CN101265484B

CN101265484B - 起搏通道基因亚型hcn2重组慢病毒载体的构建方法

Info

Publication number: CN101265484B
Application number: CN2008100237825A
Authority: CN
Inventors: 杨向军; 周亚峰; 李红霞; 韩莲花; 蒋文平
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2008-04-18
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: CN101265484A

Abstract

本发明公开了一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒。本发明将带有HCN2基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2与慢病毒一起建立HCN2重组病毒载体，成为慢性心律失常的细胞治疗和基因治疗的基础。

Description

起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法

技术领域

本发明涉及一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法。

背景技术

哺乳动物基因组编码四种HCN基因，分别命名为HCN1～HCN4。这四种异构体在心脏中均已发现，但不同种属、不同心脏组织和发育不同阶段这些异构体的表达存在差异：不同种属成年动物窦房结均优势表达HCN4，约占窦房结总体HCN的80％。在四种异构体中HCN1，2，4是心脏中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达。起搏活性小的区域(如心室肌)，HCN2的表达占优势；而起搏活性高的区域HCN4的表达占优势。目前对于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。

目前的研究大多使用腺病毒表达系统来初步探讨生物起搏的可行性；虽然此类研究也获得了较大的成就，但由于腺病毒表达系统具有高免疫原性，其病毒基因组游离于宿主基因组外，所以只能瞬时表达外源基因，国外体内的研究仅仅持续了3-10天，这就限制了它的发展。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，该病毒既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性，这是其最为突出的优点。可见慢病毒可能是基因治疗的最佳载体，以后的发展趋势也许是利用慢病毒为载体，结合细胞治疗和基因治疗；把起搏基因HCN1-4转到干细胞中，增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。而构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，将带有HCN2基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2与慢病毒一起建立HCN2重组病毒载体，成为慢性心律失常的细胞治疗和基因治疗的基础。

本发明的技术方案是：一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒。

本发明进一步的技术方案是：一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒；

所述穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤：

(1)将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Puc19质粒中，构建质粒Puc19-HCN2

(2)将目的片段HCN2基因从质粒Puc19-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2；

(3)将目的片段HCN2基因从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒中，构建穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2。

所述构建方法还包括将穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2与慢病毒系统混合重组后的HCN2慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞，获得病毒液。

本发明优点是：慢病毒是逆转录病毒的一种，其既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性。构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。如果把带有起搏基因HCN2的片段重组到慢病毒中，进而再转到干细胞中，可以增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。

附图说明

图1为慢病毒包装系统质粒图谱；

图2为转染293T细胞24小时后的荧光照片(放大倍数250×)；

图3为Western blot蛋白电泳图，转染：转染细胞；空：未转染细胞；

图4为HCN2 real-time RT-PCR实时定量检测结果曲线；

图5为HCN2重组慢病毒载体的构建及转染流程示意图；

图6a为本发明阳性克隆质粒的测序报告第一部分；

图6b为本发明续图6a的阳性克隆质粒测序报告的第二部分。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒；

将全长约3.0kb的hHCN2目的序列从pCDNA3-hHCN2质粒(我们实验室以前构建)卸载下来，最终装载到带有免疫荧光蛋白的质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上，构建穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2，所述穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤：

(1)将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Puc19质粒中，构建质粒Puc19-HCN2；

具体实施例：

一、穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2的构建：

hHCN2的目的序列插入于pcDNA3载体上，插入的位点为EcoR I和Xba I，首先用EcoR I和Xba I从pCDNA3-hHCN2质粒切下目的片段连接到Puc19载体中，再用EcoR I和Hind III从质粒Puc19切下目的片段连接到pcDNA3.1(A)载体中，再用Xba I单酶从质粒pcDNA3.1(A)双切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。最终将阳性质粒送上海生工进行基因测序鉴定，观察hHCN2基因是否插入穿梭质粒。

1.准备工作：pCDNA3-hHCN2、Puc19、pcDNA3.1(A)pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒的抽提

采用碱裂解法小量抽提质粒。首先配置以下溶液：

溶液I(P1) 溶液II(P2) 溶液III(P3)

Buffer P1(resuspension buffer)50mM Tris-Cl，pH 8.0；10mM EDTA；15-25℃。

Buffer P2(lysis buffer)200mM NaOH，1％SDS(w/v)15-25℃。

Buffer P3(neutralization buffer)3.0M乙酸钾(potassium acetate)，pH 5.5，15-25℃或者2-8℃

RNase A(10mg/ml)用前煮沸10分钟灭活。

a)抽质粒的前一晚接菌于3ml抗性LB中，240rpm，37℃摇过夜。

b)倒菌液于1.5ml EP管中，12,000rpm，30秒。去上清(可以倒置纸上敲，至沉淀散开，并可以用溶液I洗一次沉淀。)

c)加200ul溶液I，同时加适量RNaseA(2ul)

d)加200ul溶液II，缓慢倒置6-8次，至溶液澄清。

e)加200ul溶液III，缓慢倒置6-8次，产生白色沉淀。

f)12,000rpm离心5min，取上清，加等体积氯仿，混匀。

g)12,000rpm离心5min，取上清，加360(0.6V)异丙醇。

h)12,000rpm离心10分钟，1ml 70％乙醇洗沉淀。

i)晾干5-10分钟。

j)无菌水30ul溶解沉淀，-20℃保存。

所得质粒于1％琼脂糖凝胶电泳。

2.开始穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2的构建

(1)将目的片段从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Puc19质粒中，构建质粒Puc-19-HCN2

1)对带有目的片段的pcDNA3-HCN2和Puc19用EcoR I和Xba I进行顺序双酶切(由于EcoR I和Xba I没有适合的双酶切buffer，因此采用顺序酶切)：

a)Xba I酶切体系如下：

Xba I(20U/μl) 1μl

NEBuffer 2(10×) 3μl

pcDNA3-HCN2/Puc19(500ng/μl) 2μl

dH₂O 24μl

Total 30μl

反应条件如下：37℃、6小时；

b)将单酶切产物进行乙醇沉淀：

30ul酶切体系中加入3ul 3M乙酸钠(pH5.2)，再加入70ul无水乙醇，-20℃沉淀30分钟；10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀进行下一步酶切反应；

c)EcoR I酶切体系如下：

EcoR I(20U/μl) 1μl

NEBuffer EcoR I(10×) 3μl

pcDNA3-HCN2/Puc19(500ng/μl) 2μl

dH₂O 24μl

Total 30μl

反应条件如下：37℃、6小时。

2)对酶切载体和目的基因片段进行凝胶电泳后回收，由于紫外线会造成碱基突变，因此在该步骤中不进行拍照，直接切胶回收，回收方法如下：

a)在紫外灯下，用干净的手术刀将目的片断条带切下，放于干净的1.5ml离心管中，尽量不要切到多余的凝胶；

b)称重，加三倍体积的Buffer QG到离心管中，即每100mg凝胶加300ulBuffer QG；

c)将离心管放于50℃水浴中，放置10分钟，直至凝胶完全融解，期间每两、三分钟晃动离心管一次；

d)观察凝胶溶液的颜色，如果为橙色或紫色，则添加5ul 3M的NaAC(pH5.2)；

e)加100ul，即一倍凝胶体积的异丙醇于凝胶溶液中，将凝胶混合液加入到QIAquick spin column中，将回收柱插于2ml废液收集管中，13,000rpm离心一分钟；

f)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，柱中添加0.5ml Buffer QG，13,000rpm离心一分钟；

g)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，柱中添加0.75ml Buffer PE，放置2-5分钟，13,000rpm离心一分钟；

h)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，13,000rpm离心一分钟；

i)将回收柱取下插入干净的1.5ml离心管中，柱中加入50ulBuffer EB(10mM Tris-Cl，pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2-5分钟，13,000rpm离心一分钟；若想获得更多量的回收产物，可以重复该步骤一次；1.5ml离心管中则为回收产物。

3)将回收的双酶切的Puc19和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作：

a)连接体系如下：

线性化Puc19 2μl

双酶切目的基因 4μl

1 0×buffer 1μl

ATP 1μl

Ligase 0.7μl

dH₂O 1.3μl

Total 10μl

b)反应条件：室温连接8分钟；

4)将连接产物转化大肠杆菌，涂布Amp⁺LB平板，37℃过夜培养：

a)取-80℃保存的DH5α感受态细菌，冰浴放置5-10分钟，使之冰中融化；

b)将5ul连接产物加入感受态细菌，用移液枪缓慢混匀，冰浴放置30分钟；

c)将混有连接产物的感受态细菌放入42℃水浴中，热击90秒，冰浴2分钟；

d)将转化产物加入900ul的SOC培养基中，37℃、150rpm摇床培养1小时；

e)3,000rpm离心2分钟，弃上清，加入200ul LB培养基重悬细菌涂布Amp⁺LB平板。

其中根据BIOSCIENCES试剂盒说明书制备感受态细菌，过程如下：

a)取DH5α甘油菌种，在LB平板中划线，37℃培养箱中培养过夜；

b)挑取一个单克隆接种入0.5ml LB培养基中，240rpm，37℃摇床培养过夜；

c)将过夜培养的0.5ml菌液转移到50mlSOB培养基中，240rpm，25℃摇床培养，直至OD600在0.4-0.6之间；

d)将培养细菌的锥形瓶放于冰上冷却10分钟；

e)将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，2,500×g，4℃离心6分钟；

f)弃上清，用5ml冰上预冷的1×wash buffer重悬沉淀，2,500×g，4℃离心6分钟；

g)弃上清，用5ml预冷的1×competent buffer重悬沉淀；

h)小量分装，每管100ul，快速放入液氮中；

i)-80℃保存，备用。

5)挑取单菌落，接种于5ml Amp⁺LB液体培养基中，37℃、250rpm摇床培养过夜；使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，根据Axygen试剂盒说明书质粒抽提步骤如下：

a)过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000×g离心1分钟，彻底去除上清；

b)加入250μl Beffer S1，振荡器充分重悬细菌；

c)加入250μl Beffer S2，颠倒混匀4-6次；注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染；

d)加入250μl Beffer S2五分钟内加入350μl Solution III，轻轻颠倒混匀6-8次；

e)12,000×g，离心10分钟；将上清转移到Miniprep柱中，Miniprep柱插于废液收集管中，12,000×g离心1分钟；注意：不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；

f)弃收集管中的废液，将Miniprep柱插于收集管中，加700μl Buffer W2到Miniprep柱中，12,000×g离心1分钟；重复该步骤一遍；

g)弃收集管中的废液，将Miniprep柱放入同一支收集管中，12,000×g离心1分钟彻底去除Buffer W2；

h)将Minipre柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50μl Eluent，室温放置1分钟后，12,000×g离心1分钟；离心管中的溶液即为所抽提的质粒，抽提后质粒浓度统一调整为500ng/ul。

(2)将目的片段从质粒Puc19-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2

1)对带有目的片段的Puc19-HCN2和pcDNA3.1A用EcoR I和Hind III进行双酶切(由于EcoR I和Hind III没有适合的双酶切buffer，因此采用顺序酶切)：

a)酶切体系如下：

Hind III(20U/μl) 1μl

NEBuffer 2(10×) 3μl

Puc19-HCN2/pCDNA3.1A(500ng/μl) 2μl

dH₂O 23μl

Total 30μl

反应条件如下：37℃、6小时；

b)将单酶切产物进行乙醇沉淀：

c)EcoR I酶切体系如下：

EcoR I(20U/μl) 1μl

NEBuffer EcoR I(10×) 3μl

pcDNA3-HCN2/Puc19(500ng/μl) 2μl

dH₂O 24μl

Total 30μl

反应条件如下：37℃、6小时。

2)对酶切载体和目的基因片段进行凝胶电泳后回收，由于紫外线会造成碱基突变，因此在该步骤中不进行拍照，直接切胶回收，回收方法同步骤(1)中2)项所述；

3)将回收的双酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作：

a)连接体系如下：

线性化pCDNA3.1A 1μl

双酶切目的基因 5μl

10×buffer 1μl

ATP 1μl

Ligase 0.7μl

dH₂O 1.3μl

Total 10μl

b)反应条件：室温连接8分钟。

4)将连接产物转化大肠杆菌，涂布Amp⁺LB平板，37℃过夜培养，方法同步骤(1)中4)项所述；

5)挑取单菌落，接种于5ml Amp+LB液体培养基中，37℃、250rpm摇床培养过夜；使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，方法同步骤(1)中5)项所述；

(3)将目的片段从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒中，构建质粒pCDH1-GFP-HCN2

1)对带有目的片段的pcDNA3.1A-HCN2和pCDH1-MCS1-EF1-copGFP(以下简写为pCDH1-GFP)用Xba I进行单酶切：

a)酶切体系如下：

Xba I(20U/μl) 1μl

NEBuffer 2(10×) 3μl

pcDNA3.1A-HNC4/pCDH1-GFP(500ng/μl) 2μl

dH₂O 24μl

Total 30μl

b)反应条件如下：37℃、6小时。

3)将回收的单酶切的pCDH1-GFP和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作：

a)连接体系如下：

线性化pCDH1-GFP(0.1ug/ul) 1μl

单酶切目的基因 5μl

10×buffer 1μl

ATP 1μl

Ligase 0.7μl

dH₂O 1.3μl

Total 10μl

b)反应条件：室温连接8分钟。

5)挑取单菌落，接种于5ml Amp⁺LB液体培养基中，37℃、250rpm摇床培养过夜；使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，方法同步骤(1)中5)项所述；

6)将阳性克隆质粒送上海生工测定基因序列。

(4)使用Qiagen小抽试剂盒抽提pCDH1-GFP-HCN2穿梭质粒用于后续的慢病毒包装实验

1)吸取10ul阳性克隆的菌保接种于2-5ml Amp⁺LB培养基中，37℃、300rpm摇床培养8小时；

2)将步骤1)中培养的菌液按1/500或1/1000接种到Amp⁺LB中，即3-6ul菌液接种于3ml Amp⁺LB中，37℃、300rpm摇床培养12-16小时；

3)菌液转移至1.5ml离心管中，4℃、6000×g离心15分钟；

4)弃上清，加0.3ml含有RNase A的Buffer P1重悬细菌沉淀，振荡、充分重悬；

5)加入0.3ml Buffer P2，颠倒混匀4-6次，不能振荡混匀，以免出现基因组污染，室温放置5分钟；

6)加入0.3ml预冷的Buffer P3，颠倒混匀4-6次，冰上放置5分钟；

7)4℃、20,000×g离心10分钟，将上清转移至干净的离心管中；重复该步骤一次；

8)将1ml Buffer QBT加入QIAGEN-tip 20中，Buffer靠重力作用流过QIAGEN-tip 20以平衡QIAGEN-tip 20；

9)将步骤7)中的上清加入到QIAGEN-tip 20中，溶液靠重力作用流出，质粒DNA则结合在QIAGEN-tip 20的膜上；

10)用2ml Buffer QC洗QIAGEN-tip 20两次；

11)用500ul Buffer QF将质粒从QIAGEN-tip20的膜上洗脱下来。

12)取1-2ul用分光光度计测定质粒浓度，用无菌水将质粒浓度调整为0.5ug/ul，以备后续构建病毒载体实验用。

(5)将阳性克隆质粒送上海生工测序，测序结果表明，与GENEBANK目的基因序列完全相同，表明成功构建pCDH1-GFP-HCN2穿梭质粒。测序报告如图6a和图6b所示。

二、使用穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2包装构建起博通道基因亚型HCN2重组慢病毒：

实验过程参照SBI的Lentivector Expression System的操作手册进行；

慢病毒包装系统：pPACKH1-Lentivector Packaging Kit(SBI)三个包装质粒图谱见图1；操作流程图如图5所示，具体操作过程如下：

1.假病毒颗粒的包装(包装产生的假病毒颗粒中含有携带目的基因的穿梭质粒)

1)转染前2-3天，D-MEM完全培养基培养293T细胞株。转染前一天，接种293T细胞到新的10cm培养皿，接种量约为5×10⁶，完全吹散细胞，充分混匀，使细胞均匀分布。转染时，细胞铺满培养皿的50-70％；

2)将2μg(浓度为500ng/μl)携带目的基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2同10μg(浓度为500ng/ul)慢病毒包装质粒混合物混合，将混合的质粒稀释到750μl Opti-MEM培养基中，充分混匀，室温孵育5分钟；

3)将60μl Lipofectamine 2000TM转染试剂稀释到750μl Opti-MEM培养基中，轻轻地混匀，室温孵育5分钟；

4)将稀释的Lipofectamine 2000 TM试剂逐滴加入到质粒-Opti-MEM混合液中，轻轻地上下颠倒混匀，室温孵育20分钟；

5)在第4步孵育形成转染混合物的同时，用10ml Opti-MEM洗293T细胞一次，然后加入8.5ml含2％血清不含抗生素的D-MEM培养基；

6)将第4步中产生的质粒-Lipofectamine 2000TM混合物加入第5步处理后的培养皿中，轻轻地混匀使转染复合物均匀分布在培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养；

7)6小时后，用新鲜的含抗生素和2％血清的D-MEM培养基替换掉含有转染混合物的培养基，继续培养48小时；

8)收集转染后24和48小时的上清液；用含2％血清不含抗生素的D-MEM培养基替换掉上清液；

注意：观察培养基的颜色，培养24小时后和48小时后，由于293T细胞的代谢活性，会引起培养基颜色变黄(呈酸性)；

9)将含有假病毒颗粒的培养基3000rpm室温离心5分钟，去除细胞碎片，然后将上清用Millex-HV 0.45μm的PVDF滤膜过滤；过滤后的病毒液用于后续的转染基质干细胞研究。

2.将构建的慢病毒转染293-T细胞，并将稳定转染的细胞扩大培养，当细胞培养到足够量时，收集细胞RNA和蛋白用于实时定量PCR鉴定和Western Blot鉴定。

3.原代细胞和稳转细胞继续培养两周后行Western blot鉴定蛋白的表达：

蛋白抽提方法：

1)从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。

2)预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。

3)配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液，5μl PMSF和5μl磷酸酶混合液)。

4)细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(10⁷个细胞中加入1ml抽提试剂；5×10⁶个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，轻轻摇动5分钟。

5)用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。

6)裂解液于预冷的离心机中14,000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。使用上清液5ul上样，凝胶蛋白电泳。

4.原代细胞和稳转细胞继续培养两周行real-time RT-PCR实时荧光定量检测：

1)RNA抽提：

Trizol RNA抽提及质量检测方法和步骤：

a)匀浆

转基因细胞培养两周后，离心沉淀细胞。加入1ml TRIZOL试剂，使用匀浆器破碎细胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL试剂进行裂解前清洗细胞，因为清洗会很可能导致mRNA的降解。

b)两相分离

匀浆后样品于15~30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15~30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

c)RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15~30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

d)RNA清洗

移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。

e)重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5~10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A_260/280比值将小于1.6。

f)变性琼脂糖凝胶电泳

i)制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。

10×MOPS电泳缓冲液：

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

ii)准备RNA样品

取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

iii)电泳

上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

2)以提取的RNA为模板合成cDNA：

a)配制退火混合物

RNA 3μg

0.5ug/ul Oligo(dT)₁₈ 1μl

加无RNA酶的H₂O至总体积 10μl

混合液在70℃水浴3分钟，降到37℃放置10分钟。

b)RT反应液

5×RT缓冲液4μl

2.5mM dNTP混合液4μl

RNA酶抑制剂1μl

MMLV反转录酶1μl

混合后37℃恒温1分钟

c)加10μl的RT反应液到10μl退火混合物中，37℃水浴60分钟，加热到95℃维持5min。得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。

3)合成的cDNA用于实时定量PCR

a)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板

i)针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：

dNTP(2.5mM each) 2.5μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

MgCl₂溶液 1.5μl

Taq聚合酶 1units

10uM的PCR特异引物F 1μl

10uM的PCR特异引物R 1μl

cDNA 1μl

加水至总体积为 25μl

轻弹管底将溶液混合，40个PCR循环(94℃，20秒；退火温度，20秒；72℃，30秒)；72℃延伸5分钟。

ii)PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

iii)将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7这几个梯度浓度的DNA。

4)进行Real time PCR反应

a)几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Real time PCR反应体系。

体系配置如下：

dNTP(2.5mM each) 2.5μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

MgCl₂溶液 1.5μl

Taq聚合酶 1units

Sybergreen I 终浓度0.25×

10uM的PCR特异引物F 1μl

10uM的PCR特异引物R 1μl

cDNA or DNA 1μl

加水至总体积为 25μl

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

b)步骤1配置的PCR反应溶液置于Real time PCR仪上进行PCR反应。

GAPDH：95℃，5min；35个PCR循环(95℃，10秒；58℃，15秒72℃，20秒；85℃(收集荧光)，5秒)。为了建PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5秒升高1℃)；

HCN2：95℃，5min；35个PCR循环(95℃，10秒58℃，15秒；72℃，20秒；85℃(收集荧光)，5秒)。为了建PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5秒升高1℃)。

表1实时定量PCR使用引物列表

基因名	双向引物序列	退火温度(℃)	产物长度(bp)
				GAPDH	F：5’AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3’R：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’	59	203

HCN2

F：5’GACGGCTCCTACTTTGG3’R：5’GGTGGGTGAGGGCTAT3’

59

433

5.结果：

(1)将带有目的基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2同慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞后，培养24小时，可以发现大量的荧光出现，如图2所示。

(2)提取蛋白后进行Western blot的蛋白鉴定结果如图3所示。

(3)各样品的目的基因和管家基因分别进行Real time PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。标准曲线法的相对定量(见图4)此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物(对照组)的量，即参照物(对照组)是1倍的样本，其它的样本为参照物量的n倍。实时定量PCR时各样品加样量均为1μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因GAPDH(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参得值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。待测基因以内参校正。结果显示稳转细胞的RNA是原代细胞的123倍。

表2内参校正列表

样品编号	GAPDH	HCN2	HCN2/GAPDH	以Cell为对照
					cell	8.70E-02	8.62E-06	9.91E-05	1.00
HCN2	9.76E-02	1.19E-03	1.22E-02	123.00

HCN2 real-timePCR实时定量检测如图4所示。以上结果表明已成功构建起博通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体。

慢病毒是逆转录病毒的一种，其既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性。构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。如果把带有起搏基因HCN2的片段重组到慢病毒中，进而再转到干细胞中，可以增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。

Claims

1.一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统混合重组建立HCN2重组病毒载体，其特征在于：所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒；

所述穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤：

(1)通过限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Puc19质粒中，构建质粒Puc19-HCN2；

(2)通过限制性内切酶EcoR I和Hind III将目的片段HCN2基因从质粒Puc19-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2；

(3)通过限制性内切酶Xba I将目的片段HCN2基因从pcDNA3.1A-HCN2中双酶切切下，连接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒中，构建成所述穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2。

2.根据权利要求1所述的起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法还包括将穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2与慢病毒包装系统混合重组后的HCN2慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞，获得病毒液的步骤。