharomyces cerevisiae 또는 흔히 베이커 효모라고도 하는 것이 저급 진핵 숙주 미생물 중 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 많은 다른 속, 종, 계가 흔히 이용 가능하고 여기서 유용하며, 여기에는 스키조사카로미체스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) [비치 및 너스(Beach and Nurse), Nature, 290:140(1981); 1985년 5월 2일에 공개된 EP 139,383]; 예를 들어, 케이 락티스(K. lactis) [MW98-8C, CBS683, CBS4574; 루벤코트(Louvencourt et al.), J. Bacteriol., 737(1983)], 케이 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이 빅케라미(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이 드로소필라룸(K. drosophilarum) [ATCC 36,906; 반 덴 베르그(Van den Berg et al.), Bio/Technology, 8:135(1990)], 케이 써모톨러런스(K. thermotolerans) 및 케이 막시아누스(K. marxianus)인 클뤼베로미체스 (Kluyveromyces) 숙주들 [미국 특허 제4,943,529호; 플리르(Fleer et al.), Bio/Technology, 9:968-975(1991)]; 얄로위아(yarrowia) [EP 402,226]; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) [EP 183,070; 스리크리쉬나(Sreekrishna et al.), J. Basic Microbiol., 28: 265-278(1988)]; 칸디다(Candida); 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia) [EP 244,234]; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) [케이스(Case et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263(1979)]; 쉬바니오미체스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) [1990. 10.31자로 공개된 EP 394,538] 와 같은 쉬반니오미체스(Schwanniomyces); 및 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) [1991.1.10자로 국제공개된 WO 91/00357]와 같은 필라멘트형 진균류 및 에이 니둘란스(A. nidulans) [발란스(Ballance et al.), Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289(1983); 틸버른(Tilburn et al.), Gene, 26:205-221(1983); 옐톤(Yelton et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984)]와 에이 니거(A. niger) [켈리 및 히네스(Kelly and Hynes), EMBO J., 4:475-479(1985)]와 같은 아스페르질러스 (Aspergillus) 숙주가 있다.

뉴로트로핀을 암호화하는 DNA의 발현에 적합한 숙주세포는 또한 다세포 생물로부터 유도될 수도 있다. 이러한 숙주세포는 복잡한 프로세싱 및 글리코실화 활성을 가질 수 있다. 원리적으로는 척추동물 또는 무척추동물 배양의 어느 것으로부터이든 상관없이 어떤 고등 진핵 세포 배양도 적합하다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바쿨로바이러스계(baculoviral strain) 및 변형체, 그리고 상응하는 퍼미시브(permissive) 곤충 숙주 세포, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 에이디스 에집티(Aedes aegypti) (모기), 에이디스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophilla melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)가 밝혀졌다. [참고: 룩코우(Luckow et al.), Bio/Technology, 6:47-55(1988); 밀러(Miller et al.), in Genetic Engineering, Setlow, J. K. et al., eds., Vol. 8(플레넘 출판사, 1986), pp. 277-279; 메다(Maeda et al.), Nature, 315:592-594(1985)]. 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica)의 L-1 변형체 및 봄빅스 모리 NPV(Bombyx mori NPV)의 Bm-5와 같은 형질감염을 위한 다양한 바이러스 종이 공개적으로 사용 가능하며, 이러한 바이러스들은 여기에서 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 1993.12.21일자로 특허된 미국특허번호 제5,272,063호에서 보고하는 바와 같이 인간 NGF가 곤충세포에서 생산되었다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페츄니아, 토마토 및 담배 식물 세포 배양을 숙주로서 이용할 수 있다. 전형적으로, 식물 세포는 뉴로트로핀을 암호화하는 DNA를 함유하도록 미리 조작되어 있는 특정 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로 배양하여 형질감염시킨다. 식물 세포 배양과 A. tumefaciens와의 배양 도중에, 뉴로트로핀을 암호화하는 DNA가 식물 세포 숙주에 옮겨져 형질감염이 이루어지고, 적당한 조건 하에서 뉴로트로핀을 암호화하는 DNA가 발현될 것이다. 또한 노팔린 합성효소 프로모터와 폴리아데닐화 시그널 서열과 같은 식물 세포와 양립가능한 조절 서열 및 시그널 서열이 이용가능하다(데픽커(Depicker et al.), J. Mol. Appl. Gen., 1:561(1982)). 또한, T-DNA 780 유전자의 상류 부위에서 단리된 DNA 세그먼트는 재조합 DNA-함유 식물 조직내에서 식물의 발현가능한 유전자의 전사 수준을 활성화 또는 증가시킬 수 있다(1989.6.21일자로 공개된 EP 321,196).

유용한 포유류 숙주 세포라인의 예로는, SV40로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아의 신장 라인[293 또는 현탁 배양액에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, 그라함(Graham et al.), J. Gen Virol., 36:59(1977)]; 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 챠이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216(1980)]; 실험쥐 세르톨리 세포 [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251(1980)]; 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종양 세포(HELA, ATCC CCL 2);개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI세포[Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 라인(Hep G2)이 있다. 바람직한 방법은 CHO 세포에서 발현시키는 것이다. 프리프로-NGF를 함유하는 인간 NGF의 엑손을 적합한 프로모터 및 벡터를 사용하여(미국 특허 제5,288,622호) 발현시켜 분비형 성숙 NGF(118 및 120 형을 포함)를 발현시킬 수 있다. 안정적으로 형질 감염되었고, 성숙 NGF형을 분비하는 안정적인 CHO 세포의 배양체가 본문에 실시예에서 검토되는 바와 같이 본 발명에 유용하다.

숙주 세포를 상기한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 형질 감염, 바람직하게는 형질전환시켜, 프로모터를 유발시키기에 적합하고, 형질전환체를 선별하는데 적합하며, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기에 적합하도록 개질된 통상의 영양 배지에서 배양시킨다. 형질감염이란 어떤 코딩 서열의 실제 발현 여부와 는 상관없이 숙주세포가 발현 벡터를 취하는 것을 말한다. 수많은 형질 감염 방법, 예를 들어 CaPO4 및 전기투과(electroporation) 등이 보통의 당업자에게 알려져 있다. 숙주 세포내에서 이 벡터 작용의 어떤 표시가 있을때 일반적으로 성공적인 형질감염이 인정된다.

형질전환은 생물체내로 DNA를 도입하여, 염색체 외부의 독립체로서 또는 염색체내의 삽입체로 그 DNA가 복제될 수 있는 것을 의미한다. 사용한 숙주세포에 따라, 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 이용하여 형질전환이 이루어진다. 삼브루크(Sambrook et al.)의 서적 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 뉴욕: 콜드 스프링 하버 실험실 출판부, 1989의 section 1.82]에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리 또는 전기투과는 일반적으로 원핵생물이나 실질적으로 세포벽 장막을 갖는 다른 세포에 이용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989.6.29일자로 공개된 WO 89/05859]에 기술되어 있는 바와 같이 일정한 식물세포의 형질전환에 이용된다. 또한, 식물은 1991.1.10일자로 공개된 WO 91/00358에 기재된 바와 같이 초음파 처리를 이용하여 형질전환되어질 수 있다.

이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포에는, 그라함 및 반데르 에브(Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457(1978)의 인산칼슘 침전법이 바람직하다. 포유류 세포 숙주 시스템의 형질전환에 관한 일반적 양상이 악셀(Axel)의 1983.8.16일자로 특허된 미국특허번호 제4,399,216호에 기술되어져 있다. 효모내로의 형질전환은 전형적으로 반 솔린겐(Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977)) 및 시아오(Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 핵속 미세주사(nuclear microinjection), 전기투과, 박테리아 원형질체와 전체 세포와의 융합 또는 폴리캐티온(polycation)(폴리브렌(polybrene), 폴리오르니틴 등) 등을 이용하여 DNA를 세포에 도입하는 방법들을 사용할 수 있다. 포유류 세포를 형질전환시키는 다양한 기술에 대해서는 케오운(Keown et al.)의 서적 [Methods in Enzymology(1990) Vol. 185, pp. 527-537] 및 만수르(Mansour et al.)의 논문 [Nature, 336:348-352(1988)]을 참조하라.

바람직하게는, 메티오닌 개시코돈, 바람직하게는 윌리치(Ullrich et al.)의 논문[Nature, 303:821-825(1983)]에서 밝혀진 두개의 메티오닌 개시코돈 중 하나가 이용 가능하도록 hNGF 유전자를 벡터에 삽입한다. hNGF 유전자(Ullrich, et. al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, p435(1983); US 5,288,622)는 번역 개시코돈으로서 이용될 것으로 추측되는 두 개의 매우 인접한 메티오닌을 갖는다(위치1은 성숙 hNGF의 N-말단 세린 잔기를 말한다). 대조적으로, 신경성장인자 중 가장 철저히 연구된 생쥐 하악선 NGF cDNA는 -121 및 -119의 위치 이외에 -187의 위치에 메티오닌을 갖는다. 포유동물 세포내 발현에 대한 바람직한 구현예에서는 프리프로-NGF 서열이 존재한다.

원핵생물 세포를 이용하여 뉴로트로핀을 생산할 때는, 이 세포는 예를 들어 실험서 [Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989)]에 일반적으로 기술되어 있는 바와 같이 프로모터를 상시 또는 인위적으로 유도시킬 수 있는 적합 배지에서 배양시킨다. 배지에는 탄소, 질소, 무기 인산염 원 이외에 어떤 필요한 보충제가 적당한 농도로 포함될 수 있고, 이는 단독으로 또는 다른 보충제나 복합 질소원과 같은 배지와 함께 혼합물로서 첨가될 수도 있다.

포유동물 숙주 세포를 이용하여 뉴로트로핀을 생산한다면, 이 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 시판되는 숙주 세포 배양에 적합한 배지로는 함스 F10(Ham's F10, 시그마사), 최소필수배지(Minimal Essential Medium[MEM], 시그마사), RPMI-1640(시그마사), 둘베코의 수정 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium[DMEM],시그마사) 등이 있다. 또한, 문헌 [Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44(1979); Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255(1980); 미국특허번호 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제5,122,469호; 또는 제4,560,655호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국특허번호 Re. 30,985](이 모든 문헌에 기술된 것을 참고로 여기에 삽입한다)에 기술된 어떤 배지도 숙주세포의 배양배지로서 사용될 수 있다. 이 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장인자 등), 염(염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염 등), 완충액(HEPES 등), 뉴클레오시드(아데노신 및 티미딘 등), 항생제(젠타마이신 TM 제제), 극소량 요소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 첨가될 수 있다. 다른 어떤 필요한 첨가물은 당업자에 알려져 있을 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양조건은 발현에 선택되었던 숙주세포에서 사용하였던 것이고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

일반적으로, 시험관내에서 포유류 세포 배양의 생산성을 최대화하는 원리, 방법 및 실질적 기술은 서적 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991)]에서 발견될 수 있다. 상기 과정은 뉴로트로핀이 세포내에서 생성되든, 세포막주위공간에서 생성되든, 또는 직접 배지로 분비되어지든 상관없이 사용되어질 수 있다.

일반적으로 적합한 기간 후 배양액을 모으고, 예를 들어 ELISA나 웨스턴 블롯 분석과 같은 면역검정(immunoassay) 또는 PC12세포 분화(Greene, L. A., Trends Neurosci. 7:91(1986))와 같은 생물학적 검정 등의 표준 확인 검정을 수행한다. 본문에공개된 변형체의 종류 및 정도를 측정하기 위한 검정은 선행문헌에 공지되어 있거나, 실시예에서 제공되거나 인용되어져 있다(예를 들어, Schmelzer et al. J. Neurochem. 59(5):1675-83(1992) 및 Burton et al., J. Neurochem. 59(5):1937-45(1992) 참조, 이를 참고로 본문에삽입한다).

세포로부터 제조된 뉴로트로핀 조성물은 HIC 이전에 바람직하게는 적어도 한 번의 정제 단계를 거친다. 적합한 정제 단계의 예로는 회수될 뉴로트로핀과 사용되어진 출발배지에 따라, 친화 크로마토그래피 등의 본문에서 기술된 것 이외에, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환수지(예를 들어 폴리아스파르트산 칼럼) 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 및 예비적 SDS-PAGE 등이 있다.

뉴로트로핀이 배지로 직접 분비되는 한 실시예에서는, 원심분리에 의해 배지로부터 세포 부스러기를 제거하고, 맑은 발효 배양액 또는 배지를 실리카겔상에서 정제한다. 실리카 크로마토그래피를 위하여는 일반적으로 그 배양액을 유도화되지 않은 실리카입자를 통과시켜 뉴로트로핀 폴리펩티드가 실리카 입자에 흡착되도록 하고, 실리카 입자를 세척하여 오염물질을 제거하고, 알코올성 또는 극성 비양성자성 용매 및 알칼리 토금속, 알칼리 금속, 또는 무기 암모늄염을 함유하는 완충액으로 실리카 입자로부터 폴리펩티드를 용리시켰다.

본 발명의 바람직한 구현예에서는, 대량적 High S 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 변형체로부터 뉴로트로핀을 분리하고 큰 오염물질을 감소시켰다. 이 수지는 포유동물 세포 배양에서 뉴로트로핀을 정제하는 초기단계로서 사용될 수 있고, 바람직하게는 모아진 세포배양액을 분획화하는데 유용하다. 다른 구현예에서는 단백질 재폴딩단계 바로 직후에 대량적 high S 양이온-교환 크로마토그래피가 가장 바람직하게 사용된다. 이 양이온 교환 칼럼의 초고속 흐름 특성은, 뉴로트로핀이 칼럼에 결합할 수 있도록 조건을 조정하여, 대량의 희석된 재폴딩 단백질 또는 모아진 세포배양액 뉴로트로핀이 그다음 단계의 크로마토그래피(HIC 또는 SP-세파로스 등) 이전에 쉽게 농축되어 질 수 있도록 한다. 또한, 수지의 양이온 교환 특성은 비결합하는 큰 단백질 및 어떤 잘못 프로세싱된 변형체 및 화학적으로 개질된 변형체(전하의 변화, MET37-산화 변형체 등)를 제거하는 것을 가능하게 한다. 가장 중요한 것은 천연 뉴로트로핀과 소수성에서 차이나는 다른 잘못 폴딩된 변형체 또는 화학적으로 개질된 변형체(예, 잘못 프로세싱된 변형체, 글리코실화 변형체(포유류 세포배양 산물))가 존재할 경우, 이 대량적 수지는 이들 소수성 변형체 의 일부 제거를 가능하게 하고, 여기서 측정되는 바와 같이 천연 뉴로트로핀을 실질적으로 농축시킬 수 있다. 제한하지 않는 의미에서, 수지 지지체의 주쇄는 소수성 함유물을 갖고 이는 여기서 알려지는 바와 같은 이점을 갖는 뉴로트로핀과 그 수지와의 비특이적 상호작용을 촉진한다. 일반적으로, 약 pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 6 내지 8의 pH의 용리 완충액 용으로는, 0 내지 3 M 농도의 TMAC가 유용하다. 초산 나트륨이 용리 완충액의 이온 세기를 증가시키기 위해 존재할 때는 더 낮은 농도의 TMAC를 사용하여도 된다. 아세테이트 이온 대신에는 염소가 바람직하게 대용될 수 있다.

뉴로트로핀이 세포막 주변 공간에서 생성되어지는 구현예의 한 실시예에서는, 배양배지 또는 용해액을 원심분리하여 입자화된 세포 부스러기를 제거한다. 필요하면 막상 단백질 및 수용성 단백질 분리를 할 수 있다. 뉴로트로핀이 막에 붙어 있는지, 용해되어 있는지, 또는 응집형으로 존재하는지에 따라, 뉴로트로핀은 용해액의 수용성 단백질 분획 및 막단백질 분획에서 정제될 수 있다. 이후 뉴로트로핀은 용해되고, 이어서 적당한 완충액을 사용하여 재폴딩된다. 세포막 주변으로부터 단리하여 재폴딩된 단백질을 생성하는 이 방법이 이하 상세히 기술된다.

불용성, 비천연의 뉴로트로핀을 적합한 단리 완충액중의 원핵 숙주세포로부터 적당한 기술을 사용하여 단리시킨다. 적당한 기술로는 예를 들면, 숙주 세포를 적합한 이온 세기의 완충액에 노출시켜서, 대부분의 숙주 단백질은 용해시키나 응집된 뉴로트로핀은 실질적으로 불용으로 만드는 방법 및 세포를 파열시켜 봉입체를 유리시키고 예를 들어 원심분리에 의해 이들 회수하는 방법 등이 있다. 이 기술은 공지되어 있고, 예를 들어 미국특허번호 제4,511,503호에 기술되어 있다.

요약하면, 숙주세포를 완충액(약 0.01 내지 2 M, 바람직하게는 0.1 내지 0.2 M의 이온 세기를 이용하여 일반적으로 pH 5 내지 9, 바람직하게는 약 6 내지 8)에서 현탁시킨다. 충분한 이온 세기 값을 유지하기 위하여는 염화 나트륨을 포함하는 어떤 적합한 염도 유용하다. 이 완충액에 현탁되어 있는 세포는 그다음 일반적으로 사용되는 기술(예를 들어, 만톤-가울린 압축 마이크로플루이다이저(Manton-Gaulin press microfluidizer), 프렌치 프레스(French press), 또는 음파 오실레이터(sonic oscillator)와 같은 기계적인 방법, 또는 화학적 또는 효소적 방법)을 이용한 용해로 파열시킨다.

화학적 또는 효소적 방법의 세포파열의 예로는, 박테리아 세포벽의 용해를 위하여 리소짐을 이용하는 스페로플라스트(spheroplast)방법(Neu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215(1964) 및 생존가능한 세포에 고삼투성 용액을 처리하고 저삼투성의 냉수로 세척하여 폴리펩티드를 유리시키는 삼투압쇼크(Neu et al., J. Biol. Chem., 240:3685-3692(1965)) 등이 있다. 미국특허번호 제4,680,262호에 기술된 세번째 방법은 형질전환된 박테리아 세포에 2 내지 4개의 탄소원자를 갖는 저급 알칸올의 유효량을 세포를 죽여 용해시키기에 충분한 시간 및 온도에서 처리하는 것을 포함한다.

세포를 파열시킨 후, 일반적으로 봉입체를 펠렛화하기 위하여 현탁액을 원심분리한다. 한 구현예에서 이 단계는 표준 원심분리기에서 약 500 내지 15,000 x g, 바람직하게는 약 12,000 x g에서 부피와 원심분리기 유형에 의존적인 충분한 시 간동안(일반적으로 약 10분 내지 0.5 시간) 수행된다. 결과의 펠렛은 불용성인 폴리펩티드 분획을 실질적으로 전부 포함한다. 그러나, 세포파열과정이 완전하지 않았다면, 펠렛에는 세포자체나 부서진 세포조각들도 또한 포함될 수 있다. 세포 파열이 완전히 일어났는지는 펠렛을 소량의 동일 완충액 용액중에 재현탁시키고 현탁액을 위상차 현미경으로 관찰하여 측정할 수 있다. 부서진 세포조각이나 전체세포가 존재할 때는 세포 조각 또는 세포 및 결합된 광굴절 소체 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드를 제거하기 위하여 또다른 파열이 필요하다. 이러한 추가적 파열 후, 필요하다면, 현탁액을 다시 원심분리하고, 펠렛을 회수하여 재현탁 및 분석한다. 시각적 검사로 펠렛화 물질내에 파열된 세포조각의 존재가 관찰되지 않거나 추가적인 처리로도 펠렛의 크기가 줄어들지 않을때까지 이 과정은 되풀이된다.

다른 구현예에서는, 적합한 완충액중에 뉴로트로핀을 용해시킴으로서 세포막주변 공간으로부터 단리한다. 이 방법은 재조합적으로 뉴로트로핀을 생산한 후 발효 용기에 시약을 직접 첨가하는 본래 용해화(in-situ solubilization) 일 수 있다. 이에 의해 뉴로트로핀을 얻기 위한 수거단계, 균일화단계, 원심분리단계의 부가적 단계를 피할 수 있다. 남은 입자들은 원심분리, 여과 또는 이들의 조합으로 제거될 수 있다.

뉴로트로핀이 폴딩되지 않았다면, 비천연의 뉴로트로핀의 크로마토그래피(RP-HPLC 등)에 의해 비폴딩의 정도가 적합하게 측정된다. 비천연 물질의 피크 면적의 증가는 비천연 뉴로트로핀이 얼마나 많이 존재하는지를 나탄낸다.

뉴로트로핀은 용해된 봉입체로부터 또는 정제의 후반 단계에서 일단 얻어지면, 하기하는 바와 같이 활성을 갖는 구조로 적합하게 재폴딩된다.

뉴로트로핀이 재폴딩되기 전에 이미 용해된 형태로 존재하지 않는다면, 뉴로트로핀은 카오트로픽제(chaotropic agent) 및 환원제를 뉴로트로핀을 충분히 용해하는데 필요한 양만큼 함유하는 알칼리 완충액중에 뉴로트로핀을 인큐베이션시켜 용해시킬 수 있다. 이 인큐베이션은 알칼리 완충액에서 뉴로트로핀을 용해시킬 수 있는 뉴로트로핀 농도, 인큐베이션 시간 및 인큐베이션 온도의 조건하에서 일어난다.

완충액중 뉴로트로핀 용해도의 측정은, 탁도 측정, 환원 SDS겔상에서 원심분리 후의 상청액 및 펠렛 사이의 뉴로트로핀 분획 측정, 단백질 검정(예, Bio-Rad단백질 검정 키트) 또는 HPLC에 의해 적합하게 수행된다.

가용화용 알칼리 완충액의 pH 범위는 전형적으로 최소한 약 7.5로, 바람직한 범위는 약 8-11이다. 후자의 범위에 속하는 pH를 제공하는 적합한 완충액의 예로는, 글리신, CAPSO (3-[시클로헥실아미노]-2-히드록시-1-프로판술포닉 에시드), AMP (2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS (3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술포닉 에시드), CHES (2-[N-시클로헥실아미노]에탄술포닉 에시드) 및 TRIS HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄히드로클로리드 등이 있다. 여기서 바람직한 완충액은 글리신 또는 CAPSO이고, 바람직하게는 약 20 mM 의 농도, 약 8.5 내지 11의 pH(바람직하게는 약 10 내지 11)이다.

가용화용 완충액중의 뉴로트로핀의 농도는 뉴로트로핀이 충분히 용해되고 부 분적으로 또는 완전히 환원 및 변성될 것이어야 한다. 선택적으로, 뉴로트로핀은 처음부터 불용성일 수 있다. 사용될 정확한 양은 예를 들어 완충액내 다른 요소들의 농도 및 유형, 특히 환원제의 유형 및 양, 카오트로픽제의 유형 및 양, 및 완충액의 pH에 의존적일 것이다. 예를 들어, 환원제(DTT 등)의 양이 증가하면, DTT:뉴로트로핀의 비율을 약 3:1 에서 10:1로 유지하기 위하여 뉴로트로핀의 농도도 동시에 최소한 3배는 증가할 것이다. 따라서, 뉴로트로핀의 바람직한 농도는 최소한 약 30 mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 30-50 mg/mL이다. 예를 들어, 뉴로트로핀은 5 M 내지 7 M 우레아(Urea), 10 mM DTT 중에 약 30-50 mg/mL의 농도로 용해시킬 수 있고, 폴딩을 위하여는 예를 들어 약 1 mg/mL로 희석할 수 있다.

용해시킨 후, 뉴로트로핀은 방치하거나 또는 5-40%(v/v)의 알코올성 또는 비양성자성 용매, 카오트로픽제, 및 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄 염을 함유하는 재폴딩 완충액으로 희석한다. 최초의 완충용액을 위한 완충액으로는 어떤 완충액 (CAPSO, 글리신 및 CAPS의 바람직하게는 pH 8.5-11, 특히 약 20 mM의 농도, 가장 바람직하게는 CAPSO 및 글리신)이라도 가능하다. 뉴로트로핀은 재폴딩 완충액으로 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 최소한 약 10배로 희석시킬 수 있다. 대안적으로, 뉴로트로핀은 재폴딩 완충액에 대하여 투석할 수 있다. 재폴딩은 약 2-45℃에서, 가장 바람직하게는 2-8℃에서 최소한 약 1 시간동안 수행할 수 있다. 이 용액은 또한 임의로 환원제 및 삼투제를 함유할 수 있다.

환원제는 상기 용해단계에서 기술하였던 것들로부터 주어진 농도 범위로 적합하게 선택되어 질 수 있다. 그 농도는 특별히 알칼리 토금속, 알칼리 금속, 또 는 암모니움 염, 뉴로트로핀 및 용매의 농도에 의존적일 것이다. 바람직하게는, 환원제의 농도는 약 0.5 내지 8 mM, 더욱 바람직하게는 약 0.5-5 mM, 더더욱 바람직하게는 약 0.5-2 mM이다. 바람직한 환원제는 DTT 및 시스테인이다.

재폴딩 용액내 산소는 불활성기체 예를 들어, 헬륨이나 아르곤의 첨가로 산소가 치환되어 임의적로 고갈될 수 있다.

임의의 삼투제는 바람직하게는 수크로스(약 0.25-1M의 농도) 또는 글리세롤(약 1-4 M의 농도)이다. 더욱 바람직하게는, 수크로스 농도가 약 1 M이고 글리세롤 농도는 약 4 M이다.

폴딩 완충액내 뉴로트로핀의 초기 농도는, HPLC, RIA 또는 바이오검정에 의해 측정되는 바와 같이, 회수된 잘못 폴딩된 형에 대한 정폴딩된 것의 비율이 최대화될 수 있는 것이다. 바람직한 뉴로트로핀의 농도(정폴딩된 구조형의 최대 생산을 가져오는)는 약 0.1 내지 15 mg/mL, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 6 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 0.2 내지 5 mg/mL의 범위에 있다.

이 인큐베이션 중에 일어나는 재폴딩 정도는 뉴로트로핀의 RIA 타이터(titer)나 완충액내 존재하는 정폴딩되고 생물학적 활성을 갖는 뉴로트로핀 구조의 증가 양과 직접 상관이 있는 RIA타이터 또는 정폴딩된 뉴로트로핀 피크 크기를 증가시키면서 하는 HPLC분석에 의해 적합하게 측정한다. 인큐베이션은 RIA 또는 HPLC에 의해 측정되는 바와 같이 정폴딩된 뉴로트로핀 구조의 생산을 최대화하고, 회수된 잘못 폴딩 뉴로트로핀 구조에 대한 정폴딩된 뉴로트로핀 구조의 비율을 최대화하고, 질량 발란스(mass balance)에 의해 측정되는 바와 같이 다분자체의 연합된 뉴로트로핀의 생산을 최소화하도록 수행한다. 대안적으로, 이 종들은 하기에서 제공되고 실시예에서 제공되는 방법에 의해 측정할 수도 있다. 구아니딘이 바람직한 재폴딩용 변성제이다.

뉴로트로핀의 재폴딩 후, 본문에제시된 다음의 절차는 개별적으로 또는 조합하여, 더 큰 순도 및 균질성을 얻기 위한 적합한 정제 절차의 예시적인 것이다: 양이온 교환 칼럼에서의 분획화; 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 및 실리카상에서의 크로마토그래피.

재폴딩 단계가 공정의 한 부분이든지 아니든지 무관하게, 뉴로트로핀을 그 변형체로부터 분리하는 바람직한 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지상에서 분리하는 것이다. 발효, 정제 또는 시험관내에서의 단백질 재폴딩 도중에 어떤 단백질은 화학적으로 개질되거나, 잘못 프로세싱되거나, 또는 천연의 3차 구조로 재폴딩되는 대신에, 안정성, 용해도, 면역성, 또는 생활성면에서 상이한 다른 구조로 재폴딩될 수 있다. 이러한 변형체들은 항원성 또는 능력상실과 같은 부작용을 피하기 위하여 회수중에 제거하여야 한다. 이 변형체가 불용성이라면, 원심분리 및 여과와 같은 고상/액상 분리기술에 의해 쉽게 제거할 수 있다. 그러나, 그 변형체가 가용성이라면, 크로마토그래피와 같은 고 해상도의 흡착기술이 이들을 제거하는데 필요할 것이다. 뉴로트로핀은 원핵세포에서 생성되거나, 시험관내에서 재폴딩되는 경우에는, 가용성의 안정한 잘못 폴딩된 변형체를 형성한다. 잘못 폴딩된 뉴로트로핀은 천연 뉴로트로핀에 비해 디설피드 쌍 패턴 및 3차 구조가 달라지고 천연의 약학적 활성이 없어진다. 진핵 세포 배양, 예를 들어, 포유동물 세포 배양에서 생성될 때, 변형체 형태는 일반적으로 미스프로세싱된 형태다. 이들도 또한 본래의 약학적 활성이 없어 제거되어져야 한다. HIC는 여기서 천연의 뉴로트로핀로부터 이들 변형체를 분리하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.

HIC 는 비공유적 소수결합을 통하여 매개되는 고형 매체로부터 단백질의 연속적인 흡착 및 탈흡착을 포함한다. 일반적으로, 고염 완충액 중의 표본 분자를 HIC칼럼에 투입한다. 완충액내 염은 물분자와 작용하여 용액내 분자의 용매화를 감소시키고, 이에 의해 표본 분자내 소수성 부위를 노출시키고 이것이 결과적으로 HIC칼럼에 의해 흡수된다. 분자가 더 소수성이면 소수성일수록, 결합을 촉진하기 위한 염은 덜 필요하다. 일반적으로, 감소하는 염 구배로 칼럼으로부터 표본을 용리시킨다. 이온 세기가 감소할수록 분자의 친수성 부위의 노출은 증가하고, 분자들은 소수성이 증가하는 순서로 칼럼으로부터 용리된다. 표본 용리는 또한 용리 완충액에 순한 유기 변형제 또는 세정제의 첨가로도 이루어진다. HIC는 서적 [Protein Purification, 2판, Springer-Verlag, New York의 176-179쪽(1988)]에 정리되어 있다.

단백질과 매트릭스 사이의 결합력은 부동 관능기의 크기 및 소수적 특성, 주위 용매의 극성 및 표면장력, 및 단백질의 소수성 등의 여러 인자에 의존적이다. HIC 매트릭스의 결합능력은 고정 소수성 리간드가 넓게 퍼져 있어야 할 필요성 때문에 낮은 경향이 있다. 또한 주어진 단백질에 대한 매체의 능력은 제작표본중 소수성 불순물의 양에 반비례하여 변화한다. 목적하는 단백질을 성능은 최대화하면서도 변형체나 다른 불순물로부터 분리해내기 위하여는, 적합한 HIC 고형 매체, 및 적하, 세척 및 용리를 위한 적합한 이동상을 밝혀내는 것이 필요하다.

여기서 결정되듯이, 정폴딩된 것과 잘못 폴딩된 뉴로트로핀을 분리하거나 또는 완전한 정프로세싱된 형태에서 미스프로세싱된 형태를 분리하는데 가장 적합한 매체는 고정 페닐 관능기를 갖는 것들이다. 페닐에 기초한 HIC 매체는 제조자가 다르면, 이러한 뉴로트로핀 형태들을 구분하는 능력이 다르게 나타난다. 페닐 토요펄(Phenyl Toyopearl) 매체 및 페닐 세파로스 패스트 플로우 저 치환(Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution)에 의해 최선의 결과가 달성된다. TSK 페닐 5PW도 또한 적합하다. 다른 HIC-고정된 관능기들이 이러한 형태들을 분리시키는 기능을 할 수 있다. 예로는 옥틸기 (파마시아사의 옥틸 세파로스 CL4B 매체상의 옥틸기 등) 및 프로필기(베이커사의 하이 프로필 매체상의 프로필기 등)가 있다. 덜 바람직한 것으로는 알콕실 관능기 수지, 부틸 관능기 및 이소아밀 관능기 수지가 있다.

HIC는 포유동물 세포 배양에서 그들의 변형체로부터 뉴로트로핀을 분리하는데 유용하였다. 예를 들어, 여기서 측정된 바와 같이, rhNGF-발현-CHO세포배양물은 부정확하게 단백질 가수분해되어 프로세싱된 변형체, 예를 들어, 전구 서열(전구 NGF, 잡종 전구 NGF 및 잘려진 전구 NGF서열)이 일부 존재하는 변형체를 포함하였다. 또한 포유류 세포 배양 배지에서 발견되는 것은 모두 글리코실화된 NGF 및 부정확하게 단백질 가수분해적으로 프로세싱된 변형체의 글리코실화된 형이다. 바람직하지 않은 글리코실화된 형(NGF가 고분자량(+2000kD)으로 보여질 수 있는 경우)은 환자에게서 필요치 않은 항원반응을 야기할 수 있고, 제품의 품질 및 활성을 악화시킨다. HIC는 rhNGF로부터 소수성 변형체, 글리코실화된 형을 포함하여 주로 N-말단이 단백질 가수분해적으로 미스프로세싱된 변형체를 효과적으로 분리한다. 실시예에 설명된 바와 같이, 전구체-서열을 함유하는 NGF와 잘려진 전구체 서열 NGF 및 NGF와 그 전구체 서열 함유 NGF의 글리코실화된 형은 페닐-HIC 도중에 NGF의 선단에서 용리된다. 따라서, 실질적으로 이들 종이 없고 이후의 단계(예를 들어 고성능 양이온 교환 크로마토그래피)에 특히 적합한 rhNGF 함유물이 얻어진다. HIC는 NGF 뿐만 아니라 원천에 관계없이 다른 뉴로트로핀에도 응용가능하다. 예를 들어, HIC는 2분자체(존재하는 단량체 형태에 따라 동형 2분자체 또는 이형 2분자체 둘 중 하나)로부터 NGF단량체를 분리하고, 또한 시험관내 재폴딩 후 얻어지거나 또는 포유류 세포로부터 생산되어 분비될 때 소수적 성질이 다른 2분자체들을 구별하는데 유용하다. HIC와 함께 사용될 뉴로트로핀 혼합물의 바람직한 출발물은 포유류 세포배양물, 더욱 바람직하게는 CHO 세포배양물이다. 이 배양물은 여기서 논의된 바와 같이 바람직하게는 최소한 하나의 사전 정제 단계를 거친다. HIC는 미스프로세싱된 글리코실화 변형체(들)을 천연의 재조합 뉴로트로핀로부터 분리하는데 특히 효과적이다. rhNGF의 경우, 글리코실화된 형과 프리프로 NGF 형이 천연의 NGF 보다 덜 소수적이어서, 천연의 NGF 이전에 용리된다. 잘못 폴딩된 형의 뉴로트로핀(박테리아에서 생성된 것)은 또한 더 소수적이어서 천연의 뉴로트로핀 보다 더 일찍 용리된다.

뉴로트로핀 형태들을 분리하는데 가장 선호되는 HIC 수지는 고정된 페닐 관능기를 갖는 것들이다. 다른 제조사로부터의 페닐-기재 HIC 배지는 이들 NGF 형들을 분리하는데 다른 효율성을 보인다. 이들 페닐-HIC수지 중에서, 토소하스사의 페닐 토요펄(Toyopearl)배지가 가장 바람직하고, 페닐 세파로스 패스트 플로우 저 치환(Pheny Sepharose Fast Flow Low Sub) 및 TSK 페닐 5PW가 바람직하다. 바람직한 HIC 관능기는 알콕실, 부틸, 이소아밀 부분이다.

HIC 이용시, 다양한 이동상의 조건을 이용한 세척으로 뉴로트로핀 형태들을 순차적으로 용리시킬 수 있다. 이 이동상은 뉴로트로핀과 정지상과의 결합에 다른 방법으로 영향을 주는 여러 다른 화학종을 포함할 수 있다. 정폴딩 및 잘못 폴딩된 뉴로트로핀(예를 들어, NT-4/5)는 이동상 염 등(황산 암모니움, NaCl 농도, 아세테이트 농도)의 염 구배의 감소 또는 단계적 감소에 의해 HIC 컬럼상에서 분리될 수 있다. 염은 이동상의 표면장력을 변화시켜 뉴로트로핀의 수지 결합력에 영향을 줄 수 있다. 표면 장력에 영향을 주는 다른 시약으로는 실시예에서 논의되는 바와 같이 구연산 나트륨 및 테트라메틸 염화 암모늄이 있다. 상대적인 극성 유기 용매 농도의 증가하는 구배 또는 단계적 증가에 의해 결합된 단백질을 용리시킴으로써 칼럼 크로마토그래피에서 변형체를 분리할 수 있다. 적합한 용매의 예로는 에탄올, 아세토니트릴 및 프로판올이 있다. 뉴로트로핀 형과 HIC 수지 사이의 결합력은 또한 이동상 pH에 의존적이고, 중성 조건이 바람직하다. 정폴딩 및 잘못 폴딩된 뉴로트로핀의 상대적 소수성도 또한 용액 pH에 의존적이다. 또한 구배나 단계적 용리 도중에 이동상의 여러 특성을 동시에 변화시킴으로써 천연 뉴로트로핀에서 변형체를 분리할 수 있다. 예를 들어, 염만 변화시켰을 때보다, 염 농도 및 비양성자 용매 농도를 용리 도중에 동시에 변화시키면 선별력이 증가한다.

HIC를 위하여는 본문에기술된 염, 황산 암모늄, 구연산염, 아세트산염 및 염화 칼륨 등이 사용될 수 있다. 뉴로트로핀이 수지에 결합하기 위하여 염의 농도는 사용된 염에 따라 일반적으로 0.5 M 내지 3 M, 더욱 바람직하게는 0.5 M 내지 2.5M이다. 예를 들어, 0.8 내지 1.5 M 염의 결합 완충액이 NGF용으로는 적합하고, 더 높은 염농도는 NGF의 수지상 침전을 가져와 회수율이 낮은 결과를 가져온다. NT-3를 위하여는, 염농도 1.0 내지 2.5의 pH 7의 결합완충액이 바람직하고, 1.25 내지 1.75 M NaCl이 더욱 바람직하고, 1.5 M이 가장 바람직하다. NT-4/5를 위하여는, 염농도 1 내지 3 M의 pH 7의 결합 완충액이 바람직하고, 2 내지 2.75 M이 더욱 바람직하고, 2.5 M NaCl이 가장 바람직하다. NT-4/5의 경우, 2.5 M NaCl이 적하에 적합할 때, 존재하는 유기 용매(10% 알코올, pH 7)를 갖는 2M NaCl이 용리에 바람직하다. 바람직하게는, 염 농도의 저하가 뉴로트로핀과 그 변형체의 용리 및 분리에 사용된다. 용리를 이루기 위해서는, 용리완충액내 염농도는 적하완충액내의 염농도보다 일반적으로 낮으나, 유기 용매로 보상되었다면 같을 수 있다.

또한, 유기 용매 사용의 또다른 이점은, 여기서 발견된 바와 같이, 유기 용매의 첨가가 피크 양상을 좁힘으로써 용리패턴을 향상시킨다는 것이다. 에탄올 이외에, 프로판올, 이소프로판올, 및 저급 알킬렌 글리콜(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜) 등의 여기서 논의된 다른 유기 용매가 사용될 수 있다. 전형적으로 5 내지 25%(v/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 20%(v/v)의 유기 용매가 정폴딩된 뉴로트로핀을 용리시킬 것이다. 유기 용매로의 용리는 구배적이거나 단계적일 수 있다. pH 범위는 바람직하게는 거의 중성에서 약산성, pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 8, pH 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 pH 7이다. pH가 원하는 범위인 한 여기서 논의된 어떤 완충액(MOPSO, MOPS, HEPES, 인산염, 구연산염, 암모늄 아세트산염, 등)도 사용될 수 있다.

본문에 보고된 바와 같이, 본 발명자에 의한 뉴로트로핀의 재조합적 생산에서 나타나는 불요한 뉴로트로핀 변형체의 발견에서 보면, 고성능 양이온 교환 크로마토그래피(바람직하게는 예비적 모드에서)가 카바밀화된 형, 산화된 형, 이소아스프(isoasp)형, 탈아미드화된 형 및 어떤 잘려진 형(예를 들어, NGF의 C-말단이 잘려진 형)과 같은 전하가 변화된 변형체를 천연의 뉴로트로핀로부터 분리하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, NT-4/5 및 NT-3의 경우에서와 같이, 박테리아 발효 도중에 생길 수 있는 N-말단이 잘려져서 전하의 변화가 일어난 형(예를 들어, 2 에서 4번째의 N-말단 아미노산의 결실)이 이제 제거될 수 있다. 포유동물 세포 배양에서 생성된 뉴로트로핀의 경우에는 C-말단 결실이 많이 하전된 말단 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들어, NGF의 118형은 그 C-말단에서 미스프로세싱이나 절단이 일어나 117, 114 및 115형이 생길 수 있다. 이들은 고성능 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 천연의 118 NGF로부터 분리될 수 있다. 특히, 바람직한 실시예는 SP-세파로스 고성능 수지, 프락토겔 EMD SO3 수지, 또는 폴리아스파르트산 수지를 사용하고, 이 중에서 폴리CAT A가 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 대규모의, SP-세파로스 고성능 또는 프락토겔 EMD SO3수지가 사용된다.

본문에 기술된 과정에 의해 얻어진 조성물은 충분히 순수한 뉴로트로핀, 일반적으로 그리고 바람직하게는 본질적으로 순수한 뉴로트로핀이고, 뉴로트로핀 변형체가 충분히 제거된, 더욱 바람직하게는 뉴로트로핀 변형체가 본질적으로 제거된 것일 것이다. 예를 들어, CHO 세포배양물로부터 NGF의 정제 이후의 전형적인 SP-세파로스 푸울(pool)은 약 92% 118, 4.6% 120, 1% 디아미드화된 NGF, 1% 산화된 NGF 및 1% 이소아스프 NGF를 함유한다. 일상적으로, 각 종의 양은 118에 대하여는 약 85 내지 93%, 120에 대하여는 0 내지 5% (주로 사용된 내생적 및/또는 외생적 단백질 가수분해의 정도에 따라), 117에 대하여는 약 0 내지 5%, 탈 아미드화 형에 대하여는 0 내지 3%, 이소아스프 형에 대하여는 0 내지 2%, 및 산화된 형에 대하여는 0 내지 2%이다. NGF의 순도(모든 종에서)는 일상적으로 99.5%를 초과한다.

뉴로트로핀을 칼럼으로부터 용리시킨 후, 담체를 가지고 조성물로, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 담체를 갖는 약학적 조성물로 적합하게 제제화한다. 뉴로트로핀 조성물은 바람직하게는 무균상태이다. 본 발명의 뉴로트로핀 조성물은 또한 시험관내에서, 예를 들면, 배양중인 뉴우런의 성장 및 생존을 촉진하는 기능이 있음이 밝혀졌다.

수용액에서 재조합 인간 신경성장인자(NGF)의 화학적 물리적 안정성은 5 내지 37℃ 사이, 4.2 내지 5.8의 pH 범위 사이로 연구되었다. NGF의 화학적 안정성은 pH가 증가함에 따라 증가하였다. pH 5.8, 호박산염 완충액에서, NGF의 물리적 안정성은 단백질의 응집으로 감소하였다. 5℃ 안정성 자료와 37℃에서의 분해 가속 자료에 기초할 때, 최적의 제제화는 pH 5.5 에서의 아세트산염 완충액인 것으로 밝혀졌다.(WO 97/17087 참조, 이를 참고로 본문에삽입한다) 역-상 HPLC는 Asn-93의 iso-Asp로의 전환이 5℃에서의 주 분해 경로라는 것을 보여주는 최초의 안정성 표시 방법이다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 NGF분해의 정량화는 시간이 지남에 따라 NGF 1분자 변형체의 여러 혼합된 2분자체로의 재배열(2분자체 교환)에 의해 복잡해진다. 표본과 대조군에 묽은 산을 처리하면 2분자체내 1분자체의 분포를 빠르게 평형화시켜, 2분자체 교환이 없는 상태에서 NGF의 분해가 정량화될 수 있다. 여러번 사용 목적을 위한 두 액상 제제내에서 벤질 알코올 및 페놀의 rhNGF와의 상용성 및 안정성을 측정하였다. 이 두 제제들은 20 mM 초산나트륨(pH 5.5) 중 0.1 mg/mL의 단백질과, 0.01% 플루로닉 에시드(pluronic acid)(F68)를 계면활성제로 갖거나 갖지 않는 136 mM의 염화 나트륨으로 구성된다. 이 두 제제중의 벤질 알코올 및 페놀의 최종 농도는 각각 0.9% 및 0.25% 이었다. 12개월 안정성 자료에 의거할 때, rhNGF는 이들 제제에서 페놀 보다는 벤질 알코올과 더 안정하다. 계면활성제를 갖는 벤질 알코올로 저장된 rhNGF제제는 첨가 계면활성제가 없는 제제에서 만큼 안정하고, 이는 F68을 rhNGF 복수회 투여 제제에 첨가하는 것이 안정성 목적에서는 필요하지 않음을 나타낸다. 따라서, pH 5.5에서 20 mM 아세트산 염 중에 0.1 mg/mL의 단백질, 136 mM NaCl, 0.9% 벤질 알코올로 구성된 제제가 제3기 임상적 추적에서 여러번의 투여를 위해 사용되는 rhNGF로서 권장할 만 하다. 여러번 투여하는 이 rhNGF 제제는 5℃에서 6개월이 넘는 USP 및 EP 보존 효율을 통과하였고, 2 mg/mL에서 현 액체 제제만큼 안정하다. 그러나, 광에 민감한 벤질 알코올이 보존제로서 존재하기 때문에 이 제제는 강한 광선에 노출되는 것을 피해야 한다.

일반적으로 이 조성물은 바람직하게는 안정하고 액상 또는 동결건조형인 제제의 질을 악화시키지 않을 양만큼, 또한 효과적이고 안전한 약학적 처방에 적합할 양만큼의 다른 성분들을 포함할 수 있다.

뉴로트로핀은 예를 들어 사용되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 독성이 없고, 제제의 다른 성분들과 양립가능한 담체인 약학적으로 허용되는 담체로 제제화된다. 예를 들어, 이 제제는 폴리펩티드에 유해한 것으로 알려진 산화제 및 다른 성분들을 바람직하게는 포함하지 않는다. 이 제제화 단계는 표준적인 기술을 이용하여 탈염 또는 투석여과(diafiltering)하여 이루어진다.

일반적으로, 뉴로트로핀을 액체 담체 또는 미세하게 분해된 고체 담체, 또는 이들 모두와 균일하면서 밀착적으로 접촉시킴으로써 제제를 제조한다. 그다음, 필요하면, 산물을 원하는 제제 모양으로 형상을 만든다. 바람직하게는 담체가 비경구 담체, 더욱 바람직하게는 수혜자의 혈액과 등장액인 용액이다. 이러한 담체 수송체의 예로는 물, 식염수, 링거액, 및 덱스트로스 용액 등이 있다. 리포좀 뿐만 아니라 불휘발성 기름 및 에틸 올레산염과 같은 비수성 수송체가 여기서 또한 유용하다.

이 담체는 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질과 같은 첨가제를 적합하게 소량 함유한다. 이러한 물질은 사용된 복용량 및 농도에서 수혜자에게 독성이 없고, 이러한 물질에는, 인산, 구연산, 호박산, 초산 및 다른 유기산, 또는 이들의 염과 같은 완충액; 아스코르브산과 같은 항산화제; 예를 들어 폴리아르기닌 또는 트리펩티드와 같은 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 또는 그 유도체, 트레할로스, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 등의 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 반-이온(counter-ion); 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머(poloxamer) 또는 PEG와 같은 비이온 계면활성제 등이 있다. 최종 제제는 액체 또는 동결건조된 것일 것이다.

치료적 처방에 사용되어질 뉴로트로핀은 무균이어야 한다. 무균 필터링 막(예를 들어 0.2 미크론 막)을 통하여 여과시켜 쉽게 무균화한다. 치료용 뉴로트로핀 조성물은 일반적으로 무균적으로 접근가능한 입구를 갖는 용기, 예를 들어, 피하주사용 주사 바늘이 뚫고 들어갈 수 있는 뚜껑을 갖는 정맥주사 용액 백 또는 병에 담겨진다. 상기 제제는 또한 시험관내 용도로도 적합하다.

보통 뉴로트로핀은 단위-투여량 단위 또는 다회투여량 단위 용기, 예를 들어, 봉합된 앰풀 또는 병에 수용액으로서 또는 물을 타서 사용할 수 있는 동결건조된 제제로서 저장될 것이다. 동결건조된 제제의 예로는, 10 mL 병에 멸균-필터링된 1% (w/v)수성 뉴로트로핀을 5 mL 채우고, 이를 동결건조시킨다. 동결건조된 뉴로트로핀을 세균발생 억제적인 주사용수를 이용하여 재조성하여 주사용 용액을 제조한다.

뉴로트로핀 제제의 치료적으로 유효한 투여량을 환자에게 투여한다. 여기서 "치료적으로 유효한 튜여량"이란, 투여하는 목적의 효과를 내는 투여량을 의미한다. 정확한 투여양은 치료될 질환에 의존적이고, 이 기술분야의 당업자는 공지의 기술을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 일반적으로, 본 발명의 뉴로트로핀 제제는 매일 약 0.01 μg/kg 내지 약 100 mg/kg씩 투여된다. 바람직하게는, 0.1 내지 0.3 μg/kg이다. 또한 이 기술분야에서는 알려진 바와 같이, 연령 및 체중, 일반적 건강, 성별, 음식, 투여 시간, 약의 상호작용, 및 질병의 심한 정도에 따른 조정이 필요할 것이고, 이 기술분야의 당업자는 통상적인 실험으로 확인가능할 것이다. 일반적으로 임상학자는 복용량이 뉴우런 기능을 회복, 유지 및 바람직하게는 재구성시킬 수 있는 수준에 달할 때까지 본 발명의 뉴로트로핀 제제를 투여할 것이다. 이 치료의 성과는 통상적인 측정방법으로 쉽게 측정된다.

선택적으로 뉴로트로핀은 다른 향신경성 인자(NGF, NT-4/5, NT-3 및/또는 BDNF 등)와 조합하거나 또는 이와 조화를 이루어 처방되고, 신경질환에 대한 다른 통상적인 치료와 함께 사용된다.

NGF의 경우, 바람직하게는 조성물이 약학적으로 유효한 양의 신경 성장인자 및 약학적으로 허용되는 아세테이트- 함유 완충액을 포함하여 이루어진다. 이 조성물은 pH 5 내지 6의 pH를 가질 것이다. 완충액은 바람직하게는 아세트산 나트륨이다. 바람직한 아세테이트의 농도는 0.1 내지 200 mM 이다. 본 조성물의 바람직한 NGF 농도는 0.07 내지 20 mg/ml이다. 또한 이 조성물은 임의로 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 또는 프로필파라벤과 같은 약학적으로 허용가능한 보존제를 더 함유한다. 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다. 벤질 알코올의 농도는 바람직하게는 0.1 내지 2.0 %이다. 이 조성물은 임의로 약학적으로 허용가능한 계면활성제를 함유할 수 있다. 또한, 이 조성물은 임의로, 그러나 바람직하게는, 생리학적으로 허용가능한 농도의 염화 나트륨을 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 조 성물은 최소한 약 0.1 mg/ml 농도의 신경성장인자 및 10 mM 내지 50 mM 농도의 아세테이트 이온을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 0.1 내지 약 2.0 mg/ml 농도의 신경성장인자 및 10 mM 내지 50 mM의 아세테이트 이온 농도를 포함한다. 가장 바람직한 조성물은 0.1 mg/ml 농도의 NGF, 20 mM 농도의 아세트산 나트륨(pH 5.5), 136 mM 농도의 염화 나트륨, 및 0.9%(v/v)의 벤질 알코올을 함유한다.

또다른 구현예는 2.0 mg/ml 농도의 NGF, 10 mM 농도의 아세트산 나트륨(pH 5.5), 142 mM 농도의 염화 나트륨을 포함한다. NGF를 0.1 mg/ml NGF, 20 mM 아세트산 나트륨, 136 mM 염화 나트륨, 0.9%(v/v)의 벤질 알코올(pH 5.5)을 가지고 제제화하는 것이 바람직하다. 여기서 논의된 바와 같이, 118/118 동형 2분자체는 NGF의 바람직한 형이다. NGF는 보통의 2분자체를 유지하기 위하여 약 pH6 내지 8에서 정제된다. 그러나, (단백질 가수분해적으로) 잘려진 형의 비율은 1분자체형을 나타내고, 이는 역상 HPLC에 의해 명백해지고, 측정되어질 수 있다. 분석적 HPLC의 산 조건은 2분자체를 해리시킨다. 다른 2분자체 형 NGF(120/120, 120/118, 118/118 등)의 존재가 발표되어져 왔다(쉬멜져 등 J. Neurochem. 59:1675-1683(1992), 그 일반적인 내용 뿐만 아니라, 주로 현 연구에서 사용된 분석적 바이오검정을 위하여 그 전문을 특별히 본문에삽입한다). 이 논문은 각 2분자체에 대하여 시험관내에서의 활성이 모두 같았음을 보고하였다. 그러나, 대조적으로, 여기서의 본 연구는 방사수용기에 기초한 검정을 이용하여 120/120 2분자체가 덜 활성을 갖는다는 것, 즉 118/118종에 비해 약 80-90%의 활성을 갖는다는 것을 최초로 밝혔다. 한 검정 유형에서는, 들쥐 PC-12 세포의 막을 단리하여 표준 NGF와 여러 시험 종 사이의 경쟁적 결합을 위해 사용하였다. RRA는 P75 및 trk A 수용체를 모두 갖는다. 또한 117/117 종이 118/118 종 만큼 활성을 갖는다는 것이 여기서 밝혀졌다. 또한, 여기서 PC-12에 기초한 검정의 이용은, 120/120 형이 118/118 형 활성의 약 60% 활성을 갖는 것을 보여주는 수용기에 기초한 검정의 발견을 확실히 하고 있다. 또한 버톤(Burton et al.)의 논문 [J. Neurochem. 59:1937-1945(1992)]을 그 일반적인 개시내용 뿐만 아니라 현 연구에서 사용된 주로 그 분석적 및 바이오검정을 위하여 특히 그 전체를 참고로서 본문에 삽입한다.

120/120 형 보다 118/118 형이 인간 환자에게는 더욱 생물학적으로 활용가능하다고 믿어진다. 생물학적 활용성의 증가는 최소한 4 내지 5배이다. 이 차이는 선행기술에서 봤을때 중요하고, 놀라우며, 예견하지 못하였던 것이다.

다음의 실시예는 예시로서 제공된 것이지 제한하기 위한 것은 아니다. 명세서내의 모든 인용문헌에서 개시된 것을 여기서 특별히 참고로 삽입한다.

<실시예 1> 118/118 NGF 동형 2분자체의 순수 정제

본 실시예는 각 단계에서의 NGF의 순수 정제 및 근본 원리를 설명하고 있다. 각 실시예에서와 같이, 이 기술분야의 당업자는 이 분야에서는 공지인 초기 배지의 부피 및 단백질 농도에 따라 쉽게 칼럼의 치수와 흐름속도를 쉽게 결정하고 조정할 수 있다.

세포배양액의 수거

120 아미노산의 인간 NGF를 암호화하는 DNA서열을 함유하는 발현벡터를 갖고 재조합 CHO 세포를 형질감염시켰다. 분비 및 프로세싱을 촉진하기 위하여 NGF 프리프로 서열도 또한 존재하였다. 재조합 CHO 세포를 배양한 후, 세포 배양 배지를 수거하였다. 수거한 세포배양액(HCCF)은 120, 118, 117의 NGF종을 포함하였다. 40-70%의 NGF는 일반적으로 118/118 동형 2분자체이고, 나머지는 120/118, 120/120인 이형 2분자체 및 소량은 118/117이다. 여기서 밝힌 바와 같이, 모든 종은 SP-세파로스 HP 칼럼으로 분리될 수 있다.

수거한 세포 배양액은 밀리포어 10 Kd 컷오프 멤브레인(Milipore 10 Kd cutoff membrane)(교환사용 가능한 셀룰로스, 복합형 또는 폴리술폰 중의 하나가 사용되었다)을 이용하여 약 20 배 농축시켰다. 농축액에 1.0 M Tris(pH 8.2) 0.1 부피를 첨가하였다. 희석시킨 물질은 0.22 μm 필터로 마이크로필터링하여 홀딩 탱크로 옮겨 37℃에서 2 내지 18 시간동안 두었다. 120/120 형의 118/118 형으로의 전환은 홀딩 도중의 내생적 프로테아제가 촉매한다.

실리카겔 크로마토그래피

마이크로 여과액은 1M NaCl로 조정하여, 1M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7에서 평형화시킨 실리카겔 칼럼에 가하였다. 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7로 칼럼을 씻었다. 적합한 pH 범위는 약 pH 6 내지 8이고, 바람직하게는 pH 7이다. 그 다음 25 mM MOPSO, pH 7로 칼럼을 씻었다. 저전도성 세척은 숙주세포 단백질을 제거한다. 결합한 NGF는 50 mM MOPSO, 0.5 M TMAC, 무수급 알콜 20% 시약(특급 변성 알코올 처방 3A(메탄올 5 부피 및 200도 에탄올 100 부피) 94-96% 및 이소프로판올 4-6%)으로 용리시켰다. 20% 프로판올, 20% 이소프로판올, 20% 메탄올 등과 같은 다른 알코올도 사용될 수 있다. 여기서 사용되는 "알코올" 및 "알코올성 용매"는 알코올에 대해 일반적으로 사용되는 의미로 쓰였고, 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소원자를, 더욱 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-프로판올 또는 t-부탄올을, 가장 바람직하게는 에탄올 및 이소-프로판올을 의미한다. 이러한 알코올은 수용액에 첨가되었을때 용액의 극성을 감소시켜 용액의 소수성을 증가시키는 용매이다. 에탄올이 가장 바람직하다. 알코올의 하한은 용리되는 퍼센트이고, 상한은 단백질 변성을 방지하는 요구에 의해 정해진다. 용매는 바람직하게는 5% 내지 25%이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 20%이고, 더더욱 바람직하게는 5 내지 15%이다. TMAC는 테트라메틸 염화 암모니움으로, NGF를 용리시키기 위해 존재한다. TMAC의 범위는 0.1 내지 1 M일 수 있다. 0.3 내지 0.7 M의 범위가 더욱 바람직하다. NGF를 용리시키기 위해 사용되는 TMAC의 양은 pH와 알코올 농도의 함수이다. pH가 낮을수록 더 적은 양의 알코올 및 TMAC가 필요하다. pH는 약 pH 4 내지 8 사이일 수 있다. 이 실시예에서 바람직한 pH는 7이고, 이 때, 다음 칼럼에 적하하기 이전에 합쳐진 분획의 조정이 최소화된다. pH의 상한은 다음 칼럼에 적하하기 위해 필요한 pH에 의해 결정되고, 하한은 NGF를 효과적으로 용리하는데의 필요에 의해 결정된다.

S-세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피

NGF를 포함하는 용리액을 모아서, 정제수로 전도도 15.5 ms/cm 미만으로 희석하고, pH를 7.0으로 조정하였다. 여러 프로테아제들이 여전히 존재할 것이므로, 시료를 8 시간 이하 방치하였다. 그러나, 120 아미노산 NGF를 118 형으로 변환시 키는 내생적 프로테아제 활성을 관찰되지 않았다. 이 시료를 25 mM MOPSO(pH 7)에서 평형화시킨 S-세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 칼럼(양이온 교환 수지 S-세파로스 TM 아가로스 패스트 플로우 TM(파마시아사))에 시료를 가하였다. 25 mM MOPSO(pH 7)로 칼럼을 세척하였다. 적합한 pH 범위는 약 pH 6 내지 8이고, 바람직하게는 pH 7이다. 그 다음, 칼럼을 0.16 M NaCl(pH 7)로 세척하였다. 결합된 NGF는 0.5 M NaCl(pH 7)로 용리시켰다. 용리 염 몰농도는 0.3 내지 1.0 M, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.6 M의 범위이다. 하한은 모든 NGF를 용리시킬 수 있는 필연성에 의해 설정되고, 상한은 불순물을 제거하는 것을 피하고 NGF의 용리를 방해할 칼럼내 소수성 상호작용을 야기하는 것을 피하는 필요에 의해 정해진다. 다른 염도 사용될 수 있고, KCl이 바람직하게 대용된다. 적은 부피의 푸울을 얻기 위하여는 0.5 M NaCl(pH 7)로 용리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 1 M을 초과하는 높은 염농도에서는, 강하게 결합하고 있는 불순물이 용리될 수 있다.

페닐 토요펄 650M 크로마토그래피(Pheny Toyopearl 650M Chromatography)

NGF 포함 SSFF 칼럼 분획을 모아, 1M NaCl로 조정하여, 페닐 토요펄 650M 칼럼에 가하였다. 25 mM MOPSO, pH 7로 칼럼을 씻었다. 적합한 pH 범위는 약 pH 5 내지 8이다. 구배 완충액A (25 mM MOPSO, pH 7, 1.0 M NaCl)에서 시작하여 구배 완충액 B(25 mM MOPSO, pH 7 80% 중의 20% 알코올)로 끝나는 10 CV(칼럼 부피) 선형 구배로 결합 NGF를 용리하였다. NGF를 포함하는 분획은 SDS-PAGE 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하여 어떤 분획이 전구체 NGF종을 함유하는지를 결정하였다. NGF를 포함하는 분획은 선택하여 합쳐서, 주로 부정확하게 프로세싱된 변 형체(부분적인 전구체 서열이 존재하는 것과 같은 것, 예를 들어, 전구체 NGF, 잡종 전구체 NGF, 및 절단된 전구체 NGF서열 등)를 제거하여 어떤 NGF전구체 서열도 충분히 제거된 NGF 조성물을 얻는다. 페닐 칼럼은 또한 소량의 글리코실화된 NGF 및 글리코실화된 NGF 전구체 서열을 또한 제거한다. 전구체 및 잘려진 전구체 NGF 서열은 NGF 및 전구체 NGF의 글리코실화 형과 함께 NGF피크의 선단에서 용리된다. 따라서, 이 칼럼은 여러 NGF 변형종으로부터 NGF를 쉽게 분리하여, 이들 종이 충분히 제거된 NGF 조성물을 얻게 한다. 이 단계에서, 변형 NGF 소수성 변형체(단백질 가수분해된 변형체 및 글리코실화된 변형체 등을 포함하는 주로 미스프로세싱된 변형체)는 HIC를 이용하여 분리되었다.

NGF 형들을 분리하는데 가장 적합한 매체는 고정된 페닐 관능기를 갖는 것들이다. 다른 제조사로부터의 페닐-기초 HIC 매체는 이들 NGF형들을 분리하는데 있어서 다른 효율성을 보였다. 토소하스사의 페닐 토요펄 매체를 이용하였을 때 가장 좋은 결과가 얻어졌다. HIC 수지 페닐 세파로스 패스트 플로우 저 치환 및 TSK 페닐 5PW도 좋은 결과를 보인다. 알콕시, 부틸, 및 이소아밀 부분을 포함하는 이러한 조건에서는 다른 HIC 관능기들은 덜 적합하고, 덜 효과적이다.

페닐 토요펄 푸울은 75%의 118, 10%의 120, 7%의 117, 1.8%의 탈아미드화된 NGF, 1.4%의 산화 NGF, 및 2.0%의 이소아스프 NGF와 나머지 2.8%는 다른 밝혀지지 않은 NGF종을 함유한다.

임의적으로, 합쳐진 분획들은 바이러스의 불활성화를 위해 3.95 미만의 pH에서 최소한 15분 동안 산처리하였다.

SP-세파로스 HP 크로마토그래피

HIC 푸울을 물 0.5 내지 1 부피로 희석하고, 희석한 푸울을 pH 6으로 조정하였다. 5% 반응성 알코올을 함유하는 (실리카겔 칼럼 단계에서와 같이) 0.2 M 염화 나트륨, 20 mM 호박산, pH 6으로 평형화시킨 SP-세파로스 HP 칼럼 상에 푸울을 적하하였다. 5% 반응성 알코올(공식 SDA-3A 알코올; 이 알코올의 존재는 임의적이다)을 함유하는 0.2 M 염화 나트륨, 20 mM 호박산, pH 6으로 칼럼을 세척하였다. 알코올은 NGF와 수지 주쇄와의 비특이적 상호작용(주로 소수성 작용)을 감소시키는데 기여한다. 적합한 알코올 범위는 약 0 내지 10%이다. 적하 pH는 약 pH 5 내지 8로서, 이것은 NGF의 최대 안정성 및 NGF 변형체의 분리를 이루고 유지하도록 선택한다. 2 칼럼 부피의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 구배완충액 A (5% 알코올을 함유하는 0.25 M NaCl, 0.02 M 호박산염, pH 6)의 11 칼럼 부피 및 구배완충액 B (0.5 M NaCl, pH 6)의 11 칼럼 부피와의 혼합에 의해 만들어진 22 칼럼 부피의 선형 구배에 의해 결합된 NGF를 용리하고 변형체로부터 분리시켰다. 이 알코올은 임의적이다. 118/118 NGF는 일반적으로 0.35 M 내지 0.40 M NaCl 농도에서 용리되었다.

칼럼 분획의 NGF 및 변형 NGF 함량에 대하여 분석하였다. 분획들은 바람직하게는 쉬멜져(1992)(상기) 및 버톤(1992)(상기)이 기술한 바와 같이 C4 RP-HPLC로 분석하였다. 분획들을 선택하여 합쳐서 개질 NGF변형체(예를 들어 산화된 NGF 종, 탈아미드화된 NGF 종 및 이소아스프 NGF 종과 같은 하전된 종류들)가 충분히 제거된 NGF 조성물을 얻는다. 이전의 HIC 칼럼은 산화된 NGF 및 이소아스프 NGF와 같 은 다른 변형체 유형을 효과적으로 제거하지 못하였다. 더 소수성을 갖기 때문에 정폴딩된 NGF보다 HIC 수지에 더 강하게 결합하는 잘못 폴딩된 단백질 및 글리코실화된 것을 HIC 칼럼은 효과적으로 제거한다. 따라서, 양이온 교환수지(예를 들어 SP-세파로스 HP)는 HIC수지에 의해 제거되지 않는 전하가 변한 변형체를 제거하는데 사용하였다.

SP-세파로스 푸울은 92%의 118, 4.6%의 120, 1%의 탈아미드화된 NGF, 1%의 산화 NGF 및 1%의 이소아스프 NGF를 함유한다. 일상적으로, 각 종류의 양의 범위는 85-93%의 118, 0-5%의 120, 0-5%의 117, 0-3%의 탈아미드화된 NGF, 0-2%의 산화 NGF 및 0-2%의 이소아스프 NGF이다. NGF(모든 종류)의 순도는 일상적으로 99.5%를 초과한다.

제제화

SP-세파로스 HP 푸울을 제제화 완충액중으로의 울트라 여과/디아여과(UF/DF)하여 제제화를 위해 준비하였다. 산성 완충액이 바람직하게 사용되고, 상기한 바와 같이, pH 5의 아세테이트가 바람직하다. 이 118/118 NGF 조성물은 NGF변형체가 충분히 제거되었고, 충분히 순수한 NGF이다. 이 제제화 물질은 뉴우런 질환의 치료, 특히 당뇨와 연관된 말초 신경질환, AIDS와 연관된 말초 감각성 신경질환의 치유에 적합하다.

<실시예 2> 120/120 NGF 동형 2분자체의 대량 순수 정제

세포배양액의 수거

HCCF는 12,000 리터의 CHO 세포로부터 일반적으로 실시예 1에서 기술한 바와 같이 얻었다. HCCF내 NGF 종의 분포는 약 40-65%가 120/118 이형 2분자체를 갖는 120/120 동형 2분자체이고, 나머지는 118/118 동형 2분자체이다. 단백질 가수분해에 의한 120에서 118로의 전환을 최소화하기 위하여 일반적으로 배지를 재빨리 프로세싱시킨다.

대규모 high S 양이온-교환 크로마토그래피

HCCF를 대규모 high S 양이온-교환 크로마토그래피 칼럼에 가하고, 1.5 M 소디움 아세테이트, 50 mM HEPES(pH 7)로 세척하였다. 결합된 NGF는 1.5 M NaCl, 0.25 M TMAC, 0.2% 티오디글리콜(pH 7)로 용리시켰다. 대규모 칼럼은 아세테이트 농도의 조정으로 pH 5 내지 8에서 달리게 할 수 있다. 아세테이트 이온 대신에는 염소가 바람직하게 대용된다. NGF는 TMAC 구배 때문에 용리된다. TMAC는 이온 특성 및 소수적 특성을 모두 갖는 염으로, 어떤 수지의 주쇄 지지체는 NGF와 수지가 비특이적으로 결합하는 것을 촉진하는 소수성을 갖기 때문에 이 특성은 유용한 특성이다. 일반적으로 약 pH 6 내지 8의 용리완충액에는, 0 내지 3 M 농도의 TMAC가 유용하다. NGF를 포함하는 분획들은 합쳐졌다.

실리카겔 크로마토그래피

분획합을 실리카겔 크로마토그래피 칼럼에 직접 가하였다. 실리카는 단백질 결합 특성에 기여하는 이온성, 극성, 및 소수성 상호작용을 갖는 복합형 크로마토그래피 수지를 제공한다. 칼럼은 1M NaCl, 25 mM MOPSO(pH 7)에서 평형화시켰다. 칼럼을 1M NaCl, 25 mM MOPSO(pH 7(바람직하게는 약 pH 5.0 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 7))로 씻었다. 결합 NGF는 25 mM 호박산염(pH 3.9), 50 mM TEAC(테트라에틸암모니움 클로리드)로 용리시켰다. TEAC는 TMAC보다 더 강력한 용리제이다. 바람직한 pH 범위는 약 pH 3.5 내지 8이다. 그러나, 탈아미드화된 NGF종의 형성을 방지 또는 감소시키기 위해서는 장시간의 pH 7.5 이상은 피해야 한다. 일반적으로, 완충액의 pH가 낮을수록, 실리카 칼럼으로부터 NGF를 용리시키는데 필요한 TMAC 또는 TEAC 등의 복합 특성을 갖는 염의 농도는 낮아진다. pH 4 내지 5 근처에서 양호한 완충액 능력을 갖는 완충액이 이 사용에 적합하다. 용리 완충액내 염의 존재는 임의적이어서, 용리완충액의 응용 전에 염이 없는 MOPSO 완충액으로 칼럼을 세척할 수 있다.

페닐 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피

NGF를 포함하는 분획을 찾아서 합하였다. 분획합은 0.7 M 아세테이트, pH 7, 25 mM MOPSO로 조정하였다. 조정한 분획합을 구배완충액 A (0.7 M 아세테이트, 25 mM MOPSO, pH 7)로 평형화시킨 페닐 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 칼럼에 가하였다. 칼럼을 90% 구배완충액 A (0.7 M 아세테이트, 25 mM MOPSO, pH 7) 에서 10% 구배완충액 B (25 mM MOPSO, pH 7, 20% 프로필렌 글리콜) 사이의 구배로 세척하였다. 헥실렌 글리콜과 같은 다른 글리콜이 대신 사용될 수 있다. 일반적으로 세척은 약 2 내지 3 CV로 또는 안정적인 바탕선 OD가 이루어질때까지 하였다. 세척으로 약간의 숙주 세포 단백질이 제거되었다. 결합 NGF는 90% 구배완충액A와 10% 구배완충액B의 혼합에서 10% 구배완충액A와 90% 구배완충액B와의 혼합까지의 선형 10 CV 구배로 용리시켰다. NaCl 또는 황산 나트륨으로 HIC 완충액내 아세테이트를 대신할 수 있다. pH는 바람직하게는 약 pH 5 내지 8이고, 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 7.5이고, pH 6 내지 8이 허용가능하나, 가장 바람직하게는 약 7이다. 이 칼럼은 동형 2분자체로 존재하거나 또는 성숙 NGF 1분자체 및 전구체 서열의 일부가 여전히 존재하는 NGF 1분자체와의 이형 2분자체로 존재하는 어떤 잔류하는 전구체 서열, 부분 전구체 서열 또는 글리코실화된 형도 분리하였다. NGF의 전구체 및 글리코실화된 형은 용리피크의 선단에 존재하여서, NGF 함유 분획은 이들 종을 충분히 배제하도록 합하여졌다.

HIC 분획의 합은 분석적 HPLC시스템에서 분리 및 검출한 바와 같이, 약 72%의 120 1분자체, 17%의 118 1분자체, 2.8%의 117 1분자체, 3.6%의 R120 1분자체, 0.8% 이소아스프형, 1.3%의 산화된형, 및 1%의 탈아미드화된 형을 포함하였다.

SP-세파로스 HP 크로마토그래피

HIC 단계에서 NGF를 포함하는 분획들을 모았다. 대규모로는 적당한 시간에 칼럼 용리액을 바로 푸울탱크(홀딩 탱크)에 넣음으로써 이를 달성한다. 푸울의 pH를 pH 6으로 조정하여, SP-세파로스 HP 크로마토그래피 칼럼에 가하였다. 20 mM 호박산염, 0.2 M NaCl, pH 6(구배 완충액 A)로 칼럼을 세척하였다. 결합한 NGF는 70% 구배완충액 A와 30% 구배완충액 B의 혼합물에서 시작하여 20% 구배완충액 A와 80% 구배완충액 B (0.7 M NaCl/pH 6)와의 혼합물을 최종으로 하여 22 CV 구배에서 용리시켰다. pH는 바람직하게는 pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 pH 5.7 내지 6.5 이고 가장 바람직하게는 pH 6이다. 대표적인 크로마토그램을 도 1에 도시하였다.

SP-세파로스 HP 푸울은 통상적으로 약 95%의 120형, 3%의 R120형, 0.65%의 이소아스프형, 0.6%의 산화형, 0.6%의 탈아미드화형을 포함하였다. 다른 밝혀지지 않은 NGF형은 약 0.6%이고, 이는 탈아미드화된 Asn45가 존재하는 디-옥시다이즈된(di-oxidized) NGF(Met37 및 Met92)를 포함하였다. 대표적인 HIC 푸울(SP-세파로스 수지상에 적하된) 및 SP-세파로스 크로마토그래피 후 얻은 푸울을 비교하는 HPIEX 분석결과를 도 2에 도시하였다. NGF의 3가지 주된 잘려진 형인, 120, 118, 117 각각은 변형체를 가질 수 있으나, 정제 도중에 우세한 잘려진 형(이 실시예에서는 120)의 변형체(예를 들어 산화형 및 이소아스프형)는 덜 우세한 형(이 실시예에서는 118 및 117)으로부터의 변형체 분석을 방해할 수 있다. 대표적인 주행(representative run)으로부터의 분획에 대한 HPLC 분석을 도 3에 도시한다.

SP-세파로스 HP는 HIC 푸울에 존재하는 변형체를 효과적으로 제거하였다. R120형은 NGF의 N-말단에 아르기닌 잔기를 더 가진다. 일반적으로 rhNGF의 N-말단 아미노산 서열은 SSSHP이나, R120은 N-말단서열이 RSSSHP이다. 따라서 R120 형은 성숙 NGF 보다 더 염기성을 갖고, SP-SHP에 의해 분리된다. 또한 이는 생활성이 낮은데, 이는 아마 NGF N-말단이 수용체(trkA) 결합에 필요하다는 사실과 관계되는 것 같다. 산화된 NGF형은 37번째 위치 메티오닌이 산화된 것을 갖는 모노-옥시다이즈형이고, 이는 더 산성인 형태를 만들어서 NGF피크의 선단에서 용리된다. 이소아스프형은 93번 아미노산인 아스팔틱산의 변형을 포함한다. 이소아스프형은 약간 더 염기성이어서 SP-세파로스 HP 수지에 약간 더 강하게 결합한다. isoAsp93을 포함하는 NGF종은 용리피크의 말단에서 용리된다. 탈아미드화는 아스파라긴 자리, 일반적으로 45번째 위치의 아스파라긴 자리에서 일어난다. 탈아미드화된 Asn을 함유하는 NGF(45번째 위치에 Asp를 만듬)는 약간 더 산성이어서, 용리피크의 선단에서 나타난다.

NGF의 하전 변형체를 분리하는데 프락토겔 EMD SO3는 SP-세파로스 HP 수지 보다 덜 바람직한 대용 수지이다. 이 덜 바람직한 수지를 사용할 때는 NGF를 용리하기 위하여 고농도의 NaCl을 필요로 한다.

제제화

이전 실시예에서와 같이, 벌크 물질을 UF/DF에 의해 제제화완충액으로 제제화하였다. 최종 벌크 산물에는, 120형이 일반적으로 92 내지 97%이고, R120이 1 내지 4%이고, 이소아스프 형이 약 0.2 내지 1.5%이고, 산화형이 약 0.2 내지 2%이고, 탈아미드화형이 0.2 내지 2%이다. 117 및 118형은 일반적으로 약 2% 미만이었다. 최종 벌크 산물은 일상적으로 최소한 99.5% 순수 NGF(모든 종을 포함)이었다.

<실시예 3> 118/118의 단리

NGF 변형체가 충분히 제거된 충분히 순수한 118/118 NGF 조성물을 얻기 위한 한 바람직한 구현예에서는, 실시예 2의 방법을 하기 변형을 하여 수행하였다. 대규모 High S 칼럼 및 실리카 칼럼의 사이에 고정상 트립신 칼럼을 사용하였다. pH를 약 pH 5 내지 8.5, 가장 전형적으로는 필요하다면 6.5 내지 7.5로 조정한 후, 대규모 푸울을 고정상 트립신 칼럼상에 직접 적하하였다. 푸울은 칼럼을 통과하고, 통과 도중에 대부분의 NGF는 118형으로 변한다. 프로테아제의 소화가 C-말단의 VRRA를 VR로 절단하여 120형을 118형으로 변환시킨다. 제한적이고 선택적인 절단을 이루기 위하여는 트립신 또는 트리신-유사 프로테아제가 사용되고, 바람직하 게는 트립신, 더욱 바람직하게는 쉽게 얻을 수 있는 돼지 트립신 또는 대용적으로 소 트립신 또는 재조합 트립신이 사용된다. 충분히 제한적이고 선택적인 절단을 제공하는 어떤 단백질 가수분해적 방법이라도 사용될 수 있으나, NGF 제조의 오염을 최소화하기 위해서는 고정된 -트립신 칼럼이 바람직하다. 칼럼은 프로테아제 활성에 도움이 되는 pH에서, 바람직하게는 pH 5.5 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 가장 바람직하게는 6.5 내지 7.5에서 달리게 한다.

이 실시예에서, 글리코실화된 NGF는 여기서 논의된 바와 같이 HIC에 의해 제거되었다. 바람직하게는 22 칼럼 부피의 0.3 M 내지 0.55 M 염 구배를 사용하는 것 이외에는 실시예 2에서 설명한 바와 같은 SP-세파로스 HP 단계를 따르면, 임상적 용도를 위한 NGF의 바람직한 조성물이 얻어졌다. RP-HPLC검정에 의해 측정된 바와 같이, 70% 초과의 118 1분자체, 10% 미만의 120 1분자체 및 15% 미만의 117 1분자체의 조성물을 얻을 수 있었다. 전형적으로는 90% 이상의 118/118 rhNGF 인 조성물, 더 일반적으로 93% 이상의 118/118 rhNGF(약 7% 이하의 탈아미드화된 변형체, 이소아스프 변형체 및 산화된 변형체를 갖는)인 조성물이 얻어진다. 더 높은 순도를 얻고자 하면, 주된 뉴로트로핀 피크(예를 들어 118/118 rhNGF피크)의 선단 및 말단에서 발견되는 것과 같은 상당한 양의 변형체를 갖는 분획물을 선택하지 말아야 한다.

<실시예 4> 박테리아 봉입체로부터의 rhNT-4/5의 부분정제 및 재폴딩

이 실시예에서는 10 또는 60 리터의 발효물에서 시작하여 rhNT-4/5를 정제하였다. 비록 다른 종이나 유기체에서 생산된 NT-4/5 도 본문에기술된 정제방법에 적합하나, 발효로 재조합 인간 NT-4/5를 생산하는데 사용된 숙주로는 이 실시예에 서 기술된 27C7/pmNT5DT라고 불리는 대장균 종이다. 이 실시예에서 사용된 발현 플라스미드는 NT-4/5 유전자를 대장균에서 발현시키는 데 필요한 전사 및 번역 조절 서열 아래에 성숙 NT-4/5의 코딩 서열을 함유하였다. NT-4/5 발현 플라스미드에서, 유전자를 대장균 내에서 발현시키는 데 사용되는 전사 서열은 알칼린 포스파타제 프로모터 서열에 의해 제공된 것이다. 전사 종결에 관한 람다 서열을 NT-4/5 종결 코돈에 인접하여 위치시켰다. 세포질로부터의 단백질의 분비는 STII 신호 서열에 의해 지시받는다. 대부분의 rhNT-4/5는 세포막 주위의 공간에서 광굴절소체로서 발견되었다. 플라스미드는 형질전환된 숙주에게 테트라사이클린 저항성을 부여하였다. 발효과정은 35-39℃ 및 pH 7.0-7.8에서 수행하였다. 발효는 25-40 시간동안 지속되었다. 이후 배양액을 수거하기 전에 냉각시켰다. 60℃에서 연속-흐름 장치를 이용한 열처리에 의해, 또는 그 온도에서 약 5-15분 동안의 인-탱크(in-tank) 열 불활성화를 이용하여 배양액을 불활성화시켰다. 열-불활성화된 배양액은 AX Alpha-laval 원심분리기 또는 그와 동일시할 것을 이용하여 원심분리시켰다. 펠렛으로부터 대장균 세포를 회수하였다.

재조합 인간 NT-4/5를 봉입체내에 발현시키는 대장균 세포를, 표준적인 수단으로 파열시켜 봉입체내에 NT-4/5를 함유하는 페이스트를 만들었다. 완충액내에는 프로테아제 억제제가 포함되어 있지 않다.

세포 부스러기로부터 봉입체를 단리하기 위하여, 대장균 NT-5 페이스트를 0.02 M Tris(pH 8), 5 mM EDTA에서 기계적 회전 분산장치(예를 들어 Turrrax)를 이용하여 재현탁시켰다(페이스트 그람당 10 ml의 완충액). 이 세포현탁액을 6000 psi에서 마이크로플루이다이져(microfluidizer)를 세 번 통과시켰다. 이 균질물을 소발 RC-3B 원심분리기로 5000 rpm에서 약 45분 동안 원심분리시켰다. 상청액은 따라버리고, 펠릿은 20 mM Tris(pH 8), 5 mM EDTA(추출완충액)에 Turrax를 이용하여 중간 속도로 2 내지 3분 동안 재현탁시켰다. 균질물을 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 펠릿은 추출완충액에 재현탁시켜, 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 남은 펠릿(들)(NT-4/5 봉입체 또는 광굴절소체라고 칭한다)은 -70℃에서 저장하였다.

봉입체로부터 NT-4/5의 단리는 다음과 같다. 봉입체 펠릿을 20 mM Tris(pH 8) 6 M 우레아, 25 mM DTT(봉입체 그람당 10 ml 완충액)에 turrax를 이용하여 중간 속도로 약 10분 동안 현탁시켰다. 현탁액을 2-8℃에서 40분동안 저어주고, 소발 RC3B로 5000rpm에서 약 45분 동안 원심분리하였다. 상청액에 PEI(폴리-에틸렌-이민)을 0.1%되게 첨가하고, 이것을 2-8℃에서 30분 동안 저어주었다. PEI는 핵산 또는 산성으로 하전된 다른 분자를 침전시킨다. 이 혼합물을 소발 RC3B로 5000rpm에서 약 45분 동안 원심분리하였다. PEI 상청액을 0.02 M Tris, 6 M 우레아, 10 mM DTT(pH 8)로 평형화시킨 DEFF 세파로스 패스트 플로우 칼럼(10 cm ×14 cm; DEFF는 디에틸 아미노에틸 수지)상에 적하하였다. 용해된 광굴절소체 1 kg 상당양을 DEFF 칼럼에 적하하였다. 환원되거나 변성된 NT-4/5는 DEFF 수지에 결합하지 않기 때문에, NT-4/5 및 6 M 우레아를 함유하는 그냥 통과한 푸울을 모으고(도6) 이 푸울의 pH를 초산으로 5.0으로 낮추었다. pH가 조정된 DEFF 통과 푸울을 6 M 우레아를 포함하는 20 mM 아세테이트(pH 5)로 평형화시킨 S-세파로스 패스트 플로우 칼럼(S는 수지상의 SO3 관능기를 말한다)상에 적하하였다. 이 조건하에서는 NT-4/5가 수지에 결합한다. 적하후, S-세파로스 패스트 플로우 칼럼을 몇 칼럼 부피의 평형 완충액으로 세척하였다. 결합한 NT-4/5는 0.5 M NaCl, 20 mM 초산 나트륨, 6 M 우레아(pH 5)(제7도)으로 용리시켰다. 0.5 M NaCl SSFF 푸울은 NT-4/5가 비록 부정확하기는 하나 재폴딩할 수 있는 20 mM Tris, 0.14 M NaCl(pH 8) 조건에서 밤새도록 투석하였다. 잘못 폴딩된 rhNT-4/5분자는 응집하여 침전물을 만든다.

정폴딩된 rhNT-4/5를 얻기 위해 응집된 잘못 폴딩 rhNT-4/5는 프로세싱된다. 응집된 잘못 폴딩된 rhNT-4/5는 원심분리에 의해 펠릿으로 수거되었다. 이 펠릿은 0.2 M Tris(pH 8), 4 M 우레아, 5 mM DTT에서 재현탁하고, 2-8℃에서 약 1-2 시간 동안 또는 펠릿이 모두 녹을 때까지 저었다. 최종 단백질 농도는 280 nm에서 흡광계수 1.8 기준으로 약 10 mg/ml 단백질로 조정시켰다. 용해시킨 펠릿 용액에 산화된 글루타티온을 최종 농도 20 mM이 되게 첨가하고, 2-8℃에서 15-30분 동안 살며시 저어 주었다. 산화된 글루타티온은 NT-4/5 설프히드릴기와 반응하여 NT-4/5-S-글루타티온 혼합 디설피드를 만든다. NT-4/5-SG 혼합 디설피드를 100 mM Tris, 20 mM 글리신, 15% PEG-300, 1 M 구아니딘HCl(pH 8.3)으로 최종 농도가 0.1 - 0.5 mg/ml 단백질이 되도록 희석하였다. NT-4/5의 정확한 재폴딩을 시작하기 위하여, 재폴딩 혼합물에 시스테인을 2-4 mM의 농도로 첨가하고, 산소를 배제시키기 위해 용기를 봉하기 전에 5-60 분동안 그 용액에 질소 또는 헬륨을 폭기(aeration)에 의해 주입한다(버블링에 의해). NT-4/5의 재폴딩은 2-8℃에서 18-24 시간동안 지속되었다.

대안적으로, rhNT-4/5는 다음과 같은 설피톨리시스(sulfitolysis)에 의해 재폴딩되었다. 봉입체 펠릿(110g)을 20 mM Tris, 7 M 우레아, 10 mM 글리신, 100 mM 아황산 나트륨, 10 mM 소디움 테트라티오네이트 1.1 리터에 재현탁시키고, turrax를 이용하여 중간 속도로 10분 동안 용해시켰다. 그 다음 그 혼합물(1260 ml)을 2-8℃에서 45분 동안 저었다. PEI를 최종농도 0.1% PEI가 되도록 첨가하였다. 그 혼합물을 4℃에서 30분 동안 더 저어 준 후, RC3B원심분리기로 5500rpm에서 45분 동안 원심분리하였다. 상청액을 20 mM Tris, 6 M 우레아, pH 8로 평형화시킨 DEFF칼럼(4.4 cm × 25 cm)상에 실었다. DEFF에서 흘러나온 것을 초산으로 pH 5로 조정하여, 20 mM 아세테이트, 6 M 우레아, pH 5로 평형화시킨 세파로스 고속흐름 칼럼(4.4 cm × 25 cm)에 실었다. NT-4/5는 25 mM MOPSO, 0.5 M NaCl, pH 7로 용리시켰다.

술포닐화된 rhNT-4/5를 포함하는 SSFF 0.5 M 염화 나트륨 푸울을 약 0.1 mg/ml 단백질로 희석하고, 1 M 구아니딘 히드로클로리드, 100 mM Tris, 20 mM 글리신, 15% PEG-300, pH 8.3으로 조정하였다. NT-4/5의 재폴딩은 2-4 mM 시스테인의 첨가로 시작된다. 재폴딩 반응은 본질적으로 24시간 이내에 완료된다. 불활성 기체(헬륨 또는 질소)를 폭기하여 용액중 산소를 대체하는 방법이 임의적으로 수행될 수 있다.

<실시예 5> 구조적(잘못 폴딩된) 변형체로부터의 정폴딩된 rhNT-4/5의 단리

실시예 4의 rhNT-4/5의 재폴딩 혼합물을 pH 4 내지 5 용액에 대하여 밤새도록 투석하여 구아니딘 및 다른 반응물을 제거하였다. 용액을 맑게하기 위하여, 용 액을 5000 rpm에서 45분 동안 원심분리하거나, 또는 0.2 um 필터를 통과시켰다.

0.5 내지 5 그람의 단백질을 포함하는 맑아진 상청액에 빙초산을 첨가하여 pH를 3 내지 5로 조정하여, C4 RP-HPLC칼럼상에 적하하거나 또는 -20℃에서 정제가 준비될 때까지 얼려 보관한다. 이 실시예에서는 산성화되고 맑아진 용액을 C4 RP-HPLC(3 cm × 50 cm)칼럼상에 적하하였는데, 이 수지에는 폴딩된 rhNT-4/5가 결합하였다. 정폴딩된 NT-4/5는 0.05 트리플루오로아세트산(TFA) 용매 시스템에서 아세토니트릴 구배를 이용하여 용리되었다(95분에 걸친 0.05% TFA중 26 내지 40%의 아세토니트릴 구배, 25 ml/min의 흐름속도). 1 내지 1.5 분 간격으로 분획을 모았다(제8도). 분석적 C4 HPLC Vydac(0.21 × 15 cm)칼럼상의 용리 시간을 정폴딩된 NT-4/5 표준의 것과 비교하여 각 분획들을 정폴딩된 NT-4/5에 대하여 분석하였다 (제9도). 표준 정폴딩된 본래의 NT-4/5는 0.5% TFA/아세토니트릴 완충액 시스템을 가지고 분당 2.5 ml의 유속에서 19분에 일반적으로 용리된다. 정폴딩된 rhNT-4/5를 함유하는 분획들을 합하여 pH를 5 내지 7로 조정하였다. 이 정폴딩된 rhNT-4/5의 합은 카바밀화된 NT-4/5 및 N-말단이 잘려진 형의 NT-4/5를 또한 포함하였다.

예비적 역상 액체 크로마토그래피 수지는 바람직하게는 약 10 내지 40 마이크론의 입도를 갖고, 약 200 내지 400 앙스트롬의 공극 크기 및 C4, C8, 또는 C18 알킬기를 갖는 매질이다.

더욱 바람직하게는, 수지가 약 15-40 마이크론의 입도를 갖고, 약 300 앙스트롬의 공극 크기를 가지며, C4 실리카 매질이다.

<실시예 6> 구조적(잘못 폴딩된) 변형체로부터의 정폴딩된 rhNT-4/5의 다른 단리 방법

10 kD 분자량를 제거하는 20 제곱 푸트(square foot) 셀룰로스(또는 폴리술폰 또는 등가물) 멤브레인(membrane)으로 밀리포어-펠리콘(Millipore-Pellicon) 울트라여과 시스템을 이용하여 실시예 4의 재폴딩된 rhNT-4/5 혼합물을 약 10배 농축시켰다. 농축된 혼합물은 0.2 마이크론 막으로 여과하기 이전에, 50 mM 아세테이트(pH 5.5), 50 mM NaCl 50 리터에 대하여 밤새도록 투석하거나 50 mM 아세테이트(pH 5.5), 50 mM NaCl안으로 투석여과(diafilter)한다.

여과된 재폴딩 혼합물은 2.5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7로 조정하여, 2.5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7로 미리 평형화시킨 HIC칼럼, 페닐 토요펄 650M 칼럼(10 cm × 19 cm)에 실었다. 칼럼을 평형화 완충액으로 세척하였다. 약간의 rhNT-4/5의 잘못 폴딩된 형은 그냥 흘러나온 분획(flow-through fraction)에서 나타나고, 반면에 다른 잘못 폴딩된 형은 20 내지 40%의 반응성 알코올과 같은 고농도의 유기 용매에서 용리되었다. 정폴딩된 rhNT-4/5은 2 M 염화나트륨, 10% 반응성 알코올, pH 7을 이용하여 페닐 칼럼으로부터 용리시켰다(제10도). 페닐 세파로스와 같은 다른 페닐 수지가 토요펄 주쇄 대신에 사용될 수 있다. 여기서 논의된 염, 황산암모늄염, 구연산염, 아세트산염 및 염화칼륨염 등이 사용될 수 있다. 사용된 염에 따라, 염의 농도는 일반적으로 1 M 내지 3 M이고, 적하에는 2.5 M NaCl이 바람직하고, 2 M NaCl이 유기 용매가 존재할 때 용리용으로 바람직하다. 바람직하게는, 뉴로트로핀 및 그 변형체를 용리 및 분리하기 위하여 염의 농도를 낮추어가며 사용한다. 용리를 이루기 위해서는, 용리 완충액내 염의 농도가 적하완충액에서보다 일반적으로 낮으나, 유기 용매로 보상이 될 때는 같은 농도일 수 있다. 또한, 여기서 발견된 바와 같이, 유기 용매를 사용하는 또다른 장점은, 유기 용매의 첨가가 용리패턴을 향상시켜 더 좁은 피크 모습을 보인다는 것이다. 에탄올 이외에 여기서 논의된 다른 유기 용매, 프로판올, 이소프로판올, 및 저급 알킬렌 글리콜(프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 및 헥실렌 글리콜 등) 등이 사용될 수 있다. 5 내지 25%(v/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 20%(v/v), 더더욱 바람직하게는 5 내지 15%(v/v)에서의 유기용매가 일반적으로 정폴딩된 뉴로트로핀을 용리시킬 것이다. 유기 용매로의 용리는 구배적이거나 또는 단계적일 수 있다. pH범위는 바람직하게는 거의 중성에서 약간 산성, pH 5-8, 더욱 바람직하게는 pH 5.5-7.5, 및 가장 바람직하게는 pH 7이다. MOPSO, MOPS, HEPES, 인산염, 구연산염, 암모늄염, 초산염 을 포함하는 여기서 논의된 어떤 완충액이라도 바람직한 pH라면 사용될 수 있다.

<실시예 7> 화학적 변형체로부터 정폴딩된 rhNT-4/5의 순수정제

카바밀화된 형 및 N-말단이 잘려진 형 같은 rhNT-4/5의 화학적 변형체로부터 정폴딩된 완전한 rhNT-4/5의 분리는 SP-세파로스 HP 수지 또는 PolyCat a HPLC 수지를 이용한 고성능 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 이루어졌다.

잘못 폴딩된 변형체를 제거하는데 C4 RP-HPLC칼럼을 사용한 경우에는, C4 HPLC 푸울을 pH 5 내지 7로 조정하여, 20 mM 호박산염, pH 6, 5% 반응성 알코올, 0.2 M NaCl로 평형화시킨 SP-세파로스 HP 칼럼(7 cm × 19 cm)에 적하하였다. NT-4/5가 결합된 수지를 평형화 완충액으로 세척하였다. 결합된 rhNT-4/5는 0.2 M NaCl에서 0.4 M NaCl(pH 6)까지의 22 칼럼 부피(CV) 구배(즉, 평형화 완충액내 염 구배)를 이용하여 용리시켜 카바밀화된 형 및 N-말단이 잘려진 형으로부터 분리시켰다(제11도). NT-4/5를 함유하는 분획은 모아서 0.05 M 아세테이트, pH 4 내지 5로 제제화하였다. 완전한 rhNT-4/5는 여기서 논의된 바와 같이 바람직하게는 분석적 RP-HPLC 또는 SDS-PAGE에 의해 표준과 비교하여 증명하고 분획들중의 변형체로부터 구별하였다.

대안적으로는, NT-4/5의 변형체를 폴리아스파르트산 칼럼(PolyCAT a, PolyLC, 콜롬비아사)(9.4 × 200 mm)상의 고성능 양이온 교환 HPLC에 의해 제거하였다(제12도). C4 HPLC 푸울을 pH 5-6으로 조정하여 Polycat a 칼럼에 적하하였다. 크로마토그래피 조건은 완충액A가 20 mM 인산염, 5% 아세토니트릴, ph 6이고,완충액B가 20 mM 인산염, 5% 아세토니트릴, 0.8 M KCl, pH 6이다. rhNT-4/5는 65분에 걸친 25 내지 60% 완충액B의 구배를 이용하여 용리하였다(제12도). 1분 단위로 분획을 모아서 상기한 바와 같이 분석적 C4 HPLC에 의해 분석하였다.

잘못 폴딩된 변형체를 제거하기 위해 HIC가 사용된 경우(상기 실시예6)에는, 정폴딩된 NT-4/5 푸울을 20 mM 호박산염, 0.1 M NaCl, 5% 반응성 알코올, pH 6으로 밤새 투석시키거나, 20 mM 호박산염 완충액내로 울트라여과/디아여과(UF/DF)시킨다. 그 다음, 투석된 또는 UF/DF 푸울을 상기한 바와 같이 SP-세파로스 HP 또는 PolyCAT a 칼럼에 적하하였다.

제제화

정폴딩된 완전한 NT-4/5를 함유하는 분획(SP-세파로스 HP 또는 PolyCAT a HPLC 단계로부터의)을 모아서, 20 mM 아세테이트, pH 4-5의 제제화 완충액에서 1-5 mg/ml로 농축시켰다. 대체적인 방법으로는, UF/DF를 이용하여 NT-4/5를 제제화하였다.

최종의 벌크 용액을 아미노산 분석, N-말단 서열 분석, 질량분석법, SDS-PAGE(제13도)로 분석하였고, 세포막에 존재하는 그의 티로신 키나제 수용체(trkB)의 자기인산화에 대한 NT-4/5의 활성을 검출하는 키나제 수용체 활성화(KIRA) 검정의 생물학적 검정을 이용하여 정제된 rhNT-4/5의 특징을 밝혔다. gD 꼬리표를 가진 trkB를 발현시키는 CHO 세포를 사용하였다. 1995.6.1일자로 국제공개된 WO 95/14930에서는 KIRA 검정에 대해 기술하고 있는데, 이것을 참고로 본문에삽입한다. 이 검정에서 rhNT-4/5는 12.6 ng/ml의 EC50을 가졌다. 일반적으로, 본문에기술된 바와 같이 정제된 정폴딩된 완전한 NT-4/5의 EC50은 5 내지 30, 더욱 바람직하게는 10 내지 20이다.

NT-4/5가 아닌 단백질에 대한 rhNT-4/5의 순도는 일반적으로 90 내지 99%이었다. 카바밀화된 변형체 및 N-말단이 잘려진 변형체에 대한 NT-4/5의 균질성도 90 내지 99%이었다. 가장 일반적으로 그리고, 바람직하게는 순도 및 균질성이 99% 이상이다.

<실시예 8> 박테리아 봉입체로부터 rhNT-3의 초기 정제, 재폴딩 및 최종 정제

세포 부스러기로부터 봉입체를 분리하기 위하여, 대장균 NT-3 페이스트(1kg)를 100 mM 소디움 아세테이트(pH 5) 10 리터에 기계적 회전 분산장치(예를 들어 turrax)를 이용하여 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 6000 psi에서 마이크로플루이다이져를 세 번 통과시켰다. 결과적인 균질물을 소발 RC-3B 원심분리기로 5000 rpm 에서 30분 동안 원심분리하였다.

봉입체로부터 NT-3의 단리는 다음과 같다. 봉입체 펠릿을 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM 아황산 나트륨, 10 mM 소디움 테트라티오네이트, 7.5 M 우레아, pH 8.3(봉입체 그람당 10 ml)에서 turrax를 이용하여 중간 속도로 약 10분동안 현탁시켰다. 현탁액을 2-8℃에서 약 1 시간동안 저었다. PEI(폴리에틸렌이민)을 약 0.15%(최종 농도)로 첨가하고, 2-8℃에서 30분 동안 저었다. 혼합물을 소발 RC-3B 원심분리기로 5000 rpm에서 약 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 겔만 프리플로우 카트리지(Gelman Preflow cartridge)로 여과시켰다. 여과된 상청액은 S-세파로스 패스트 플로우 평형화 완충액(50 mM 소디움 아세테이트, 5 M 우레아, pH 5) 3배 부피로 희석하였다. 희석 여과된 상청액(7 mS 미만의 전도도)을 50 mM 소디움 아세테이트, 5 M 우레아, pH 5 로 평형화시킨 S-세파로스 FF 칼럼상에 적하한다. 칼럼을 먼저 50 mM 소디움 아세테이트, 5 M 우레아, pH 5로 세척하고, 그 다음 50 mM MOPS, 5 M 우레아, 10 mM 글리신, pH 7.0으로 세척하였다. 50 mM MOPS, 5 M 우레아, 10 mM 글리신, pH 7.0 중의 0 내지 0.6 M NaCl 구배 10 칼럼 부피를 이용하여 설피톨화된(Sulfitolyzed) NT-3를 용리시켰다.

S-세파로스 FF 푸울을 0.1 M Tris, 2 M 우레아, 0.1 M NaCl, 15% PEG 300, 10 mM 글리신, 25 mM 에탄올아민, pH 9.1을 함유하는 재폴딩완충액에서 약 0.1 mg/ml 단백질로 희석시켜서, 부분 정제된 NT-3를 재폴딩시켰다. 재폴딩은 시스테인 약 5 mM의 첨가로 개시시켜 2-8℃에서 약 2-5일 동안 저어 준다. 임의적으로, 재폴딩 용액내 산소 농도를 낮추기 위해 재폴딩 완충액에 헬륨이나 아르곤을 살포 할 수도 있다.

재폴딩된 푸울의 pH는 pH 7로 조정하여, 여과하고, 50 mM HEPES, pH 7로 평형화시킨 대규모 High S 양이온-교환 크로마토그래피 칼럼상에 적하하였다. pH조정된 재폴딩 푸울을 대용량 칼럼에 적하한 후, 칼럼을 먼저 50 mM MOPS, pH 7로 세척하고, 다음에 50 mM MOPS, 0.1 M TMAC, 0.3 M NaCl, pH 7로 세척하였다. NT-3는 50 mM MOPS, 0.25 M TMAC, 1.5 M NaCl, pH 7로 용리시켰다.

그 다음 대규모 푸울을 페닐 세파로스 패스트 플로우 고 치환 칼럼상에서 더 정제하였다. 페닐 칼럼은 50 mM HEPES, 1.5 M NaCl, pH 7 에서 평형화시키고, 대규모의 푸울을 페닐 칼럼상에 직접 적하하였다. 칼럼을 평형화 완충액으로 세척하고, 정폴딩된 NT-3를 50 mM HEPES, 1.5 M NaCl, pH 7 에서 50 mM HEPES, 10% 반응성 알코올 pH 7 까지의 15 칼럼 부피 구배를 이용하여 용리시켰다. 분획들은 C4 HPLC 또는 SDS-PAGE로 분석하고, 정폴딩된 NT-3를 포함하는 분획들은 합쳤다.

페닐 푸울을 25 mS(일반적으로 물로 약 2 부피) 미만으로 희석하여, 25 mM MOPSO, pH 7로 미리 평형화시킨 SP-세파로스 HP칼럼상에 적하하였다. 칼럼은 먼저 평형화완충액으로 세척하고, 25 mM MOPSO(pH 7) 중의 0.35 M TMAC 에서 0.65 M TMAC 까지의 20 칼럼 부피 구배를 이용하여 NT-3를 칼럼으로부터 용리시켰다. rhNT-3를 함유하는 분획(C4 HPLC 검정에 의해 판단되듯이)들을 합쳤다.

SP-세파로스 HP 푸울은 10,000 분자량 멤브레인 상에서 약 1 mg/ml로 농축시키고, 그 다음 6배 부피의 10 mM 아세테이트, 140 mM NaCl, pH 5.0 로 투석여과하였다.

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Claims (31)

1. 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 이용하여 혼합물 내의 다른 단백질 및 재조합 인간 뉴로트로핀 변형체로부터 재조합 인간 뉴로트로핀을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리 단계는 혼합물을 페닐 관능기를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지 상에 적하하는 단계와 재조합 인간 뉴로트로핀이 변형체로부터 분리되는 조건 하에서 유기 용매를 포함하는 용리 완충액으로 재조합 인간 뉴로트로핀을 수지로부터 용리시키는 단계를 포함하며, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지 상에 적하되는 혼합물의 pH는 5-8인, 다른 단백질 및 재조합 인간 뉴로트로핀의 변형체(재조합 인간 뉴로트로핀의 잘못 폴딩된 변형체, 단백질분해적으로 부정확하게 프로세싱된 변형체, 또는 글리코실화 변형체를 포함할 수 있음)를 함유하는 혼합물로부터, NGF, NT-4/5 또는 NT-3인 재조합 인간 뉴로트로핀 또는 이의 유전공학적으로 조작된 형태를 단리하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 수지상에 적하되는 혼합물의 염농도가 0.5 M 내지 3 M인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 수지상에 적하되는 혼합물의 염농도가 0.5 M 내지 2.5 M인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 수지상에 적하되는 혼합물의 염농도가 0.7 M 아세테이트 또는 1.0 M 내지 2.5 M NaCl인 방법.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 유기 용매는 5 내지 20 부피%인 방법.
9. 제1항에 있어서, 용리 완충액 pH가 pH 5-8인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 용리가 염구배를 감소시키는 것을 포함하는 방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, 상기 뉴로트로핀이 박테리아 배양물로부터 제조되고, 소수성 상호작용 수지를 이용하기 전에 시험관내에서 재폴딩된 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 뉴로트로핀이 포유동물 세포주 배양물로부터 단리된 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 수지를 이용하여 상기 뉴로트로핀을 그의 화학적 변형체로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 분리 단계가, 뉴로트로핀 및 그의 화학적 변형체를 포함하는 혼합물을 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 수지상에 적하하는 단계와, 그 뉴로트로핀이 화학적 변형체로부터 분리되는 조건하에서 뉴로트로핀을 수지에서 용리시키는 단계를 포함하고, 상기 뉴로트로핀은 높은 pI를 갖는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 고성능 양이온-교환 수지가 SP-세파로스 HP 수지, 폴리 아스파르트산 수지, 폴리술포에틸 양이온-교환 수지 또는 프락토겔 EMD SO3 수지인 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 고성능 양이온 교환 수지로부터의 뉴로트로핀 함유 용리액을 탈염시키거나 또는 투석여과(diafiltering)하고, 담체와 함께 제제화하는 방법.
19. 제1항에 있어서, 실리카 겔 수지를 이용하여 뉴로트로핀을 다른 단백질로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 실리카 겔 수지를 이용하여 pH 3.5 내지 8.0에서 테트라메틸 암모늄 클로라이드 또는 테트라에틸 암모늄 클로라이드를 주성분으로 하는 용리 완충액으로 재조합 인간 뉴로트로핀을 용리함으로써 다른 단백질로부터 재조합 인간 뉴로트로핀 분리하는 것을 더 포함하는, 다른 단백질 및 재조합 인간 뉴로트로핀 변형체를 함유하는 혼합물로부터 재조합 인간 뉴로트로핀, 또는 이의 유전공학적으로 조작된 형태를 단리하는 방법.
21. 제1항에 있어서, 고성능 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 뉴로트로핀을 그의 화학적 변형체로부터 분리하는 것을 더 포함하는, 다른 단백질 및 재조합 인간 뉴로트로핀 변형체를 함유하는 혼합물로부터 재조합 인간 뉴로트로핀, 또는 이의 유전공학적으로 조작된 형태를 단리하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 뉴로트로핀 및 그 변형체가 분리 이전에 본질적으로 순수한 것인 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 수지가 SP-세파로스 HP 수지, 폴리 아스파르트산 수지, 폴리술포에틸 양이온 교환 수지 또는 프락토겔 EMD SO3 수지인 방법.
24. 제21항에 있어서, 예비적 역상 액체 크로마토그래피 수지를 이용하여 뉴로트로핀을 그 뉴로트로핀의 잘못 폴딩된 변형체로부터 분리하는 단계를 임의적으로 더 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 수지가 C4 관능기를 함유하는 방법.
26. 알쯔하이머병, 당뇨병성 신경병증, AIDS 관련 신경병증 및 말초 신경병증의 치료에 적합한, 제1항의 방법에 의해 제조된 뉴로트로핀 및 담체를 포함하는 조성물.
27. 본질적으로 뉴로트로핀의 변형체(뉴로트로핀의 잘못 폴딩된 변형체, 단백질분해적으로 부정확하게 프로세싱된 변형체, 또는 글리코실화 변형체를 포함할 수 있음)가 제거되어 본질적으로 순수하고 균질인, NGF, NT-4/5 또는 NT-3인 뉴로트로핀 및 담체를 포함하는, 알쯔하이머병, 당뇨병성 신경병증, AIDS 관련 신경병증 및 말초 신경병증의 치료에 적합한 조성물.
28. 제27항에 있어서, 멸균된 조성물.
29. (a) 뉴로트로핀 및 그의 변형체(뉴로트로핀의 잘못 폴딩된 변형체, 단백질분해적으로 부정확하게 프로세싱된 변형체, 또는 글리코실화 변형체를 포함할 수 있음)를 함유하는 혼합물을 pH 5-8의 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지상에 적하하는 단계,

    (b) 상기 수지를 pH 5-8의 완충액으로 세척하는 단계,

    (c) 알코올성 용매 또는 극성 비양성자성 용매를 5 내지 25%(v/v)의 농도로 함유하는 pH 5-8의 완충액으로 뉴로트로핀을 용리시키는 단계,

    (d) 뉴로트로핀-함유 용리액을 pH 5-6의 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 수지상에 적하하는 단계, 및

    (e) 양이온을 0.2-0.5 M의 농도로 함유하는 pH 5-6의 완충액으로 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 뉴로트로핀을 용리시키는 단계

    를 포함하는, NGF, NT-4/5 또는 NT-3인 뉴로트로핀의 정제방법.
30. 삭제
31. 삭제

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