CN104195160A

CN104195160A - 一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法

Info

Publication number: CN104195160A
Application number: CN201410387234.6A
Authority: CN
Inventors: 张文宇; 阮卡; 章永垒; 陈星�; 黄奋飞; 白羊; 陈胜亮
Original assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Current assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明公开了一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法。人工合成pro-hBDNF序列后克隆入载体得到含有pro-hBDNF的重组载体；再转化到大肠杆菌中，得到工程菌；包涵体表达；包涵体的复性：包涵体裂解、洗涤、溶解、复性；的分离纯化；质量比pro-rhBDNF：胰蛋白酶=250:1的胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽；rhBDNF成熟肽的纯化；最后获得纯度超过95%的重组人脑源性神经营养因子。利用胰蛋白酶酶切pro-rhBDNF，在该比例下可以完全消化pro-rhBDNF的导肽，而不会消化rhBDNF成熟肽。同时该方法制备简单易行，便于实施。

Description

一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法。

背景技术

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。一种小分子二聚体蛋白质BDNF结构、分布及信号转导BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9.99,主要由β折叠和无规则卷曲二级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质。BDNF分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。BDNF不仅有可以和Trk家族这样有着强亲和力的受体(TrkA、TrkB、TrkC)结合还可以和分子量为75 kD的肿瘤坏死因子家族中的成员一神经营养素受体(P75 neurotrophin receptor)作用，发挥相应的生物学效应。目前脑源性神经营养因子对运动神经元病，周围神经病，基底神经节病，缺血性脑损伤，癫痫等疾病均有治疗效果。

基于脑源性神经营养因子在临床上的广阔应用前景，而现今的BDNF产品存在潜在的瑕疵：第一，BDNF由猪脑组织中提取的蛋白质，具有潜在的免疫原性。第二，随着需求的扩大，需要大量的合格的猪脑组织，成为大规模生产的瓶颈。因此，对重组人脑源性神经营养因子的开发迫在眉睫。近年来，已成功在不同表达系统中重组表达β-hBDNF的报道，包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞等表达系统，但仍未有研究成果应用于产业化。究其原因，其中大部分表达策略是直接将编码119aa的成熟肽基因直接进行重组表达，而没有考虑到成熟肽形成过程中，N端上游的导肽在成熟肽的表达过程中具有促进其正确折叠的作用，从而影响其产业化的进程。

通常所说的β-hBDNF是119个氨基酸成熟肽。在人体内，从编码基因到成熟肽经历下列过程：①prepro-hBDNF编码序列（744bp）翻译成prepro-hBDNF（247aa），prepro-hBDNF包括信号肽（prepeptide, aa: 1-18）、导肽（propeptide, aa: 19-131）、成熟肽（peptide, aa: 132-247）；②prepro-hBDNF在内质网上被信号肽酶水解形成pro-hBDNF，pro-hBDNF包括导肽和成熟肽。导肽末端带有4个氨基酸残基（aa: 128-131）Arg-Val-Arg-Arg，该4个氨基酸序列为哺乳动物前体蛋白加工酶（proprotein convatases）的识别位点，导肽可被高尔基体中的前体蛋白加工酶-弗林蛋白酶（furin）识别并切除，形成hBDNF(119aa)。

因此，本领域中迫切需要开发利用剔除信号肽后的pro-hBDNF（导肽+成熟肽）进行原核表达制备重组人脑源性神经营养因子的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种剔除信号肽后的pro-hBDNF（导肽+成熟肽）进行原核表达制备重组人脑源性神经营养因子的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括如下步骤，

表达载体及工程菌的构建：人工合成pro-hBDNF序列，将其序列克隆入载体得到含有pro-hBDNF的重组载体；再将其转化到大肠杆菌中，得到工程菌；

pro-rhBDNF的包涵体表达；

pro-rhBDNF包涵体的复性：pro-rhBDNF包涵体裂解、洗涤、溶解、复性；

pro-rhBDNF的分离纯化；

rhBDNF成熟肽的分离纯化：胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽；rhBDNF成熟肽的纯化。

所述表达载体及工程菌的构建为，人工合成SEQ ID NO:1序列，并且在序列上下游分别引入 Nde I酶切位点和 Bam HI酶切位点；利用限制性内切酶NdeI和BamHI对含目的片段的质粒和pET11a空载体分别进行双酶切；然后将酶切产物分别用乙醇沉淀纯化；用T₄ DNA Ligase将纯化后的酶切产物和原核表达载体进行连接反应；将构建好的融合表达载体pET11a-pro-hBDNF转化到E.coli TOP10中，经菌液PCR鉴定和测序鉴定后，鉴定正确的pET-11a-pro-hBDNF的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3)或Rosetta (DE3)pLysS表达菌株中即得到工程菌。

所述pro-rhBDNF的包涵体表达为，按1:50的比例将工程菌转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀≈1.0-1.2，加入IPTG至终浓度为 1mM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000 rpm，4 °C离心20 min收集菌体。

所述pro-rhBDNF包涵体的复性为，按5 ml buffer/g菌体的比例添加Lysis buffer，重悬菌体；添加10 μg/mL DNase，3 mM MgCl₂；在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理1 s，停止2 s，共处理10 min；加入1/2 体积的Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用Lysis buffer重悬沉淀，添加1/2体积 Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用IB wash buffer重悬沉淀，12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；重复洗涤包涵体3-4次；再按 5 mL/g 包涵体的比例添加溶解buffer（6M盐酸胍，100 mM DTT），室温溶解包涵体，待沉淀全部溶后，12000 rpm，4°C离心10 min，取上清；使用6 M盐酸胍溶液透析包涵体溶液，可室温透析3 h后更换透析缓冲液，于4 °C透析过夜；再缓慢添加至复性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μL；使盐酸胍终浓度降至200 mM，于4 °C中过夜；所述Lysis buffer为0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.0；Triton buffer为6% Triton X-100，1.5M NaCl，60mM EDTA；IB wash buffer为0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0；溶解buffer为6M盐酸胍，100 mM DTT；复性液为0.1M Tris-HCl, 1M L-精氨酸, 5mM EDTA, 0.61g/L 氧化型谷光氨肽, 1.53 g/L 还原型谷光氨肽。

所述pro-rhBDNF的分离纯化为采用阳离子交换层析和疏水作用层析。

所述rhBDNF成熟肽的分离纯化中，胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽为按250 mg hpro-BDNF添加1 mg Trypsin的比例，添加Trypsin后，4 °C处理14-16 h， 50 rpm缓慢搅拌。

所述rhBDNF成熟肽的分离纯化中，rhBDNF成熟肽的纯化为使用?KTA Purifer 100层析系统来进行rhBDNF成熟肽进行再次纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow 5 mL

本发明的目的在于提供一种重组制备pro-hBDNF的编码基因，其中含有信号肽、导肽和hBDNF成熟肽序列。其序列如SEQ ID NO:1所示。

含有信号肽、导肽和hBDNF成熟肽序列，其序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1

1 ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCC

61 ATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCAT

121 GGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCT

181 GACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAAT

241 GAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTG

301 CCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGACGCTGCA

361 AACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTG

421 TGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCG

481 GGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATAC

541 TTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGAC

601 AAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATG

661 GATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACA

721 TTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG。

本发明的目的之二在于提供了一种利用原核大肠杆菌表达系统制备重组人脑源性神经营养因子的方法。

本发明的目的之三在于提供了一种纯化rhBDNF的策略，其策略包括第一步阳离子层析纯化pro-rhBDNF、第二步疏水层析纯化pro-rhBDNF、第三步阳离子纯化hBDNF。

本发明的目的之四在于提供一种利用廉价的胰蛋白酶按照一定的酶底物比例（1:250）酶切pro-rhBDNF制备rhBDNF的方法。

本发明所述的制备包括基因修饰、三次纯化包括两次离子交换层析和一次疏水层析、活性检测。

本发明利用大肠杆菌密码子偏好性修饰后的pro-rhBDNF(包括导肽)的编码基因，连接pET11a载体，在大肠杆菌表达菌株Rosetta (DE3)中进行包涵体形式表达。通过多次的洗涤，初步获得pro-rhBDNF。在导肽的作用下，体外对rhBDNF成熟肽进行复性。利用阳离子交换层析对复性获得的pro-rhBDNF进行第一次纯化。接着再利用疏水层析对pro-rhBDNF进行第二次纯化，进一步提高浓度。按照一定的比例（质量比pro-rhBDNF：胰蛋白酶=250:1），利用胰蛋白酶酶切pro-rhBDNF在该比例下可以完全消化pro-rhBDNF的导肽，而不会消化rhBDNF成熟肽。最后再通过阳离子层析纯化获得纯度超过95%的重组人脑源性神经营养因子。该方法制备简单易行，便于实施。

附图说明

图1是 SDS-PAGE检测不同IPTG浓度下诱导重组pro-rhBDNF在大肠杆菌Rossta上清及包涵体的表达情况图。

图2 是?KTA Purifer 100层析系统阳离子交换纯化pro-rhBDNF图（第一步纯化）。

图3是 ?KTA Purifer 100层析系统疏水层析纯化pro-rhBDNF图（第二步纯化）。使用的色谱柱为HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub)。

图4是?KTA Purifer 100层析系统阳离子交换以及疏水层析偶联纯化后收集的pro-rhBDNF样品的SDP-PAGE电泳图。

图5 是?KTA Purifer 100层析系统阳离子交换层析纯化rhBDNF成熟肽图（第三次纯化）。

图6 是SDS-PAGE检测获得的rhBDNF成熟肽。

图7 是PC12神经瘤细胞突触检测法检测rhBDNF的生物活性图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：pET11a-pro-rhBDNF表达载体及工程菌的构建和包涵体表达

1．表达载体及工程菌的构建

化学合成SEQ ID NO:1序列（合成厂家：invitrogen），并且在序列上下游分别引入 Nde I酶切位点和 Bam HI酶切位点，并将其克隆入T载体中。合成的序列表达的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；利用限制性内切酶NdeI和BamHI对含化学合成的目的基因的T载体和pET11a空载体分别进行双酶切；然后将酶切产物分别用乙醇沉淀纯化；用T₄ DNA Ligase将纯化后的酶切产物和原核表达载体进行连接反应；将构建好的融合表达载体（pET11a-pro-hBDNF）转化到E.coli TOP10中，经菌液PCR鉴定和测序鉴定（测序厂家：invitrogen）后，鉴定正确的pET11a-pro-hBDNF的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3)（或Rosetta (DE3)pLysS）表达菌株中，工程菌保存于-80°C。

SEQ ID NO:2：

1 MTILFLTMVI SYFGCMKAAP MKEANIRGQG GLAYPGVRTH GTLESVNGPK AGSRGLTSLA

61 DTFEHMIEEL LDEDQKVRPN EENNKDADLY TSRVMLSSQV PLEPPLLFLL EEYKNYLDAA

121 NMSMRVRRHS DPARRGELSV CDSISEWVTA ADKKTAVDMS GGTVTVLEKV PVSKGQLKQY

181 FYETKCNPMG YTKEGCRGID KRHWNSQCRT TQSYVRALTM DSKKRIGWRF IRIDTSCVCT

241 LTIKRGR。

2．pro-rhBDNF的包涵体表达

（1）用灭菌接菌环刮取-80°C冻存的甘油菌，划线于琼脂板上，在37°C恒温箱中倒置培养过夜，活化菌株；

（2）挑取单菌落接种于100mL液体LB培养基（含50μg/mL Amp）中，37°C，180rpm条件下振荡培养约10-12h；

（3）按1:50的比例转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀≈1.0-1.2（约3hr）；

（4）立即加入IPTG至终浓度分别为为0、0.05、0.1、0.5、1mM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000 rpm，4 °C离心20 min收集菌体，菌体可保存于- 80 °C冰箱中。

实施例2：pro-rhBDNF包涵体的复性

1．pro-rhBDNF包涵体裂解

（1）按5 ml buffer/g菌体的比例添加Lysis buffer（0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.0），重悬菌体；

（2）添加10 μg/mL DNase，3 mM MgCl₂；

（3）在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理1 s，停止2 s，共处理10 min。裂解的沉淀中可见pro-rhBDNF，结果见图1，其中泳道1-5为菌体超声破碎后的上清，IPTG诱导浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L; 泳道6-10为菌体超声破碎后的沉淀，IPTG诱导浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L；pro-hBDNF大小约为27 KDa，对比上清和沉淀的条带可知，在各浓度的IPTG的诱导下，均能以包涵体的形式表达pro-hBDNF，如图中箭头所示，大小也与预期吻合。

2．pro-rhBDNF包涵体洗涤

（1）往超声裂解后的菌体中加入1/2 体积的Triton buffer（6% Triton X-100，1.5M NaCl，60mM EDTA），室温振荡30 min；

（2） 12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；

（3）用Lysis buffer（0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.0）重悬沉淀（可使用超声波破碎仪进行），添加1/2体积 Triton buffer（6% Triton X-100，1.5M NaCl，60mM EDTA），室温振荡30 min；

（4） 12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；

（5）用IB wash buffer（0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0）重悬沉淀，12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；

（6）重复洗涤包涵体3-4次，包涵体可保存于- 80 °C中。

3．pro-rhBDNF包涵体溶解

（1）按 5 mL/g 包涵体的比例添加溶解buffer（6M盐酸胍，100 mM DTT），室温溶解包涵体，可使用超声波破碎仪辅助溶解；

（2）待沉淀全部溶（浑浊状），12000 rpm，4°C离心10 min，取上清（会有白色沉淀）；

（3）使用6 M盐酸胍溶液透析包涵体溶液，可室温透析3 h后更换透析缓冲液，于4 °C透析过夜。

4．pro-rhBDNF包涵体复性

（1）准备可使蛋白样品中盐酸胍终浓度降至200 mM体积的Refording buffer（0.1M Tris-HCl, 1M L-精氨酸, 5mM EDTA, 0.61g/L 氧化型谷光氨肽, 1.53 g/L 还原型谷光氨肽）；

（2）缓慢添加包涵体溶液至复性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μL；

（3）将添加包涵体溶液的复性液置于4 °C过夜。

实施例3：pro-rhBDNF的分离纯化

1．阳离子交换层析初步纯化pro-rhBDNF

（1）使用buffer A（50 mM PBS，pH=7）透析上述复性液，更换buffer 3-4次；

（2）使用?KTA Purifer 100层析系统来进行hpro-BDNF的初步纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow 5 mL；

（3）仪器操作完全按照protocol进行，A1泵为buffer A（50 mM PBS，pH=7），B1泵为buffer B（50 mM PBS， 1 M NaCl，pH=7）；更换之前，先用纯水洗泵（每次换buffer均要进行此操作），换上buffer A、B后，A1、B1分别进行洗泵，管路走100%A1相；

（4）基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置：上样为10 mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；

（5）设置梯度洗脱，0-100% buffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分。洗脱缓冲液流速设置为 5 mL/min。

该步骤纯化色谱图见图2，使用的填料为SP Sepharose Fast Flow，横纵坐标分别是mAU、ml。SDS-PAGE检测图见图4。其中泳道1为纯化前样品，泳道2为阳离子交换层析纯化样品。

2．疏水作用层析二次纯化pro-rhBDNF

（1）使用?KTA Purifer 100层析系统进行疏水层析纯化，色谱柱为：HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub) 5 mL；

（2） A1泵为buffer AMS（50 mM PBS，1M 硫酸铵，pH=7），B1泵为buffer A（50 mM PBS，pH=7）；更换之前，先用纯水洗泵（每次换buffer均要进行此操作），换上buffer AMS、buffer A（50 mM PBS，pH=7）后，A1、B1分别进行洗泵，管路走100% A1相；

（3）添加硫酸铵至步骤1分离收集得到的蛋白样品中，使其终浓度为1 M。基线冲平后，buffer AMS至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置：上样为10 mL/min，上完样后，buffer AMS冲洗至无紫外吸收；

（4）设置梯度洗脱，0-100%，梯度长度为6个柱体积。收集相应吸收峰下的馏分。

该步骤纯化色谱图见图3，使用的色谱柱为HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub)，SDS-PAGE检测图见图4。其中泳道1为纯化前样品，泳道2为阳离子交换层析纯化样品；泳道3为经疏水层析后获得纯度较高的pro-rhBDNF。对比泳道2、3可知，经过疏水层析纯化后，pro-rhBDNF的浓度得到提升，其他杂带可在后续的酶切步骤中去除。

实施例4：rhBDNF成熟肽的分离纯化及生物学活性检测

1．胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽

（1）使用buffer A（50 mM PBS，pH=7）透析疏水层析分离得到的蛋白样品，或使用3 KD的超滤浓缩管置换样品缓冲液为buffer A，使样品浓度约为0.5 mg/mL。使用紫外吸收法测定蛋白浓度，计算公式为1.45*A280 - 0.74*A260；

（2）按250 mg hpro-BDNF添加1 mg Trypsin的比例，添加Trypsin，4 °C处理14-16 h，可缓慢搅拌（50 rpm）。Trypsin可切割去除Mature-BDNF上游的导肽。

2．rhBDNF成熟肽的纯化

（1）使用?KTA Purifer 100层析系统来进行rhBDNF成熟肽进行再次纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow 5 mL；

（2）仪器操作完全按照protocol进行，A1泵为buffer A（50 mM PBS，pH=7），B1泵为buffer B（50 mM PBS， 1 M NaCl，pH=7）；更换之前，先用纯水洗泵（每次换buffer均要进行此操作），换上buffer A、B后，A1、B1分别进行洗泵，管路走100%A1相；

（3）基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置：上样为10 mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；

（4）设置梯度洗脱，0-100% buffer B，梯度长度为20 个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分。洗脱缓冲液流速设置为 5 mL/min。收集相应吸收峰下的馏分；

（5）使用buffer A透析分离得到的蛋白样品，或使用3 KD的超滤浓缩管置换样品buffer为buffer A，紫外吸收法测定浓度，冷冻离心浓缩并保存于-20 °C。

该步骤纯化色谱图见图5，使用的填料为SP Sepharose Fast Flow。SDS-PAGE检测图见图6，从图中可知，经过三步纯化获得的rhBDNF纯度可达95%。

3．rhBDNF成熟肽生物学活性检测

正常细胞培养条件下（RPMI1640含10%马血清）以25 ng/ml 神经生长因子处理PC12神经瘤细胞使其具备对神经营养因子家族致敏活性；通过胰酶消化PC12细胞并接种至12孔板中按实验组所示浓度添加标准浓度神经生长因子以及纯化的重组人脑源性神经营养因子（rhBDNF），经37℃培养48h培养后在倒置显微解剖镜观察PC12神经瘤细胞的突触生长情况。检测结果见图7，其中1组为阴性对照（第二天及第五天）；2组为125AU恩经复标准品处理后第二天及第五天结果，3组为40 ug/ml rhBDNF处理后第二天及第五天结果。结果表明利用本方案表达、纯化获得的rhBDNF成熟肽与恩经复具有相当的生物活性。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门北大之路生物工程有限公司

<120> 一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法

<130> P9839

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatactttg gttgcatgaa ggctgccccc 60

atgaaagaag caaacatccg aggacaaggt ggcttggcct acccaggtgt gcggacccat 120

gggactctgg agagcgtgaa tgggcccaag gcaggttcaa gaggcttgac atcattggct 180

gacactttcg aacacatgat agaagagctg ttggatgagg accagaaagt tcggcccaat 240

gaagaaaaca ataaggacgc agacttgtac acgtccaggg tgatgctcag tagtcaagtg 300

cctttggagc ctcctcttct ctttctgctg gaggaataca aaaattacct agacgctgca 360

aacatgtcca tgagggtccg gcgccactct gaccctgccc gccgagggga gctgagcgtg 420

tgtgacagta ttagtgagtg ggtaacggcg gcagacaaaa agactgcagt ggacatgtcg 480

ggcgggacgg tcacagtcct tgaaaaggtc cctgtatcaa aaggccaact gaagcaatac 540

ttctacgaga ccaagtgcaa tcccatgggt tacacaaaag aaggctgcag gggcatagac 600

aaaaggcatt ggaactccca gtgccgaact acccagtcgt acgtgcgggc ccttaccatg 660

gatagcaaaa agagaattgg ctggcgattc ataaggatag acacttcttg tgtatgtaca 720

ttgaccatta aaaggggaag atag 744

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met

1 5 10 15

Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu

20 25 30

Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly

35 40 45

Pro Lys Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu

50 55 60

His Met Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn

65 70 75 80

Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu

85 90 95

Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu

100 105 110

Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg

115 120 125

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile

130 135 140

Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln

165 170 175

Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr

180 185 190

Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys

195 200 205

Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys

210 215 220

Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr

225 230 235 240

Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg

245

Claims

1.一种制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括如下步骤，

pro-rhBDNF的包涵体表达；

pro-rhBDNF的分离纯化；

2.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述表达载体及工程菌的构建为，人工合成SEQ ID NO:1序列，并且在序列上下游分别引入 Nde I酶切位点和 Bam HI酶切位点；利用限制性内切酶NdeI和BamHI对含目的片段的质粒和pET11a空载体分别进行双酶切；然后将酶切产物分别用乙醇沉淀纯化；用T₄ DNA Ligase将纯化后的酶切产物和原核表达载体进行连接反应；将构建好的融合表达载体pET11a-pro-hBDNF转化到E.coli TOP10中，经菌液PCR鉴定和测序鉴定后，鉴定正确的pET-11a-pro-hBDNF的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3)或Rosetta (DE3)pLysS表达菌株中即得到工程菌。

3.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF的包涵体表达为，按1:50的比例将工程菌转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀≈1.0-1.2，加入IPTG至终浓度为 1mM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000 rpm，4 °C离心20 min收集菌体。

4.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF包涵体的复性为，按5 ml buffer/g菌体的比例添加Lysis buffer，重悬菌体；添加10 μg/mL DNase，3 mM MgCl₂；在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理1 s，停止2 s，共处理10 min；加入1/2 体积的Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用Lysis buffer重悬沉淀，添加1/2体积 Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用IB wash buffer重悬沉淀，12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；重复洗涤包涵体3-4次；再按 5 mL/g 包涵体的比例添加溶解buffer（6M盐酸胍，100 mM DTT），室温溶解包涵体，待沉淀全部溶后，12000 rpm，4°C离心10 min，取上清；使用6 M盐酸胍溶液透析包涵体溶液，可室温透析3 h后更换透析缓冲液，于4 °C透析过夜；再缓慢添加至复性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μL；使盐酸胍终浓度降至200 mM，于4 °C中过夜；所述Lysis buffer为0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.0；Triton buffer为6% Triton X-100，1.5M NaCl，60mM EDTA；IB wash buffer为0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0；溶解buffer为6M盐酸胍，100 mM DTT；复性液为0.1M Tris-HCl, 1M L-精氨酸, 5mM EDTA, 0.61g/L 氧化型谷光氨肽, 1.53 g/L 还原型谷光氨肽。

5.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF的分离纯化为采用阳离子交换层析和疏水作用层析。

6.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述rhBDNF成熟肽的分离纯化中，胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽为按250 mg hpro-BDNF添加1 mg Trypsin的比例，添加Trypsin后，4 °C处理14-16 h， 50 rpm缓慢搅拌。

7.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述rhBDNF成熟肽的分离纯化中，rhBDNF成熟肽的纯化为使用?KTA Purifer 100层析系统来进行rhBDNF成熟肽进行再次纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow 5 mL。