CN104830778B - 稳定高表达os‑9的细胞株的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种稳定高表达OS‑9的细胞株的构建方法，属于分子生物技术领域。该方法包括将plenti6.3载体和OS‑9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3‑OS‑9质粒；以所述plenti6.3‑OS‑9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco‑2细胞后筛选出阳性克隆，培养10‑15天后，获得稳定高表达OS‑9的细胞株。该细胞株，方便了在研究OS‑9过表达的状态下，其他功能性蛋白的表达情况，为OS‑9过表达与其他功能性蛋白表达关系的研究提供了材料。可通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。

Description

稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法和应用。
背景技术
肠粘膜屏障是机体防御的重要屏障，可防止肠腔内致病性抗原(细菌、有毒物质、食物抗原物质、致癌物质等)侵入，使机体内环境保持相对稳定，维持机体的正常生命活动。
肠上皮细胞间的紧密连接蛋白是构成肠粘膜屏障的重要组成部分。一旦紧密连接蛋白受到破坏，肠上皮细胞间通透性便增加,细菌、内毒素和大分子物质就可通过紧密连接蛋白进入体循环，参与多种疾病的发生发展。
大量研究表明在烧伤、创伤、大型手术等外科应激条件下，会引起肠道的急性缺氧，从而导致肠粘膜屏障功能障碍，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征，导致多脏器功能衰竭，甚至危及生命。
骨肉瘤蛋白(os-9)是在人体组织广泛表达的一种蛋白，但其功能尚不完全明确。目前对os-9的研究主要集中于它从内质网向高尔基体转运一些膜蛋白，以及在缺氧条件下调节缺氧诱导因子。然而os-9在表达的过程中，其可能会伴随着一系列的刺激和诱导作用，并促使一些未知蛋白(包括一些对机体防御功能有利的蛋白)表达量提高；因此通过研究os-9的表达状态，进一步地探究其对其他对机体防御功能具有帮助的功能性蛋白的表达情况为人们对疾病治疗和防御开辟了新的路径。
然而，目前还未见有通过os-9过表达探究肠粘膜屏障保护作用的相关报道，因此提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法并进行应用是人们亟需解决的一个技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，该方法实现了高表达OS-9的细胞株的构建，为通过研究OS-9高表达探究对机体防御功能具有帮助的功能性蛋白的表达情况提供了实验材料。
本发明的第二目的在于提供上述的表达OS-9的细胞株的构建方法构建成的细胞株的用途。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，包括将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
该方法构建的细胞株，其能够实现OS-9的过表达，进而为在研究OS-9过表达过程中，其他功能蛋白表达状态提供了良好的实验材料，而且该细胞株表达OS-9稳定，可很好地用于定量和定性检测OS-9高表达状态下相关蛋白的表达状态；此外，该构建方法由于载体、供体细胞以及宿主细胞等选择合理，进而使得稳定高表达OS-9的细胞株易于获得，且获得的细胞株性能稳定，易于贮存。
可选的，该构建方法具体包括以下步骤：
1)、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；
2)、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
3)、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；
4)、对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；
5)、以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物；
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游扩增引物如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：12所示。
通过特定序列的引物，以实现不同位置OS-9基因片段的扩增，上述所举几种引物，由于酶切位点设置合理，同时序列选择得当，非常便于全长OS-9序列的扩增以及后续连接反应的顺利进行。
可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括如下步骤：
以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；
以3个扩增产物为模板，以如SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4所示序列为引物，进行扩增。
以不同的引物，通过扩增获得不同的目的片段，具体的，引物SEQ ID NO：1和SEQID NO：2扩增上游1.6kb目的片段(退火温度选择60℃)；引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4扩增下游260bp片段(退火温度选择50℃)；引物SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：12基因拼接中间缺失的165bp片段(退火温度55℃)。
然后以上面三个PCR产物做模板，用引物SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4，扩增全长OS-9，目的片段2k。该方式可快速有效地获得全长OS-9基因。
可选的，在步骤3)中，所述酶切反应的体系为：PacI 0.8-1.2μl，PmeI 0.8-1.2μl，10×buffer 1.8-2.2μl，OS-9基因1.8-2.2μg，ddH2O补至20μl。
在上述的酶切反应体系中，由于反应体系设置合理，因此可以实现顺利酶切效果，从而便于后续与plenti6.3载体顺利连接。
可选的，在步骤3)中，所述连接的过程中采用T4 DNA连接酶，且反应温度为15-17℃。
在该温度下，T4 DNA连接酶具有较好的连接效果，可以实现大量的OS-9基因与plenti6.3载体连接。
可选的，在步骤5)中，具体包括：
a)、将plenti6.3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6.3-OS-9质粒；
b)、将所述稀释后plenti6.3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25分钟，得到DNA与转染试剂复合物；
c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38℃、4-6％的CO2的条件下分段培养90-100小时后，离心，过滤，得到病毒液；
d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高表达OS-9的细胞株。
可选的，在步骤c)中，所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；所述过滤的过程中，滤径为0.4-0.5微米。
所述的构建方法在制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中的应用。
所述的构建方法通过提高claudin-1和occludin表达量，增强肠粘膜屏障功能中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、通过本发明的构建方法构建的高表达OS-9的细胞株，其生化性能稳定，能够实现OS-9过表达，极大的方便了在研究OS-9过表达的状态下，其他功能性蛋白的表达情况，为OS-9过表达与其他功能性蛋白表达的关系的相关研究提供了理想的实验材料。
(2)、该高表达OS-9的细胞株，可通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。
(3)、该构建方法在获取全长OS-9基因的过程中，对于引物进行特定的选择，而且在PCR的过程中，用不同的引物扩增，获取不同目的片段，然后再以所获的目的片段为模板再次扩增，非常利于全长OS-9基因的获取。
(4)、该细胞株在高表达OS-9的过程中，其可明显提高紧密连接蛋白(claudin-1和occludin)的表达量，而且还可降低对肠粘膜通透性的破坏，因此用于制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中，以预防和治疗肠粘膜疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明应用例1中OS-9过表达细胞株在正常条件和缺氧条件对紧密连接蛋白claudin-1和occludin的蛋白表达图。
其中，A为western blot实验结果，B图为western blot结果的定量统计分析；
图2为本发明应用例2中，免疫荧光实验结果显示OS-9过表达对紧密连接蛋白的上调的结果图；
图3为本发明提供的高表达OS-9的细胞株与肠上皮细胞跨上皮电阻检测肠粘膜屏障通透性关系检测结果图；
图4为本发明实施例5提供的高表达OS-9的细胞株的倒置荧光显微镜观测以及os-9表达结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，包括：将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
该方法构建的细胞株，其能够实现OS-9的过表达，进而为在研究OS-9过表达过程中，其他功能蛋白表达状态提供了良好的实验材料，而且该细胞株表达OS-9稳定，可很好地用于定量和定性检测OS-9高表达状态下相关蛋白的表达状态；此外，该构建方法由于载体、供体细胞以及宿主细胞等选择合理，进而使得获得稳定高表达OS-9的细胞株的过程易于实现，而且获得的细胞株性能稳定，易于贮存。
接下来，结合以上的内容，对本发明的稳定高表达OS-9的细胞株构建方法举出以下具体的实施例。
实施例1
S11：提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；
S12：以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物；
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游扩增引物SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所述；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：12所示。
另外，在扩增的过程中，以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；
以3个扩增产物为模板，以如SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4所示序列为引物，进行扩增。
S13：将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；
所述酶切反应的体系为：PacI 0.8-1.2μl，PmeI 0.8-1.2μl，10×buffer 1.8-2.2μl，OS-9基因1.8-2.2μg，ddH2O补至20μl；另外，在连接的过程中采用T4 DNA连接酶，且反应温度为15-17℃。
S14：对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；
S15：以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
具体的，该步骤包括以下操作：
a)、将plenti6.3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6.3-OS-9质粒；
b)、将所述稀释后plenti6.3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25分钟，得到DNA与转染试剂复合物；
c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38℃、4-6％的CO2的条件下分段培养90-100小时后，离心，过滤，得到病毒液；
所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；过滤的过程中，滤径为0.4-0.5微米。
d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高表达OS-9的细胞株。
实施例2
S21：提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；
在该步骤中，对于Caco-2细胞的传代培养具体包括：
人结肠癌上皮Caco-2细胞株购自中国科学院细胞库；Caco-2细胞完全培养基配制：20％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％双抗，MEM培养基为母液；Caco-2细胞培养条件：37℃，5％CO2，饱和湿度，培养4-6天；待细胞融合约80％时，将细胞用无菌PBS洗涤3次，加入含0.25％EDTA的胰酶进行消化，显微镜下观察，待细胞变圆，部分脱落时，立即加入含有血清的培养基终止消化；用滴管反复吹打细胞悬液几次，将细胞悬液转移至无菌离心管，放入离心机，1000转/分钟，离心5分钟；离心完毕，倒去上清液，加入无菌的Hanks缓冲液，用滴管再次吹打均匀，然后1000转/分钟，离心5分钟；离心完毕，倒去上清液，加入完全培养基吹打均匀，按1:3传代分瓶，置于细胞培养箱培养。
对于Caco-2细胞mRNA的提取操作包括：
倒去细胞培养基，用PBS洗涤两次。按每10cm2生长细胞加入1ml Trizol裂解液，用移液枪吹打细胞使其脱落。将裂解液转移至离心管中，室温静置5分钟。加入1/5Trizol量的氯仿，振荡混匀。室温静置5分钟。12000g，4℃，离心15分钟。将上清液小心转入一新的去酶离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇。室温静置10分钟。12000g，4℃，离心10分钟。小心倒去上清，向沉淀中缓慢加入1ml 75％的乙醇。12000g，4℃，离心5分钟。倒去上清，保留沉淀，室温晾干2-5分钟。加入30-100μl适量DEPC水溶解沉淀，测定浓度，置于冰上，备用。
逆转录的操作具体包括：
使用逆转录试剂盒(Takara)将mRNA逆转录为cDNA。按以下成分于冰上配制反应混合液：
5×gDNA Eraser Buffer2μl，gDNA Eraser 1μl，Total RNA 2μl，RNase FreeddH2O 5μl。
将混合液简短离心后，42℃，反应2分钟；再按以下成分继续于冰上配制反应混合液。
上述反应混合液10μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl，RT Primer Mix*4 1μl，5×PrimeScript Buffer 2 4μl，RNase Free ddH2O 4μl。
将混合液简短离心后，37℃，15分钟，然后迅速于85℃反应5秒，再置于冰上。将获得的Caco-2细胞cDNA作为模板，继续以下步骤。
S22：以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
在该步骤中，在PCR扩增的过程中，对于引物的设计和选择按以下操作进行：
从GenBank资料库中获得人OS-9的mRNA序列(NM_001017956)，设计带有酶切位点PacI和PmeI的基因引物：
PacI-OS9-upF:agtcTTAATTAAACCATGGCGGCGGAAACGCTGCTG；
Br-OS9-upR:ATCCTCCTCTGTAGGTTGGGGTGATGGGGGAGG；
Os9-F1:ccatcaccccaacctacagaggaggatcctgagcacagag；
Os9-R1:GCTTGGTGACCCGGACCCGGACTCTGTGCTCAGGATCCTC；
Os9-F2:gggtccgggtcaccaagctccgtctcggaggccctaatca；
Os9-R2:ATCTCGAGGACAGTCAGATCCTGATTAGGGCCTCCGAGAC；
Os9-F3:gatctgactgtcctcgagatgaaacgggaaaacccacagctgaaacaaatcgaggg；
Os9-R3:CCAGCAGCTCCTTCACCAGCCCCTCGATTTGTTTCAGCTG；
Os9-F4:ctggtgaaggagctgctggagagggagggactcacagctg；
Os9-R4:ATTTTGATCTCAATTTTCCCTGCAGCTGTGAGTCCCTCCC；
Br-OS9-downF:acagctgcagGGAAAATTGAGATCAAAATTGTCC；
PmeI-OS9-downR:gtcaGTTTAAACTCAGAAGTCAAATTCGTCCAGG。
引物设计和合成由上海天晶生物技术有限公司协助完成。
使用PCR试剂盒(Takara)按以下成分于冰上配制反应体系：
Premi×Taq 10μl，cDNA0.5μl，Forward Primer 0.5μl，Reverse Primer 0.5μl，RNase Free ddH2O 8.5μl。
将上述反应液简短离心后，按以下表1所示条件进行PCR扩增：
表1 PCR扩增过程中反应条件
引物PacI-OS-9-upF&Br-OS-9-upR扩增上游1.6kb目的片段(退火温度选择60℃)；引物Br-OS-9-downF&PmeI-OS-9-downR扩增下游260bp片段(退火温度选择50℃)；引物OS-9-F1到OS-9-R4基因拼接中间缺失的165bp片段(退火温度55℃)；然后以上面三个PCR产物做模板，用引物PacI-OS-9-upF&PmeI-OS-9-downR，扩增全长OS-9，目的片段2k，退火温度为60℃；PCR产物放置4℃，电泳备用。
电泳和切胶回收的具体操作包括：
称取0.5g琼脂糖，加入20ml 0.5×TBE缓冲液，微波溶解。待溶液温度降至60℃左右，加入Goldview染料，使其终浓度为0.01％。将溶液倒入大孔制胶槽，加入PCR反应液。按电压100V进行电泳35-45分钟。停止电泳，取胶，回收备用。
使用凝胶回收试剂盒(碧云天)进行胶回收；具体的，在紫外灯下，将目的基因条带处的胶切割下，称重，在离心管内用枪头捣碎；加入等体积的溶液I(如胶为100mg，则加100μl溶液I)，涡旋振荡混匀；50-60℃水浴加热约10分钟至胶全融，期间，需涡旋或颠倒混匀3-4次，以加速凝胶融解；加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟；16000g，离心1分钟，倒弃收集管内的液体；在DNA纯化柱内加入700μl溶液II，室温放置1分钟；16000g，离心1分钟，洗去杂质。倒弃收集管内的液体；再加入500μl溶液II，最高速离心1分钟，进一步洗去杂质。倒弃收集管内的液体；16000g，再离心1分钟，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发；将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入30μl溶液III至管内柱面上，放置1分钟；16000g，离心1分钟，所得液体即为高纯度全长OS-9DNA。
S23：将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；
酶切的过程中，按以下成分于冰上配制反应体系：
PacI 1μl，PmeI 1μl，10×buffer 2μl，上述胶回收产物2μg，ddH2O至20μl；37℃，1小时，进行双酶切反应，酶切反应完之后，进行连接，其反应体系如下：
按以下成分于冰上配制反应体系：plenti6.3载体100ng，PCR产物(经过酶切后)1μg，Buffer 1μl，T4 DNA连接酶1μl，ddH2O至10μl，16℃，过夜，连接plenti6.3载体和OS-9基因。
将plenti6.3载体和OS-9基因连接后，进行转化操作，具体的操作为：
取DH5α感受态细胞100μl置于冰浴中；向感受态细胞悬液中加入1μl上述连接反应液，轻轻旋转离心管混匀内容物，于冰浴中静置30分钟；将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟；向离心管中加入900μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)；将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含有氨苄的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开；将平板置于室温直至液体被全部吸收，倒置平板于生化培养箱，37℃培养12-16小时。
S24：对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；
挑取步骤S23中的单克隆菌落，接种于50ml液体LB培养基中；放置37℃恒温摇床，振荡过夜；取30-50ml的菌液，使用无内毒素质粒抽提试剂盒(Omega)进行质粒提取；室温下3500-5000g离心10分钟收集细菌；倒去培养基，加入2.5ml Solution I/RNase A混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；往重悬液中加入2.5ml Solution II，轻轻颠倒混匀7-10次，室温放置2分钟；加入1.25ml冰浴Buffer N3，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮状沉淀；把HiBind中量柱套在收集管中，加入2ml Buffer GPS至柱子中，静置3-10分钟。
室温3500-5000g离心5分钟，去掉滤液；将裂解液倒进针筒过滤器中(针筒开口朝上，下面出口处接收集管)，静置2分钟；插入并轻推活塞使裂解液流进收集管中；在过滤澄清的裂解液中，加入1/10体积的ETR,颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴10-20分钟；42℃水浴5分钟后，25℃，3500-5000g离心5分钟，ETR溶液将在管底形成蓝色分层；转移上清液至离心管，加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后室温静置1-2分钟；将HiBind中量柱套在15ml离心管中，转移20ml混合液至柱子内，室温，3500-5000g离心3-5分钟，倒去滤液；重复操作，直至将剩余的过滤液全部从柱子滤出；把柱子重新装回收集管，加入3ml HB Buffer，按上述条件离心，倒去滤液。
把柱子重新装回收集管，加入3.5ml DNA Wash Buffer，按上述条件离心，倒去滤液；重复操作；把柱子重新装回收集管，最大速度(<6000g)离心10-15分钟，甩干柱子；把柱子装在干净的15ml离心管上，加入70℃预热的0.5-1ml Endotoxin-Free Elution Buffer，室温静置2分钟，以最大速度离心5分钟，获得plenti6.3-OS-9质粒。
S25：以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
该步骤具体为慢病毒包装的步骤，在具体操作时，为了提高所所制成细胞株的生化特性，优选按照以下操作进行。
(1)病毒转染：
转染前一天，取生长状态良好的293T细胞，弃旧培养液，加入2ml PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液；每皿加入1ml胰酶消化液，消化约1min直到细胞收缩、变圆，吸弃胰酶，加入3ml DMEM+10％FBS培养基，用枪吹打数次，将皿底的细胞冲洗下来，重悬均匀；按1:5的比例传至poly-(D-lysine)(PDL)包被的10cm皿中，8.5ml DMEM+10％FBS，37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养约24h；
转染当天，观察细胞状态，细胞状态良好，贴壁牢，密度在50-70％时即可用于转染；
转染时，向无菌的1.5ml离心管中加入500μlDMEM，然后向其中加入所制备的各DNA溶液：plenti6.3-OS-9质粒6μg，包装质粒Packaging Mix 6μg(psPAX2:pMD2.G＝3:1)，混合均匀，在室温下温育5分钟；同时，在另一无菌的1.5ml离心管中加入500μl Opti-MEM，向其中加入Lipo2000转染试剂24μl，轻轻混匀，室温下温育5分钟；把稀释后的DNA与稀释后的Lipo2000转染试剂混合，轻轻地颠倒混匀，室温下孵育20分钟，以形成DNA与转染试剂的复合物；取1ml DNA与Lipo2000转染试剂混合液均匀地滴加在293T细胞的培养液中，在超净工作台平面上轻轻的将平皿正向画8字四次，反省画8字四次，使培养基与转染混合液摇匀，于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养。
(2)病毒收获：
转染后48小时，收集293T细胞上清液(第一次收液)，4℃暂存；细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至72h，收集病毒上清；细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至96h，收集病毒上清；将病毒上清液3000转，离心15分钟，0.45μm过滤，病毒滴度测定后-80℃保存。
(3)病毒滴度测定(荧光显微镜观察法)：
感染前一天，用胰酶消化细胞并计数，准备5×105细胞/ml的293T细胞接种24孔板，每孔0.5ml；细胞接种后第二天，根据病毒的预期滴度，准备10个无菌的EP管，10倍倍比稀释慢病毒浓缩液；
15μl慢病毒原液+135μl DMEM→10-1病毒液
15μl 10-1病毒液+135μl DMEM→10-2病毒液
15μl 10-2病毒液+135μl DMEM→10-3病毒液
以此类推，做十个稀释度(10～10-8)；
细胞换液，每孔内加入400μl无抗生素的DMEM+10％FBS培养液，除control组外其余各孔均加入polybrene至终浓度为8μg/ml；各感染孔内分别加入相应稀释度的病毒液及病毒原液100μl，放入37℃、5％CO2的培养箱内；感染24小时后，换液，每孔内加入500μlDMEM+10％FBS+1％P/S+1％Glutamax，继续放回培养箱内进行孵育；
感染72h后观察荧光表达情况，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液含量(μl)。
(4)病毒感染：
感染前一天，接种Caco-2细胞于24孔板，每孔3×104个，培养24h后；将收集的病毒上清液37℃复温，选取合适的病毒滴度，按病毒液：培养基＝1:1比例加入培养板；加入polybrene(终浓度8μg/ml)，培养48小时，显微镜下观察。
(5)阳性细胞筛选：
在每孔加入5μg/ml的杀稻瘟菌素，以致死重组不成功的细胞；每隔两天，换液，加入新的杀稻瘟菌素，持续10-15天，获得持续稳定高表达OS-9的Caco-2细胞株；按常规细胞传代培养并保种。
此外，通过该实施例构建的OS-9过表达稳定细胞株进行鉴定，具体的，于倒置荧光显微镜下观察，图4中，A所示，转染成功的细胞荧光明显。利用western blot方法检测该细胞株中os-9表达情况，如图4中，B所示，os-9的表达明显增强.
应用例1
将本发明实施例2构建成的高表达OS-9的细胞株进行western blot检测紧密连接蛋白变化，具体包括以下步骤：
1、将细胞株分为四组进行实验，分别为：对照组(control)、缺氧组(hypoxia)、OS-9高表达组(OS-9)和OS-9缺氧组(OS-9+hypoxia)。
其中，缺氧操作的条件为：倒去细胞瓶中的培养基，用PBS洗涤3次；加入无血清MEM培养基，放入低氧培养箱，1％O2，、5％CO2，37℃培养8小时。
2、提取蛋白
将各实验组细胞用预冷PBS洗3遍，用吸水纸尽量吸干PBS；加入1ml RIPA裂解液和10μl PMSF(博彩生物)，滴管吹打均匀，置于冰上30min；将样品转移至1.5ml离心管，4℃，20000g，离心30min；小心吸取上清，转移至干净1.5ml离心管，测定蛋白浓度后，-20℃保存，备用；
3、制胶
根据紧密连接蛋白claudin-1和occludin的分子大小，分别制作分离胶浓度10％和12％的SDS-PAGE凝胶；
10％凝胶配制：1.9ml水，1.7ml 30％丙烯酰胺溶液，1.3ml1.5mol/LTris(pH8.8)，50μl 10％SDS，50μl 10％过硫酸氨，2μl TEMED。
12％凝胶配制：1.6ml水，2ml 30％丙烯酰胺溶液，1.3ml1.5mol/LTris(pH8.8)，50μl 10％SDS，50μl 10％过硫酸氨，2μl TEMED。
按上述比例加好分离胶溶液，迅速混匀后小心加入胶槽(留梳齿+1cm长以备加积层胶)，避免气泡；加入双蒸水迅速封闭液面，避免氧气进入；静止至少半小时，待分离胶凝固(分离胶与去离子水界面清晰可见一条分离线)；取下胶槽，倒出上层水，用滤纸小心吸干；再配制积层胶溶液：1.4ml水，330μl 30％丙烯酰胺溶液，250μl1.0mol/LTris(pH6.8)，20μl 10％SDS，20μl 10％过硫酸氨，2μl TEMED；将积层胶溶液迅速混匀后加入分离胶上方，小心插入梳子，不能有气泡；静止至少半小时，待积层胶凝固，准备电泳。
4、电泳
电泳前，将蛋白样品和5×上样缓冲液混合，100℃煮沸5min变性；取下制胶槽双层玻片放入垂直电泳槽，加入1×甘氨酸电泳缓冲液，内槽缓冲液面高于矮的玻片，外槽也加入1×甘氨酸电泳缓冲液；先80V电压，直至肉眼可见溴酚蓝跑过积层胶，然后加大电压至100V，直至溴酚蓝跑到接近凝胶底部，停止电泳；取出制胶槽双层玻璃，去离子水冲洗，小心用刮勺刮开双层玻璃，再用刮勺定量切去上端积层胶，下端上样缓冲液指示剂，左右两端多余泳道，小心用刮勺将胶放入盛有转印缓冲液的小培养皿中，准备转膜。
5、转膜
裁剪和凝胶大小一致的滤纸2张，在转印缓冲液中润湿；裁取一张略大于凝胶的PVDF膜，用镊子将膜在甲醇中快速浸泡约10秒，然后夹至滤纸上，再把凝胶放于膜上，最后用另一张滤纸盖住，赶去中间的气泡，做成“三明治”样；用纱布浸湿电转液擦拭半干转印仪，把“三明治”放在电转仪中央，凝胶放在负极面，膜在正极面；开启电源，开始转膜，恒压12V，30min-60min。
6、封闭
预先配制好TBST缓冲液：Tris碱4.84g，Nacl 16g，去离子水定溶至1900ml，PH值调至7.6，加入Tween-202ml，终浓度1‰，加去离子水定溶至2000ml；用TBST溶液配制5％的脱脂奶粉，充分溶解后，将膜取出放于奶粉溶液中，置于摇床常温平缓摇动1-2小时。
7、孵抗体
根据抗体稀释度，用TBST或者封闭液配好一抗，做一略大于膜的封口袋；取出膜，不要漂洗，放入封口袋中，加入一抗，4℃孵育过夜；取出膜，用TBST漂洗5min×3次，加入二抗，置于摇床常温平缓摇动1-2小时。
8、显色
取出膜，用TBST漂洗10min×3次；根据ECL发光试剂盒说明，滴加等体积的发光试剂A和B，混匀，加于膜表面，1-5min，凝胶成像系统照相即可。
实验结果
无论是正常情况还是缺氧条件下，OS-9过表达组的紧密连接蛋白claudin-1和occludin都比对照组明显升高，*p<0.05，有显著性差异，结果如图1所示。其中，A为westernblot实验结果，B图为western blot结果的定量统计分析。
应用例2
将本发明实施例2构建成的高表达OS-9的细胞株进行免疫荧光检测紧密连接蛋白变化，具体包括以下步骤：
1、将细胞株分为四组进行实验，分别为：对照组(control)、缺氧组(hypoxia)、OS-9高表达组(OS-9)和OS-9缺氧组(OS-9+hypoxia)。
2、将各实验组Caco-2细胞接种于激光共聚焦培养皿，放置细胞培养箱培养48小时，hypoxia组和OS-9+hypoxia组再分别缺氧8小时；取出，用PBS洗涤3次；加入4％多聚甲醛室温固定10-15分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟；加入3％H2O2，室温，10分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟；滴加封闭血清，室温封闭30分钟；滴加一抗，4℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5分钟；避光下，滴加荧光二抗，37℃避光孵育1小时；避光下，PBS洗涤3次，每次5分钟；避光下，滴加DAPI染液，室温，5分钟；避光下，双蒸水洗涤3次，每次5分钟；加入PBS，装入湿盒，待激光共聚焦显微镜观察。
实验结果
免疫荧光再次证实无论是正常情况还是缺氧条件下，OS-9过表达组的紧密连接蛋白claudin-1和occludin荧光强度都明显强于对照组，结果如图2所示。
应用例3
本发明实施例2构建成的高表达OS-9的细胞株与肠上皮细胞跨上皮电阻检测肠粘膜屏障通透性关系检测，具体包括以下步骤：
细胞株以2×104个/孔接种到24孔板的Transwell小室内，另外留一孔作为空白对照，不接种细胞；每天更换培养基，并用Millicell ERS-2电阻测定仪测定细胞的跨上皮电阻(TER)；培养5-7天，待TER稳定后分别实施例2中的分组实验，分别于缺氧前后测定TER值；
按照公式计算最终TER值：Rcell monolayer＝(Rsample-Rblank)/0.3，即以原始数值减去空白对照数值，再除以Transwell小室面积。
实验结果：
缺氧条件下，OS-9过表达组的肠上皮细胞跨膜电阻降低明显少于正常肠上皮细胞，说明在缺氧情况下，OS-9的高表达减弱了肠上皮屏障的损伤程度，*p<0.05，有显著性差异。结果如图3所示。
通过应用例1-3可知，过表达OS-9细胞株，其紧密连接蛋白表达量(claudin-1和occludin)与对照组相比，无论是在缺氧还是正常的情况下均明显提高，而且OS-9过表达细胞株的肠上皮细胞跨膜电阻降低明显少于正常肠上皮细胞(说明在缺氧情况下，OS-9的高表达减弱了肠上皮屏障的损伤程度)，因此，该细胞株可以应用在制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中，以期通过提高claudin-1和occludin表达量，增强对肠粘膜屏障的保护。
综上，本发明提供的能够实现OS-9过表达，极大的方便了在研究OS-9过表达的状态下，其他功能性蛋白的表达情况，为OS-9过表达与其他功能性蛋白表达的关系的相关研究提供了理想的实验材料；该高表达OS-9的细胞株，可通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。该构建方法在获取全长OS-9基因的过程中，对于引物进行特定的选择，而且在PCR的过程中，用不同的引物扩增，获取不同目的片段，然后再以所获的目的片段为模板再次扩增，非常利于全长OS-9基因的获取。此外，该细胞株在高表达OS-9的过程中，其可明显提高紧密连接蛋白(claudin-1和occludin)的表达量，而且还可降低对肠粘膜通透性的破坏，因此用于制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中，以预防和治疗肠粘膜疾病。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.稳定高表达OS-9的细胞株在制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中的应用，其特征在于，所述稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法包括：将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
1)、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；
2)、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
3)、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；
4)、对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；
5)、以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物；
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游扩增引物如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：12所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括如下步骤：
以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；
以3个扩增产物为模板，以如SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4所示序列为引物，进行扩增。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3)中，所述酶切反应的体系为：PacI0.8-1.2μl，PmeI 0.8-1.2μl，10×buffer 1.8-2.2μl，OS-9基因1.8-2.2μg，ddH2O补至20μl。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3)中，所述连接的过程中采用T4DNA连接酶，且反应温度为15-17℃。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，在步骤5)中，具体包括：
a)、将plenti6.3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6.3-OS-9质粒；
b)、将所述稀释后plenti6.3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25分钟，得到DNA与转染试剂复合物；
c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38℃、4-6％的CO2的条件下分段培养90-100小时后，离心，过滤，得到病毒液；
d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高表达OS-9的细胞株。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤c)中，所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；所述过滤的过程中，滤径为0.4-0.5微米。
9.权利要求1-8任一项所述的应用中构建获得的稳定高表达OS-9的细胞株在制备通过提高claudin-1和occludin的表达量增强肠粘膜屏障功能的药物中的应用。
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