CN109266668A - 一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法 - Google Patents

一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法 Download PDF

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CN109266668A CN201710579974.3A CN201710579974A CN109266668A CN 109266668 A CN109266668 A CN 109266668A CN 201710579974 A CN201710579974 A CN 201710579974A CN 109266668 A CN109266668 A CN 109266668A
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Abstract

本发明公开了一种高通量启动子捕获系统，其是将基因组随机片段插入到BamHI/HindIII双酶切的Pro‑free‑trap载体中，从而得到了各类瞬时转染启动子筛选系统Pro‑DNA‑Trap。通过酶标仪对潜在的启动子片段(随机基因组DNA)、已知启动子CMV和空载体进行碱性磷酸酶报告基因活性检测，若重组质粒表达一种碱性磷酸酶，则能与底物对硝基苯磷酸二钠发生显色反应，通过检测后可知该潜在启动子序列是否具有启动子活性。

Description

一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物技术、基因工程和遗传工程领域，是一种适用于各种转染、转化细胞的高通量捕获启动子及增强子的方法。主要涉及将质粒(Pro-trap)上连入基因组随机酶切片段，从而构建出带有随机片段的启动子筛选重组质粒Pro-promoter。通过检测碱性磷酸酶报告基因的表达强度从而得知随机酶切片段是否具有启动子活性及活性强度。
背景技术
真核生物基因表达受到多种因子的调控，例如转录因子、miRNA、IncRNA等。目前基因表达调控分为转录水平调控、翻译水平调控、翻译后加工水平调控。其中转录水平调控在基因表达调控中尤为重要。而启动子在这一过程中有着很关键的作用(Keasling etal.2008)。启动子通常是指位于调控基因的上游能与RNA聚合酶结合的一段DNA 序列(Carninci and Sandelin2006)。目前，RNA聚合酶主要有三种，分别是RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III。因此启动子也有与其对应的三种rRNA基因启动子(I型)、RNA(II型)和tNA基因启动子(III型)(Putthoff and Akyuz 2003)。I 型和III型启动子属于原核生物，主要在基因转录起始位点的上游(Dieci and Fiorino 2007)，而真核生物启动子属于II型启动子，启动子大部分都位于其所调控基因的上游。然而，目前高通量捕获启动子和增强子仍是一个困难。目前在细菌中进行高通量捕获启动子的方法是采用乳化反应和连接酶用于快速筛选和检测细菌中启动子的活性(Takaaki Kojimaet.al.)。在植物中主要是通过T-DNA介导的promoter进行启动子筛选(Pratibhaet.al. 2013)。在动物细胞中主要是通过LTR介导的插入进行启动子的筛选(Von M H，Reddy S， Ruley H E 1990)。利用外源性逆转录病毒DNA插入小鼠细胞系被首先报道(Jaenisch 1976)，逆转录病毒DNA插入基因组基因捕获技术进行基因检测已逐渐形成(Pinson KI et.al.2000)。基本上，基因陷阱技术是基于质粒或逆转录病毒的基于载体的基因寻找工具，其包含选择性标记或报告基因。当载体整合到宿主中具有相同ORF的功能基因的位置时，选择标记或报告基因只能表达(Brown SDand Nolan PM 2000)。根据载体中元件的差异，基因陷阱技术进一步发展为增强子捕获，启动子捕获和基因捕获。启动子捕获载体含有报告基因和无启动子报告基因[33]。当无启动子报告载体随机插入基因组时，如果插入的报告基因ORF和未鉴定的宿主基因ORF形成融合ORF，则翻译的融合蛋白来自宿主基因，报道基因报告存在活性宿主启动子附近。因此，可以鉴定并测序具有启动子活性的片段，以测定启动子序列组成(Stanford WL，Cohn JB，CordesSP 2001)。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，可被用于新基因和超强启动子的发现，本发明是这样获得的：
一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，其具体步骤如下：
A)用含10％血清的细胞培养基于37℃，5％CO2培养乳腺癌4T1细胞；当细胞生长至对数生长期时提取基因组DNA和总RNA；
其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分百计，将89％的RPMI-1640 培养液、10％的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素溶液混合后获得；
B)使用限制性内切酶BamH I和Hind III随机酶切转移性的小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA和表达载体Pro-free-trap；于37℃反应4h，即获得小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA片段和表达载体Pro-DNA-trap的酶切产物线性化载体DNA；
酶切体系：10×Buffer BamH I 2μL，4μL小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA，0.8μL10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL10U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；
C)配制线性化载体DNA和所有随机酶切后的基因组DNA片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒；
连接反应体系：10×T4DNALigase Buffer 1μL，步骤B)获得的基因组DNA片段5μL，步骤B)获得的线性化载体3μL，T4DNA Ligase 1μL；
D)将连接产物转化大肠杆菌感受态GT115细胞，于低盐固体LB培养基中37℃培养12h，获得单克隆；
E)挑取全部单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；
F)提取菌液中的质粒并用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切，经验证正确的质粒贮存于-20℃；
G)以pEGFP-N1质粒为模板，以SEAP-P-F和SEAP-P-R为上下游引物，进行PCR扩增CMV启动子并测序鉴定；
PCR反应体系：2.5μL10×Taq Easy Buffer，2μL2.5mM的dNTPs，0.5μL5U/μL的Taqpolymerase，1μL 10μM的上游引物，1μL 10μM的下游引物，10ng/μL的模板1μL，ddH2O补足至总体系为25μL；
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min， 40个循环；72℃延伸10min；
H)用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切步骤G)获得的CMV启动子目的片段，于37℃反应4h，即获得可用于连接反应的目的片段；
酶切体系：2μL 10×Buffer BamH I，5μL步骤G)获得的DNA片段，0.8μL10U/μL 的限制性内切酶BamH I，1.6μL10U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；
I)配制步骤B)获得的线性化的Pro-free-trap载体和步骤H)获得的目的片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒Pro-CMV-trap；
连接反应体系：14μL步骤H)获得的酶切片段，3μL步骤B)获得的线性化的Pro-free-trap 载体，2μL10×T4DNA Ligase Buffer，1μLT4DNA Ligase；
J)连接产物转化大肠杆菌GT115感受态细胞，并涂布于低盐LB固体培养基上37℃培养12h，获得单克隆；
K)挑取单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；将阳性克隆菌液进行测序鉴定并提取质粒；
L)将脂质体用细胞培养液稀释25倍，室温放置5min，将步骤K)获得的质粒分别加入稀释好的脂质体中，均匀混合，室温放置20min；
M)将对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔中均匀分散5×105个细胞并加入500μL无抗生素含10％血清的细胞培养基，37℃，5％CO2培养24h；转染前弃去各孔中的细胞培养基，向各孔中加入步骤L)获得的质粒与脂质体的混合物，混匀后于摇床缓慢摇匀10min，于37℃，5％CO2培养5小时后吸出细胞培养液，换成500μ L无抗生素含10％血清的新鲜培养液，于37℃，5％CO2培养；
转染36h后，检测碱性磷酸酶活性；并设置mSEAP阳性对照质粒及阴性对照脂质体Lipofecton 2000。
附图说明
图1为本发明小鼠乳腺癌细胞4T1基因组DNA提取结果电泳图；
图2为本发明小鼠乳腺癌细胞4T1基因组DNA双酶切验证电泳图；
图3为本发明启动子捕获载体Pro-free-trap载体双酶切验证电泳图；
图4为本发明中所构建的带有随机基因组片段的重组载体示意图；
图5为本发明中随机4T1基因组DNA片段与Pro-free-trap载体重组质粒电泳图；
图6为本发明中重组质粒Pro-DNA-trap构建成功后两个随机质粒双酶切验证电泳图；
图7为本发明中CMV启动子PCR扩增电泳图；
图8为本发明中CMV启动子双酶切电泳图；
图9为本发明中所构建的带有CMV启动子的重组载体示意图；
图10为本发明中阳性重组质粒Pro-CMV-trap双酶切验证电泳图；
图11为本发明中不同转染时间碱性磷酸酶活性测定的折线统计图；
图12为本发明中从阳性启动子文库中随机抽取的14个重组质粒做成的折线图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行具体描述。
实施例涉及实验材料与仪器：
4T1小鼠乳腺癌细胞系购于中国协和医学院；
pEGFP-N1荧光蛋白报告基因载体购于Addgene公司；
DH5α感受态细胞、GT115感受态、Pro-trap-basic载体购自InVivoGen公司；
pMD18-T Simple Vector购自TaKaRa公司；
0.25％-EDTA胰蛋白酶购自Hyclone公司；
抗生素(青霉素/链霉素)购自Hyclone公司；
琼脂糖购自Spain公司；
Taq酶购自Trans公司；
DL2,000DNA Marker购自索莱宝公司；
DL5,000DNA Marker购自索莱宝公司；
DL10,000DNA Marker购自索莱宝公司；
GT115感受态购自InVivoGen公司；
E.Z.N.A Gel Extraction Kit购自OMEGA公司；
E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I购自OMEGA公司；
HindIII限制性内切酶购自Thermo公司；
BamHI限制性内切酶购自Thermo公司；
T4DNA Ligase购自Thermo公司；
Zeocin(博来霉素)购自Invitrogen公司；
RPMI1640购自Hyclone公司；
胎牛血清购自TBD公司；
Lipo 2000购自Invitrogen公司；
低速离心机购自中科中佳公司；
稳流稳压电泳仪购自北京六一仪器厂公司；
PCR仪购自伯乐公司；
二氧化碳细胞培养箱购自Heraeus公司；
-80℃低温冰箱购自Thermo Scientific公司；
台式冷冻离心机购自Thermo Scientific公司；
超净工作台购自苏净安泰公司；
恒温摇床购自上海蓝豹公司；
凝胶成像仪购自伯乐公司；
倒置显微镜购自奥林巴斯公司；
酶标仪购自BioTek公司；
摇床购自其林贝尔公司；
恒温水浴锅购自上海科析试验仪器厂。
实施例涉及的培养基：
液体LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，
固体LB培养基(5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，琼脂粉15g/L)，含10％血清的细胞培养基配方：以质量百分百计，将89％的RPMI-1640培养液(购自 Hyclone公司)、10％的胎牛血清(购自TBD公司)及1％的青霉素-链霉素溶液(购自 Hyclone公司)混合后获得。
实施例1：
(1)4T1细胞的复苏与培养
a)从液氮中将冻存的小鼠乳腺癌细胞系4T1取出后直接放于37℃的水浴锅中，待3～5 min细胞融化后取出；在超净工作台中将细胞用PRMI-1640细胞培养液将细胞悬浮，转移到15mL的离心管中，并轻轻吸打混匀，1500rpm离心5分钟，倒掉上清；用2mL细胞培养液PRMI-1640，含有10％胎牛血清以及1％的双抗(即100μg/mL链霉素以及100U/mL 青霉素)将细胞悬浮；在细胞培养瓶中放入8mL细胞培养液RPMI-1640，含有10％胎牛血清以及1％的双抗，将2mL的细胞悬液加入培养瓶中；之后将培养瓶置于37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养；
b)小鼠乳腺癌4T1细胞贴壁培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的RPMI-1640细胞培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中常规传代，细胞生长至对数期时进行试验；
c)复苏的细胞经过2-3天的培养，细胞聚合度度达到90％时，进行细胞传代；
倒掉细胞培养瓶中的培养液，用5mL 1×PBS清洗三次。倒掉PBS，加入0.25％胰蛋白酶1mL，37℃消化5min，显微镜下观察是否完全消化。如未能完全消化，轻轻拍打培养瓶两侧将细胞拍散。完全消化后，用4mL含有血清的细胞培养液终止消化，并转移到15mL 离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉上清。加入5mL 1×PBS将细胞悬浮，轻轻吸打混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清。加入4mL新鲜的细胞培养液悬浮细胞，取两个无菌的培养瓶，加入8mL含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的RPMI-1640 细胞培养基，之后将细胞悬液平均分至两个细胞培养瓶中。
(2)4T1细胞的基因组DNA提取
选择25cm2培养瓶中4T1细胞聚合度达到90％的细胞，倒掉培养瓶中的培养液，用5mL 1×PBS洗3遍，加入0.25％胰蛋白酶1mL，在培养箱中37℃消化5min；细胞消化完全后，用2mL含有血清的细胞培养液终止消化，向瓶中加入5mL 1×PBS，悬浮细胞并将其转到15mL离心管中，1500rpm离心5min后，弃上清；用450μL TE(PH＝9.0)(0.5mol/L Tris，0.02mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl)悬浮细胞；向悬液中加入100μL 10％SDS，均匀混合，用移液枪将悬液转至2个1.5mL EP管中；向上述2个离心管中分别加入125μL 6mol/L NaCl，均匀混合，2500rpm离心30min；将上清转移至新1.5mL EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，均匀混合后，12000rpm离心10min，弃上清；室温晾干后，用50μL去离子水溶解DNA， -20℃冻存；基因组DNA用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，可以看出基因组DNA 提取的较纯净，可以用于双酶切反应，以获得随机大小片段。
(3)基因组DNA双酶切
a)根据表1，配制20μL酶切体系，用移液器轻轻吹打混匀，置于37℃反应4h，以获得基因组随机酶切产物以获得基因组随机酶切片段；取2μL酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，由图2可见，有弥散条带出现，符合基因组DNA的特点；剩下的用乙酸钠法回收双酶切的随机基因组DNA片段；
基因组DNA酶切体系如下表(表1)：
试剂 体积(μL)
4T1细胞基因组DNA 4
BamH I(10U/μL) 0.8
HindIII(10U/μL) 1.6
10×BufferBamH I 2
ddH<sub>2</sub>O 11.6
总体积 20
b)在EP管中，加入剩余双酶切产物1/10体积的3mol/L(PH＝4.8)乙酸钠，并用手指轻弹管壁，混匀液体；加入2～2.5倍体积(按加入乙酸钠后的体积)的冷冻的100％乙醇，轻轻混匀，并将其在-20℃沉降30min以上；12000rpm离心5min，弃上清；加入1mL预冷的70％乙醇，颠倒混匀离心管数次，12000rpm离心5min，弃上清；待室温晾干后用20 μL去离子水(PH＝8.0)回溶，产物-20℃冻存待用。
(4)Pro-free-trap载体的双酶切
根据表2，配制20μL酶切体系，Pro-free-trap载体酶切体系如下表(表2)：
用移液器轻轻吹打混匀，置于37℃反应4h，以获得Pro-free-trap载体双酶切产物，以获得线性化Pro-free-trap载体；酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，由图3可见，产物显示有一较大片段，产物使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收。
(5)构建随机4T1基因组DNA与Pro-free-trap载体的启动子文库
a)将经过BamH I/HindIII双酶切回收的4T1基因组片段和经过相同酶切回收后的Pro-free-trap载体配制如下连接体系(表3)，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡，于22℃连接1h，以获得重组载体。重组载体示意图见图4；
连接体系如下表(表3)：
试剂 体积(μL)
酶切后的4T1基因组片段(BamH I/HindIII) 5
酶切后的Pro-free-trap(BamH I/HindIII) 3
T4DNA Ligase Buffer(10×) 1
T4DNA Ligase 1
总体积 10
b)将5μL连接产物加入到50μL大肠杆菌感受态GT115细胞中，轻轻混匀后冰上放置30min；之后在将其放入42℃水浴锅中，热激90s后迅速将EP管放在冰上静置5min；在超净工作台中向EP管中加入450μL无抗生素的低盐LB液体培养基，混合均匀，37℃，180rpm 扩大培养1h；将所有的菌液都涂布在含有Zeocin(博来霉素)的低盐固体LB培养基中，每 50μL菌液用50μL低盐液体LB稀释，将稀释后的菌液分成7份后分别涂布在7个固体培养板上；
c)将涂布后的平板在恒温培养箱中倒置培养12-16h；共得到706个单克隆，将这些单克隆全部挑取，摇菌，用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒。从随机质粒库中随机选取8 个质粒用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图5所示，显示质粒大小均不相同，说明随机质粒库构建成功；
d)为进一步验证随机质粒库构建成功，在质粒库中随机取2个质粒进行双酶切验证，酶切方法和体系同步骤(4)。如图6所示，两个随机的质粒双酶切后切出了不同大小的片段，说明连接在报告载体上的随机片段大小不同，随机质粒库构建成功。
(6)阳性重组质粒Pro-CMV-trap的构建
a)根据pEGFP-N1载体CMV启动子的序列设计引物，合成由北京鼎国昌盛生物科技有限公司完成。以pEGFP-N1质粒为模板配制如下PCR反应体系，轻轻吹打混匀，置于PCR 仪中扩增目的片段；
PCR反应体系体系如下表(表4)：
试剂 体积(μL)
模板pEGFP-N1质粒 1
10×Taq Easy Buffer 2.5
2.5mM dNTPs 2
5U/μL Taq 0.5
SEAP-P-F1上游扩增引物 1
SEAP-P-R1下游扩增引物 1
ddH<sub>2</sub>O 17
总体积 25
PCR反应条件如下表(表5)：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由图7可见，结果显示PCR产物大小约为600bp，与实际长度582bp基本一致。用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段；PCR产物连接T载体pMD18-TSimple Vector后，进行测序及结果分析，表明所获得的片段为CMV启动子片段，与预期一致；
b)根据表6，配制20μL酶切体系，按表6顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，置于37℃反应4h，以获得测序正确的EGFP的CMV启动子片段的双酶切产物；酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，由图8可见，产物显示较小片段的大小约为600bp，与预期相符，产物使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收：
扩增的CMV片段的酶切体系如下表(表6)：
c)将经过BamH I/HindIII双酶切后经过胶回收的EGFP的CMV片段和经过相同酶切的线性Pro-free-trap载体配制如下连接体系(表7)，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡，于22℃连接1h，以获得重组载体。重组载体示意图见图9；
连接体系如下表(表7)：
试剂 体积(μL)
EGFP的CMV(BamH I/HindIII) 14
Pro-free-trap(BamH I/HindIII) 3
10×T4DNA Ligase Buffer 2
T4DNA Ligase 1
总体积 20
d)将5μL连接产物加入到50μL大肠杆菌感受态GT115细胞中，轻轻混匀后冰上放置30min；之后在将其放入42℃水浴锅中，热激90s后迅速将EP管放在冰上静置5min；在超净工作台中向EP管中加入450μL无抗生素的低盐LB液体培养基，混合均匀，37℃，180rpm 扩大培养1h；将所有的菌液都涂布在含有Zeocin(博来霉素)的低盐固体LB培养基中，每 50μL菌液用50μL低盐液体LB稀释，将稀释后的菌液涂布在固体培养板上；
e)将涂布后的平板在恒温培养箱中倒置培养12-16h；挑取阳性单克隆，摇菌，将阳性克隆菌液送北京鼎国基因公司测序，用OMEGA质粒提取试剂盒提取测序正确的阳性质粒；
f)用BamH I/HindIII酶切鉴定提取的质粒，根据表8，配制15μL酶切体系，酶切体系如下表(表8)：
试剂 体积(μL)
Pro-CMV-trap 3
BamH I(10U/μL) 0.3
HindIII(10U/μL) 0.6
Buffer BamH I(10×) 1.5
ddH<sub>2</sub>O 9.6
总体积 15
用移液器轻轻吹打混匀，置于37℃反应2h，，以鉴定构建载体成功的阳性克隆；酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，由图10可见，产物显示较小片段的大小约为600bp，与预期相符。
(7)细胞瞬时转染及转染最佳时间的确定
a)选取生长良好的乳腺癌4T1细胞，倒掉培养瓶中的细胞培养液，用5mL 1×PBS洗三次。弃PBS，加入0.25％胰酶(购于Hyclone公司)1mL，37℃消化5min，并在倒置显微镜下观察是否完全消化。向培养瓶中加入5mL含有10％血清的培养液终止消化，用移液器将细胞轻轻吹散后转移到15mL离心管中，1500rpm，离心5min，倒掉上清。用7mL 1×PBS悬浮细胞，并取20μL细胞悬液用细胞计数板计数，剩下的悬液1500rpm，离心5min，倒掉上清。取24孔细胞培养板，向各个孔中加入0.5mL有血清无抗生素的新鲜培养液。培养板的每孔中均匀分散5×105的4T1细胞，37℃，5％CO2培养24h；
b)吸出24h前铺板的培养板各孔中培养液，每孔加入0.5mL 1×PBS清洗一次，换上350μL 无抗生素无血清的新鲜RPMI-1640培养液(购于Hyclone公司)。取0.8μg步骤(6)获得的 mSEAP阳性对照质粒Pro-CMV-trap，用RPMI-1640培养液稀释至50μL，每孔2μL脂质体Lipofecton 2000；同样地将脂质体用RPMI-1640培养液稀释至50μL，室温放置5min，将稀释好的质粒加入稀释好的Lipofecton 2000中，均匀混合，室温放置20min。将Pro-CMV-trap脂质体混合物加入到4T1细胞中，轻轻混匀后，将细胞培养板放在摇床缓慢的摇匀10min。37℃，5％CO2培养5h后吸出细胞培养培养板中的培养液，换成500μL无抗生素有血清的新鲜培养液，放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养；
c)收集不同转染Pro-CMV-trap载体的细胞培养时间的上清，分为6h、12h、24h、36h、48h。取不同培养时间的细胞上清培养液450μL放在干净无菌的1.5mLEP管中。将收集的上清培养液10000rpm离心5min。取离心后培养液的300μL上清到另一个1.5mLEP，不要取到管底的细胞碎片。取10μL的不同时间段的细胞上清到96孔板上。另外取10μL 的新鲜无血清无双抗的细胞培养液作为阴性对照。将样品放在65℃水浴加热5～10min，用来抑制细胞的內源碱性磷酸酶活性。根据表8，配制转染体系，用移液器轻轻吹打混匀，按
表8顺序依次加入各种试剂：
试剂 体积(μL)
1×Dilution Buffer 50
1×Assay Buffer 100
L-高精氨酸 20
H<sub>2</sub>O 20
总体积 290
d)在37℃水浴加热10min。在各个孔中加入20μL SEAP底物对硝基苯磷酸二钠(PNPP)，注意避光。在避光条件下，37℃水浴10min，在405nm条件下检测其吸光值。之后在避光条件下405nm条件下每隔10min检测一次，直到达到吸光值的最高峰。确定碱性磷酸酶活性最高的转染时间即为转染最佳时间；
图11是不同转染时间碱性磷酸酶活性测定的折线统计图，可见转染时间为36h时，碱性磷酸酶表达活性最高，故确定最佳转染时间为36h。
(8)随机文库的质粒转染细胞以及报告基因SEAP活性的检测
在确定SEAP活性最高值的转染时间及检测时间后，将得到的706个随机文库的质粒全部转染4T1细胞，并检测质粒是否有活性。使用步骤(7)中相同的方法进行质粒转染，36h 后用步骤(7)中相同的方法对SEAP活性进行检测鉴定。图12是从启动子文库中随机抽取的14个阳性质粒做成的折线统计图。

Claims (2)

1.针对上述问题，本发明提供一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，可被用于新基因和超强启动子的发现，本发明是这样获得的：
一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，其具体步骤如下：
A)用含10％血清的细胞培养基于37℃，5％CO2培养乳腺癌4T1细胞；当细胞生长至对数生长期时提取基因组DNA和总RNA
其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分百计，将89％的RPMI-1640培养液、10％的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素溶液混合后获得；
B)使用限制性内切酶BamH I和Hind III随机酶切转移性的小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA和表达载体Pro-free-trap；于37℃反应4h，即获得小鼠乳腺癌4T1细胞基因组基因组DNA片段和表达载体Pro-DNA-trap的酶切产物线性化载体DNA；
酶切体系：10×BufferBamH I 2μL，4μL小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10 U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；
C)配制线性化载体DNA和所有随机酶切后的基因组DNA片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒；
连接反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，步骤B)获得的基因组DNA片段5μL，步骤B)获得的线性化载体3μL，T4 DNA Ligase 1μL；
D)将连接产物转化大肠杆菌感受态GT115细胞，于低盐固体LB培养基中37℃培养12h，获得单克隆；
E)挑取全部单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；
F)提取菌液中的质粒并用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切验证正确后将质粒贮存于-20℃；
G)以pEGFP-N1质粒为模板，以SEAP-P-F和SEAP-P-R为上下游引物，进行PCR扩增CMV启动子并测序鉴定；
PCR反应体系：2.5μL 10×Taq Easy Buffer，2μL 2.5mM的dNTPs，0.5μL 5U/μL的Taqpolymerase，1μL 10μM的上游引物，1μL 10μM的下游引物，10ng/μL的模板1μL，ddH2O补足至总体系为25μL；
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min；
H)用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切步骤G)获得的CMV启动子目的片段，于37℃反应4h，即获得可用于连接反应的目的片段；
酶切体系：2μL 10×Buffer BamH I，5μL步骤G)获得的DNA片段，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；
I)配制步骤B)获得的线性化的Pro-free-trapc载体和步骤H)获得的目的片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒Pro-CMV-trap；
连接反应体系：14μL步骤H)获得的酶切片段，3μL步骤B)获得的线性化的Pro-free-trap载体，2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase；
J)连接产物转化大肠杆菌GT115感受态细胞，并涂布于低盐LB固体培养基上37℃培养12h，获得单克隆；
K)挑取单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；将阳性克隆菌液进行测序鉴定并提取质粒；
L)将脂质体用细胞培养液稀释25倍，室温放置5min，将步骤K)获得的质粒分别加入稀释好的脂质体中，均匀混合，室温放置20min；
M)将对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔中均匀分散5×105个细胞并加入500μL无抗生素含10％血清的细胞培养基，37℃，5％CO2培养24h；转染前弃去各孔中的细胞培养基，向各孔中加入步骤L)获得的质粒与脂质体的混合物，混匀后于摇床缓慢摇匀10min，于37℃，5％CO2培养5小时后吸出细胞培养液，换成500μL无抗生素含10％血清的新鲜培养液，于37℃，5％CO2培养；
转染36h后，检测碱性磷酸酶活性；并设置mSEAP阳性对照质粒及阴性对照脂质体Lipofecton 2000。
2.根据权利要求1所述启动子及增强子捕获技术的方法，其特征在于，步骤C)所述的基因组DNA片段是这样获得的：用限制性内切酶BamH I和Hind III在37℃，4h对基因组DNA进行随机酶切；步骤M)对于重组质粒启动子或增强子活性的检测步骤是这样的：将脂质体与随机基因组片段转染细胞36h后，收集每孔中的细胞上清液10000rpm离心5min，取离心后的上清液将样品放在65℃水浴加热5～10min，用来抑制细胞的內源碱性磷酸酶活性；在样品中加入1×Dilution Buffer 50μL，1×Assay Buffer 100μL，L-高精氨酸20μL，H2O 20μL；在37℃水浴加热10min；在各个孔中加入20μL SEAP底物(PNPP)，注意避光在避光条件下37℃水浴10min，在OD450条件下检测碱性磷酸酶活性，其指标可作为启动子或增强子活性检测标准。
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