CN107828719A - Gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用 - Google Patents

Gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。本发明通过基因工程技术成功构建GDF11原核表达载体，利用发酵生产、镍柱分离纯化得到GDF11蛋白，本发明通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究GDF11对脂肪干细胞成骨分化影响，发现GDF11可以诱导ASCs成骨分化，并且本发明还证实了GDF11是通过激活BMP途径诱导ASCs的成骨分化，为GDF11的临床应用奠定了理论基础。

Description

GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。
背景技术
生长分化因子-11(growth differentiation factor 11，GDF-11)，又称为骨形态发生蛋白-11，属于转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族的一种分泌性蛋白。TGF-β超家族包括转化生长因子(TGF-βs)、骨形态发生蛋白(BMPs)、生长分化因子(GDFs)等亚家族，广泛存在于从线虫到哺乳类动物之中，在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤修复等方面都发挥着重要的作用。作为TGF-β超家族成员，GDF-11在胚胎发育中也发挥着举足轻重的作用。GDF-11先后在尾芽、肢芽、背根神经节、脊索背侧区、成齿质细胞、嗅上皮、视网膜和脑的特定区域、前肠及后肾间充质中表达，参与中轴骨骼模式图的形成，牙髓细胞的分化，软骨的形成，胰腺的发育，肌细胞的生成及神经再生等过程。新近的研究还发现GDF-11具有明显的抑制甚至逆转心脏、骨骼肌等器官老化，改善大脑认知的作用。
中国专利申请(CN105770860A)公开了生长分化因子-11在促进糖尿病伤口愈合中的用途，属于医药技术领域。本发明通过建立由有效浓度的链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠伤口模型，评估了生长分化因子-11对糖尿病小鼠伤口模型伤口愈合情况的影响，研究发现生长分化因子-11可以促进糖尿病小鼠伤口的愈合，且其愈合速度均高于阳性对照组(EGF)和空白对照组。因此，本发明的提出为糖尿病伤口愈合治疗提供了一种有效的技术手段。
目前GDF11对于骨髓干细胞成骨方面的影响仍不能确定，但是GDF11对于脂肪来源的间充质干细胞成骨分化的影响尚无报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。
所述GDF11可以促进成骨诱导液的成骨能力，也能够单独诱导脂肪间充质干细胞成骨分化。
本发明利用基因工程技术构建pET-22b-gdf11的BL21原核表达菌，其中所用PCR引物为：GDF11-F5'AAAAAGACAGCTATCGCGA 3'为上游引物GDF11-R5'CCCAAGCTTGCCGGATCCTTAAGAGCA 3'为下游引物，上下游引物中分别引入了BamHI和HindIII酶切位点。本发明以人来源的正常细胞的cDNA为模板PCR扩增得到gdf11片段，利用BamHI和Hind III酶对pET-22b质粒以及GDF11 PCR片段经行酶切，连接，转化入大肠杆菌BL21，通过对氨苄抗性的筛选挑出转化成功的单克隆菌，扩大培养后提取质粒，并作为模板进行菌落PCR，在300bp左右有目的条带出现。以及再次使用BamHI和Hind III双酶切出现了一条5000bp以上的条带，为pET-22b(5500bp左右)质粒，还有一条300bp左右的GDF11目的条带。通过测序最终表明构建的pET-22b-gdf11质粒是成功的。
本发明通过发酵生产、镍柱分离纯化，最终得到纯度较高的GDF11蛋白。
本发明通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究GDF11对脂肪干细胞成骨分化影响，结果发现GDF11添加浓度为600ng/mL，900ng/mL时，有明显的染红的钙结节的形成。其中900ng/mL的效果最好，染得颜色最深。表明高浓度的GDF11有诱导ASCs的成骨分化的能力，其中900ng/mL的GDF11诱导效果最好。通过q-PCR的数据可以发现添加900ng/mL的GDF11，7天时成骨相关的基因alp，ost，runx2都显著的上调，而14天时ost有明显的上调，而alp以及runx2有较明显的上调。Western Blot的数据也表明，通过添加900ng/ML GDF11可以使ASCs的ALP，Runx2蛋白表达量上调，同时还可以诱导骨形成蛋白OPN的表达。
此外，本发明通过BMP信号通路研究初步探讨了GDF11诱导成骨分化的分子机制。通过Western Blot实验发现，GDF11(900ng/mL)在1h，6h以及12h时可以磷酸化ASCs的SMAD1/5/8。接着使用SMAD1/5/8通路抑制剂(LDN-193189)进行实验，发现抑制剂在200ng/mL时可以完全抑制GDF11对ASCs磷酸化的SMAD1/5/8激活作用。另外，本发明将GDF11和抑制剂同时加入ASCs完全培养基，相比于只添加GDF11组，基本不会促进ASCs的成骨分化。说明GDF11确实是通过SMAD1/5/9这条通路刺激ASCs的成骨分化。本发明为GDF11的临床应用奠定了理论基础。具有潜在治疗骨质疏松药物的开发应用。
附图说明
图1是实验技术路线流程图；
图2是pET-22b表达质粒图谱；
图3是pET-22b-gdf11质粒构建及鉴定图谱(A)GDF11扩增片段M：marker；1、2GDF11片段(B)菌落PCR，M：marker；1、2：GDF11片段(C)双酶切鉴定M：marker；1：质粒酶切；
图4是GDF11蛋白诱导表达(A)GDF11蛋白诱导M：marker；1：未加诱导剂；2：添加1mmol IPTG(B)GDF11包涵体检测M：marker；1：上清；2：包涵体；
图5是GDF11蛋白表达条件优化(A)不同浓度的IPTG对GDF11表达的影响；(B)不同时间和温度对GDF11表达的影响；
图6是GDF11蛋白分离纯化(A)GDF11过柱分离M：maker；1：未处理样品；2：过柱废液；3：30mM咪唑；4：100mM咪唑；5：200mM咪唑；6、300mM咪唑(B)GDF11复性纯化M：maker；1，2：GDF11复性液；
图7是ASCs提取与表面标记鉴定；
图8是ASCs诱导分化(A)未处理ASCs；(B)成软骨分化；(C)成脂分化(D)成骨分化；
图9是不同浓度的GDF11联合成骨诱导液处理ASCs14天后对成骨分化的影响Cell：未处理；osteogenic：成骨诱导液；B+GDF11浓度(成骨诱导液+33.3ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、900ng/ml)；
图10是不同浓度的GDF11对ASCs成骨分化的影响；
图11是GDF11诱导ASCs成骨相关基因的表达，Cell：对照组；gdf11：GDF11 900ng/ml；
图12是成骨相关蛋白表达Cell：对照组；实验组：GDF11900ng/mL；
图13是(A)900ng/ml的GDF11处理ASCs 1h、6h、12h后p-SMAD1/5/8蛋白表达；(B)LDN-193189抑制GDF11诱导SMAD1/5/8蛋白的磷酸化；(C)Cell：对照组；GDF11：GDF11900ng/ml；G+L：GDF11+200ng/ml LDN-193189
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1利用基因工程技术构建pET-22b-gdf11的BL21原核表达菌
(一)gdf11片段扩增
(1)PCR：GDF11-F5'AAAAAGACAGCTATCGCGA 3'为上游引物GDF11-R5'CCCAAGCTTGCCGGATCCTTAAGAGCA 3'为下游引物，以人来源的正常细胞的cDNA为模板PCR扩增gdf11片段。扩增的体系如下表1所示：
表1 PCR扩增体系
PCR反应体系如下表2所示：
表2 PCR反应体系
按上述条件扩增gdf11 DNA片段。
(2)琼脂糖核酸电泳
①琼脂糖凝胶的配制：往锥形瓶中先加入取事先称量的0.3g琼脂粉，再添加事先稀释的1×的30mL TAE缓冲液，最终为1％的凝胶液。使用微波炉加热溶解琼脂粉，加热条件为高火1min。取出加热后的锥形瓶放入冷水槽内冷却至50℃左右，用手握住不会烫手。再加入1μL的EB摇晃均匀后快速导入板槽中，记住不要有气泡，最后插上梳子，等待其凝固后备用。
②上样：取上述PCR产物50μL加入10×loading buffer 2μL，用枪吹打均匀。拔出上述凝固的琼脂糖凝胶的梳子，转移入电泳槽，电泳槽中的缓冲液需要没过凝胶表面。用枪吸取PCR混合物轻轻加入凝胶孔中，另取10μL的DNA mark加在样品左侧孔内。
③跑胶：插入电源，注意红为正极，黑为负极，电泳正反极千万不要弄错。电压调节为100V，打开电源，根据样品泳动的位置确定时间，位置为胶长的2/3处电泳时间，大概25min左右。
④观察核酸片段。跑完胶后，关闭电源，取出凝胶；打开凝胶成像仪，将凝胶置于紫外灯下合适位置，打开紫外，观测拍照。
(3)胶回收
①与紫外灯下按照marker用刀片延边缘切下包含目的基因的凝胶，放入事先称重的1.5mL离心管，再称重做好标记。这里我们使用的是OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒。
②凝胶块称重后按1g凝胶加入1mL的比例加入Binding Buffer，加完后恒温器中58℃加热融化，每5min涡旋震荡一次，直到凝胶完全融为液体。
③将收集管套入废液管中，用移液器将EP管中上述溶解的液体转移收集管中，离心10000g，1min，弃废液。
④向收集管的柱子中加300μL的Binding Buffer，离心10000g，1min，弃废液。
⑤向收集管的柱子中加700μL的SPW Washing Buffer，离心10000g，1min，弃废液。
⑥重复上一步。
⑦空柱离心13000g，2min，弃废液。
⑧收集管套入新的EP管上，加入20～30μL的3d水，室温静置2-3min。
⑨离心13000g，2min，最终EP管中的液体即为回收的DNA样品溶液，-20℃保存。
(4)测浓度
使用微量测量仪，按仪器操作说明书测定DNA浓度以及纯度。
(二)GDF11表达质粒构建
(1)双酶切：用BamHI和Hind III酶切pET-22b质粒和上述扩增的gdf11 DNA片段，酶切体系如下表3所示：
表3 酶切体系
反应条件为37℃，8～10h。
(2)酶切后跑胶回收并测浓度。
(3)连接：用T4连接酶将酶切后的pET-22b质粒和gdf11片段连接，构建pET-22b-gdf1。连接体系如下表4所示：
表4 连接体系
16℃，连接过夜，连接后将质粒导入BL21大肠杆菌。
(三)感受态制备及转化
(1)BL21感受态的制备：先接种一支5mL的不含构建质粒的BL21大肠杆菌，37℃，180rpm培养8h后，接到100mL的LB培养基中，37℃，180rpm，培养至OD600＝0.5(此时菌的活力最好)；将养好的菌分装到50mL的灭菌的干净离心管中，冰浴30min；接着4000rpm，4℃，10min离心后弃上清，留菌体，加入10mL预冷的CaCl2(0.1mol/L)冰浴5min；继续4000rpm，4℃，10min离心5min后弃上清，留菌体，最后加入3.2mL的预冷CaCl2(0.1mol/L)以及0.8mL的50％甘油，混匀后分装，放置于-80℃备用。
(2)转化：将上述连接的质粒取10μL与上述制备的BL21感受态50μL加入到1.5mL的灭菌ep管中(轻轻摇晃均匀)，冰上放置30min后42℃水浴90s后取出放入冰中2min，再加入450μL的LB培养基，37℃，100～150rpm温育45min；取出100μL已转化的感受态细菌铺入含氨苄的LB固体培养板中，37℃培养12～16h。
(3)菌体筛选：挑单克隆菌落于新的加入氨苄的5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床12h。在超净台内取出1mL的菌体于EP管内，10000rpm，离心1min，收集菌体。取30μL的3dH2O重悬菌体，100℃，10min，放入-20℃冷冻10min后常温融化，离心后取上清5μL为模板菌落PCR用来验证其质粒是否转入菌中。验证正确后保菌。
(四)重组质粒鉴定
(1)质粒提取：
①将单克隆挑选的菌种培养后，取100μL转接到另一试管中，37℃，180rpm摇菌过夜。
②菌体收集：将上述摇菌过夜的LB培养基倒入新的EP管内，离心10000g，1min，弃上清，收集细菌沉淀。
③Omega公司的质粒小量抽提试剂盒按说明步骤提取质粒。
④每个EP管中加入250μL Solution I重悬菌体，Solution I使用前加入Rnase A，混匀，4℃存放，可用移液器吹打重悬。
⑤再向EP管中加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀，室温静置5min，使细菌充分裂解至溶液透明。
⑥向EP管中再加入350μL Solution III，轻轻颠倒混匀，见白色絮状物生成即可。
⑦室温离心13000g，10min。
⑧将上一步骤离心后的上清液用移液器小心转移到质粒纯化柱中，切记不可吸取管内沉淀。离心13000g，1min，弃废液。
⑨在质粒纯化柱内加入500μL Buffer HB，离心13000g，1min，弃废液。
⑩在质粒纯化柱内加入750μL DNA Wash Buffer，离心13000g，1min，丢弃废液。注DNA Wash Buffer先需加入54mL无水乙醇，混匀，4℃存放。
空柱离心13000g，2min，除去残留液体。
将质粒纯化柱置于1.5mL新的EP管上，并加入50μL 3d水，室温放置3-5min。
离心13000g，1min，EP管内液体即为提取质粒，测浓度。
(2)菌落PCR：
接菌至5mL的LB培养基，37℃180rpm培养过夜，取菌液于EP管中，10000rpm，1min，弃上清，收集菌体。取50μL PBS将菌体重悬，重悬后放入金属浴锅100℃，10min，再放入-20℃冷冻，反复2，3次将细胞壁破碎，使菌体内部质粒释放，最后10000rpm，1min取上清作为模板。扩增检测的体系如下表5所示：
表5 PCR扩增体系
PCR反应体系参考前面步骤。
(3)双酶切鉴定：按照(二)中的步骤方法双酶切即可。
(4)提取的质粒由生工测序公司测序。
实施例2发酵生产、镍柱分离纯化得到GDF11蛋白
(1)GDF11蛋白的检测
①将挑选检测的菌接入一支5mL的LB液体培养基，37℃，180rpm培养12h。
②取1mL的菌10000rpm，离心1min，弃上清。
③加入50μL的3dH2O重悬菌体，100℃加热，10min，再在-20℃反复冻融两到三次，使菌体外的细胞壁破裂。
④在进行10000rpm，1min离心。取上清为S1，取沉淀加入10％SDS溶解为S2。
⑤S1和S2分别跑胶，考马斯蓝染色，和未转染质粒的BL21大肠杆菌的溶解液比较，检测出是否有目的蛋白生成。
(2)考马斯蓝染色
①SDS-PAGE胶的配制：8％分离胶的配制(20mL)，各成分如下表6所示：
表6 8％分离胶成分
将分离胶用枪快速打入玻璃板的夹层中，一块板加4～5mL的下胶，之后再用75％酒精将下胶压平，之后室温放置20～30min，待分离胶凝固后再倒掉酒精，放置5min。
5％浓缩胶的配制(10mL)，各成分含量如下表7所示：
表7 5％浓缩胶成分含量
用枪头将配制好的浓缩胶快速灌满胶板并插入梳子，室温放置20～30min待其凝固后，放置入电泳槽中准备进行上样。
②上样：将样品加入5×的蛋白loading buffer，金属浴100℃，10min。用10μL移液器将样品加入胶孔内。并在样品旁边加入5μL的蛋白maker。
③电泳：连通电源，注意正反极，先60V电泳30min，压缩样品为一条直线，跑完浓缩胶，再换成120V电泳90min～120min直到跑完分离胶。
④染色：将跑完的凝胶切下来放入器皿中，加考拉斯亮蓝，放入摇床室温染色4h左右。
⑤脱色：考马斯亮蓝回收，用纯水冲洗摇晃3次，再加入脱色液，放入摇床上低速摇动，大约2h，直至背景颜色脱完，中间可以换洗脱液。
⑥拍照记录。
上述构建成功的菌体使用1mmol的IPTG诱导后，如图4所示，发在35kDa左右出现诱导表达的、GDF11条带。接着检测了蛋白的可溶性，收集菌体后超声破碎，离心后，分别取上清和沉淀跑胶，经考马斯亮蓝染色发现，目的蛋白存在于沉淀中。说明诱导表达的GDF11蛋白是以包涵体的形式存在。
(3)GDF11蛋白表达优化
①诱导剂的优化：为确定诱导剂的最佳浓度，使用IPTG浓度分别0.5mM、1mM和1.5mM，诱导的条件都为37℃，180rpm，诱导时间都为6h，按上面的步骤处理后，使用SDS-PAGE考马斯蓝染色检测目的蛋白相对表达量，确定诱导剂的最佳浓度。
②温度时间的优化：为确定诱导时间和温度，收集30℃和37℃，180rpm，1mM的IPTG诱导6h，7h，8h，9h表达菌，使用SDS-PAGE考马斯蓝染色检测目的蛋白相对表达量，确定最佳的诱导时间和温度。
由图5可知，不同浓度的IPTG、时间以及温度都对GDF11的表达没有影响。
(4)GDF11蛋白分离纯化
菌体收集处理：使用发酵罐大量培养构建菌，通过沉淀离心收集菌体，收集完的菌体按一下步骤处理：
①重悬菌体：称量菌体湿重，以1：10的比例加入PBS(pH8.0)，使用振荡器重悬菌体，混匀。
②超声波破碎：将金属探头伸入液体里，冰浴低温超声。超声条件为功率15％、超声时间3s、间隙时间6s、超声总时间15min，超声次数3次。
③离心：使用高速冷冻离心机，低温4℃、17000g、30min，收集沉淀，上清、沉淀分别留样S3、S4。
④样品预处理：以1：10的比例加入样品洗液重悬沉淀。使用高速冷冻离心机离心，低温4℃、17000g、30min，收集沉淀。此步骤重复2～3次，每次上清留样S5、S6、S7，最后一次离心沉淀留样S8。
⑤尿素处理：以1：10的比例加入Elution buffer重悬沉淀，浸泡过夜。
⑥离心：高速冷冻离心机离心，低温4℃、17000g、30min，取上清，上清和沉淀分别留样S9、S10。抽滤，留样电泳。
蛋白分离纯化：处理完的样品洗液先用滤纸粗过滤一遍，接滤液后过柱，分离纯化的柱子为Ni2+。过柱前，先加少量水压平液面，后装上柱子，快速压入，直到没有汽包生成。接着用纯水过柱，直到柱内充满纯水(洗柱)；再用Elution buffer过柱，直到柱内的纯水都被Elution buffer替代为止，最后在以1.5μL/s的速度上样。样品上完后，使用30mM浓度的咪唑洗脱至OD值稳定，再用100mM，200mM，300mM浓度的咪唑各洗脱一次，每次的洗脱液保留待检测。
蛋白复性：将检测含目的蛋白的洗脱液收集测浓度后，将蛋白用Elution buffer稀释至0.05mg/mL，先将透析袋100℃煮沸10min，再装入透析袋(不得超过透析袋容积的三分之一)，分别放入4M，2M，1M，0.5M，0.05M的脲透析液中透析，每12h换一次透析液，透析完后收集透析复性液，4℃，3500rpm，45min超滤离心，浓缩蛋白后得到最终蛋白产物，过滤除菌后分装于-80℃保存备用。纯化结果，如图6所示。
试验例1通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究GDF11对脂肪干细胞成骨分化影响
(一)ASCs成骨诱导
(1)消化计数：将培养于T75细胞瓶中的ASCs按细胞消化的方法，利用培养基将ASCs吹打成悬浮状态，用细胞计数器计算密度。
(2)铺板：添加培养基将上述计数好的ASCs稀释到1×106个/mL，利用枪吹打均匀后接种到灭菌的细胞培养6孔板中。
(3)换液诱导：将铺好板的6孔板放入细胞培养箱内，24h后等ASCs贴壁后取出换液。换液时先将原先的培养基小心沿壁小心吸出，每孔再加入1mL的PBS，轻轻摇晃后吸走，重复2次后，添加成骨诱导液2mL，放入培养箱培养，每隔3天左右换液一次。
(4)添加GDF11：将不同浓度的GDF 11(33.3ng/mL，100ng/mL，300ng/mL，600ng/mL，900ng/mL)添加到ASCs培养基中培养细胞。
(二)茜素红染色
细胞成骨诱导分化完后将成骨诱导液弃去，PBS洗3遍，再加入4％的多聚甲醛固定30min。弃除多聚甲醛，PBS洗两遍，再加入配好的茜素红染液染3-5min。最后除去茜素红，PBS洗两遍，拍照记录，观察其是否能够诱导脂肪干细胞成骨分化。结果发现在600ng/mL，900ng/mL时，有明显的染红的钙结节的形成。其中900ng/mL的效果最好，染得颜色最深。通过显微镜(50×)可以看到在600ng/mL，900ng/mL GDF11的诱导下形成的钙结节。表明高浓度的GDF11有诱导ASCs的成骨分化的能力，其中900ng/mL的GDF11诱导效果最好(如图9所示)。
(三)成骨相关基因检测
(1)ASCs总RNA的抽提：一瓶T25加入Trizol试剂1mL，室温静置2～3min后，将细胞吹打下来装入1.5mL的进口EP管中；EP管中加入0.2mL的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min。离心12000g，15min。离心后分为三层，上层澄清含有RNA，中间一层为白色蛋白，底层为DNA杂质。轻轻吸取上层水相(约400μL)，千万不要吸取其他层的液体，会污染RNA，吸取的液体为澄清白色；将吸取的上层水相中加入等量的异丙醇(约400μL)，再轻轻吹打混匀，室温静置5min后，离心12000g，15min，离心后白色羽毛状的RNA沉淀于EP管底；将上清弃去，加入1mL的75％乙醇将沉淀洗涤，离心8000g，10min；离心后，弃上清，EP管倒扣在干净的纸巾上，除去多余乙醇。静置1min，最后加入15-30μL的DEPC水溶解；用超微量紫外分光光度计，测定RNA浓度，OD260/OD280值应在1.8～2.0之间。DNA污染会使OD＞2.0；蛋白质污染会使OD＜1.8。
(2)逆转录：逆转录反应：可参照PrimeScript TM RT reagent Kit(PerfectRealTime)试剂盒。其反应体系如下表8所示：
表8 反应体系
逆转录条件：37℃15min；85℃5s。将逆转录的cDNA做好标记，可立即进行荧光定量PCR或-20℃保存备用(保存时间不要超过一个月)。
(3)荧光定量：按试剂盒要求，其反应体系如下表9所示：
表9 荧光定量PCR反应体系
按上面配置好的反应混合物加入到反应板中，每孔10μL，三个复孔，加完后4℃离心1500r/min 5min，开始进行Real-Time，其反应条件如下表10所示：
表10 Real-Time反应条件
由图11可以发现添加900ng/mL的GDF11，7天时成骨相关的基因alp，ost，runx2都显著的上调，而14天时ost有明显的上调，而alp以及runx2有较明显的上调。
4.4成骨相关蛋白检测
(1)蛋白浓度测定：根据之前的步骤，把不同组的ASCs收集，用PBS洗涤3次，洗涤后。加入已经SDS和PMSF(50:1)的裂解混合液(6孔板的一个孔加入50μL)，摇晃均匀后，使用细胞刮刮取细胞(最好在冰上经行此操作)，再用枪头将溶解细胞后的SDS裂解液收集到1.5mL的EP管内。在金属浴上100℃加热10min，期间可以震荡混悬，煮完后液体会变得澄清，以10000g离心20min，后取上清液测定蛋白浓度。
BCA试剂盒测定蛋白浓度的步骤如下：
①加入ddH2O到蛋白标准品中，将其稀释至100μL，其终浓度应为0.5mg/mL。
②加入A液和B液(体积50:1)混合均匀，为BCA工作液，应现配现用。
③按照下表11配制蛋白标准样品，并用此绘制标准曲线。
表11 蛋白标准样品配置
(4)取待测蛋白样品2uL混合加入38μLPBS，使待测样品稀释20倍，在往96孔板中加待测样品，每孔10μL，每个样品共三孔。加完样品后再加BCA工作液100μL，充分混匀，37℃孵育30min，再用酶标仪测定OD450值。
(5)根据样品所测的吸光值，利用标准曲线得出相应的蛋白含量(μg)，乘稀释的倍数20倍，便可得到真实蛋白浓度。将测定的蛋白样品稀释配比后加入适量的5×SDSLoading Buffer，摇匀后金属浴100℃煮10min，处理好以后便进行SDS-PAGE电泳。
②SDS-PAGE胶的配制：8％分离胶的配制(20mL)，如下表12所示：
表12 8％分离胶的配制
将分离胶用枪快速打入玻璃板的夹层中，一块板加4～5mL的下胶，之后再用75％酒精将下胶压平，之后室温放置20～30min，待分离胶凝固后再倒掉酒精，放置5min。
进行5％浓缩胶的配制(10mL)，具体成分如下表13所示：
表13 5％浓缩胶的配制
用枪头将配制好的浓缩胶快速灌满胶板并插入梳子，室温放置20～30min待其凝固后，放置入电泳槽中准备进行上样。
③跑胶转膜：电泳槽中加入电泳缓冲液，后拔出梳子，每孔可加入10μL到15μL的蛋白样品。将电源连接好进行电泳(注意正反极)。跑上胶的电泳条件为60V 30min，样品跑至分离胶前都会被压成一条直线，跑到下胶时，电压改为100V。直到观察溴酚蓝到达板底部时停止电泳。接着取出胶板，撬开玻璃板，根据maker将含目的蛋白的胶切下来。利用尺子和铅笔，剪取相应大小的PVDF膜。并将膜放入甲醇中活化5min，接着按照从下往上的顺序放入一层海绵、三层滤纸、含目的蛋白的凝胶、PVDF膜、三层滤纸、一层海绵放入转膜架中，除气泡后加紧架子放到转膜槽中，加入转膜液进行转膜，恒压200mA，2h。转膜结束后将转入蛋白的PVDF膜放入TBS中清洗3次，每次5min。
④孵抗显影：将清洗好的膜放入5％脱脂奶粉的TBST中封闭，常温摇床放置1.5h；TBST洗膜3次，每次8min，洗完膜后孵育一抗，孵育条件4℃过夜；孵完一抗后用TBST液洗膜3次，每次8min，再加入加入二抗(鼠抗1：5000；兔抗1：8000)室温孵育1h；TBST洗膜3次，每次8min，洗完后将PVDF膜放到干净薄膜上，用ECL发光液用移液枪滴加到膜表面；用滤纸吸干多余的ECL液，在不含白光的环境中将PVDF膜置于暗盒中，在上面再放置三张胶片进行压片；根据蛋白发光程度的不同，压片时间不同。压完片后先后用显影液或定影液各浸泡5min左右，取出胶片后清水洗涤晾干并用扫描仪扫描。
由图12可知，通过添加900ng/mL GDF11可以使ASCs的ALP，Runx2蛋白表达量上调，同时还可以诱导骨形成蛋白OPN的表达。
试验例2 通过BMP信号通路研究初步探讨了GDF11诱导成骨分化的分子机制
通过Western Blot的实验发现，GDF11(900ng/mL)在1h，6h以及12h时可以磷酸化ASCs的SMAD1/5/8，如图13A所示。接着使用SMAD1/5/8通路抑制剂(LDN-193189)进行实验，发现抑制剂在200ng/mL时可以完全抑制GDF11对ASCs磷酸化的SMAD1/5/8激活，如图13B所示。将GDF11和抑制剂同时加入ASCs完全培养基，相比于只添加GDF11组，基本不会促进ASCs的成骨分化。说明GDF11确实是通过SMAD1/5/9这条通路刺激ASCs的成骨分化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GDF11通过基因工程构建pET-22b-gdf11的BL21原核表达菌，在原核表达系统中诱导表达、发酵生产和镍柱分离纯化得到。
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