CN107011430A - 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法 - Google Patents

一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11(GDF11)及其制备方法,属于生物医药技术领域。本发明所述的截短的生长分化因子11由95个氨基酸组成,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。对本发明获得的截短的生长分化因子11的生物活性进行研究,结果表明该截短的GDF11能够刺激成纤维细胞的胶原分泌,并且具有促进心肌成纤维细胞Smad2/3的磷酸化,激活心肌成纤维细胞Smad2/3通路的活性。因此,更进一步的,本发明所述的截短的生长分化因子11在治疗或预防舒张性心力衰竭、阿尔茨海默氏病等不可逆的老年性疾病中将具有广泛的应用前景。

Description

一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种截短后的生长分化因子11(GDF11),还涉及通过基因工程的方法生产该生长分化因子11的方法,本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
生长分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)又称为骨形态发生蛋白11(bone morphogenetic proteins 11,BMP11),是属于转化生长因子超家族的一种分泌性蛋白质,在早期胚胎发育中通过负性调控,参与骨骼、肾脏、胰腺、视网膜、嗅神经等组织器官的形成和分化,是胚胎正常发育不可缺少的调控因子。近年来GDF11在老年病和抗衰老的研究中取得了令人惊喜的结果。给老年小鼠注射GDF11,老年小鼠心脏的重量与胫骨长度的比值明显降低,心脏质量减轻,心肌细胞明显变小,肌浆/内质网钙ATP酶的转录水平明显升高。GDF11只对小鼠增令性心肌肥厚有逆转作用,而对压力超负荷造成的心肌肥厚没有逆转作用,说明这种逆转作用对衰老心肌是特异性的。近年研究结果还证实注射GDF11能刺激大脑新生血管的生成和神经元的生长,激活干细胞修复肌肉的损伤。这些新的研究结果提示,GDF11有可能就是人们在苦苦寻找的“长生不老”药,和“返老还童”药,有可能为舒张性心力衰竭、阿尔茨海默氏病等不可逆的老年性疾病提供新的治疗和预防方法。
GDF11的前体蛋白共由407个氨基酸组成,在第298位精氨酸羧基形成的肽键处被Furin酶水解成两个片段。其中由羧基端的109个氨基酸组成的片段即为成熟的GDF11。成熟的GDF11富含半胱氨酸,能形成3个链内的二硫键,分别由313与372位的半胱氨酸、341与404位半胱氨酸和345与406位半胱氨酸形成。二硫键是维持蛋白质三级结构的唯一的共价键,对维持蛋白质的立体结构和功能具有重要作用。除链内二硫键外,第371位的半胱氨酸还能和另一分子GDF11的371位的半胱氨酸形成链间的二硫键。
Furin蛋白酶是一种广泛参与前体蛋白切割的内切蛋白酶,其识别底物的序列为R-X-K/R-R↓,其中R为精氨酸,K为赖氨酸,X为任意氨基酸,↓为切点。GDF11前体蛋白295-298位氨基酸为RSRR,正是furin蛋白酶的切点,在最后R的羧基端切断GDF11前体蛋白,产生成熟的GDF11。纯化的Furin蛋白酶体外实验的结果证实,Furin蛋白酶也能识别并切割R-X-X-R↓序列,但切割的效率远不如切割R-X-K/R-R↓的效率高。GDF11前体蛋白的312-316位氨基酸为R-C-C-R,也是Furin酶能够识别和切割的序列。在体内该序列可被Furin蛋白酶识别并切割,使GDF11丢掉了313、314位的半胱氨酸,破坏了313与372间的二硫键,有可能会因此改变GDF11的立体结构和活性(图1)。
鉴于此,利用基因工程的手段获得成熟的GDF11蛋白,对于心力衰竭、阿尔茨海默氏病等不可逆的老年性疾病的预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种截短的生长分化因子11(GDF11)蛋白以及编码该蛋白的核苷酸序列。
本发明的目的之二在于提供通过基因重组获得所述的截短的GDF11蛋白的方法。
本发明的目的之三在于提供所述的截短的GDF11蛋白在促进大脑新生血管的生成和神经元的生长,激活干细胞修复肌肉的损伤中的用途。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明删除了GDF11前体蛋白第299-312位的14个氨基酸,即成熟GDF11氨基端的14个氨基酸,得到由95个氨基酸组成的截短的GDF11。GDF11前体蛋白第312-315位是RCCR序列,为Furin酶的识别、切割的序列,因此删除了312位的R,即破坏了Furin酶的识别序列,使其不能再在315位的R后面切断GDF11,保住了313位和314位的C,也就保住了313-372间的二硫键,保护了GDF11的立体结构和活性。
本发明的一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11(GDF11),其由95个氨基酸组成,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述的具有生物学活性的截短的生长分化因子11的核苷酸序列、含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
其中,优选的,所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的,本发明还提出了一种通过基因重组获得截短的生长分化因子11的方法,包括以下步骤:
(1)合成编码截短的生长分化因子11的核苷酸序列,所述的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示;
(2)将步骤(1)合成的核苷酸序列插入原核表达载体中,获得含有编码截短的生长分化因子11的核苷酸序列的重组质粒;
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化大肠杆菌,经表达和纯化后获得所述的截短的生长分化因子11。
在本发明所述的方法中,优选的,步骤(2)所述的原核表达载体为pE-SUMO。
在本发明所述的方法中,优选的,步骤(3)还包括用带有His标签的水解SUMO蛋白的酶水解表达得到的融合蛋白,获得的水解物过镍离子柱,由柱平衡液洗脱的蛋白峰即为截短的生长分化因子11。
在本发明所述的方法中,优选的,编码所述的带有His标签的SUMO蛋白水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
对本发明获得的截短的生长分化因子11的生物活性进行研究,结果表明该截短的GDF11能够刺激成纤维细胞的胶原分泌,并且具有促进心肌成纤维细胞Smad2/3的磷酸化的作用,说明本发明截短的GDF11具有激活心肌成纤维细胞Smad2/3通路的活性。
因此,更进一步的,本发明还提出了所述截短的生长分化因子11在制备治疗或预防舒张性心力衰竭以及刺激成纤维细胞胶原分泌的药物中的用途。
附图说明
图1为GDF11前体蛋白的291-407位氨基酸序列;
图中显示295-298位的RSRR序列,312-316位的RCCR序列,313与372位、341与404位、345与406位间的二硫键;
图2为纯化获得His-ULP蛋白的SDS-PAGE结果;
图3为表达得到的SUMO-GDF11融合蛋白的SDS-PAGE结果;
第1道marker,2道2M尿素-Ni缓冲液碎菌上清,3道2M尿素-Ni缓冲液碎菌沉淀,4道含3M尿素-Ni缓冲液碎菌上清,5道3M尿素-Ni缓冲液碎菌沉淀,6、7道LB培养基培养原液;
图4为经镍离子柱亲和层析纯化后获得SUMO-GDF11融合蛋白的SDS-PAGE结果;
图5为采用SUMO蛋白水解酶His-ULP酶切截短的GDF11蛋白后的SDS-PAGE结果;
图6为截短的GDF11对小鼠乳鼠成纤维细胞胶原分泌的影响;
图7为Western blotting检测截短的GDF11对心肌成纤维细胞Smad2/3表达及磷酸化水平的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
实施例1截短GDF11的制备
1、带有His标签的SUMO蛋白水解酶(His-ULP)的制备
(1)合成His-ULP基因,添加5‘NcoI,3’XhoI识别序列,所述His-ULP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,用NcoI和XhoI双酶切;
(2)用NcoI和XhoI双酶切pET-28a(+)(kan)质粒,酶切后与步骤(1)获得的DNA片段连接重组,转化JM109,筛选阳性克隆,测序,获得测序结果正确的重组质粒,命名为pET-28a(+)-ULP;
(3)将步骤(2)获得的重组质粒pET-28a(+)-ULP转化大肠杆菌BL21(DE3)中;
(4)培养步骤(3)中获得的基因工程菌:含10ul 100mg/ml卡那霉素的20ml普通培养基加入冻存菌种5ul,37℃,200rpm,培养14h(过夜);50ul 100mg/ml卡那霉素加入200ml普通培养基中,接种2ml菌液37℃,200rpm,培养14h(过夜);普通培养基加入50ul 1M IPTG诱导剂(IPTG 2.5g溶于10.49ml去离子水中,0.22um无菌滤膜过滤,-20℃保存。)诱导表达6h(160rpm,30℃)后离心8000rpm,10min。用超声波破菌制备裂解液;
(5)步骤(4)中获得的裂解液4℃12000rpm离心30min,收集裂解液上清,经镍离子柱亲和层析纯化,回收的蛋白样进行G25除咪唑及复性,即得His-ULP蛋白,见图2。
2.重组的截短GDF11的制备
(1)合成SEQ ID NO.2所示的编码截短的GDF11核苷酸序列,5’端带有BsaI酶切位点,3’端带有BamHI酶切位点,并用BsaI和BamHI双酶切;
酶切反应体系:
(2)用BsaI和BamHI双酶切pE-SUMO质粒,酶切后与步骤(1)获得的编码DNA片段连接重组。
酶切反应体系:
连接反应体系如下表1所示:
表1连接反应体系
16℃,20-24h。
(3)转化受体菌JM109,筛选阳性克隆菌,测序,获得测序正确的重组质粒,命名为pE-SUMO-GDF11。
(4)将步骤(3)获得的重组质粒pE-SUMO-GDF11转化大肠杆菌BL21(DE3)中;
(5)培养步骤(4)中获得的基因工程菌:含10ul 100mg/ml卡那霉素的20ml普通培养基加入冻存菌种5ul,37℃,200rpm,培养14h(过夜);50ul 100mg/ml卡那霉素加入200ml普通培养基中,接种2ml菌液37℃,200rpm,培养14h(过夜);普通培养基加入50ul 1M IPTG诱导剂(IPTG 2.5g溶于10.49ml去离子水中,0.22um无菌滤膜过滤,-20℃保存。)诱导表达6h(160rpm,30℃)后离心8000rpm,10min。
(6)提包涵体:将菌体沉淀刮出,放入烧杯中,加入TE1缓冲液(PH=8.0,200ml去离子水中Tris 1.21g,EDTA·2Na 0.074g,NaCl 1.17g),40ml左右,放入转子转15min,4℃,8000r,10min;将菌体沉淀刮出,放入烧杯中,加入TE2缓冲液(pH=7.0,200ml去离子水中尿素24g,Tris0.48g,EDTA·2Na0.074g,NaCl1.17g),40ml左右,放入转子转30min,4℃,8000rpm,10min;将菌体沉淀刮出,放入烧杯中,加入变性液(pH=7.0,200ml去离子水中尿素96.096g,Tris0.48g,EDTA·2Na0.074g,NaCl 1.17g),40ml左右,转子转2h,4℃8000rpm,30min。
(7)收集裂解液上清,经镍离子柱亲和层析纯化(8M尿素-Ni柱平衡缓冲液:尿素240g,Tris 1.21g,Nacl 7.3g,pH 7.4,ddH2O定容至500ml),即得SUMO-GDF11融合蛋白。
(8)配制12%分离胶,5%浓缩胶,通过SDS-PAGE验证SUMO-GDF11融合蛋白的表达及纯化效果,结果如图3,4所示。
(9)用上述制备得到的带有His标签的SUMO蛋白水解酶His-ULP水解融合蛋白,回收回来的蛋白样进行G25除尿素及复性,再一次过Ni-柱进行纯化(Ni柱平衡缓冲液),由柱平衡液洗脱的蛋白峰即为截短的GDF11,如图5,结果表明His-ULP的酶活性与购买的ULP酶活性相同。酶切反应体系:
实施例2截短的GDF11在刺激成纤维细胞胶原分泌中的应用
采用picrosirius red ELISA检测试剂盒,将小鼠乳鼠成纤维细胞清洗并吸干PBS后,分成4组,分别用10ng/ml,50ng/ml,500ng/ml的纯化后的截短的GDF11(实施例1制备)分别刺激细胞48小时,设不加截短的GDF11的组作为对照。48小时后,用胶原裂解液冰上裂解30min,超声5min×5次处理,低温离心(13500rpm裂解细胞),取上清液于另一EP管中,利用酶联免疫检测仪在波长562nm下进行蛋白的吸光度测定,并依据标准曲线换算出蛋白浓度。将剩余的上清液置于避光管中,使用试剂盒中的染料染色,4℃摇床中避光染色30min,13500rpm离心,沉淀即为胶原染料复合物,弃上清液,剩余沉淀用滤纸吸干后,加入染料释放剂,将胶原释放出来,在540nm波长下进行测定。对比各组染色前蛋白浓度值,计算可得胶原百分率。
测定结果如图6所示,从图6结果可以看出不同剂量GDF11(10ng/ml,50ng/ml,500ng/ml)分别刺激细胞48小时后,小鼠成纤维细胞分泌胶原呈现剂量依赖性增加。
实施例3截短的GDF11在促进Smad2/3的表达和磷酸化中的应用
六孔板原代培养乳鼠心肌成纤维细胞,加入纯化的截短GDF11(实施例1制备)或全长GDF11分别处理25分钟、1小时,然后用PBS洗2次,加50ul裂解液和5ul蛋白酶抑制剂,2ulPMSF,刮下细胞,转入离心管,冰上放30min,再12000g离心50分钟,收集上清获总蛋白,BCA测蛋白浓度,利用western blotting检测截短的GDF11以及全长GDF11对心肌成纤维细胞Smad2/3表达及磷酸化水平的影响。
结果如图7所示,从图7结果可以看出本发明截短的GDF11能够促进Smad2/3的磷酸化,并且相较于全长GDF11作用更强,说明本发明截短的GDF11具有强的激活Smad2/3通路的活性。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
<130> KLPI170155
<160> 3
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> PRT
<213> GDF11
<400> 1
1 Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp
16 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser
31 Gly Gln Cys Glu Tyr MET Phe MET Gln Lys Tyr Pro His Thr His
46 Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys
61 Thr Pro Thr Lys MET Ser Pro Ile Asn MET Leu Tyr Phe Asn Asp
76 Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly MET Val Val Asp
91 Arg Cys Gly Cys Ser
<210> 2
<211> 285
<212> DNA
<213> GDF11
<400> 2
tgctgccgtt acccgctgac tgttgacttc gaagcattcg gttgggactg gatcatcgca 60
ccgaaacgtt acaaagcaaa ctactgctcc ggtcagtgcg aatacatgtt catgcagaaa 120
tacccgcaca ctcacctggt tcagcaggca aacccgcgtg gttccgcagg tccgtgctgc 180
actccgacta aaatgtcccc gatcaacatg ctgtacttca acgacaaaca gcagatcatc 240
tacggtaaaa tcccgggtat ggttgttgac cgttgcggtt gctcc 285
<210> 3
<211> 678
<212> DNA
<213> His-ULP
<400> 3
caccaccacc accaccacct ggttccggaa ctgaacgaaa aagacgacga ccaagtacag 60
aaagctctgg cttctcgtga aaacactcag ctgatgaacc gcgacaacat cgaaatcact 120
gttcgtgact tcaaaactct ggctccgcgc cgttggctga acgacactat catcgaattc 180
ttcatgaaat acatcgaaaa atctactccg aacactgtgg cgtttaattc atttttctat 240
accaatttat cagaaagggg ttatcaaggc gttcgtcgct ggatgaaacg taaaaaaact 300
caaatcgaca aactggacaa aatcttcact ccgatcaacc tgaaccagtc ccactgggct 360
ctgggtatca tcgacctgaa aaaaaaaact atcggttacg ttgactctct gtccaacggt 420
ccgaacgcta tgagcttcgc tatcctgact gacctgcaga aatacgttat ggaagaaagc 480
aaacacacta tcggtgaaga cttcgacctg atccacctgg actgcccgca gcagccgaac 540
ggttacgact gcggtatcta cgtctgcatg aacactctgt acggtagcgc tgacgctccg 600
ctggacttcg actacaaaga cgctatccgt atgcgtcgct tcatcgctca cctgatcctg 660
actgacgctc tgaaataa 678

Claims (10)

1.一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11(GDF11),其特征在于所述的截短的生长分化因子11由95个氨基酸组成,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的具有生物学活性的截短的生长分化因子11的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列,其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种表达载体,其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞,其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种通过基因重组获得截短的生长分化因子11的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)合成编码截短的生长分化因子11的核苷酸序列,所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(2)将步骤(1)合成的核苷酸序列插入原核表达载体中,获得含有编码截短的生长分化因子11的核苷酸序列的重组质粒;
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化大肠杆菌,经表达和纯化后获得所述的截短的生长分化因子11。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的原核表达载体为pE-SUMO。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(3)还包括用带有His标签的水解SUMO蛋白的酶水解表达得到的融合蛋白,获得的水解物过镍离子柱,由柱平衡液洗脱的蛋白峰即为截短的生长分化因子11。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于编码所述的带有His标签的SUMO蛋白水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
10.权利要求1所述的截短的生长分化因子11在制备治疗或预防舒张性心力衰竭以及刺激成纤维细胞胶原分泌的药物中的用途。
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